JPH0576382A - Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法Info
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- JPH0576382A JPH0576382A JP26536091A JP26536091A JPH0576382A JP H0576382 A JPH0576382 A JP H0576382A JP 26536091 A JP26536091 A JP 26536091A JP 26536091 A JP26536091 A JP 26536091A JP H0576382 A JPH0576382 A JP H0576382A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 特定ＤＮＡの選択的増幅技術及び遺伝子組換
技術を利用して、Ｂ型肝炎ウイルスのコア又は表面構造
タンパク質を製造する。 【構成】 ＮｃｏＩ認識配列を含み、天然コア構造タン
パク質コードＤＮＡの開始コドン含有領域に特異的結合
可能な塩基配列を有する第１プライマーと、ＧＧＡＴＣ
ＣＴＡを含み、前記コア構造タンパク質コードＤＮＡの
停止コドン含有領域に特異的結合可能な塩基配列を有す
る第２プライマーとの組合せ、又はＮｃｏＩ認識配列を
含み、天然表面構造タンパク質コードＤＮＡの開始コド
ン含有領域に特異的結合可能な塩基配列を有する第１プ
ライマーと、ＡＡＧＣＴＴＴＡを含み、前記表面構造タ
ンパク質コードＤＮＡの停止コドン含有領域に特異的結
合可能な塩基配列を有する第２プライマーとの組合せを
用いる。
技術を利用して、Ｂ型肝炎ウイルスのコア又は表面構造
タンパク質を製造する。 【構成】 ＮｃｏＩ認識配列を含み、天然コア構造タン
パク質コードＤＮＡの開始コドン含有領域に特異的結合
可能な塩基配列を有する第１プライマーと、ＧＧＡＴＣ
ＣＴＡを含み、前記コア構造タンパク質コードＤＮＡの
停止コドン含有領域に特異的結合可能な塩基配列を有す
る第２プライマーとの組合せ、又はＮｃｏＩ認識配列を
含み、天然表面構造タンパク質コードＤＮＡの開始コド
ン含有領域に特異的結合可能な塩基配列を有する第１プ
ライマーと、ＡＡＧＣＴＴＴＡを含み、前記表面構造タ
ンパク質コードＤＮＡの停止コドン含有領域に特異的結
合可能な塩基配列を有する第２プライマーとの組合せを
用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定のＤＮＡを選択的
に増幅する技術及び遺伝子組換え技術を利用して、Ｂ型
肝炎ウイルスのコア構造タンパク質又は表面構造タンパ
ク質を製造する方法に関する。本発明は、特には、それ
らの構造タンパク質をコードしているＤＮＡを選択的に
増幅する技術を利用する際に用いる２種類のプライマー
ＤＮＡとして、開始コドンを含むと共に特定の制限酵素
で切断することのできるオリゴヌクレオチド、及び停止
コドンを含むと共に特定の別の制限酵素で切断すること
のできるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする
ものである。
に増幅する技術及び遺伝子組換え技術を利用して、Ｂ型
肝炎ウイルスのコア構造タンパク質又は表面構造タンパ
ク質を製造する方法に関する。本発明は、特には、それ
らの構造タンパク質をコードしているＤＮＡを選択的に
増幅する技術を利用する際に用いる２種類のプライマー
ＤＮＡとして、開始コドンを含むと共に特定の制限酵素
で切断することのできるオリゴヌクレオチド、及び停止
コドンを含むと共に特定の別の制限酵素で切断すること
のできるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする
ものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｖｉｒｕｓ：以下、ＨＢＶの略称を用いることが
ある）はヒト肝臓疾患の原因となる感染因子であり、Ｈ
ＢＶに感染した慢性肝炎患者の中から肝硬変又は肝癌患
者に至ることが明らかになっている。また、輸血による
感染も問題となっている。Ｂ型肝炎に感染しているかど
うかのスクリーニング検査は感染の防止及び治療のため
に必要であり、Ｂ型肝炎の感染に対する診断用試験は種
々試みられている。
Ｂ ｖｉｒｕｓ：以下、ＨＢＶの略称を用いることが
ある）はヒト肝臓疾患の原因となる感染因子であり、Ｈ
ＢＶに感染した慢性肝炎患者の中から肝硬変又は肝癌患
者に至ることが明らかになっている。また、輸血による
感染も問題となっている。Ｂ型肝炎に感染しているかど
うかのスクリーニング検査は感染の防止及び治療のため
に必要であり、Ｂ型肝炎の感染に対する診断用試験は種
々試みられている。
【０００３】しかし、前記の診断用試薬に用いる精製Ｈ
Ｂｓ抗原を得るためには大量のヒト血漿を用いる必要が
あり、しかもこの精製工程は非常に危険であるので改良
が望まれていた。また、ＨＢｓ抗原陽性患者が徐々に減
少しているので、遺伝子組換え技術を利用してＨＢｓ抗
原を生産することが期待されている。
Ｂｓ抗原を得るためには大量のヒト血漿を用いる必要が
あり、しかもこの精製工程は非常に危険であるので改良
が望まれていた。また、ＨＢｓ抗原陽性患者が徐々に減
少しているので、遺伝子組換え技術を利用してＨＢｓ抗
原を生産することが期待されている。
【０００４】遺伝子組換え技術を利用してＨＢｓ抗原を
製造する方法は既に種々報告されているが、いずれも大
量のデーン粒子を含む血漿を集めて処理する必要があ
り、また放射性同位体（例えば、32Ｐ）を用いて行われ
ているので、特殊な設備を必要とし、一般的ではなかっ
た。
製造する方法は既に種々報告されているが、いずれも大
量のデーン粒子を含む血漿を集めて処理する必要があ
り、また放射性同位体（例えば、32Ｐ）を用いて行われ
ているので、特殊な設備を必要とし、一般的ではなかっ
た。
【０００５】遺伝子組換え技術を利用する従来法として
は、例えば、Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，３５８１−３５９０
（１９８３）に以下の方法が記載されている。即ち、Ｈ
ＢＶから単離した約３．２Ｋｂの環状ＤＮＡを制限酵素
（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等）で切断して得たＤＮＡ断
片をプラスミドベクターに組み込み、この組換えベクタ
ーによる形質転換体を寒天平板上にまいたコロニーをス
クリーニングしてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡのクローンを
得る。続いて、このプラスミドを大腸菌で増殖した後、
プラスミドを単離し、適切な制限酵素を用いてＨＢｓタ
ンパク質遺伝子（又はＨＢｃタンパク質遺伝子）を含む
ＤＮＡ断片を切り出す。更に、こうして得られたＤＮＡ
断片を発現ベクターに組み込み、その発現ベクターによ
る形質転換体を培養して目的とするＨＢｓタンパク質又
はＨＢｃタンパク質を単離していた。
は、例えば、Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，３５８１−３５９０
（１９８３）に以下の方法が記載されている。即ち、Ｈ
ＢＶから単離した約３．２Ｋｂの環状ＤＮＡを制限酵素
（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等）で切断して得たＤＮＡ断
片をプラスミドベクターに組み込み、この組換えベクタ
ーによる形質転換体を寒天平板上にまいたコロニーをス
クリーニングしてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡのクローンを
得る。続いて、このプラスミドを大腸菌で増殖した後、
プラスミドを単離し、適切な制限酵素を用いてＨＢｓタ
ンパク質遺伝子（又はＨＢｃタンパク質遺伝子）を含む
ＤＮＡ断片を切り出す。更に、こうして得られたＤＮＡ
断片を発現ベクターに組み込み、その発現ベクターによ
る形質転換体を培養して目的とするＨＢｓタンパク質又
はＨＢｃタンパク質を単離していた。
【０００６】しかしながら、前記の方法では、発現ベク
ターに挿入するＤＮＡ断片は、ＨＢｓタンパク質又はＨ
Ｂｃタンパク質をコードしている遺伝子よりも大きく、
５’末端の上流及び３’末端の下流に余分のＤＮＡ配列
をもっていた。これは、開始コドンＡＴＧの直前で切断
できる制限酵素がないことと、停止コドンＴＡＡ、ＴＡ
Ｇ又はＴＧＡの直後で切断できる制限酵素がまだ見つか
っていないことによるものであった。更に、ＨＢｓ抗原
には４種のサブタイプ（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａ
ｙｗ）が存在し、サブタイプが相違すると同じ制限酵素
（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等）で切断できる
塩基配列が保存されていないので、各サブタイプ毎に切
断できるかどうかを確認する必要があった。また、変異
により切断部位が消失することもあるので、クローニン
グができない場合があった。
ターに挿入するＤＮＡ断片は、ＨＢｓタンパク質又はＨ
Ｂｃタンパク質をコードしている遺伝子よりも大きく、
５’末端の上流及び３’末端の下流に余分のＤＮＡ配列
をもっていた。これは、開始コドンＡＴＧの直前で切断
できる制限酵素がないことと、停止コドンＴＡＡ、ＴＡ
Ｇ又はＴＧＡの直後で切断できる制限酵素がまだ見つか
っていないことによるものであった。更に、ＨＢｓ抗原
には４種のサブタイプ（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａ
ｙｗ）が存在し、サブタイプが相違すると同じ制限酵素
（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等）で切断できる
塩基配列が保存されていないので、各サブタイプ毎に切
断できるかどうかを確認する必要があった。また、変異
により切断部位が消失することもあるので、クローニン
グができない場合があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、大量の血漿を用いる必要がなく、開始コドンの直前
から停止コドンの直後までからなる挿入用ＤＮＡ断片を
得ることができ、しかもＨＢｓ抗原のサブタイプによる
差異や変異による切断部位の消失にも適応可能な方法を
提供することにある。
は、大量の血漿を用いる必要がなく、開始コドンの直前
から停止コドンの直後までからなる挿入用ＤＮＡ断片を
得ることができ、しかもＨＢｓ抗原のサブタイプによる
差異や変異による切断部位の消失にも適応可能な方法を
提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記の課題は、本発明の
第１の方法、即ち、 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在す
る塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構
造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列における開
始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイ
ルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの開始コド
ンＡＴＧを含む領域に特異的に結合することのできる塩
基配列又はその相補的塩基配列を有する第１のＤＮＡプ
ライマー（以下、１Ｃプライマーと称することがある）
と、（ｂ）塩基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含み、その塩基
配列の最後に存在する塩基配列ＣＴＡが、天然ヒトＢ型
肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列における停止コドンＴＡＧに相補的な塩基配列
ＣＴＡに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア
構造タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＧ
を含む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又
はその相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマー
（以下、２Ｃプライマーと称することがある）と、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス
ＤＮＡとを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型
肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡを
増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化して、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を複製
可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスコア
構造タンパク質の製造方法によって解決することができ
る。
第１の方法、即ち、 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在す
る塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構
造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列における開
始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイ
ルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの開始コド
ンＡＴＧを含む領域に特異的に結合することのできる塩
基配列又はその相補的塩基配列を有する第１のＤＮＡプ
ライマー（以下、１Ｃプライマーと称することがある）
と、（ｂ）塩基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含み、その塩基
配列の最後に存在する塩基配列ＣＴＡが、天然ヒトＢ型
肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列における停止コドンＴＡＧに相補的な塩基配列
ＣＴＡに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア
構造タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＧ
を含む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又
はその相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマー
（以下、２Ｃプライマーと称することがある）と、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス
ＤＮＡとを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型
肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡを
増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化して、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を複製
可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスコア
構造タンパク質の製造方法によって解決することができ
る。
【０００９】更に、前記の課題は、本発明の第２の方
法、即ち、 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在す
る塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構
造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列における開
始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイ
ルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの開始コド
ンＡＴＧを含む領域に特異的に結合することのできる塩
基配列又はその相補的塩基配列を有する第１のＤＮＡプ
ライマー（以下、１Ｓプライマーと称することがある）
と、（ｂ）塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含み、その塩基
配列の最後に存在する塩基配列ＴＴＡが、天然ヒトＢ型
肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列における停止コドンＴＡＡに相補的な塩基配列
ＴＴＡに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面
構造タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＡ
を含む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又
はその相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマー
（以下、２Ｓプライマーと称することがある）と、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス
ＤＮＡとを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型
肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡを
増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII で消化して、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化Ｄ
ＮＡ断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII 消化ＤＮＡ断片を複
製可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面
構造タンパク質の製造方法によって解決することができ
る。なお、本明細書の記載において、Ａはアデニン残
基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基そしてＴはチ
ミン残基の意味である。
法、即ち、 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在す
る塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構
造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列における開
始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイ
ルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの開始コド
ンＡＴＧを含む領域に特異的に結合することのできる塩
基配列又はその相補的塩基配列を有する第１のＤＮＡプ
ライマー（以下、１Ｓプライマーと称することがある）
と、（ｂ）塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含み、その塩基
配列の最後に存在する塩基配列ＴＴＡが、天然ヒトＢ型
肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列における停止コドンＴＡＡに相補的な塩基配列
ＴＴＡに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面
構造タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＡ
を含む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又
はその相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマー
（以下、２Ｓプライマーと称することがある）と、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス
ＤＮＡとを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型
肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡを
増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII で消化して、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化Ｄ
ＮＡ断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII 消化ＤＮＡ断片を複
製可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面
構造タンパク質の製造方法によって解決することができ
る。なお、本明細書の記載において、Ａはアデニン残
基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基そしてＴはチ
ミン残基の意味である。
【００１０】ＨＢＶのＤＮＡ遺伝子配列はすでに解明さ
れており〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｎｏ．６，８，１３（１９８３）〕、分子量２．
１×１０6 ダルトンで約３２００塩基対よりなることが
分かっている。この内、コアタンパク質遺伝子（ＨＢｃ
遺伝子）領域は約１９００番目の塩基から約２４００番
目の塩基の間に存在している。本発明の第１の方法の第
１工程では、このＨＢｃ遺伝子領域、即ち、ＨＢｃをコ
ードするＤＮＡ領域のみを選択的に増幅する。これに
は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用
すると、微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域のみを
自動的に約１００万倍にまで増幅することができる（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）。
ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対
するプライマーと−鎖に対するプライマーと、更に耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼとを用いて増幅するサイクルを繰
り返す。
れており〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｎｏ．６，８，１３（１９８３）〕、分子量２．
１×１０6 ダルトンで約３２００塩基対よりなることが
分かっている。この内、コアタンパク質遺伝子（ＨＢｃ
遺伝子）領域は約１９００番目の塩基から約２４００番
目の塩基の間に存在している。本発明の第１の方法の第
１工程では、このＨＢｃ遺伝子領域、即ち、ＨＢｃをコ
ードするＤＮＡ領域のみを選択的に増幅する。これに
は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用
すると、微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域のみを
自動的に約１００万倍にまで増幅することができる（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）。
ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対
するプライマーと−鎖に対するプライマーと、更に耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼとを用いて増幅するサイクルを繰
り返す。
【００１１】本発明の第１の方法において、第１工程の
ＰＣＲ法で用いる前記１Ｃプライマー（＋鎖用）は、制
限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、し
かもその塩基配列内に開始コドンＡＴＧ（前記塩基配列
の下線部）を有している。この１Ｃプライマーは、前記
の制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧも含め
て、少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩
基、より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが
好ましい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての
特異性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極
めて困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、
プライマーとしての特異性は向上するが、プライマーの
製造にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは
分子内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
ＰＣＲ法で用いる前記１Ｃプライマー（＋鎖用）は、制
限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、し
かもその塩基配列内に開始コドンＡＴＧ（前記塩基配列
の下線部）を有している。この１Ｃプライマーは、前記
の制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧも含め
て、少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩
基、より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが
好ましい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての
特異性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極
めて困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、
プライマーとしての特異性は向上するが、プライマーの
製造にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは
分子内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
【００１２】好ましい１Ｃプライマーは、前記認識塩基
配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧを、天然
ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列における開始コドンＡＴＧに対応させ
た場合に、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧの上流及び／
又は下流に、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパ
ク質をコードするＤＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域
の塩基配列と同一、あるいは、多くても３塩基が置換、
欠失又は挿入された塩基配列を有するものである。例え
ば、１Ｃプライマーは、前記開始コドンの下流に天然ヒ
トＨＢｃ遺伝子と同様に、好ましくは９塩基の配列ＧＡ
ＣＡＴＴＧＡＣ、より好ましくは１９塩基の配列ＧＡＣ
ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡＧが連結した構造を有
することができる。また、１Ｃプライマーは、前記制限
酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流に、天然ヒトＨＢｃ
遺伝子と同様の６塩基の配列ＴＴＴＧＧＧを有すること
もできる。更に、開始コドン下流の前記１９塩基配列に
２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例えば、
ＧＡＣＡＴＴ（又はＣ）ＧＡＣ（又はＴ）ＡＣＴ（又は
Ｃ）ＴＡＴＡＡＡＧであってもよい（下線部が置換）。
配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧを、天然
ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列における開始コドンＡＴＧに対応させ
た場合に、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧの上流及び／
又は下流に、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパ
ク質をコードするＤＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域
の塩基配列と同一、あるいは、多くても３塩基が置換、
欠失又は挿入された塩基配列を有するものである。例え
ば、１Ｃプライマーは、前記開始コドンの下流に天然ヒ
トＨＢｃ遺伝子と同様に、好ましくは９塩基の配列ＧＡ
ＣＡＴＴＧＡＣ、より好ましくは１９塩基の配列ＧＡＣ
ＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡＧが連結した構造を有
することができる。また、１Ｃプライマーは、前記制限
酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流に、天然ヒトＨＢｃ
遺伝子と同様の６塩基の配列ＴＴＴＧＧＧを有すること
もできる。更に、開始コドン下流の前記１９塩基配列に
２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例えば、
ＧＡＣＡＴＴ（又はＣ）ＧＡＣ（又はＴ）ＡＣＴ（又は
Ｃ）ＴＡＴＡＡＡＧであってもよい（下線部が置換）。
【００１３】本発明の第１の方法において、第１工程の
ＰＣＲ法で用いる前記２Ｃプライマー（−鎖用）は、塩
基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含む。この８塩基の配列の
内、最初の６塩基の配列ＧＧＡＴＣＣは制限酵素Ｂａｍ
ＨＩの認識塩基配列であり、最後の３塩基の配列ＣＴＡ
は停止コドンＴＡＧに相補的な配列である。この２Ｃプ
ライマーも、前記塩基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含めて、
少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、
より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好ま
しい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異
性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて
困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プラ
イマーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造
にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子
内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
ＰＣＲ法で用いる前記２Ｃプライマー（−鎖用）は、塩
基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含む。この８塩基の配列の
内、最初の６塩基の配列ＧＧＡＴＣＣは制限酵素Ｂａｍ
ＨＩの認識塩基配列であり、最後の３塩基の配列ＣＴＡ
は停止コドンＴＡＧに相補的な配列である。この２Ｃプ
ライマーも、前記塩基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含めて、
少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、
より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好ま
しい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異
性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて
困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プラ
イマーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造
にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子
内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
【００１４】好ましい２Ｃプライマーは、前記塩基配列
ＧＧＡＴＣＣＴＡ内の最後に存在する塩基配列ＣＴＡ
を、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列における停止コドンＴＡＧの
相補的塩基配列ＣＴＡに対応させた場合に、前記塩基配
列ＧＧＡＴＣＣＴＡの上流及び／又は下流に、天然ヒト
Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａの停止コドンＴＡＧを含む領域の相補的塩基配列と同
一、あるいは、多くても３塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有するものである。例えば、２Ｃプライ
マーは、前記停止コドンの下流に好ましくは６塩基の配
列ＡＣＡＴＴＧ、より好ましくは１６塩基の配列ＡＣＡ
ＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡが連結した構造を有する。
これらの塩基配列は、天然ヒトＨＢｃ遺伝子の＋鎖と相
補的な塩基配列である。また、前記塩基配列ＧＧＡＴＣ
ＣＴＡの上流に、好ましくは６塩基の配列ＴＣＣＡＡＧ
を有することもできる。この塩基配列も、天然ヒトＨＢ
ｃ遺伝子の＋鎖と相補的な塩基配列である。更に、停止
コドン上流の前記１６塩基配列に２〜３塩基の置換、欠
失又は挿入がある配列、例えば、ＡＣＡＴＴＴＧＧＡＴ
ＴＣＣＣＧＡであってもよい（下線部が置換）。
ＧＧＡＴＣＣＴＡ内の最後に存在する塩基配列ＣＴＡ
を、天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列における停止コドンＴＡＧの
相補的塩基配列ＣＴＡに対応させた場合に、前記塩基配
列ＧＧＡＴＣＣＴＡの上流及び／又は下流に、天然ヒト
Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａの停止コドンＴＡＧを含む領域の相補的塩基配列と同
一、あるいは、多くても３塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有するものである。例えば、２Ｃプライ
マーは、前記停止コドンの下流に好ましくは６塩基の配
列ＡＣＡＴＴＧ、より好ましくは１６塩基の配列ＡＣＡ
ＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡが連結した構造を有する。
これらの塩基配列は、天然ヒトＨＢｃ遺伝子の＋鎖と相
補的な塩基配列である。また、前記塩基配列ＧＧＡＴＣ
ＣＴＡの上流に、好ましくは６塩基の配列ＴＣＣＡＡＧ
を有することもできる。この塩基配列も、天然ヒトＨＢ
ｃ遺伝子の＋鎖と相補的な塩基配列である。更に、停止
コドン上流の前記１６塩基配列に２〜３塩基の置換、欠
失又は挿入がある配列、例えば、ＡＣＡＴＴＴＧＧＡＴ
ＴＣＣＣＧＡであってもよい（下線部が置換）。
【００１５】本発明の第２の方法で調製する表面タンパ
ク質遺伝子（ＨＢｓ遺伝子）領域は、ＨＢＶＤＮＡ遺伝
子配列の約１５０番目の塩基から約８４０番目の塩基の
間に存在している。本発明の第２の方法の第１工程で
は、このＨＢｓ遺伝子領域のみを選択的に増幅する。こ
れには、前記のとおり、ＰＣＲ法を用いることができ
る。
ク質遺伝子（ＨＢｓ遺伝子）領域は、ＨＢＶＤＮＡ遺伝
子配列の約１５０番目の塩基から約８４０番目の塩基の
間に存在している。本発明の第２の方法の第１工程で
は、このＨＢｓ遺伝子領域のみを選択的に増幅する。こ
れには、前記のとおり、ＰＣＲ法を用いることができ
る。
【００１６】前記１Ｓプライマー（＋鎖用）は、制限酵
素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、しかも
その塩基配列内に開始コドンＡＴＧ（前記塩基配列の下
線部）を有している。この１Ｓプライマーは、前記の制
限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧも含めて、
少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、
より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好ま
しい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異
性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて
困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プラ
イマーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造
にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子
内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、しかも
その塩基配列内に開始コドンＡＴＧ（前記塩基配列の下
線部）を有している。この１Ｓプライマーは、前記の制
限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧも含めて、
少なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、
より好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好ま
しい。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異
性が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて
困難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プラ
イマーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造
にコストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子
内での二重構造をとり易くなり好ましくない。
【００１７】好ましい１Ｓプライマーは、前記認識塩基
配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧを、天然
ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列における開始コドンＡＴＧに対応させ
た場合に、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧの上流及び／
又は下流に、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパ
ク質をコードするＤＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域
の塩基配列と同一、あるいは、多くても３塩基が置換、
欠失又は挿入された塩基配列を有するものである。例え
ば、１Ｓプライマーは、前記開始コドンの下流に天然ヒ
トＨＢｓ遺伝子と同様に、好ましくは１０塩基の配列Ｇ
ＡＧＡＡＣＡＣＡＡ、より好ましくは２０塩基の配列Ｇ
ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴが連結した構
造を有することができる。また、１Ｓプライマーは、前
記制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流に、天然ヒト
ＨＢｓ遺伝子と同様の５塩基の配列ＡＣＣＧＡを有する
こともできる。更に、開始コドン下流の前記２０塩基配
列に２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例え
ば、ＧＡＧＡＡ（又はＧ）ＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＡ
Ｔ（又はＣ）Ｔであってもよい（下線部が置換）。ま
た、前記制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流の５塩
基配列ＡＣＣＧＡの替わりに、ＧＡ（又はＴ）Ａ（又は
Ｔ）ＧＡを連結させてもよい。
配列ＣＣＡＴＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧを、天然
ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列における開始コドンＡＴＧに対応させ
た場合に、前記認識塩基配列ＣＣＡＴＧＧの上流及び／
又は下流に、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパ
ク質をコードするＤＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域
の塩基配列と同一、あるいは、多くても３塩基が置換、
欠失又は挿入された塩基配列を有するものである。例え
ば、１Ｓプライマーは、前記開始コドンの下流に天然ヒ
トＨＢｓ遺伝子と同様に、好ましくは１０塩基の配列Ｇ
ＡＧＡＡＣＡＣＡＡ、より好ましくは２０塩基の配列Ｇ
ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴが連結した構
造を有することができる。また、１Ｓプライマーは、前
記制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流に、天然ヒト
ＨＢｓ遺伝子と同様の５塩基の配列ＡＣＣＧＡを有する
こともできる。更に、開始コドン下流の前記２０塩基配
列に２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例え
ば、ＧＡＧＡＡ（又はＧ）ＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＡ
Ｔ（又はＣ）Ｔであってもよい（下線部が置換）。ま
た、前記制限酵素ＮｃｏＩの認識塩基配列の上流の５塩
基配列ＡＣＣＧＡの替わりに、ＧＡ（又はＴ）Ａ（又は
Ｔ）ＧＡを連結させてもよい。
【００１８】前記の２Ｓプライマー（−鎖用）は、塩基
配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含む。この８塩基の配列の内、
最初の６塩基の配列ＡＡＧＣＴＴは制限酵素ＨｉｎｄII
I の認識塩基配列であり、最後の３塩基の配列ＴＴＡは
停止コドンＴＡＡに相補的な配列である。この２Ｓプラ
イマーも、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含めて、少
なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、よ
り好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好まし
い。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異性
が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて困
難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プライ
マーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造に
コストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子内
での二重構造をとり易くなり好ましくない。
配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含む。この８塩基の配列の内、
最初の６塩基の配列ＡＡＧＣＴＴは制限酵素ＨｉｎｄII
I の認識塩基配列であり、最後の３塩基の配列ＴＴＡは
停止コドンＴＡＡに相補的な配列である。この２Ｓプラ
イマーも、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含めて、少
なくとも２０塩基（好ましくは２０塩基〜４０塩基、よ
り好ましくは２８塩基〜３２塩基）からなるのが好まし
い。２０塩基よりも小さいとプライマーとしての特異性
が低下し、本発明方法の目的を達成することが極めて困
難になる。また、塩基数が大きくなればなる程、プライ
マーとしての特異性は向上するが、プライマーの製造に
コストがかかり、更にプライマー分子間あるいは分子内
での二重構造をとり易くなり好ましくない。
【００１９】好ましい２Ｓプライマーは、前記塩基配列
ＡＡＧＣＴＴＴＡ内の最後に存在する塩基配列ＴＴＡ
を、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列における停止コドンＴＡＡの
相補的塩基配列ＴＡＡに対応させた場合に、前記塩基配
列ＡＡＧＣＴＴＴＡの上流及び／又は下流に、天然ヒト
Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａの停止コドンＴＡＡを含む領域の相補的塩基配列と同
一、あるいは、多くても３塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有するものである。例えば、２Ｓプライ
マーは、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡの上流に好まし
くは６塩基の配列ＴＴＴＡＴＴが連結した構造を有する
ことができる。この塩基配列は、天然ヒトＨＢｃ遺伝子
の＋鎖と相補的な塩基配列である。また、前記塩基配列
ＡＡＧＣＴＴＴＡの下流に、好ましくは６塩基の配列Ａ
ＡＴＧＴＡ、より好ましくは１６塩基の配列ＡＡＴＧＴ
ＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡを有することもできる。これら
の塩基配列も、天然ヒトＨＢｃ遺伝子の＋鎖と相補的な
塩基配列である。更に、停止コドン下流の前記１６塩基
配列に２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例
えば、ＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡであってもよ
い（下線部が置換）。また、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴ
ＴＡの上流の６塩基配列ＴＴＴＡＴＴに替えて、ＴＴＴ
Ｇ（又はＣ）ＴＧを連結させることもできる。
ＡＡＧＣＴＴＴＡ内の最後に存在する塩基配列ＴＴＡ
を、天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列における停止コドンＴＡＡの
相補的塩基配列ＴＡＡに対応させた場合に、前記塩基配
列ＡＡＧＣＴＴＴＡの上流及び／又は下流に、天然ヒト
Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａの停止コドンＴＡＡを含む領域の相補的塩基配列と同
一、あるいは、多くても３塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有するものである。例えば、２Ｓプライ
マーは、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡの上流に好まし
くは６塩基の配列ＴＴＴＡＴＴが連結した構造を有する
ことができる。この塩基配列は、天然ヒトＨＢｃ遺伝子
の＋鎖と相補的な塩基配列である。また、前記塩基配列
ＡＡＧＣＴＴＴＡの下流に、好ましくは６塩基の配列Ａ
ＡＴＧＴＡ、より好ましくは１６塩基の配列ＡＡＴＧＴ
ＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡを有することもできる。これら
の塩基配列も、天然ヒトＨＢｃ遺伝子の＋鎖と相補的な
塩基配列である。更に、停止コドン下流の前記１６塩基
配列に２〜３塩基の置換、欠失又は挿入がある配列、例
えば、ＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡであってもよ
い（下線部が置換）。また、前記塩基配列ＡＡＧＣＴＴ
ＴＡの上流の６塩基配列ＴＴＴＡＴＴに替えて、ＴＴＴ
Ｇ（又はＣ）ＴＧを連結させることもできる。
【００２０】前記の各プライマーについては、＋鎖用の
１Ｃプライマー及び１Ｓプライマー、そして−鎖用の２
Ｃプライマー及び２Ｓプライマーに関して説明したが、
それらの替わりに、それらに対して相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを用いても同様の結果を得る
ことができる。前記の各プライマーは、通常のＤＮＡ自
動合成機を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えば、ホス
ホアミダイト法）によって調製することができる。
１Ｃプライマー及び１Ｓプライマー、そして−鎖用の２
Ｃプライマー及び２Ｓプライマーに関して説明したが、
それらの替わりに、それらに対して相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを用いても同様の結果を得る
ことができる。前記の各プライマーは、通常のＤＮＡ自
動合成機を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えば、ホス
ホアミダイト法）によって調製することができる。
【００２１】次に、本発明の第１の方法の各工程を説明
する。工程１：ＤＮＡの増幅〔図１〕 Ｂ型肝炎ウイルスとしては任意のウイルスを用いること
ができ、例えば、ＨＢｓのサブタイプａｄｒ及びａｄｗ
を用いてもよい。ＨＢウイルスＤＮＡをＰＣＲ装置を用
い約９５℃で熱変性し、更に約６０℃に加熱してアニー
リングし、環状２重鎖ＤＮＡを１重鎖ＤＮＡとする。続
いて、前記の１Ｃプライマー（＋鎖用）及び２Ｃプライ
マー（−鎖用）を添加すると、各プライマーはＨＢｃ抗
原をコードするＤＮＡの領域に特異的に結合する（１Ｃ
プライマーは＋鎖と結合し、２Ｃプライマーは−鎖と結
合する）。次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（例えば、市販のＴａｑポリメラー
ゼ）を添加し、以下のＰＣＲ法増幅サイクルを実施す
る。１サイクルは （ｉ）ＤＮＡの変性工程〔約９０〜９５℃で、約１０秒
〜約２分間〕、 （ii）１本鎖ＤＮＡと１Ｃプライマー及び２Ｃプライマ
ーとのアニーリング工程〔約３７〜７０℃で、約３０秒
〜約３分間〕、及び （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔約
６５〜８０℃で、約３０秒〜約５分間〕 からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、
ｎサイクル後には２n 倍に増幅される。本発明の第１の
方法においては、前記サイクルを１０〜６０回、好まし
くは２０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいて
は、工程（iii ）の加熱時間を約５〜１０分間に延長し
てＤＮＡ合成が完全に行われるようにするのが好まし
い。
する。工程１：ＤＮＡの増幅〔図１〕 Ｂ型肝炎ウイルスとしては任意のウイルスを用いること
ができ、例えば、ＨＢｓのサブタイプａｄｒ及びａｄｗ
を用いてもよい。ＨＢウイルスＤＮＡをＰＣＲ装置を用
い約９５℃で熱変性し、更に約６０℃に加熱してアニー
リングし、環状２重鎖ＤＮＡを１重鎖ＤＮＡとする。続
いて、前記の１Ｃプライマー（＋鎖用）及び２Ｃプライ
マー（−鎖用）を添加すると、各プライマーはＨＢｃ抗
原をコードするＤＮＡの領域に特異的に結合する（１Ｃ
プライマーは＋鎖と結合し、２Ｃプライマーは−鎖と結
合する）。次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（例えば、市販のＴａｑポリメラー
ゼ）を添加し、以下のＰＣＲ法増幅サイクルを実施す
る。１サイクルは （ｉ）ＤＮＡの変性工程〔約９０〜９５℃で、約１０秒
〜約２分間〕、 （ii）１本鎖ＤＮＡと１Ｃプライマー及び２Ｃプライマ
ーとのアニーリング工程〔約３７〜７０℃で、約３０秒
〜約３分間〕、及び （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔約
６５〜８０℃で、約３０秒〜約５分間〕 からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、
ｎサイクル後には２n 倍に増幅される。本発明の第１の
方法においては、前記サイクルを１０〜６０回、好まし
くは２０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいて
は、工程（iii ）の加熱時間を約５〜１０分間に延長し
てＤＮＡ合成が完全に行われるようにするのが好まし
い。
【００２２】次に、クレノーＤＮＡポリメラーゼＩを加
え、両端をブラントエンドして、約６００ｂｐのＤＮＡ
断片の存在の有無をアガロースゲルにて電気泳動を行な
い確認する。
え、両端をブラントエンドして、約６００ｂｐのＤＮＡ
断片の存在の有無をアガロースゲルにて電気泳動を行な
い確認する。
【００２３】工程２：制限酵素による消化〔図２〕 次に、前記工程（１）で得られた反応液に緩衝液を加
え、更に制限酵素ＮｃｏＩを添加し、酵素反応に適切な
温度（例えば２０〜４０℃）にて酵素による消化が充分
行なわれる時間（例えば３０分〜５時間）にわたって酵
素反応を実施する。この処理液中のＤＮＡをフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させて分取
する。この沈澱を緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ
を添加し前記と同様に消化する。
え、更に制限酵素ＮｃｏＩを添加し、酵素反応に適切な
温度（例えば２０〜４０℃）にて酵素による消化が充分
行なわれる時間（例えば３０分〜５時間）にわたって酵
素反応を実施する。この処理液中のＤＮＡをフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させて分取
する。この沈澱を緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ
を添加し前記と同様に消化する。
【００２４】工程３：組換えプラスミドの作成〔図２〕 発現ベクターとしてはプラスミド、大腸菌ファージλ、
酵母、ウイルス等を使用することができるが、好適には
プラスミドを用いる。例えばプラスミドｐＴＶ１１９Ｎ
〔寳酒造〕を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化
し、電気泳動によって大きい方の断片を単離し、前記工
程（２）で得たＤＮＡ断片とリガーゼで結合して組換え
プラスミドを作成する。プラスミドとしてはｐＴｒｃ９
９Ａ（ファルマシア社）を用いることもできる。また、
ウイルス遺伝子を利用した動物細胞発現ベクターとして
はｐＭＳＧ（ファルマシア社）やｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ社）等を用いることができる。この場合
は、前記工程（２）で消化処理したＤＮＡ断片をブラン
トエンドした後、適当なリンカー（例えば５’リン酸化
ＸｈｏＩリンカー又は５’リン酸化ＳａｌＩリンカー）
をＤＮＡの両端に付け、このＤＮＡ断片を更に制限酵素
ＸｈｏＩ又はＳａｌＩで消化した後、同じ制限酵素で消
化した前記ベクターに導入することによって組換えＤＮ
Ａを作成することもできる。
酵母、ウイルス等を使用することができるが、好適には
プラスミドを用いる。例えばプラスミドｐＴＶ１１９Ｎ
〔寳酒造〕を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化
し、電気泳動によって大きい方の断片を単離し、前記工
程（２）で得たＤＮＡ断片とリガーゼで結合して組換え
プラスミドを作成する。プラスミドとしてはｐＴｒｃ９
９Ａ（ファルマシア社）を用いることもできる。また、
ウイルス遺伝子を利用した動物細胞発現ベクターとして
はｐＭＳＧ（ファルマシア社）やｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ社）等を用いることができる。この場合
は、前記工程（２）で消化処理したＤＮＡ断片をブラン
トエンドした後、適当なリンカー（例えば５’リン酸化
ＸｈｏＩリンカー又は５’リン酸化ＳａｌＩリンカー）
をＤＮＡの両端に付け、このＤＮＡ断片を更に制限酵素
ＸｈｏＩ又はＳａｌＩで消化した後、同じ制限酵素で消
化した前記ベクターに導入することによって組換えＤＮ
Ａを作成することもできる。
【００２５】工程４：形質転換〔図２〕 前記工程（３）で得られる組換えＤＮＡを用いて、公知
の手段によって形質転換を行う。即ち、プラスミドベク
ターを用いた場合にはＣａ2+処理した大腸菌に導入す
る。また、λファージベクターを用いた場合には、イン
ビトロパッケージング反応により、組換え体を取り込ん
だλファージ粒子を調製し、これを大腸菌に感染させ
る。更に動物細胞発現ベクターを用いた場合は、例えば
ＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーション法によって導
入し、それぞれを形質転換を行う。
の手段によって形質転換を行う。即ち、プラスミドベク
ターを用いた場合にはＣａ2+処理した大腸菌に導入す
る。また、λファージベクターを用いた場合には、イン
ビトロパッケージング反応により、組換え体を取り込ん
だλファージ粒子を調製し、これを大腸菌に感染させ
る。更に動物細胞発現ベクターを用いた場合は、例えば
ＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーション法によって導
入し、それぞれを形質転換を行う。
【００２６】工程５：タンパク質の発現 前記工程（４）で得られた形質転換細胞をそれぞれ好適
な手段によって培養する。即ち、ＨＢｃ遺伝子をもつ大
腸菌を例えばアンピシリンを含むＬ−ブロス培地に接種
し、３０〜４０℃、好適には３７℃にて、一晩（あるい
は少なくとも３時間程度）培養を行う。続いて誘導物質
（例えばｌａｃプロモーターに作用するＩＰＴＧ）を添
加してＨＢｃタンパク質の発現を行う。更に、少なくと
も３時間程度経過した後でタンパク質分解酵素阻害剤
（例えばＰＭＳＦ）を添加し、培養を続ける。また、動
物細胞発現ベクターを用いた場合は、例えばＧ４１８含
有ＭＥＭ培地で培養し、デキサメタゾンを用いてＨＢｃ
タンパク質の発現を行うこともできる。
な手段によって培養する。即ち、ＨＢｃ遺伝子をもつ大
腸菌を例えばアンピシリンを含むＬ−ブロス培地に接種
し、３０〜４０℃、好適には３７℃にて、一晩（あるい
は少なくとも３時間程度）培養を行う。続いて誘導物質
（例えばｌａｃプロモーターに作用するＩＰＴＧ）を添
加してＨＢｃタンパク質の発現を行う。更に、少なくと
も３時間程度経過した後でタンパク質分解酵素阻害剤
（例えばＰＭＳＦ）を添加し、培養を続ける。また、動
物細胞発現ベクターを用いた場合は、例えばＧ４１８含
有ＭＥＭ培地で培養し、デキサメタゾンを用いてＨＢｃ
タンパク質の発現を行うこともできる。
【００２７】工程６：タンパク質の単離 前記工程（５）で得られた培養液を遠心分離して菌体を
補集し、例えば、界面活性剤を添加して超音波処理を行
うか、あるいはリゾチーム・シュークロース・トリスＨ
Ｃｌを添加した後に凍結─解凍処理することによって、
大腸菌の細胞質分画を得る。得られた分画をカラム（例
えばＤＥＡＥセルロースカラム）で処理して夾雑物を除
去した後、ＨＢｃタンパク質を溶出させ、次にこの溶出
液を抗ＨＢｃ抗体カラムで処理することによってＨＢｃ
タンパク質を精製する。
補集し、例えば、界面活性剤を添加して超音波処理を行
うか、あるいはリゾチーム・シュークロース・トリスＨ
Ｃｌを添加した後に凍結─解凍処理することによって、
大腸菌の細胞質分画を得る。得られた分画をカラム（例
えばＤＥＡＥセルロースカラム）で処理して夾雑物を除
去した後、ＨＢｃタンパク質を溶出させ、次にこの溶出
液を抗ＨＢｃ抗体カラムで処理することによってＨＢｃ
タンパク質を精製する。
【００２８】次に、本発明の第２の方法の各工程につい
て、特に第１の方法と異なる点を中心に説明する。工程１：ＤＮＡの増幅〔図３〕 プライマーとして、前記の１Ｃプライマー及び２Ｃプラ
イマーに替えて、前記の１Ｓプライマー及び２Ｓプライ
マーを使用すること以外は第１の方法と異なる点はな
い。１Ｓプライマー及び２Ｓプライマーは、ＨＢｓ抗原
をコードするＤＮＡの領域に特異的に結合する。この
内、１Ｓプライマーは＋鎖と結合し、２Ｓプライマーは
−鎖と結合する。ＰＣＲ法増幅サイクルを実施し、クレ
ノーＤＮＡポリメラーゼＩを加え、両端をブラントエン
ドして、約７００ｂｐのＤＮＡ断片の存在の有無を１．
２％アガロースゲルにて電気泳動を行い確認する。
て、特に第１の方法と異なる点を中心に説明する。工程１：ＤＮＡの増幅〔図３〕 プライマーとして、前記の１Ｃプライマー及び２Ｃプラ
イマーに替えて、前記の１Ｓプライマー及び２Ｓプライ
マーを使用すること以外は第１の方法と異なる点はな
い。１Ｓプライマー及び２Ｓプライマーは、ＨＢｓ抗原
をコードするＤＮＡの領域に特異的に結合する。この
内、１Ｓプライマーは＋鎖と結合し、２Ｓプライマーは
−鎖と結合する。ＰＣＲ法増幅サイクルを実施し、クレ
ノーＤＮＡポリメラーゼＩを加え、両端をブラントエン
ドして、約７００ｂｐのＤＮＡ断片の存在の有無を１．
２％アガロースゲルにて電気泳動を行い確認する。
【００２９】ＨＢｓ抗原には、４種のサブタイプａｄ
ｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗが存在し、それぞれ塩基
配列が少しづつ異なっている。しかしながら、それらの
変異はいずれも１Ｓプライマーと２Ｓプライマーとの間
に存在するので、１Ｓプライマーと２Ｓプライマーとを
用いて本発明の第２の方法によって製造することができ
る。
ｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗが存在し、それぞれ塩基
配列が少しづつ異なっている。しかしながら、それらの
変異はいずれも１Ｓプライマーと２Ｓプライマーとの間
に存在するので、１Ｓプライマーと２Ｓプライマーとを
用いて本発明の第２の方法によって製造することができ
る。
【００３０】工程２：制限酵素による消化〔図４〕 次に、前記工程（１）で得られた反応液に緩衝液を加
え、更に制限酵素ＮｃｏＩを添加し、酵素反応に適切な
温度（例えば２０〜４０℃）にて酵素による消化が充分
行なわれる時間（例えば３０分〜５時間）にわたって酵
素反応を実施する。この処理液中のＤＮＡをフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ分取す
る。この沈澱を緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII
を添加し前記と同様に消化する。
え、更に制限酵素ＮｃｏＩを添加し、酵素反応に適切な
温度（例えば２０〜４０℃）にて酵素による消化が充分
行なわれる時間（例えば３０分〜５時間）にわたって酵
素反応を実施する。この処理液中のＤＮＡをフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ分取す
る。この沈澱を緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII
を添加し前記と同様に消化する。
【００３１】工程３：組換えプラスミドの作成〔図４〕 発現ベクターとしてはプラスミド、大腸菌ファージλ、
酵母、ウイルス等を使用することができるが、好適には
プラスミドを用いる。例えばプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ
〔寳酒造〕を制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で消化
し、電気泳動によって大きい方の断片を単離し、前記工
程（２）で得たＤＮＡ断片とリガーゼで結合して組換え
プラスミドを作成する。プラスミドとしては、ｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア社）を用いることができる。
酵母、ウイルス等を使用することができるが、好適には
プラスミドを用いる。例えばプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ
〔寳酒造〕を制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で消化
し、電気泳動によって大きい方の断片を単離し、前記工
程（２）で得たＤＮＡ断片とリガーゼで結合して組換え
プラスミドを作成する。プラスミドとしては、ｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア社）を用いることができる。
【００３２】また、ウイルス遺伝子を利用した動物細胞
発現ベクターとしてはｐＭＳＧ（ファルマシア社）やｐ
ＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）等を用いることが
できる。この場合は、前記工程（２）で消化処理したＤ
ＮＡ断片をブラントエンドした後、適当なリンカー（例
えば５’リン酸化ＳａｌＩリンカー）をＤＮＡの両端に
付け、このＤＮＡ断片を更に制限酵素ＳａｌＩで消化し
た後、同じ制限酵素で消化した前記のベクターに導入す
ることによって組換えＤＮＡを作成することもできる。
発現ベクターとしてはｐＭＳＧ（ファルマシア社）やｐ
ＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）等を用いることが
できる。この場合は、前記工程（２）で消化処理したＤ
ＮＡ断片をブラントエンドした後、適当なリンカー（例
えば５’リン酸化ＳａｌＩリンカー）をＤＮＡの両端に
付け、このＤＮＡ断片を更に制限酵素ＳａｌＩで消化し
た後、同じ制限酵素で消化した前記のベクターに導入す
ることによって組換えＤＮＡを作成することもできる。
【００３３】工程４：形質転換〔図４〕 前記の組換えＤＮＡを用いて公知の手段によって形質転
換を行う。即ち、プラスミドベクターを用いた場合には
Ｃａ2+処理した大腸菌に導入する。また、λファージベ
クターを用いた場合には、インビトロパッケージング反
応により組換え体を取り込んだλファージ粒子を調製
し、これを大腸菌に感染させる。更に動物細胞発現ベク
ターを用いた場合は、例えばＣＯＳ−１細胞にエレクト
ロポレーション法によって導入し、それぞれを形質転換
を行う。
換を行う。即ち、プラスミドベクターを用いた場合には
Ｃａ2+処理した大腸菌に導入する。また、λファージベ
クターを用いた場合には、インビトロパッケージング反
応により組換え体を取り込んだλファージ粒子を調製
し、これを大腸菌に感染させる。更に動物細胞発現ベク
ターを用いた場合は、例えばＣＯＳ−１細胞にエレクト
ロポレーション法によって導入し、それぞれを形質転換
を行う。
【００３４】工程５：タンパク質の発現 工程（４）で得られた形質転換細胞をそれぞれ好適な手
段によって培養する。即ち、ＨＢｓ遺伝子をもつ大腸菌
を例えばアンピシリンを含むＬ−ブロス培地に接種し、
３０〜４０℃、好適には３７℃にて、一晩（あるいは少
なくとも３時間程度）培養を行う。そして誘導物資（例
えばｌａｃプロモーターに作用するＩＰＴＧ）を添加し
てＨＢｓタンパク質の発現を行う。そして少なくとも３
時間程度経過した後でタンパク質分解酵素阻害剤（例え
ばＰＭＳＦ）を添加し、培養を続ける。また、動物細胞
発現ベクターを用いた場合は、例えばＧ４１８含有ＭＥ
Ｍ培地で培養し、デキサメタゾンを用いてＨＢタンパク
質の発現を行うこともできる。
段によって培養する。即ち、ＨＢｓ遺伝子をもつ大腸菌
を例えばアンピシリンを含むＬ−ブロス培地に接種し、
３０〜４０℃、好適には３７℃にて、一晩（あるいは少
なくとも３時間程度）培養を行う。そして誘導物資（例
えばｌａｃプロモーターに作用するＩＰＴＧ）を添加し
てＨＢｓタンパク質の発現を行う。そして少なくとも３
時間程度経過した後でタンパク質分解酵素阻害剤（例え
ばＰＭＳＦ）を添加し、培養を続ける。また、動物細胞
発現ベクターを用いた場合は、例えばＧ４１８含有ＭＥ
Ｍ培地で培養し、デキサメタゾンを用いてＨＢタンパク
質の発現を行うこともできる。
【００３５】工程６：タンパク質の単離 工程（５）で得られた培養液を遠心分離して菌体を補集
し、例えば、界面活性剤を添加して超音波処理を行うか
あるいはリゾチーム・シュークロース・トリスＨＣｌを
添加した後に凍結─解凍処理することによって、大腸菌
の細胞質分画を得る。得られた分画をカラム（例えばＤ
ＥＡＥセルロースカラム）で処理して夾雑物を除去した
後、ＨＢｓタンパク質を溶出させ、次に、この溶出液を
抗ＨＢｓ抗体カラムで処理することによってＨＢｓタン
パク質を精製する。
し、例えば、界面活性剤を添加して超音波処理を行うか
あるいはリゾチーム・シュークロース・トリスＨＣｌを
添加した後に凍結─解凍処理することによって、大腸菌
の細胞質分画を得る。得られた分画をカラム（例えばＤ
ＥＡＥセルロースカラム）で処理して夾雑物を除去した
後、ＨＢｓタンパク質を溶出させ、次に、この溶出液を
抗ＨＢｓ抗体カラムで処理することによってＨＢｓタン
パク質を精製する。
【００３６】本発明方法によって得られるＨＢｃタンパ
ク質及びＨＢｓタンパク質は、患者血清中の抗ＨＢｃ抗
体価及び抗ＨＢｓ抗体価を測定するための抗原として用
いることができる。
ク質及びＨＢｓタンパク質は、患者血清中の抗ＨＢｃ抗
体価及び抗ＨＢｓ抗体価を測定するための抗原として用
いることができる。
【００３７】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００３８】実施例１：Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパ
ク質の調製 （１）ヒト血漿試料の調製 ＨＢｓ抗原陽性（ＲＰＨＡ法による）でしかもＨＢｅ抗
原陽性（オクタロニー法による）の肝炎患者の血漿を選
び、ＨＢｓ抗原のサブタイプａｄｒ及びサブタイプａｄ
ｗの各血漿約８０mlを採取した。２０％シュークロース
３０mlに血漿約３０mlをのせ、超遠心分離（日立ＲＰ−
４５、３７０００ｒｐｍ×１６時間）を４℃で行い、デ
ーン粒子のペレットを集めた。このペレットを１０mMト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１５０mM─ＮａＣｌ約５ml
に懸濁し、−８０℃で保存した。この懸濁液１mlにプロ
テイナーゼＫ２００μｇを加え、終濃度０．５％ＳＤ
Ｓ、１０mM─ＥＤＴＡ及び１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で６８℃にて２０時間プロテアーゼ処理を行っ
た後、フェノール抽出を３回繰り返してからエタノール
で沈澱させてＨＢＶＤＮＡを単離した。
ク質の調製 （１）ヒト血漿試料の調製 ＨＢｓ抗原陽性（ＲＰＨＡ法による）でしかもＨＢｅ抗
原陽性（オクタロニー法による）の肝炎患者の血漿を選
び、ＨＢｓ抗原のサブタイプａｄｒ及びサブタイプａｄ
ｗの各血漿約８０mlを採取した。２０％シュークロース
３０mlに血漿約３０mlをのせ、超遠心分離（日立ＲＰ−
４５、３７０００ｒｐｍ×１６時間）を４℃で行い、デ
ーン粒子のペレットを集めた。このペレットを１０mMト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１５０mM─ＮａＣｌ約５ml
に懸濁し、−８０℃で保存した。この懸濁液１mlにプロ
テイナーゼＫ２００μｇを加え、終濃度０．５％ＳＤ
Ｓ、１０mM─ＥＤＴＡ及び１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で６８℃にて２０時間プロテアーゼ処理を行っ
た後、フェノール抽出を３回繰り返してからエタノール
で沈澱させてＨＢＶＤＮＡを単離した。
【００３９】（２）ＨＢｃタンパク質遺伝子の作成 ３８１Ａ型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）を用いて常法により、ＮｃｏＩ認識部位を含
む配列表の配列番号１に記載の配列で表される塩基３０
個からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＢｃ−１と称
する）及びＢａｍＨＩ認識部位を含む配列表の配列番号
２に記載の配列で表される塩基３０個からなるオリゴヌ
クレオチド（以下、ＣＨＢｃ−１と称する）を調製し
た。これらのＨＢｃ−１及びＣＨＢｃ−１をＨＢｃ遺伝
子のプライマーとして用い、前項（１）で単離した２種
のＨＢＶＤＮＡ（ＨＢｓサブタイプａｄｒ及びａｄｗ）
を試料として、９５℃にて１０分間熱処理した後、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ〔寳酒造〕を添加し、酵素反応
（７２℃；３分間）、熱変性（９０℃；１分間）及びア
ニーリング（６０℃；２分間）の各操作をＰＣＲ装置
〔寳酒造〕で３０回繰り返し行った〔図１〕。
テムズ社）を用いて常法により、ＮｃｏＩ認識部位を含
む配列表の配列番号１に記載の配列で表される塩基３０
個からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＢｃ−１と称
する）及びＢａｍＨＩ認識部位を含む配列表の配列番号
２に記載の配列で表される塩基３０個からなるオリゴヌ
クレオチド（以下、ＣＨＢｃ−１と称する）を調製し
た。これらのＨＢｃ−１及びＣＨＢｃ−１をＨＢｃ遺伝
子のプライマーとして用い、前項（１）で単離した２種
のＨＢＶＤＮＡ（ＨＢｓサブタイプａｄｒ及びａｄｗ）
を試料として、９５℃にて１０分間熱処理した後、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ〔寳酒造〕を添加し、酵素反応
（７２℃；３分間）、熱変性（９０℃；１分間）及びア
ニーリング（６０℃；２分間）の各操作をＰＣＲ装置
〔寳酒造〕で３０回繰り返し行った〔図１〕。
【００４０】こうして増幅されたＤＮＡの５’末端を制
限酵素ＮｃｏＩで切断し、３’末端をＢａｍＨＩで切断
した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、
エチジウムブロマイドの存在下にてＵＶランプで検出で
きた約５７０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを切り取り、Ｄ
ＮＡ回収・精製キット（商品名ＤＮＡ ＰＲＥＰ；ダイ
アヤトロン社）を用いてＤＮＡの精製を行った〔図
２〕。
限酵素ＮｃｏＩで切断し、３’末端をＢａｍＨＩで切断
した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、
エチジウムブロマイドの存在下にてＵＶランプで検出で
きた約５７０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを切り取り、Ｄ
ＮＡ回収・精製キット（商品名ＤＮＡ ＰＲＥＰ；ダイ
アヤトロン社）を用いてＤＮＡの精製を行った〔図
２〕。
【００４１】（３）ＨＢｃ遺伝子を含むプラスミドの調
製 市販の発現ベクターｐＴＶ１１９Ｎ（寳酒造）を制限酵
素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで処理して大きい方の断片を
取り、前項（２）で得られた約５７０ｂｐのＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し、組換えプラスミ
ドｐＴＶ１１９・ＨＢｃを得た〔図２〕。
製 市販の発現ベクターｐＴＶ１１９Ｎ（寳酒造）を制限酵
素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで処理して大きい方の断片を
取り、前項（２）で得られた約５７０ｂｐのＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し、組換えプラスミ
ドｐＴＶ１１９・ＨＢｃを得た〔図２〕。
【００４２】（４）プラスミドｐＴＶ１１９・ＨＢｃに
よる大腸菌の形質転換 前項（３）で得られたｐＴＶ１１９・ＨＢｃと市販の大
腸菌ＭＶ１１８４（寳酒造）を５０mMＣａＣｌ2 で処理
し、作成したコンピテント細胞を０℃にて４０分間イン
キュベートし、４２℃で３分間熱処理した後、３７℃で
１時間Ｌ−ブロスにて培養した。この大腸菌をアンピシ
リン（５０μｇ／ml）、０．５mMＩＰＴＧ及び０．００
４％Ｘ−ＧＡＬを含むＬ−ブロス寒天平板培地上にま
き、３７℃で一夜培養を行った。生じたアンピシリン耐
性で透明なコロニーを、各々新たなアンピシリン（１０
０μｇ／ml）を含むＬ−ブロスで３７℃にて一夜培養
し、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで
切断した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行
い、エチジウムブロマイドの存在下でＵＶランプによ
り、約５７０ｂｐのＨＢｃＤＮＡ及び３１００ｂｐのプ
ラスミドベクターの存在を確認した。ここに得られた約
５７０ｂｐのＨＢｃ遺伝子をもつ大腸菌をｐＴＶ１１９
・ＨＢｃ−００１（サブタイプａｄｒ由来ＤＮＡとして
３クローン）及びｐＴＶ１１９・ＨＢｃ−１０１（サブ
タイプａｄｗ由来ＤＮＡとして３クローン）と命名し
た。
よる大腸菌の形質転換 前項（３）で得られたｐＴＶ１１９・ＨＢｃと市販の大
腸菌ＭＶ１１８４（寳酒造）を５０mMＣａＣｌ2 で処理
し、作成したコンピテント細胞を０℃にて４０分間イン
キュベートし、４２℃で３分間熱処理した後、３７℃で
１時間Ｌ−ブロスにて培養した。この大腸菌をアンピシ
リン（５０μｇ／ml）、０．５mMＩＰＴＧ及び０．００
４％Ｘ−ＧＡＬを含むＬ−ブロス寒天平板培地上にま
き、３７℃で一夜培養を行った。生じたアンピシリン耐
性で透明なコロニーを、各々新たなアンピシリン（１０
０μｇ／ml）を含むＬ−ブロスで３７℃にて一夜培養
し、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで
切断した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行
い、エチジウムブロマイドの存在下でＵＶランプによ
り、約５７０ｂｐのＨＢｃＤＮＡ及び３１００ｂｐのプ
ラスミドベクターの存在を確認した。ここに得られた約
５７０ｂｐのＨＢｃ遺伝子をもつ大腸菌をｐＴＶ１１９
・ＨＢｃ−００１（サブタイプａｄｒ由来ＤＮＡとして
３クローン）及びｐＴＶ１１９・ＨＢｃ−１０１（サブ
タイプａｄｗ由来ＤＮＡとして３クローン）と命名し
た。
【００４３】（５）ｐＴＶ１１９・ＨＢｃ遺伝子の大腸
菌でのＨＢｃタンパク質の発現 プラスミドｐＴＶ１１９・ＨＢｃの遺伝子発現は、０．
５mMＩＰＴＧを含むＬ−ブロスを用い、３７℃にて７時
間培養するか又は一夜培養を行い、菌体を、リゾチーム
（１mg／ml）を含む２０％シュークロース／３０mMトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８．０）で０℃にて２０分間処理した
後、菌体に対して更に凍結−解凍処理を３回繰り返し
（前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ）、得られた上清をＨＢｃタンパク質の粗分画と
した。ＨＢｃタンパク質（ａｄｒ由来の３クローン）の
ＲＰＨＡ法による結果を表１に示す。表１において、一
夜培養した場合、クローン１及び２はＨＢｃタンパク質
の産生量は良好であり、クローン３はタンパク質分解酵
素による分解を受け、少なくなっている。また、ａｄｗ
由来の３クローンは、各々７時間及び一夜培養共に２10
〜２11であった。
菌でのＨＢｃタンパク質の発現 プラスミドｐＴＶ１１９・ＨＢｃの遺伝子発現は、０．
５mMＩＰＴＧを含むＬ−ブロスを用い、３７℃にて７時
間培養するか又は一夜培養を行い、菌体を、リゾチーム
（１mg／ml）を含む２０％シュークロース／３０mMトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８．０）で０℃にて２０分間処理した
後、菌体に対して更に凍結−解凍処理を３回繰り返し
（前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ）、得られた上清をＨＢｃタンパク質の粗分画と
した。ＨＢｃタンパク質（ａｄｒ由来の３クローン）の
ＲＰＨＡ法による結果を表１に示す。表１において、一
夜培養した場合、クローン１及び２はＨＢｃタンパク質
の産生量は良好であり、クローン３はタンパク質分解酵
素による分解を受け、少なくなっている。また、ａｄｗ
由来の３クローンは、各々７時間及び一夜培養共に２10
〜２11であった。
【００４４】
【表１】
【００４５】（６）ウェスタンブロットによるＨＢｃタ
ンパク質の確認 前項（５）で得たＨＢｃタンパク質の粗分画を１２．５
％ポリアクリルアミドゲル（０．４％ＳＤＳ存在下）で
電気泳動した後、ブロッテイングバッファー〔２５mMト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２mMグリシン及び２０
％メチルアルコール〕を用いて、ニトロセルロース膜に
転写した（５０Ｖ、７０分）。ニトロセルロース膜を１
０％ＦＣＳを含む１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
１５０mMＮａＣｌでブロッキングした後、第１抗体とし
てマウス抗ＨＢｃモノクロナール抗体（サブクラスＩｇ
Ｍ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｃ．）を用い、第２抗体としてホスファターゼ標識
ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ）抗体を用いた。基質にＢＣＩ
Ｐ（５−ブロモ─４−クロロ─３−インドリルホスフェ
ート）及びＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を用
いて活性染色を行ったところ、４５Ｋｄ（ダイマー）及
び２１Ｋｄ（モノマー）のＨＢｃタンパク質のバンドが
強く染まった。
ンパク質の確認 前項（５）で得たＨＢｃタンパク質の粗分画を１２．５
％ポリアクリルアミドゲル（０．４％ＳＤＳ存在下）で
電気泳動した後、ブロッテイングバッファー〔２５mMト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２mMグリシン及び２０
％メチルアルコール〕を用いて、ニトロセルロース膜に
転写した（５０Ｖ、７０分）。ニトロセルロース膜を１
０％ＦＣＳを含む１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
１５０mMＮａＣｌでブロッキングした後、第１抗体とし
てマウス抗ＨＢｃモノクロナール抗体（サブクラスＩｇ
Ｍ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｃ．）を用い、第２抗体としてホスファターゼ標識
ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ）抗体を用いた。基質にＢＣＩ
Ｐ（５−ブロモ─４−クロロ─３−インドリルホスフェ
ート）及びＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を用
いて活性染色を行ったところ、４５Ｋｄ（ダイマー）及
び２１Ｋｄ（モノマー）のＨＢｃタンパク質のバンドが
強く染まった。
【００４６】（７）ＨＢｃタンパク質の分離及び精製 前項（５）で得たＨＢｃタンパク質の粗分画をＤＥ５２
（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐａｐｅｒ Ｌｔｄ．）カラム
（２．５×１５cm）にかけ、０．５Ｍ−ＮａＣｌで溶出
した。この分画を０．１５Ｍ−ＮａＣｌで透析した後、
抗ＨＢｃ抗体カラム（１×１０cm）にかけ、４Ｍ─Ｍｇ
Ｃｌ2 で溶出し、ＨＢｃタンパク質を精製した。
（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐａｐｅｒ Ｌｔｄ．）カラム
（２．５×１５cm）にかけ、０．５Ｍ−ＮａＣｌで溶出
した。この分画を０．１５Ｍ−ＮａＣｌで透析した後、
抗ＨＢｃ抗体カラム（１×１０cm）にかけ、４Ｍ─Ｍｇ
Ｃｌ2 で溶出し、ＨＢｃタンパク質を精製した。
【００４７】実施例２：Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパ
ク質の調製 （１）血漿試料の調製 前記実施例１（１）に記載した試料と同一の試料を用い
た。
ク質の調製 （１）血漿試料の調製 前記実施例１（１）に記載した試料と同一の試料を用い
た。
【００４８】（２）ＨＢｓ遺伝子の作成 ３８１Ａ型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社）を用いて常法により、ＮｃｏＩ認識部位を含
む配列表の配列番号３に記載の配列で表される塩基３０
個からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＢｓ−１と称
する）及びＨｉｎｄIII 認識部位を含む配列表の配列番
号４に記載の配列で表される塩基３０個からなるオリゴ
ヌクレオチド（以下、ＣＨＢｓ−１と称する）を調製し
た。これらのＨＢｓ−１及びＣＨＢｓ−１をＨＢｓ遺伝
子のプライマーとして用い、前項（１）の２種のＨＢＶ
ＤＮＡ（ＨＢｓサブタイプａｄｒ及びａｄｗ）を試料と
して、実施例１（２）に記載の方法と同様に処理してＰ
ＣＲ法を実施した。
テムズ社）を用いて常法により、ＮｃｏＩ認識部位を含
む配列表の配列番号３に記載の配列で表される塩基３０
個からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＢｓ−１と称
する）及びＨｉｎｄIII 認識部位を含む配列表の配列番
号４に記載の配列で表される塩基３０個からなるオリゴ
ヌクレオチド（以下、ＣＨＢｓ−１と称する）を調製し
た。これらのＨＢｓ−１及びＣＨＢｓ−１をＨＢｓ遺伝
子のプライマーとして用い、前項（１）の２種のＨＢＶ
ＤＮＡ（ＨＢｓサブタイプａｄｒ及びａｄｗ）を試料と
して、実施例１（２）に記載の方法と同様に処理してＰ
ＣＲ法を実施した。
【００４９】こうして増幅されたＤＮＡの５’末端を制
限酵素ＮｃｏＩで切断し、３’末端を制限酵素Ｈｉｎｄ
III で切断した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳
動を行い、エチジウムブロマイドの存在下にてＵＶラン
プで検出できた約６７０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを切
り取り、ＤＮＡ回収・精製キット（商品名ＤＮＡ ＰＲ
ＥＰ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡの精製を行っ
た〔図３〕。
限酵素ＮｃｏＩで切断し、３’末端を制限酵素Ｈｉｎｄ
III で切断した後、１．２％アガロースゲルにて電気泳
動を行い、エチジウムブロマイドの存在下にてＵＶラン
プで検出できた約６７０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを切
り取り、ＤＮＡ回収・精製キット（商品名ＤＮＡ ＰＲ
ＥＰ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡの精製を行っ
た〔図３〕。
【００５０】（３）ＨＢｓ遺伝子を含むプラスミドの調
製 市販の遺伝子発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ（寳酒造）を
制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で処理して大きい方
の断片を取り、前項（２）で得られた約６７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＨＢｓ遺伝子）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て挿入し、組換えプラスミドｐＴＶ１１８・ＨＢｓを得
た〔図４〕。
製 市販の遺伝子発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ（寳酒造）を
制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で処理して大きい方
の断片を取り、前項（２）で得られた約６７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＨＢｓ遺伝子）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て挿入し、組換えプラスミドｐＴＶ１１８・ＨＢｓを得
た〔図４〕。
【００５１】（４）プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ・ＨＢｓ
による大腸菌の形質転換 前項（３）で得られたｐＴＶ１１８Ｎ・ＨＢｓと、Ｌ−
ブロスで３７℃にて一夜培養した大腸菌ＭＶ１１８４
（寳酒造）を５０mMＣａＣ１2 で処理して作製したコン
ピテント細胞を、０℃にて４０分間インキュベートし、
４２℃にて３分間熱処理した後、３７℃にて１時間Ｌ−
ブロスにて培養した。この大腸菌をアンピシリン（５０
μｇ／ml）、０．５mMＩＰＴＧ及び０．００４％Ｘ−Ｇ
ＡＬを含むＬ−ブロス寒天平板培地上にまき、３７℃で
一夜培養を行った。生じたアンピシリン耐性で透明なコ
ロニーを、各々新たなアンピシリン（１００μｇ／ml）
を含むＬ−ブロスで３７℃にて一夜培養し、アルカリ溶
菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した（前記のＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。このＤ
ＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で切断した
後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、エチ
ジウムブロマイドの存在下でＵＶランプにより、約６７
０ｂｐのＨＢｓＤＮＡ及び３１００ｂｐのプラスミドベ
クターの存在を確認した。ここに得られた約６７０ｂｐ
のＨＢｓ遺伝子をもつ大腸菌をｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−
００１（サブタイプａｄｒ由来ＤＮＡとして１６クロー
ン）及びｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−１０１（サブタイプａ
ｄｗ由来ＤＮＡとして１２クローン）と名付けた。
による大腸菌の形質転換 前項（３）で得られたｐＴＶ１１８Ｎ・ＨＢｓと、Ｌ−
ブロスで３７℃にて一夜培養した大腸菌ＭＶ１１８４
（寳酒造）を５０mMＣａＣ１2 で処理して作製したコン
ピテント細胞を、０℃にて４０分間インキュベートし、
４２℃にて３分間熱処理した後、３７℃にて１時間Ｌ−
ブロスにて培養した。この大腸菌をアンピシリン（５０
μｇ／ml）、０．５mMＩＰＴＧ及び０．００４％Ｘ−Ｇ
ＡＬを含むＬ−ブロス寒天平板培地上にまき、３７℃で
一夜培養を行った。生じたアンピシリン耐性で透明なコ
ロニーを、各々新たなアンピシリン（１００μｇ／ml）
を含むＬ−ブロスで３７℃にて一夜培養し、アルカリ溶
菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した（前記のＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。このＤ
ＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で切断した
後、１．２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、エチ
ジウムブロマイドの存在下でＵＶランプにより、約６７
０ｂｐのＨＢｓＤＮＡ及び３１００ｂｐのプラスミドベ
クターの存在を確認した。ここに得られた約６７０ｂｐ
のＨＢｓ遺伝子をもつ大腸菌をｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−
００１（サブタイプａｄｒ由来ＤＮＡとして１６クロー
ン）及びｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−１０１（サブタイプａ
ｄｗ由来ＤＮＡとして１２クローン）と名付けた。
【００５２】（５）ｐＴＶ１１８・ＨＢｓ遺伝子の大腸
菌でのＨＢｓタンパク質の発現 プラスミドｐＴＶ１１８・ＨＢｓの発現は、前記実施例
１（５）に記載の方法と同一の条件で行った。ＨＢｓタ
ンパク質の確認にはＨＢｓ抗原キット（ウエルカム・ダ
イアグノステイック・ジャパン）を用いＲＰＨＡ法によ
り行った。しかし、ｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−００１及び
ｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−１０１のクローンはともにＨＢ
ｓ抗原タンパク量の産生が少なく２0 〜２2 であった。
菌でのＨＢｓタンパク質の発現 プラスミドｐＴＶ１１８・ＨＢｓの発現は、前記実施例
１（５）に記載の方法と同一の条件で行った。ＨＢｓタ
ンパク質の確認にはＨＢｓ抗原キット（ウエルカム・ダ
イアグノステイック・ジャパン）を用いＲＰＨＡ法によ
り行った。しかし、ｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−００１及び
ｐＴＶ１１８・ＨＢｓ−１０１のクローンはともにＨＢ
ｓ抗原タンパク量の産生が少なく２0 〜２2 であった。
【００５３】
【発明の効果】本発明方法によってＢ型肝炎ウイルスの
コア構造タンパク質又は表面構造タンパク質を製造する
と、大量の血漿を用いる必要がなく、開始コドンの直前
から停止コドンの直後までからなる挿入用ＤＮＡ断片を
得ることができ、しかもＨＢｓ抗原のサブタイプによる
差異や変異による切断部位の消失にも適応可能である。
コア構造タンパク質又は表面構造タンパク質を製造する
と、大量の血漿を用いる必要がなく、開始コドンの直前
から停止コドンの直後までからなる挿入用ＤＮＡ断片を
得ることができ、しかもＨＢｓ抗原のサブタイプによる
差異や変異による切断部位の消失にも適応可能である。
【００５４】
【配列表】
【００５５】配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列：TTTGGGCCAT GGACATTGAC CCGTATAAAG
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列：TCCAAGGGAT CCTAACATTG AGATTCCCGA
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列：ACCGACCATG GAGAACACAA CATCAGGATT
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列：TTTATTAAGC TTTAAATGTA TACCCAAAGA
【図１】ＨＢｃ遺伝子の作成工程を示す説明図である。
【図２】プラスミドｐＴＶ１１９・ＨＢｃの作成工程を
示す説明図である。
示す説明図である。
【図３】ＨＢｓ遺伝子の作成工程を示す説明図である。
【図４】プラスミドｐＴＶ１１８・ＨＢｓの作成工程を
示す説明図である。
示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩
基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎
ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列における開始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒ
トＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤ
ＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域に特異的に結合する
ことのできる塩基配列又はその相補的塩基配列を有する
第１のＤＮＡプライマーと、 （ｂ）塩基配列ＧＧＡＴＣＣＴＡを含み、その塩基配列
の最後に存在する塩基配列ＣＴＡが、天然ヒトＢ型肝炎
ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列における停止コドンＴＡＧに相補的な塩基配列ＣＴ
Ａに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルスコア構造
タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＧを含
む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又はそ
の相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマーと、 （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、 （ｄ）Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡと を含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型肝炎ウイ
ルスコア構造タンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化して、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を複製
可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルスコア構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスコア
構造タンパク質の製造方法。 - 【請求項２】 （１）（ａ）制限酵素ＮｃｏＩの認識塩
基配列ＣＣＡＴＧＧを含み、前記認識塩基配列ＣＣＡＴ
ＧＧ内に存在する塩基配列ＡＴＧが、天然ヒトＢ型肝炎
ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列における開始コドンＡＴＧに対応して、前記天然ヒ
トＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤ
ＮＡの開始コドンＡＴＧを含む領域に特異的に結合する
ことのできる塩基配列又はその相補的塩基配列を有する
第１のＤＮＡプライマーと、 （ｂ）塩基配列ＡＡＧＣＴＴＴＡを含み、その塩基配列
の最後に存在する塩基配列ＴＴＡが、天然ヒトＢ型肝炎
ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列における停止コドンＴＡＡに相補的な塩基配列ＴＴ
Ａに対応して、前記天然ヒトＢ型肝炎ウイルス表面構造
タンパク質をコードするＤＮＡの停止コドンＴＡＡを含
む領域に特異的に結合することのできる塩基配列又はそ
の相補的塩基配列を有する第２のＤＮＡプライマーと、 （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと、 （ｄ）Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡと を含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけて、Ｂ型肝炎ウイ
ルス表面構造タンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、 （２）Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードす
る増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII で消化して、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化Ｄ
ＮＡ断片を生成し、 （３）そのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII 消化ＤＮＡ断片を複
製可能な発現ベクターに連結して、組換えＤＮＡを形成
し、 （４）その組換えＤＮＡで微生物又は細胞を形質転換
し、 （５）得られた形質転換体を培養して前記形質転換体に
Ｂ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質をコードするＤＮ
Ａを発現させてＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質を
産生させ、 （６）産生させたＢ型肝炎ウイルス表面構造タンパク質
を形質転換体から単離する 各工程を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面
構造タンパク質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26536091A JP3305342B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26536091A JP3305342B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576382A true JPH0576382A (ja) | 1993-03-30 |
| JP3305342B2 JP3305342B2 (ja) | 2002-07-22 |
Family
ID=17416099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26536091A Expired - Lifetime JP3305342B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3305342B2 (ja) |
-
1991
- 1991-09-17 JP JP26536091A patent/JP3305342B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3305342B2 (ja) | 2002-07-22 |
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