JPH0576394A - カリウムイオン測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 操業性、定量性、正確性に優れたカリウムイ
オン沈度の酵素的測定用組成物を提供する。 【構成】 下記の組成物Ａ又は組成物Ａ及び組成物Ｂを
含有してなることを特徴とするカリウムイオン測定用組
成物。 Ａ ａ）ピルビン酸キナーゼ、ｂ）グリセロールキナーゼ、
ｃ）グリセロール三リン酸オキシダーゼ、ｄ）ペルオキ
シダーゼ、ｅ）還元型色原体、ｆ）アデノシン二リン酸
またはその塩及びｇ）フォスフォエノールピルビン酸ま
たはその塩を含有する組成物。 Ｂ ａ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ｂ）グルコースデ
ヒドロゲナーゼ及びｃ）還元型ニコチンアデニンジヌク
レオシド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアデニンジ
ヌクレオシドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含有する組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はカリウムイオン測定用組
成物に関するものである。体液中のカリウムイオン測定
は、急性腎不全や慢性腎不全などの腎疾患、原発性アル
デステロン症や続発性アルデステロン症などの内分泌症
疾患の有用な情報を与えるものとして臨床意義が深い。

【０００２】

【従来の技術】従来、カリウムイオンを含めて金属イオ
ンの測定法としては、炎光光度計法、化学的測定法、イ
オン選択電極法が用いられてきている。しかしながら、
炎光光度計法は操作が煩雑であり、試料の処理能力に問
題があった。化学的測定法は操作が煩雑な上に試薬が高
価であるという問題があり、臨床検査の現場で実際には
余り用いられていない。イオン選択電極法は、比較的操
作が簡単であるが、電極の劣化のため測定時に誤差を生
じるという問題がある。また最近、酵素法によるカリウ
ムイオンの測定方法が報告されている（Clin.Chem.198
9;35:817-820 ）。しかしながらこの報告による方法
は、ニコチンアデニンジヌクレオシド（ＮＡＤＨ）の紫
外部の吸光度（340nm 付近）の減少を測定する方法のた
め、保存中にＮＡＤＨが減少し高値検体の測定ができな
くなるという問題や、減少反応であるため感度をある一
定以上に上げることはできないという問題、あるいはア
ンモニウムイオンの影響を回避する手段として、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼを用いて、下記化１によりアン
モニウムイオンを消去しているが、これではカリウムイ
オン濃度の測定波長とアンモニウムイオンの消去反応の
測定波長が重なることになり、高濃度のアンモニウムイ
オンを消去する場合、吸光度の設定あるいは波長の設定
等が困難であるという問題があった。

【化１】

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
現状に鑑み、操作性、定量性、正確性に優れたカリウム
イオン濃度の酵素的測定用組成物を提供することであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、カリウム
イオンにより活性化される酵素を用いて検体中のカリウ
ムイオン濃度を測定する方法を鋭意検討したところ、ピ
ルビン酸キナーゼを用いる反応により生じるアデノシン
三リン酸を、グリセロールキナーゼ、グリセロール三リ
ン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いて定量する
ことが可能であることを見いだした。

【０００５】すなわち、本発明の第１の発明の要旨は、 ａ）ピルビン酸キナーゼ、ｂ）グリセロールキナーゼ、
ｃ）グリセロール三リン酸オキシダーゼ、ｄ）ペルオキ
シダーゼ、ｅ）還元型色原体、ｆ）アデノシン二リン酸
またはその塩及びｇ）フォスフォエノールピルビン酸ま
たはその塩を含有することを特徴とするカリウムイオン
測定用組成物に存する。

【０００６】この測定系を用いて試料を測定した場合、
通常は何ら問題はないが過剰にアンモニウムイオンを添
加すると正の影響があることがわかった。そこで、アン
モニウムイオンの影響回避策を検討したところ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼを用いることにより、低濃度の
アンモニウムイオンを有効に消去できることを見いだし
た。しかしながら、高濃度のアンモニウムイオンが添加
された試料を測定する場合、完全にアンモニウムイオン
を消去するためには、高濃度のＮＡＤＨあるいはＮＡＤ
ＰＨの添加が必要であることがわかった。ＮＡＤＨまた
はＮＡＤＰＨは、還元作用を有するため、高濃度のＮＡ
ＤＨあるいはＮＡＤＰＨの存在はペルオキシダーゼを用
いる発色反応系に負の影響を与え十分な感度が得られな
くなる。

【０００７】そこでさらに検討した結果、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼを用いる反応により酸化されるＮＡＤ
ＨあるいはＮＡＤＰＨをグルコースデヒドロゲナーゼを
用いる反応に利用することが可能であることを見いだし
た。つまり、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨをリサイクル
させることにより低濃度のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを
用いて高濃度のアンモニウムイオンを効果的に消去する
反応系を完成するに至った。

【０００８】さらに、このアンモニウムイオン消去反応
系を、上記のカリウムイオンの測定系に組み込むことに
より、より正確性の高いカリウムイオン測定系を完成す
るに至った。

【０００９】すなわち、本発明の第２の発明の要旨は、
下記の組成物Ａ及び組成物Ｂを含有してなることを特徴
とするカリウムイオン測定用組成物に存する。 Ａ ａ）ピルビン酸キナーゼ、ｂ）グリセロールキナーゼ、
ｃ）グリセロール三リン酸オキシダーゼ、ｄ）ペルオキ
シダーゼ、ｅ）還元型色原体、ｆ）アデノシン二リン酸
またはその塩及びｇ）フォスフォエノールピルビン酸ま
たはその塩を含有する組成物。 Ｂ ａ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ｂ）グルコースデ
ヒドロゲナーゼ及びｃ）還元型ニコチンアデニンジヌク
レオシド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアデニンジ
ヌクレオシドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含有する組成物。
上記組成物Ｂは、アンモニウムイオン消去用の組成物で
あって、高濃度のアンモニウムイオンを効果的に消去す
ることができる。

【００１０】ピルビン酸キナーゼを用いてカリウムイオ
ンを測定する方法としては、ピルビン酸キナーゼを用い
る反応により生じるピルビン酸をピルビン酸オキシダー
ゼを利用し過酸化水素を生成させ色原体とペルオキシダ
ーゼ共存下、キノイド色素を生成させ比色定量する方法
があるが、この方法は、内因性のピルビン酸の影響を受
けやすく、またピルビン酸オキシダーゼのコストが高い
ため、商業的に利用することが困難である。

【００１１】また本発明以外の組成物を用いてアンモニ
ウムイオンを消去する方法としては、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼを組合わ
せてアンモニウムイオンを消去する方法が挙げられる
が、この方法においては有効にアンモニウムイオンを消
去することができるもののイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの基質となるイソクエン酸がグルコースより高価であ
り、またイソクエン酸デヒドロゲナーゼの反応を停止す
るため、金属キレート剤の添加が必要であるが、金属キ
レート剤の添加はカリウムイオンの測定に負の影響を与
えるため、カリウムイオンの測定に留まらず金属イオン
の測定においてはできるかぎり添加を制限する必要があ
る。

【００１２】したがって、カリウムイオン測定において
これらの方法の利用は商業的に困難であり、本発明の組
成物を用いてカリウムイオンを測定する方法が、正確
性、精度、簡便性、コスト的に優れている。

【００１３】上記の組成物を利用して、試料中のカリウ
ムイオンを測定する方法としては以下に例示される反応
系を利用するものが挙げられる。

【００１４】

【化２】

【００１５】

【化３】 ＰＥＰ フォスフォエノールピルビン酸 ＧＫ グリセロールキナーゼ ＡＤＰ アデノシンジフォスフェート Ｇ３ＰＯＤ グリセロ三リン酸オキシダーゼ ＡＴＰ アデノシントリフォスフェート ＰＯＤ ペルオキシダーゼ ４−ＡＡ ４−アミノアンチピリン Ｇ１ＤＨ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ α−ＫＧ α−ケトグルタルサン酸 ＧＬＤＨ グルコースデヒドロゲナーゼ ＰＫ ピルビン酸キナーゼ

【００１６】本発明に用いられるピルビン酸キナーゼの
起源は特に限定されるものではなく、例えばウサギ筋肉
あるいは牛の筋肉より得られるものを用いてよい。好適
にはウサギ筋肉由来のものが用いられる。本発明に用い
られるグリセロールキナーゼの起源は特に限定されるも
のではなく、例えばカンジダ マイコデルマ(CandidaMy
coderma ）由来のものやセルロモナス エスピー(Cellu
lomonas sp.)由来のものが用いられる。好適には、Cell
ulomonas sp.由来のものが用いられる。本発明に用いら
れるグリセロール三リン酸オキシダーゼの起源は特に限
定されるものではないが、好適には微生物由来のものが
用いられる。本発明に用いられるペルオキシダーゼの由
来は特に限定されるものではないが、好適には西洋ワサ
ビ由来のものが用いられる。本発明に用いられるグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼの起源は特に限定されるもので
はなく細菌、酵母、牛の肝由来のものが用いられるが、
好適には細菌由来のものが用いられる。本発明に用いら
れるグルコースデヒドロゲナーゼの起源は特に限定され
るものではないが、好適には微生物由来のものが用いら
れる。

【００１７】本発明に用いられる還元型色原体として
は、特に限定されるものではない。例えば４−アミノア
ンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラ
ゾン等のカップラーとフェノール、２−クロロフェノー
ル、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノー
ル等のフェノール誘導体もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチ
ルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメト
キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−
アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）
−Ｎ′−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニ
シジン等のアニリン誘導体の組合せ、または１０−Ｎ−
メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ
−フェノチアジン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニ
ル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル〕アミン、
４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル−（２，７
−ジヒドロキシ−１−ナフチル）メタン等のロイコ色素
が挙げられる。

【００１８】本発明に用いられるアデノシン二リン酸
塩、フォスオエノールピルビン酸塩は、カリウムイオン
を含んでいないものなら特に限定されず、ナトリウム
塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩、シクロヘ
キシルアミン等塩が挙げられる。還元型ニコチンアデニ
ンジヌクレオシド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアデニ
ンジヌクレオシドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は特に限定され
るものでなく、カリウムイオンを含有していないものな
ら如何なるものでも使用することができる。

【００１９】本発明の試薬のｐＨは緩衝液により、ｐＨ
６〜９に保たれているのが好ましく、緩衝液はカリウム
イオンを含有しないものであればいかなるものでもよ
い。例えばトリエタノールアミン緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝
液、トリス緩衝液が挙げられる。

【００２０】本発明の試薬は必要により、界面活性剤、
防腐剤、安定化剤、酵素賦活剤等を加えてもよい。界面
活性剤としては、非イオン界面活性剤が好適に用いられ
る防腐剤としては、ＮａＮ3 、抗生物質が好適に用いら
れる。安定化剤、酵素賦活剤として効果を示すものであ
れば特に限定されない。例えばアルブミン、ＦＡＤ、マ
グネシウムイオン等が挙げられる。

【００２１】本発明に用いられるピルビン酸キナーゼの
測定に使用する酵素濃度は測定に適した濃度であれば特
に制限されるものではないが、０．０１〜１０ｕ／ｍｌ
の範囲で好適に用いられる。ピルビン酸オキシダーゼ
は、１〜３０ｕ／ｍｌの範囲で好適に用いられる。グリ
セロールキナーゼは、０．０５〜５０ｕ／ｍｌの範囲で
好適に用いられる。グリセロール三リン酸オキシダーゼ
は、０．１〜５０ｕ／ｍｌの範囲で好適に用いられる。
ペルオキシダーゼは、１〜１００ｕ／ｍｌの範囲で好適
に用いられる。フォスフォエノールピンビン酸またはそ
の塩、アデノシン二リン酸またはその塩、還元型色原体
は、測定に適した濃度であれば特に制限されるのではな
いが、フォスフォエノールピルビン酸またはその塩は
０．５〜５ｍＭの範囲で好適に用いられ、アデノシン二
リン酸またはその塩は１〜２０ｍＭの範囲で好適に用い
られる。還元型色原体は０．０１〜１０ｍＭの範囲で好
適に用いられる。還元型ニコチンアデニンジヌクレオシ
ド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアデニンジヌクレオシ
ドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は測定に適した濃度であれば特
に制限はされないが好適には、０．０５〜０．５ｍＭの
範囲で用いられる。

【００２２】本発明のカリウムイオン測定用組成物を用
いて、カリウムイオンを測定する方法は、前記のごとく
試料をピルビン酸キナーゼ、グリセロールキナーゼ、グ
リセロール三リン酸オキシダーゼ、を含有する試薬と反
応させて生成するＨ₂ Ｏ₂ を色原体とペルオキシダーゼ
共存下、キノイド色素を生成させ比色定量する方法があ
る。また本第２発明の組成物Ａと組成物Ｂは最初から混
合しておいて一液型の試薬として使用してもよいし、あ
るいは別々に二液型の試薬として使用してもよい。本発
明の組成物を用いて測定する条件としては、特に厳密に
規制するものではないが、反応温度は、１０〜４０℃の
間で好ましくは２５℃あるいは３７℃が用いられる。反
応時間は、０〜１０分の間が好適に用いられる。測定波
長としては発色した色素のλmax 付近で測定されること
が望ましい。

【００２３】

【実施例】

実施例１ 試料中のカリウムイオン濃度を以下の測定法により測定
した。また、対照として電極法で同一サンプルを測定し
た。 試薬Ａ ０．１Ｍ トリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝
液 ｐＨ ７．６ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．２Ｍ グリセリン ４ｍＭ ＡＤＰ ０．７ｍＭ ＰＥＰトリス塩 ０．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２ｍＭ フェノール ０．４ｕ／ｍｌ ピルビン酸キナーゼ ３．０ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ １０ｕ／ｍｌ グリセロ三リン酸オキシダーゼ ３０ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ

【００２４】試薬Ｂ ０．１Ｍ トリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝
液 ｐＨ ７．６ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．２Ｍ グリセリン ４ｍＭ ＡＤＰ ０．７ｍＭ ＰＥＰトリス塩 ０．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２ｍＭ フェノール ０．４ｕ／ｍｌ ピルビン酸キナーゼ ３．０ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ １０ｕ／ｍｌ グリセロ三リン酸オキシダーゼ ３０ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ５０ｍＭ グルコース ５ｍＭ α−ケトグルタン酸 ０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ ５０ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ

【００２５】測定方法 塩化カリウム水溶液１００ｍＭの１０段階希釈液と血清
１０段階希釈液をそれぞれ試料とし、各４０μｌを採取
し、これに上記試薬４ｍｌを加えて、３７℃で１０分間
反応させて、４００ｎｍにおけるタイムコース（測定波
長において、酵素反応が進んでいる挙動）と１分間の吸
光度変化を求めた。なお、ブランクはカリウムイオン含
有被検液の代わりに蒸留水を用いた。図１に１００ｍＭ
塩化カリウム水溶液と血清試料のタイムコースを、図２
及び図３に１００ｍＭ塩化カリウム水溶液と血清試料の
希釈直線性を示す。図より明らかなように、塩化カリウ
ム水溶液血清を試料として用いても、本発明では短時間
に正確かつ簡単にカリウムイオンを測定することができ
る。さらに、塩化アンモニウム水溶液１００ｍＭの１０
段階希釈液を試料として同様に測定を行った。図４及び
図５に１００ｍＭ塩化カリウム水溶液と１００ｍＭ塩化
アンモニウム水溶液のタイムコースを示す。

【００２６】表１及び表２は各サンプルを試薬Ａ，Ｂ及
び電極法で測定した結果を示す。

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】表３は生血清に１００ｍＭ塩化カリウム水
溶液と１００ｍＭの塩化アンモニウム水溶液を添加した
サンプルを試薬Ａ，Ｂ及び電極法で測定した結果を示
す。

【表３】

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、操作性、定量性、正確
性に優れたカリウムイオン濃度の酵素的測定用組成物が
提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】１００ｍＭ塩化カリウム水溶液と血清試料のタ
イムコースを示す。

【図２】１００ｍＭ塩化カリウム水溶液の希釈直線性を
示す。

【図３】血清試料の希釈直線性を示す。

【図４】試薬Ａを使用した場合の１００ｍＭ塩化カリウ
ム水溶液と１００ｍＭの塩化アンモニウム水溶液のタイ
ムコースを示す。

【図５】試薬Ｂを使用した場合の１００ｍＭ塩化カリウ
ム水溶液と１００ｍＭの塩化アンモニウム水溶液のタイ
ムコースを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）ピルビン酸キナーゼ、ｂ）グリセロ
   ールキナーゼ、ｃ）グリセロール三リン酸オキシダー
   ゼ、ｄ）ペルオキシダーゼ、ｅ）還元型色原体、ｆ）ア
   デノシン二リン酸またはその塩及びｇ）フォスフォエノ
   ールピルビン酸またはその塩を含有することを特徴とす
   るカリウムイオン測定用組成物。
2. 【請求項２】 下記の組成物Ａ及び組成物Ｂを含有して
   なることを特徴とするカリウムイオン測定用組成物。 Ａ ａ）ピルビン酸キナーゼ、ｂ）グリセロールキナーゼ、
   ｃ）グリセロール三リン酸オキシダーゼ、ｄ）ペルオキ
   シダーゼ、ｅ）還元型色原体、ｆ）アデノシン二リン酸
   またはその塩及びｇ）フォスフォエノールピルビン酸ま
   たはその塩を含有する組成物。 Ｂ ａ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ｂ）グルコースデ
   ヒドロゲナーゼ及びｃ）還元型ニコチンアデニンジヌク
   レオシド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアデニンジ
   ヌクレオシドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含有する組成物。