JPH0576393A - 酵母活性の測定法 - Google Patents
酵母活性の測定法Info
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- JPH0576393A JPH0576393A JP24794791A JP24794791A JPH0576393A JP H0576393 A JPH0576393 A JP H0576393A JP 24794791 A JP24794791 A JP 24794791A JP 24794791 A JP24794791 A JP 24794791A JP H0576393 A JPH0576393 A JP H0576393A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酵母細胞の活性を短時間かつ正確に把握する
こと。 【構成】 酵母細胞を低ｐＨ環境下に所定時間置いてか
ら、酵母細胞内ｐＨを測定し、その値が当該酵母細胞の
活性と相関していることを利用して、酵母細胞の活性を
判定する。 【効果】 簡便な操作で、上記の目的が達成される。
こと。 【構成】 酵母細胞を低ｐＨ環境下に所定時間置いてか
ら、酵母細胞内ｐＨを測定し、その値が当該酵母細胞の
活性と相関していることを利用して、酵母細胞の活性を
判定する。 【効果】 簡便な操作で、上記の目的が達成される。
Description
【０００１】〔発明の背景〕
【産業上の利用分野】本発明は、酵母の細胞内ｐＨを測
定することによって、酵母の活性、たとえば増殖力また
は発酵力、あるいは生死ないし生菌率、を容易かつ簡便
に測定して、当該酵母の活性を判定する方法に関する。
酵母の活性を短時間に知ることは、発酵産業での工程管
理あるいは製品の品質管理などにおいて望ましいことで
ある。
定することによって、酵母の活性、たとえば増殖力また
は発酵力、あるいは生死ないし生菌率、を容易かつ簡便
に測定して、当該酵母の活性を判定する方法に関する。
酵母の活性を短時間に知ることは、発酵産業での工程管
理あるいは製品の品質管理などにおいて望ましいことで
ある。
【０００２】
【従来の技術】従来、微生物の増殖力の測定には、微生
物を実際に培養してその増殖能力を知る方法（プレート
カルチャー法、スライドカルチャー法等）がある。この
方法は、寒天培地に実際にコロニーを形成させて、その
数より現実の増殖能力を知るものであるから、最も信頼
のおける方法である。しかし、培養が必要であるという
ことは結果が得られるまでに約１〜６日が必要であり、
迅速に測定結果を得られないという欠点がある。
物を実際に培養してその増殖能力を知る方法（プレート
カルチャー法、スライドカルチャー法等）がある。この
方法は、寒天培地に実際にコロニーを形成させて、その
数より現実の増殖能力を知るものであるから、最も信頼
のおける方法である。しかし、培養が必要であるという
ことは結果が得られるまでに約１〜６日が必要であり、
迅速に測定結果を得られないという欠点がある。
【０００３】一方、この他にメチレンブルーやフルオレ
セイン誘導体等による染色法が知られている。この方法
は、酵母の生菌と死菌とでは生菌のみが細胞内にとりこ
んだメチレンブルーを無色化すること、あるいはフルオ
レセインのエステル誘導体（無蛍光であることがふつう
である）を酵母に取り込ませると、生細胞であれば酵母
中のエステラーゼによってこれが分解されてフルオレセ
インが再生されて蛍光を発生すること、を利用したもの
であって、染色後に顕微鏡下で染色細胞を計数するだけ
の簡便な方法である。しかしながら、得られる測定結果
は、その細胞の増殖力とは必ずしも一致しない。
セイン誘導体等による染色法が知られている。この方法
は、酵母の生菌と死菌とでは生菌のみが細胞内にとりこ
んだメチレンブルーを無色化すること、あるいはフルオ
レセインのエステル誘導体（無蛍光であることがふつう
である）を酵母に取り込ませると、生細胞であれば酵母
中のエステラーゼによってこれが分解されてフルオレセ
インが再生されて蛍光を発生すること、を利用したもの
であって、染色後に顕微鏡下で染色細胞を計数するだけ
の簡便な方法である。しかしながら、得られる測定結果
は、その細胞の増殖力とは必ずしも一致しない。
【０００４】〔発明の概要〕
【発明が解決しようとする課題】このように従来技術に
は、長時間を要したり、また短時間で結果が得られる
が、増殖力とは必ずしも一致しないことがあったりする
という解決すべき技術課題があった。本発明は、できる
だけ短時間にしかもその細胞の活性、たとえば増殖力、
発酵力等、を把握しようとする新しい方法を提供しよう
とするものである。
は、長時間を要したり、また短時間で結果が得られる
が、増殖力とは必ずしも一致しないことがあったりする
という解決すべき技術課題があった。本発明は、できる
だけ短時間にしかもその細胞の活性、たとえば増殖力、
発酵力等、を把握しようとする新しい方法を提供しよう
とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、酵母細胞を低
ｐＨ環境の溶液に一定時間放置後の細胞内ｐＨを測定す
ることにより、その細胞の活性、具体的には増殖力、発
酵力、あるいは生菌率、を把握することができるとの発
見に基くものである。
ｐＨ環境の溶液に一定時間放置後の細胞内ｐＨを測定す
ることにより、その細胞の活性、具体的には増殖力、発
酵力、あるいは生菌率、を把握することができるとの発
見に基くものである。
【０００６】＜要旨＞すなわち、本発明による酵母活性
の測定法は、下記の工程からなること、を特徴とするも
のである。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。
の測定法は、下記の工程からなること、を特徴とするも
のである。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。
【０００７】この工程(2) の他の態様に関して、本発明
による酵母活性の測定法は、下記の工程からなること、
を特徴とするものである。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。
による酵母活性の測定法は、下記の工程からなること、
を特徴とするものである。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。
【０００８】本発明によるもう一つの酵母活性の測定法
は、下記の工程からなること、を特徴とするものであ
る。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。
は、下記の工程からなること、を特徴とするものであ
る。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。
【０００９】この工程(4) の他の態様に関して、本発明
による酵母活性の測定法は、下記の工程からなることを
特徴とするものである。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。
による酵母活性の測定法は、下記の工程からなることを
特徴とするものである。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。
【００１０】＜効果＞本発明は染色法の範疇に入るもの
であるところ、本発明によれば、酵母を低ｐＨ環境下に
所定時間置くことによって、先ず、対象酵母の個々の細
胞の活性の差が増幅され、しかも「所定時間」は通常数
時間までであるので、染色法に生得的な短時間での測定
という効果を享受することができる。
であるところ、本発明によれば、酵母を低ｐＨ環境下に
所定時間置くことによって、先ず、対象酵母の個々の細
胞の活性の差が増幅され、しかも「所定時間」は通常数
時間までであるので、染色法に生得的な短時間での測定
という効果を享受することができる。
【００１１】酵母を低ｐＨ環境下に置いてから測定した
細胞内ｐＨが酵母細胞の活性と相関があるということは
本発明者らがはじめて見出した現象であると思料される
ところであるが、この現象は酵母細胞のＨポンプ作用に
基因するものと推定される（ただし、そのような推定に
よって、本発明は何の制約をも受けるものではない）。
すなわち、活性の高い酵母細胞はＨポンプ作用が強く
て、環境が低ｐＨとなっても細胞内ｐＨを原ｐＨに維持
する能力が大きい。それに対して、活性の低い細胞は原
細胞内ｐＨ値を維持することが弱いので、所定時間経過
後の細胞内ｐＨは原ｐＨ値より低いあるレベルにまで低
下する。
細胞内ｐＨが酵母細胞の活性と相関があるということは
本発明者らがはじめて見出した現象であると思料される
ところであるが、この現象は酵母細胞のＨポンプ作用に
基因するものと推定される（ただし、そのような推定に
よって、本発明は何の制約をも受けるものではない）。
すなわち、活性の高い酵母細胞はＨポンプ作用が強く
て、環境が低ｐＨとなっても細胞内ｐＨを原ｐＨに維持
する能力が大きい。それに対して、活性の低い細胞は原
細胞内ｐＨ値を維持することが弱いので、所定時間経過
後の細胞内ｐＨは原ｐＨ値より低いあるレベルにまで低
下する。
【００１２】従って、活性の旺盛な酵母細胞とこれが劣
る酵母細胞とでは低ｐＨ環境下で所定時間経過後は細胞
内ｐＨに有意な差が生じ、それをそのままあるいは酵母
細胞内に取り込ませたｐＨ感受性の蛍光物質の発光によ
って検出すれば、高感度かつ短時間に所与の酵母の活性
を把握することができる。
る酵母細胞とでは低ｐＨ環境下で所定時間経過後は細胞
内ｐＨに有意な差が生じ、それをそのままあるいは酵母
細胞内に取り込ませたｐＨ感受性の蛍光物質の発光によ
って検出すれば、高感度かつ短時間に所与の酵母の活性
を把握することができる。
【００１３】酵母の活性を簡便な方法によって把握する
ことができるので、本発明は酵母利用のたとえば食品産
業において発酵に関する製品の品質管理、工程管理等に
裨益するところが大きい。
ことができるので、本発明は酵母利用のたとえば食品産
業において発酵に関する製品の品質管理、工程管理等に
裨益するところが大きい。
【００１４】〔発明の具体的説明〕 ＜酵母＞本発明によって活性を測定する酵母は、分類上
酵母の範疇に入るものがいずれも対象となる。それらの
うちで代表的なものは、ビール酵母、パン酵母、ワイン
酵母、清酒酵母、アルコール酵母等であって、微生物学
的にはサッカロマイセス（Saccharomyces)に属するもの
である。これらの酵母にはたとえば醸造業者が使用目的
に応じて育種したものも包含されるが、そのような「変
異種」も本発明の対象とするものとする。
酵母の範疇に入るものがいずれも対象となる。それらの
うちで代表的なものは、ビール酵母、パン酵母、ワイン
酵母、清酒酵母、アルコール酵母等であって、微生物学
的にはサッカロマイセス（Saccharomyces)に属するもの
である。これらの酵母にはたとえば醸造業者が使用目的
に応じて育種したものも包含されるが、そのような「変
異種」も本発明の対象とするものとする。
【００１５】＜低ｐＨ環境＞本発明による酵母細胞内ｐ
Ｈの測定は、酵母細胞を低ｐＨ環境下に所定時間置いて
から行なう。本発明でいう低ｐＨ環境とは、ｐＨ６以
下、好ましくは５以下、の条件を意味する。ｐＨ値の下
限は特にないが、好ましくはｐＨ２〜３程度、である。
Ｈの測定は、酵母細胞を低ｐＨ環境下に所定時間置いて
から行なう。本発明でいう低ｐＨ環境とは、ｐＨ６以
下、好ましくは５以下、の条件を意味する。ｐＨ値の下
限は特にないが、好ましくはｐＨ２〜３程度、である。
【００１６】このような低ｐＨ環境は、酵母の水性懸濁
液に無機酸または有機酸を添加することによって容易に
実現することができる。また、所定ｐＨ値を維持するた
めには、緩衝剤、具体的には酸性緩衝剤、を使用するこ
とがふつうである。
液に無機酸または有機酸を添加することによって容易に
実現することができる。また、所定ｐＨ値を維持するた
めには、緩衝剤、具体的には酸性緩衝剤、を使用するこ
とがふつうである。
【００１７】酵母細胞をこのような低ｐＨ環境下に置く
時間は、機能的にいえば酵母細胞内ｐＨが実質的に変化
しなくなるまでの時間、が好ましい。一方、定量的にい
えば、これは１分以上、好ましくは３０分以上、であ
り、２００分を越えることはほとんどない。好ましい時
間は５〜１００分、特に好ましい時間は３０〜１００
分、である。この低ｐＨ環境の温度は、酵母細胞のｐＨ
維持能力（前記の推定機作によれば、Ｈポンプ能力）が
働く温度であるべきことはいうまでもない。これは、一
般に、酵母の代謝休止温度より低くなく、一方酵母が死
滅するほど高温でない温度であるが、好ましい温度はマ
イナス数度〜常温である。
時間は、機能的にいえば酵母細胞内ｐＨが実質的に変化
しなくなるまでの時間、が好ましい。一方、定量的にい
えば、これは１分以上、好ましくは３０分以上、であ
り、２００分を越えることはほとんどない。好ましい時
間は５〜１００分、特に好ましい時間は３０〜１００
分、である。この低ｐＨ環境の温度は、酵母細胞のｐＨ
維持能力（前記の推定機作によれば、Ｈポンプ能力）が
働く温度であるべきことはいうまでもない。これは、一
般に、酵母の代謝休止温度より低くなく、一方酵母が死
滅するほど高温でない温度であるが、好ましい温度はマ
イナス数度〜常温である。
【００１８】＜細胞内のｐＨの測定（その一）＞このよ
うな低ｐＨ環境下に所定時間置かれた酵母細胞の細胞内
ｐＨは、合目的的な任意の方法ないし手段によって測定
することができる。一般に細胞内ｐＨの測定は公知であ
って、具体的には、たとえば、生命の科学３９（５）：
３８６−３９７（１９８８）に示されており、本発明に
おいても適当なものを選んで使用することができる。
うな低ｐＨ環境下に所定時間置かれた酵母細胞の細胞内
ｐＨは、合目的的な任意の方法ないし手段によって測定
することができる。一般に細胞内ｐＨの測定は公知であ
って、具体的には、たとえば、生命の科学３９（５）：
３８６−３９７（１９８８）に示されており、本発明に
おいても適当なものを選んで使用することができる。
【００１９】そのような細胞内ｐＨの測定法の一つは、
弱酸・塩基の分配を用いる方法（J.Clin.Invest.38:720
-729(1959)）であって、具体的にはたとえばＤＭＯ
（５，５‐ジメチル‐２，４‐オキサゾリジンジオン）
を細胞懸濁液に添加し、平衡化後、細胞内外のＤＭＯ濃
度を測定して、その分配度から細胞内ｐＨを算出するこ
とからなるものである。
弱酸・塩基の分配を用いる方法（J.Clin.Invest.38:720
-729(1959)）であって、具体的にはたとえばＤＭＯ
（５，５‐ジメチル‐２，４‐オキサゾリジンジオン）
を細胞懸濁液に添加し、平衡化後、細胞内外のＤＭＯ濃
度を測定して、その分配度から細胞内ｐＨを算出するこ
とからなるものである。
【００２０】酵母細胞内ｐＨの測定法の他の一つは、無
機リン酸のケミカルシフトが細胞内ｐＨによって変化す
ることを利用したものであって（J. Biol. Chem. 248:7
276(1973))、細胞をそのままＮＭＲ分析にかけ、その無
機リン酸のケミカルシフトを測定することによって、細
胞内ｐＨを測定することからなるものである。
機リン酸のケミカルシフトが細胞内ｐＨによって変化す
ることを利用したものであって（J. Biol. Chem. 248:7
276(1973))、細胞をそのままＮＭＲ分析にかけ、その無
機リン酸のケミカルシフトを測定することによって、細
胞内ｐＨを測定することからなるものである。
【００２１】＜細胞内のｐＨの測定（その二）＞酵母細
胞内のｐＨ測定法の他の、そして本発明の好ましい、方
法は、酵母細胞にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ、
細胞内ｐＨに対応して発生する蛍光を測定することから
なるものである。
胞内のｐＨ測定法の他の、そして本発明の好ましい、方
法は、酵母細胞にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ、
細胞内ｐＨに対応して発生する蛍光を測定することから
なるものである。
【００２２】ｐＨ感受性の蛍光物質、すなわち、それが
置かれたｐＨ条件に対応して蛍光発色に差を生じる蛍光
物質、は周知であって、酵母細胞に取込ませることがで
きるものはいずれも本発明において使用することができ
る。
置かれたｐＨ条件に対応して蛍光発色に差を生じる蛍光
物質、は周知であって、酵母細胞に取込ませることがで
きるものはいずれも本発明において使用することができ
る。
【００２３】ｐＨ感受性蛍光物質を酵母細胞内に取り込
ませるには、合目的的な任意の方法ないし手段によるこ
とができる。一般に、酵母細胞をその水性懸濁液中でた
とえば常温でｐＨ感受性蛍光物質と所定時間（たとえば
数秒〜６０分間）接触させればよい。もっとも、ｐＨ感
受性蛍光物質は具体的には下記のようなものであるが、
これらはそのままでは上記のように酵母細胞と接触させ
ても合理的な時間内に必要量が取り込まれないことが多
い。そのような蛍光物質にはイオン性の基、たとえばフ
ェノール性水酸基あるいはカルボキシル基を持つものが
多いので、それをエステル（たとえば、低級カルボン酸
たとえば酢酸あるいは低級アルコールたとえばメタノー
ル、とのエステル）の形にすれば、容易に酵母細胞に取
り込まれるようになる。
ませるには、合目的的な任意の方法ないし手段によるこ
とができる。一般に、酵母細胞をその水性懸濁液中でた
とえば常温でｐＨ感受性蛍光物質と所定時間（たとえば
数秒〜６０分間）接触させればよい。もっとも、ｐＨ感
受性蛍光物質は具体的には下記のようなものであるが、
これらはそのままでは上記のように酵母細胞と接触させ
ても合理的な時間内に必要量が取り込まれないことが多
い。そのような蛍光物質にはイオン性の基、たとえばフ
ェノール性水酸基あるいはカルボキシル基を持つものが
多いので、それをエステル（たとえば、低級カルボン酸
たとえば酢酸あるいは低級アルコールたとえばメタノー
ル、とのエステル）の形にすれば、容易に酵母細胞に取
り込まれるようになる。
【００２４】本発明で使用するのに適当なｐＨ感受性蛍
光物質の具体例をいくつか示せば、フルオレセインおよ
びその誘導体、クエン１（quene 1)およびその誘導体、
１，４‐ジヒドロキシ‐フタロニトリルおよびその誘導
体、ウンベリフェロンおよびその誘導体、ヒドロキシピ
レンおよびその誘導体、５‐ジメチルアミノナフタレン
‐１‐スルホネート（ダンシル）発色基、カルボキシ‐
セミナフトロダフルオル（carboxy-seminaphthorhodafl
uor)（カルボキシＳＮＡＲＦ）、カルボキシ‐セミナフ
トフルオレセイン（カルボキシＳＮＡＦＬ）、その他が
ある（そのさらなる詳細は、たとえば、生命の科学３９
（５）：３８６−３８９（１９８８）の図１参照）。こ
れらを酵母細胞に取り込ませるときの現実の姿がそのエ
ステル誘導体であることがふつうであることは前記した
ところである。本発明で代表的なｐＨ感受性蛍光物質
は、たとえば、５（６）‐カルボキシフルオレセインジ
アセテートや２´，７´‐ビス（カルボキシエチル）‐
５（６）‐カルボキシフルオレセイン・テトラアセトオ
キシメチルエステルである。
光物質の具体例をいくつか示せば、フルオレセインおよ
びその誘導体、クエン１（quene 1)およびその誘導体、
１，４‐ジヒドロキシ‐フタロニトリルおよびその誘導
体、ウンベリフェロンおよびその誘導体、ヒドロキシピ
レンおよびその誘導体、５‐ジメチルアミノナフタレン
‐１‐スルホネート（ダンシル）発色基、カルボキシ‐
セミナフトロダフルオル（carboxy-seminaphthorhodafl
uor)（カルボキシＳＮＡＲＦ）、カルボキシ‐セミナフ
トフルオレセイン（カルボキシＳＮＡＦＬ）、その他が
ある（そのさらなる詳細は、たとえば、生命の科学３９
（５）：３８６−３８９（１９８８）の図１参照）。こ
れらを酵母細胞に取り込ませるときの現実の姿がそのエ
ステル誘導体であることがふつうであることは前記した
ところである。本発明で代表的なｐＨ感受性蛍光物質
は、たとえば、５（６）‐カルボキシフルオレセインジ
アセテートや２´，７´‐ビス（カルボキシエチル）‐
５（６）‐カルボキシフルオレセイン・テトラアセトオ
キシメチルエステルである。
【００２５】エステル誘導体として酵母細胞内に取り込
まれたｐＨ感受性蛍光物質は、細胞内のエステラーゼが
作用してエステル構造が破壊されてイオン形の蛍光物質
が再生される。イオン形の蛍光物質は酵母細胞に取り込
まれ難かったことと同様に細胞外へも排出され難いの
で、細胞内に蓄積される。このように酵母細胞内に取り
込まれたｐＨ感受性蛍光物質は、それに励起光を照射す
ると、所与の細胞内ｐＨ値に応じた蛍光を発する。
まれたｐＨ感受性蛍光物質は、細胞内のエステラーゼが
作用してエステル構造が破壊されてイオン形の蛍光物質
が再生される。イオン形の蛍光物質は酵母細胞に取り込
まれ難かったことと同様に細胞外へも排出され難いの
で、細胞内に蓄積される。このように酵母細胞内に取り
込まれたｐＨ感受性蛍光物質は、それに励起光を照射す
ると、所与の細胞内ｐＨ値に応じた蛍光を発する。
【００２６】所定の励起波長によって発生する蛍光を所
定波長において測定して得た蛍光強度と当該ｐＨ感受性
蛍光物質が置かれているｐＨ条件との関係を予め求めて
検量線を作製しておき、当該励起光により酵母細胞が発
生する蛍光の強度を測定して、酵母細胞内ｐＨを知るこ
とができる。
定波長において測定して得た蛍光強度と当該ｐＨ感受性
蛍光物質が置かれているｐＨ条件との関係を予め求めて
検量線を作製しておき、当該励起光により酵母細胞が発
生する蛍光の強度を測定して、酵母細胞内ｐＨを知るこ
とができる。
【００２７】しかし、所与の酵母細胞標品であっても、
個々の細胞によってｐＨ感受性蛍光物質の取り込み量が
異なることがあり、励起光照射によって発生する蛍光の
強度は取り込まれたｐＨ感受性物質の細胞内賦存量ない
し濃度によって左右されるので、測定された蛍光強度の
絶対値では正確なそのｐＨ依存性を表示できないことが
ある。従って、１種の蛍光強度すなわち蛍光強度の絶対
値ではなくて、２種の蛍光強度の比を採用して、蛍光物
質の細胞内濃度の影響を消去することが好ましい。
個々の細胞によってｐＨ感受性蛍光物質の取り込み量が
異なることがあり、励起光照射によって発生する蛍光の
強度は取り込まれたｐＨ感受性物質の細胞内賦存量ない
し濃度によって左右されるので、測定された蛍光強度の
絶対値では正確なそのｐＨ依存性を表示できないことが
ある。従って、１種の蛍光強度すなわち蛍光強度の絶対
値ではなくて、２種の蛍光強度の比を採用して、蛍光物
質の細胞内濃度の影響を消去することが好ましい。
【００２８】そのような２種の蛍光強度の一具体例は、
波長の異なる２種の励起光を使用し、所定の波長での蛍
光強度をそれぞれ測定して得たものであって、具体的に
は、たとえば５（６）‐カルボキシフルオレセインジア
セテートの場合は励起波長が４４１nmおよび４８８nm、
蛍光測定波長が５１８nmという条件で得られる２種の蛍
光強度がある。蛍光物質の細胞内濃度の影響を消去する
ための２種の蛍光強度の他の具体例の一つは、１種の励
起光を使用し、所定の２種の波長で蛍光を測定して得た
ものであって、具体的には、たとえば、カルボキシ‐Ｓ
ＮＡＲＦの場合は励起波長が５３４nm、蛍光測定波長が
６０４nmおよび６３４nmという条件で得られる２種の蛍
光強度がある。
波長の異なる２種の励起光を使用し、所定の波長での蛍
光強度をそれぞれ測定して得たものであって、具体的に
は、たとえば５（６）‐カルボキシフルオレセインジア
セテートの場合は励起波長が４４１nmおよび４８８nm、
蛍光測定波長が５１８nmという条件で得られる２種の蛍
光強度がある。蛍光物質の細胞内濃度の影響を消去する
ための２種の蛍光強度の他の具体例の一つは、１種の励
起光を使用し、所定の２種の波長で蛍光を測定して得た
ものであって、具体的には、たとえば、カルボキシ‐Ｓ
ＮＡＲＦの場合は励起波長が５３４nm、蛍光測定波長が
６０４nmおよび６３４nmという条件で得られる２種の蛍
光強度がある。
【００２９】いずれの方式によるとしても、得られる２
種の蛍光強度の比を、当該ｐＨ感受性物質の関数として
検量線を作製すればよい。蛍光強度の測定は、細胞懸濁
液蛍光光度計で行なってもよいし( Biochemistry18:221
0-2218(1979) ）、スライドグラスにその細胞を載置し
て、蛍光顕微鏡下で測光、測定してもよい（Nature 32
5:447-450(1987)）。
種の蛍光強度の比を、当該ｐＨ感受性物質の関数として
検量線を作製すればよい。蛍光強度の測定は、細胞懸濁
液蛍光光度計で行なってもよいし( Biochemistry18:221
0-2218(1979) ）、スライドグラスにその細胞を載置し
て、蛍光顕微鏡下で測光、測定してもよい（Nature 32
5:447-450(1987)）。
【００３０】本発明で使用することができる細胞内ｐＨ
測定装置の一具体例としては、特開平３−２４４４２号
公報（特願平１−１５８７０８号）記載のものを挙げる
ことができる。
測定装置の一具体例としては、特開平３−２４４４２号
公報（特願平１−１５８７０８号）記載のものを挙げる
ことができる。
【００３１】本発明による方法は、酵母個々の細胞内ｐ
Ｈを測定する場合にも、酵母標品すなわち一定集団の平
均的な細胞内ｐＨ値を測定するためにも、利用すること
ができる。前者の場合は、酵母細胞個々の蛍光発光状況
を調べることになるが、そのような場合は画像処理もし
くはフローサイトメトリーの技法によるのが便利であ
る。前記の特開平３−２４４４２号公報は、画像処理の
一例についても必要な情報を開示するものてある。
Ｈを測定する場合にも、酵母標品すなわち一定集団の平
均的な細胞内ｐＨ値を測定するためにも、利用すること
ができる。前者の場合は、酵母細胞個々の蛍光発光状況
を調べることになるが、そのような場合は画像処理もし
くはフローサイトメトリーの技法によるのが便利であ
る。前記の特開平３−２４４４２号公報は、画像処理の
一例についても必要な情報を開示するものてある。
【００３２】＜酵母活性の判定＞このようにして測定さ
れた酵母細胞内ｐＨが当該酵母細胞の活性と相関がある
ことは後記の実験事実の明らかにするところであって、
細胞内ｐＨ値が大きい酵母ほど活性が旺盛である。従っ
て、対象とする酵母に対して、予め細胞内ｐＨ値と酵母
活性についての情報を用意しておけば、細胞内ｐＨ値か
ら当該酵母の活性を把握することができる。
れた酵母細胞内ｐＨが当該酵母細胞の活性と相関がある
ことは後記の実験事実の明らかにするところであって、
細胞内ｐＨ値が大きい酵母ほど活性が旺盛である。従っ
て、対象とする酵母に対して、予め細胞内ｐＨ値と酵母
活性についての情報を用意しておけば、細胞内ｐＨ値か
ら当該酵母の活性を把握することができる。
【００３３】本発明による方法が、上記のような酵母標
品についての平均的な細胞内ｐＨ値だけでなくて、酵母
個々の細胞内ｐＨを測定するのにも有用であることは前
記したところであるが、所与の酵母試料について個々の
細胞の活性を測定すれば、当該試料、ひいてはその酵母
集団である酵母標品、の細胞活性の分布を知ることがで
きる。
品についての平均的な細胞内ｐＨ値だけでなくて、酵母
個々の細胞内ｐＨを測定するのにも有用であることは前
記したところであるが、所与の酵母試料について個々の
細胞の活性を測定すれば、当該試料、ひいてはその酵母
集団である酵母標品、の細胞活性の分布を知ることがで
きる。
【００３４】
＜実施例１＞ビール酵母を麦汁で定常期迄培養した（８
℃）。その細胞を水洗後、２℃下で無菌的に水中保存し
た。保存日数を変えることにより、生菌率の異なった細
胞集団を取得した。各酵母の生菌率を麦芽寒天培地を用
いたプレートカルチャー法で求めた。一方、細胞内ｐＨ
の測定は以下のように行なった。酵母を約２ml分取し、
ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．２、５０mM ２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸、ＮａＣｌ １１０mM、ＫＣ
ｌ ５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、終濃度１mM５
（６）‐カルボキシフルオレセインジアセテートを添加
して０℃に３０分放置した。その後、ｐＨ３のクエン酸
／リン酸バッファ（５０mM、ＮａＣｌ１１０mM、ＫＣｌ
５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、同バッファに懸
濁させた。０℃で９０分後、蛍光光度計（島津製作所製
分光蛍光光度計「ＲＦ−５０００」）で２励起波長
（４４１nmおよび４８８nm）に対する蛍光（５１８nm）
強度を測定した。その蛍光強度の比をとり、予め作製し
た検量線より細胞内ｐＨ（細胞集団としてのｐＨ）を求
めた。
℃）。その細胞を水洗後、２℃下で無菌的に水中保存し
た。保存日数を変えることにより、生菌率の異なった細
胞集団を取得した。各酵母の生菌率を麦芽寒天培地を用
いたプレートカルチャー法で求めた。一方、細胞内ｐＨ
の測定は以下のように行なった。酵母を約２ml分取し、
ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．２、５０mM ２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸、ＮａＣｌ １１０mM、ＫＣ
ｌ ５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、終濃度１mM５
（６）‐カルボキシフルオレセインジアセテートを添加
して０℃に３０分放置した。その後、ｐＨ３のクエン酸
／リン酸バッファ（５０mM、ＮａＣｌ１１０mM、ＫＣｌ
５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、同バッファに懸
濁させた。０℃で９０分後、蛍光光度計（島津製作所製
分光蛍光光度計「ＲＦ−５０００」）で２励起波長
（４４１nmおよび４８８nm）に対する蛍光（５１８nm）
強度を測定した。その蛍光強度の比をとり、予め作製し
た検量線より細胞内ｐＨ（細胞集団としてのｐＨ）を求
めた。
【００３５】結果は、図１に示す通りであった。図１の
結果から明らかなように、細胞内ｐＨ値と生菌率（プレ
ートカルチャー法で得たもの）との間に相関がある。な
お、ここで用いた検量線は、下表のデータをプロットし
て作製したものである。
結果から明らかなように、細胞内ｐＨ値と生菌率（プレ
ートカルチャー法で得たもの）との間に相関がある。な
お、ここで用いた検量線は、下表のデータをプロットし
て作製したものである。
【００３６】 ｐＨ 5.99 5.78 5.58 5.37 5.27 5.16 4.95 I488 ｌｎ 1.641 1.430 1.194 1.051 0.867 0.770 0.519 I441 また、上で用いたのと同一の酵母を同様にＭＥＳバッフ
ァに懸濁させ、終濃度１mM５（６）‐カルボキシフルオ
レセインジアセテートを添加、懸濁後室温で２０分イン
キュベートした。その懸濁液を蛍光顕微鏡（Ｂ励起）で
観察し、染色されたものを生細胞、染色されていないも
のを死細胞として、生菌率を計測した。その結果は、図
２に示す通りであった。
ァに懸濁させ、終濃度１mM５（６）‐カルボキシフルオ
レセインジアセテートを添加、懸濁後室温で２０分イン
キュベートした。その懸濁液を蛍光顕微鏡（Ｂ励起）で
観察し、染色されたものを生細胞、染色されていないも
のを死細胞として、生菌率を計測した。その結果は、図
２に示す通りであった。
【００３７】＜実施例２＞パン酵母を、２％ペプトン、
１％酵母エキス、２％グルコースを含む培地で定常期迄
培養し（２５℃）、水洗後、２℃、８℃、２０℃および
２５℃で無菌的に保存して、生菌率の異なる酵母を取得
した。実施例１と同様の実験を行なった。結果は、図３
に示す通りであった。
１％酵母エキス、２％グルコースを含む培地で定常期迄
培養し（２５℃）、水洗後、２℃、８℃、２０℃および
２５℃で無菌的に保存して、生菌率の異なる酵母を取得
した。実施例１と同様の実験を行なった。結果は、図３
に示す通りであった。
【００３８】＜実施例３＞ビール酵母を麦汁で定常期迄
培養し（８℃）、水洗後その細胞を無菌的に保存し（４
℃）、保存日数を変えることで発酵能の異なった種々の
酵母を取得した。それら酵母の細胞内ｐＨと麦汁発酵力
（８℃）との関係を求めた。結果は、図４に示す通りで
あった。
培養し（８℃）、水洗後その細胞を無菌的に保存し（４
℃）、保存日数を変えることで発酵能の異なった種々の
酵母を取得した。それら酵母の細胞内ｐＨと麦汁発酵力
（８℃）との関係を求めた。結果は、図４に示す通りで
あった。
【００３９】この実験は、酵母をエイジングするとその
酵母の発酵力は低下していくが、それを細胞内ｐＨによ
って正確にとらえているか否かをみたものである。図４
の結果から、酵母の発酵力は細胞内ｐＨ値によって正確
にとらえられていることがわかる。
酵母の発酵力は低下していくが、それを細胞内ｐＨによ
って正確にとらえているか否かをみたものである。図４
の結果から、酵母の発酵力は細胞内ｐＨ値によって正確
にとらえられていることがわかる。
【００４０】＜実施例４＞ビール酵母を麦汁で定常期迄
培養した（８℃）。その細胞を水洗後、２℃下で無菌的
に水中保存した。保存日数を変えることにより、酵母活
性（具体的には、増殖能、発酵能）の異なった細胞集団
を取得した。各酵母の細胞内ｐＨの測定は、酵母細胞を
ｐＨ３のクエン酸／リン酸バッファに懸濁させるところ
を、下記のバッファに懸濁させることを除き、実施例１
と同様に行なった。
培養した（８℃）。その細胞を水洗後、２℃下で無菌的
に水中保存した。保存日数を変えることにより、酵母活
性（具体的には、増殖能、発酵能）の異なった細胞集団
を取得した。各酵母の細胞内ｐＨの測定は、酵母細胞を
ｐＨ３のクエン酸／リン酸バッファに懸濁させるところ
を、下記のバッファに懸濁させることを除き、実施例１
と同様に行なった。
【００４１】バッファー pH6.66、50mM Mops 、110mMNaCl 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH6.20、50mM MES、110mMNaCl 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH5.60、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH5.30、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH4.60、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH4.00、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH3.40、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH3.00、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 結果は、図５に示す通りであった。
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH5.30、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH4.60、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH4.00、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH3.40、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 pH3.00、50Mmクエン酸‐リン酸２ナトリウム、110mMNaC
l 、5mMKCl、 1mMMgCl2 結果は、図５に示す通りであった。
【００４２】＜実施例５＞ビール酵母を麦汁で定常期ま
で培養した（８℃）。水洗後、２℃下で無菌的に水中保
存した細胞を実験に供した。細胞をｐＨ３のクエン酸／
リン酸バッファ（５０mM、ＮａＣｌ １１０mM、ＫＣｌ
５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、同バッファに懸
濁させ、終濃度５μＭの５（６）‐カルボキシフルオレ
セインジアセテートを添加し、室温に３０分放置後、２
℃／９０分間微攪拌下で放置した。３％グルコース、
０．６７％イーストナイトロジェンベース（Difco)、１
％カラギーナン（Sigma TypeII）培地とこの細胞を混合
し、ヘマチトメータを用いてスライドカルチャーを行な
った。速やかに、蛍光顕微鏡画像処理装置を用いて、個
々の細胞の細胞内ｐＨと細胞の位置を測定した。その
後、２０℃でインキュベートした。１６時間後、細胞内
ｐＨを測定した細胞の増殖後の細胞数を数えた。結果
は、図６に示す通りであった。
で培養した（８℃）。水洗後、２℃下で無菌的に水中保
存した細胞を実験に供した。細胞をｐＨ３のクエン酸／
リン酸バッファ（５０mM、ＮａＣｌ １１０mM、ＫＣｌ
５mM、ＭｇＣｌ２ １mM）で洗浄後、同バッファに懸
濁させ、終濃度５μＭの５（６）‐カルボキシフルオレ
セインジアセテートを添加し、室温に３０分放置後、２
℃／９０分間微攪拌下で放置した。３％グルコース、
０．６７％イーストナイトロジェンベース（Difco)、１
％カラギーナン（Sigma TypeII）培地とこの細胞を混合
し、ヘマチトメータを用いてスライドカルチャーを行な
った。速やかに、蛍光顕微鏡画像処理装置を用いて、個
々の細胞の細胞内ｐＨと細胞の位置を測定した。その
後、２０℃でインキュベートした。１６時間後、細胞内
ｐＨを測定した細胞の増殖後の細胞数を数えた。結果
は、図６に示す通りであった。
【００４３】
【発明の効果】酵母細胞を低ｐＨ環境下に所定時間置い
たときの細胞内ｐＨを測定することによって短時間にか
つ正確に当該酵母細胞の活性、すなわち増殖力、発酵
力、生菌率等を把握することができることは、「課題を
解決するための手段」の項において前記したところであ
る。
たときの細胞内ｐＨを測定することによって短時間にか
つ正確に当該酵母細胞の活性、すなわち増殖力、発酵
力、生菌率等を把握することができることは、「課題を
解決するための手段」の項において前記したところであ
る。
【図１】ビール酵母細胞内ｐＨ値と生菌率との関係を示
すグラフ。
すグラフ。
【図２】ビール酵母の蛍光法による生菌率とプレートカ
ルチャー法による生菌率との関係を示すグラフ。
ルチャー法による生菌率との関係を示すグラフ。
【図３】パン酵母細胞内ｐＨ値と生菌率との関係を示す
グラフ。
グラフ。
【図４】ビール酵母の細胞内ｐＨ値と発酵力との関係を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図５】ビール酵母細胞を各種細胞外ｐＨ条件下におい
たときの、細胞内ｐＨ値の対応を示すグラフ。
たときの、細胞内ｐＨ値の対応を示すグラフ。
【図６】ビール酵母を低ｐＨ環境下に所定時間置いてか
ら培養したときの、各細胞内ｐＨ毎の所定培養時間後の
細胞数を示すグラフ。
ら培養したときの、各細胞内ｐＨ毎の所定培養時間後の
細胞数を示すグラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年７月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】この工程（２）の他の態様に関して、本発
明による酵母活性の測定法は、下記の工程からなるこ
と、を特徴とするものである。 （１） 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定
時間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 （２） 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母固有の細胞内
ｐＨ値との差が小さい酵母ほど活性が高いものと判定す
る。 ここで「当該酵母固有の細胞内ｐＨ値」とは、当該酵母
が固有の活性、換言すれば劣化していない活性、すなわ
ち高い活性、を保持している場合に、工程（１）で用い
られた低ｐＨ環境下で示す細胞内ｐＨ値をいう。
明による酵母活性の測定法は、下記の工程からなるこ
と、を特徴とするものである。 （１） 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定
時間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 （２） 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母固有の細胞内
ｐＨ値との差が小さい酵母ほど活性が高いものと判定す
る。 ここで「当該酵母固有の細胞内ｐＨ値」とは、当該酵母
が固有の活性、換言すれば劣化していない活性、すなわ
ち高い活性、を保持している場合に、工程（１）で用い
られた低ｐＨ環境下で示す細胞内ｐＨ値をいう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】この工程（４）の他の態様に関して、本発
明による酵母活性の測定法は、下記の工程からなること
を特徴とするものである。 （１） 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ま
せる工程。 （２） 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低
ｐＨ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光
を照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定す
る。 （３） 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比
に対応した細胞内ｐＨ値を求める。 （４） 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母固有の細胞内
ｐＨ値との差が小さい酵母ほど活性が高いものと判定す
る。 ここで「当該酵母固有の細胞内ｐＨ値」とは、当該酵母
が固有の活性、換言すれば劣化していない活性、すなわ
ち高い活性、を保持している場合に、工程（１）で用い
られた低ｐＨ環境下で示す細胞内ｐＨ値をいう。
明による酵母活性の測定法は、下記の工程からなること
を特徴とするものである。 （１） 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ま
せる工程。 （２） 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低
ｐＨ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光
を照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定す
る。 （３） 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比
に対応した細胞内ｐＨ値を求める。 （４） 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母固有の細胞内
ｐＨ値との差が小さい酵母ほど活性が高いものと判定す
る。 ここで「当該酵母固有の細胞内ｐＨ値」とは、当該酵母
が固有の活性、換言すれば劣化していない活性、すなわ
ち高い活性、を保持している場合に、工程（１）で用い
られた低ｐＨ環境下で示す細胞内ｐＨ値をいう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】酵母を低ｐＨ環境下に置いてから測定した
細胞内ｐＨが酵母細胞の活性と相関があるということは
本発明者らがはじめて見出した現象であると思料される
ところであるが、この現象は酵母細胞のＨポンプ作用に
起因するものと推定される（ただし、そのような推定に
よって、本発明は何の制約をも受けるものではない）。
すなわち、活性の高い酵母細胞はＨポンプ作用が強く
て、環境が低ｐＨとなっても細胞内ｐＨを原ｐＨに維持
する能力が大きい。それに対して、活性の低い細胞は原
細胞内ｐＨ値を維持することが弱いので、所定時間経過
後の細胞内ｐＨは原ｐＨ値より低いあるレベルにまで低
下する。
細胞内ｐＨが酵母細胞の活性と相関があるということは
本発明者らがはじめて見出した現象であると思料される
ところであるが、この現象は酵母細胞のＨポンプ作用に
起因するものと推定される（ただし、そのような推定に
よって、本発明は何の制約をも受けるものではない）。
すなわち、活性の高い酵母細胞はＨポンプ作用が強く
て、環境が低ｐＨとなっても細胞内ｐＨを原ｐＨに維持
する能力が大きい。それに対して、活性の低い細胞は原
細胞内ｐＨ値を維持することが弱いので、所定時間経過
後の細胞内ｐＨは原ｐＨ値より低いあるレベルにまで低
下する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】＜酵母活性の判定＞このようにして測定さ
れた酵母細胞内ｐＨが当該酵母細胞の活性と相関がある
ことは後記の実験事実の明らかにするところであって、
細胞内ｐＨ値が大きい酵母ほど活性が旺盛である。従っ
て、対象とする酵母に対して、予め細胞内ｐＨ値と酵母
活性についての情報を用意しておけば、細胞内ｐＨ値か
ら当該酵母の活性を把握することができる。より具体的
には、測定した細胞内ｐＨ値を当該酵母固有の細胞内ｐ
Ｈ値と比較し、その差が小さいものほど活性が高いと判
定することができる。ここで、酵母活性の判定の際に用
いる当該酵母固有の細胞内ｐＨ値とは、固有の活性を持
つ、換言すれば活性が劣化していない、すなわち活性が
高い状態の、当該酵母を活性測定に用いる低ｐＨ環境下
に所定時間置いた場合に得られる細胞内ｐＨ値である。
この値は酵母の種類および用いる低ｐＨ値ごとに異なる
が、通常は５．５〜６．５強度である。このような判定
法を用いれば、たとえば酵母を産業上の目的で発酵等に
利用する場合において、本発明による酵母活性測定を実
施し、当該酵母固有の細胞ｐＨ値と測定された値との差
がある一定値以上になったときはその酵母を使用しない
ことにより、常に活性の高い酵母のみを利用することが
できる。酵母を発酵等に利用する場合のこのような対象
酵母の活性の把握は、当該酵母固有の細胞内ｐＨ値との
差による代りに、測定された細胞内ｐＨ値そのものによ
って、すなわち測定された細胞内ｐＨ値が所定のレベル
より大きいか否かによって、行なうことができることは
いうまでもない。
れた酵母細胞内ｐＨが当該酵母細胞の活性と相関がある
ことは後記の実験事実の明らかにするところであって、
細胞内ｐＨ値が大きい酵母ほど活性が旺盛である。従っ
て、対象とする酵母に対して、予め細胞内ｐＨ値と酵母
活性についての情報を用意しておけば、細胞内ｐＨ値か
ら当該酵母の活性を把握することができる。より具体的
には、測定した細胞内ｐＨ値を当該酵母固有の細胞内ｐ
Ｈ値と比較し、その差が小さいものほど活性が高いと判
定することができる。ここで、酵母活性の判定の際に用
いる当該酵母固有の細胞内ｐＨ値とは、固有の活性を持
つ、換言すれば活性が劣化していない、すなわち活性が
高い状態の、当該酵母を活性測定に用いる低ｐＨ環境下
に所定時間置いた場合に得られる細胞内ｐＨ値である。
この値は酵母の種類および用いる低ｐＨ値ごとに異なる
が、通常は５．５〜６．５強度である。このような判定
法を用いれば、たとえば酵母を産業上の目的で発酵等に
利用する場合において、本発明による酵母活性測定を実
施し、当該酵母固有の細胞ｐＨ値と測定された値との差
がある一定値以上になったときはその酵母を使用しない
ことにより、常に活性の高い酵母のみを利用することが
できる。酵母を発酵等に利用する場合のこのような対象
酵母の活性の把握は、当該酵母固有の細胞内ｐＨ値との
差による代りに、測定された細胞内ｐＨ値そのものによ
って、すなわち測定された細胞内ｐＨ値が所定のレベル
より大きいか否かによって、行なうことができることは
いうまでもない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】＜実施例３＞ビール酵母を麦汁で定常期ま
で培養し（８℃）、水洗後その細胞を無菌的に保存し
（４℃）、保存日数を変えることで発酵能の異なった種
々の酵母を取得した。それら酵母の細胞内ｐＨと麦汁発
酵力（８℃）との関係を求めた。酵母懸濁液を吸引濾過
して酵母を圧搾し、１１°Ｐに調製したホップ添加麦汁
に添加（０．３５％（湿重量／ｖ））して充分に通気し
たのち、８℃で静置発酵させた。経時的に発酵液の一部
を採取し、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ．７）でろ過した
後、振動式密度計によりろ液のエキス分（糖度）を測定
した。発酵開始から３日間のエキスの消費量を求めて酵
母の発酵能とした。結果は図４に示す通りであった。
で培養し（８℃）、水洗後その細胞を無菌的に保存し
（４℃）、保存日数を変えることで発酵能の異なった種
々の酵母を取得した。それら酵母の細胞内ｐＨと麦汁発
酵力（８℃）との関係を求めた。酵母懸濁液を吸引濾過
して酵母を圧搾し、１１°Ｐに調製したホップ添加麦汁
に添加（０．３５％（湿重量／ｖ））して充分に通気し
たのち、８℃で静置発酵させた。経時的に発酵液の一部
を採取し、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ．７）でろ過した
後、振動式密度計によりろ液のエキス分（糖度）を測定
した。発酵開始から３日間のエキスの消費量を求めて酵
母の発酵能とした。結果は図４に示す通りであった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】バッファー ｐＨ６．６６、５０ｍＭ Ｍｏｐｓ、１１０ｍＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ６．２０、５０ｍＭ ＭＥＳ、１１０ｍＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ５．６０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ５．３０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ４．６０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ ｐＨ４．００、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａｃｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ３．４０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ３．００、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ 結果は、図５に示す通りであった。
ｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ６．２０、５０ｍＭ ＭＥＳ、１１０ｍＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ５．６０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ５．３０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ４．６０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ ｐＨ４．００、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａｃｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ３．４０、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ ｐＨ３．００、５０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウ
ム、１１０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ２ 結果は、図５に示す通りであった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】＜実施例５＞ビール酵母を麦汁で定常期ま
で培養した（８℃）。水洗後、２℃下で無菌的に水中保
存した細胞を実験に供した。細胞をｐＨ３のクエン酸／
リン酸バッファ（５０ｍＭ、ＮａＣｌ １１０ｍＭ、Ｋ
Ｃｌ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ）で洗浄後、同バッ
ファに懸濁させ、終濃度５μＭの５（６）−カルボキシ
フルオレセインジアセテートを添加し、室温に３０分放
置後、２℃／９０分間微攪拌下で放置した。３％グルコ
ース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（Ｄｉ
ｆｃｏ）、１％カラギーナン（Ｓｉｇｍａ ＴｙｐｅＩ
Ｉ）培地とこの細胞を混合し、ヘマチトメータを用いて
スライドカルチャーを行なった。速やかに、蛍光顕微鏡
画像処理装置を用いて、個々の細胞の細胞内ｐＨと細胞
の位置を測定した。その後、２０℃でインキュベートし
た。１６時間後、細胞内ｐＨを測定した細胞の増殖後の
細胞数を数えた。結果は、図６に示す通りであった。 ＜実施例６＞＜実施例１＞の方法をさらに簡略化し、よ
り迅速に酵母の活性を測定する方法を検討した。ビール
酵母を麦汁で定常期まで培養した（８℃）。水洗後、２
℃下で無菌的に水中保存した細胞を実験に供した。細胞
をｐＨ３、クエン酸／リン酸バッファー（５０ｍＭ、Ｎ
ａＣｌ １１０ｍＭ，ＫＣｌ ５ｍＭ，ＭｇＣｌ２ １
ｍＭ）で洗浄後、同バッファーに懸濁、終濃度１ｍＭの
５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートを添
加し、０℃に１５分、３０分または６０分放置した。そ
の後、螢光光度計で２励起波長（４４１，４８８ｎｍ）
に対する蛍光（５１８ｎｍ）強度を測定した。その蛍光
強度の比をとり、予め作製したキャリブレーションカー
ブよりｐＨを求めた。また、同一の酵母に対して＜実施
例１＞と同様の方法で分析を行った。分析値の変動を見
るために同一の酵母（Ａ〜Ｃ）での各々の分析法に対し
て５回実施した。結果を表１、２および３に示した。こ
の簡略法によっても、＜実施例１＞の方法による場合と
同等の結果が再現性よく得られることがわかる。
で培養した（８℃）。水洗後、２℃下で無菌的に水中保
存した細胞を実験に供した。細胞をｐＨ３のクエン酸／
リン酸バッファ（５０ｍＭ、ＮａＣｌ １１０ｍＭ、Ｋ
Ｃｌ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ）で洗浄後、同バッ
ファに懸濁させ、終濃度５μＭの５（６）−カルボキシ
フルオレセインジアセテートを添加し、室温に３０分放
置後、２℃／９０分間微攪拌下で放置した。３％グルコ
ース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（Ｄｉ
ｆｃｏ）、１％カラギーナン（Ｓｉｇｍａ ＴｙｐｅＩ
Ｉ）培地とこの細胞を混合し、ヘマチトメータを用いて
スライドカルチャーを行なった。速やかに、蛍光顕微鏡
画像処理装置を用いて、個々の細胞の細胞内ｐＨと細胞
の位置を測定した。その後、２０℃でインキュベートし
た。１６時間後、細胞内ｐＨを測定した細胞の増殖後の
細胞数を数えた。結果は、図６に示す通りであった。 ＜実施例６＞＜実施例１＞の方法をさらに簡略化し、よ
り迅速に酵母の活性を測定する方法を検討した。ビール
酵母を麦汁で定常期まで培養した（８℃）。水洗後、２
℃下で無菌的に水中保存した細胞を実験に供した。細胞
をｐＨ３、クエン酸／リン酸バッファー（５０ｍＭ、Ｎ
ａＣｌ １１０ｍＭ，ＫＣｌ ５ｍＭ，ＭｇＣｌ２ １
ｍＭ）で洗浄後、同バッファーに懸濁、終濃度１ｍＭの
５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートを添
加し、０℃に１５分、３０分または６０分放置した。そ
の後、螢光光度計で２励起波長（４４１，４８８ｎｍ）
に対する蛍光（５１８ｎｍ）強度を測定した。その蛍光
強度の比をとり、予め作製したキャリブレーションカー
ブよりｐＨを求めた。また、同一の酵母に対して＜実施
例１＞と同様の方法で分析を行った。分析値の変動を見
るために同一の酵母（Ａ〜Ｃ）での各々の分析法に対し
て５回実施した。結果を表１、２および３に示した。こ
の簡略法によっても、＜実施例１＞の方法による場合と
同等の結果が再現性よく得られることがわかる。
Claims (12)
- 【請求項１】下記の工程からなることを特徴とする、酵
母活性の測定法。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。 - 【請求項２】下記の工程からなることを特徴とする、酵
母活性の測定法。 (1) 酵母をｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時
間経過後に酵母細胞内ｐＨを測定する。 (2) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。 - 【請求項３】低ｐＨ環境が、ｐＨ５以下の環境である、
請求項１または２に記載の酵母活性の測定法。 - 【請求項４】酵母活性が、酵母の増殖力または発酵力で
ある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母活性の
測定法。 - 【請求項５】酵母活性が、酵母の生菌率である、請求項
１〜３のいずれか１項に記載の酵母活性の測定法。 - 【請求項６】測定した酵母細胞内ｐＨ値が、個々の酵母
細胞内ｐＨ測定値である、請求項１〜５のいずれか１項
に記載の酵母活性の測定法。 - 【請求項７】測定した酵母細胞内ｐＨ値が、酵母集団の
平均測定値である、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の酵母活性の測定法。 - 【請求項８】下記の工程からなることを特徴とする、酵
母活性の測定法。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値の高い酵母をそれの低い酵
母よりも活性が高いものと判定する。 - 【請求項９】下記の工程からなることを特徴とする、酵
母活性の測定法。 (1) 酵母細胞内にｐＨ感受性の蛍光物質を取り込ませ
る工程。 (2) 蛍光物質を取り込ませた酵母をｐＨ６以下の低ｐ
Ｈ環境下に置き、所定時間経過後に酵母細胞に励起光を
照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度を測定する。 (3) 予め作成した検量線により、測定蛍光強度の比に
対応した細胞内ｐＨ値を求める。 (4) 得られた細胞内ｐＨ値と当該酵母個有の細胞内ｐ
Ｈ値との差の小さい酵母をその差の大きい酵母よりも活
性が大きいものと判定する。 - 【請求項１０】２種の蛍光強度が、波長の異なる２種の
励起光によって発生した蛍光のうち所定波長での蛍光強
度である、請求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１１】２種の蛍光強度が、１種の励起光によっ
て発生した蛍光のうち、２種の所定波長での蛍光強度で
ある、請求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１２】ｐＨ感受性蛍光物質がフェノール性水酸
基および（または）カルボキシル基を有するものであ
り、この官能基を低級カルボン酸および（または）低級
アルコールでエステル化した状態で酵母細胞に取り込ま
せ、酵母細胞内で当該ｐＨ感受性蛍光物質を発生させ
る、請求項８〜１１項のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24794791A JPH07108235B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 酵母活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24794791A JPH07108235B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 酵母活性の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576393A true JPH0576393A (ja) | 1993-03-30 |
| JPH07108235B2 JPH07108235B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=17170917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24794791A Expired - Lifetime JPH07108235B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 酵母活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108235B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006238771A (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-14 | Sapporo Breweries Ltd | フローサイトメトリー解析による微生物細胞活性の評価方法 |
| JP2009153395A (ja) * | 2007-12-25 | 2009-07-16 | Kirin Brewery Co Ltd | 微生物細胞の生理状態評価方法 |
-
1991
- 1991-09-26 JP JP24794791A patent/JPH07108235B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006238771A (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-14 | Sapporo Breweries Ltd | フローサイトメトリー解析による微生物細胞活性の評価方法 |
| JP2009153395A (ja) * | 2007-12-25 | 2009-07-16 | Kirin Brewery Co Ltd | 微生物細胞の生理状態評価方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108235B2 (ja) | 1995-11-22 |
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