JPH0578396A - ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白 - Google Patents
ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白Info
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- JPH0578396A JPH0578396A JP2419240A JP41924090A JPH0578396A JP H0578396 A JPH0578396 A JP H0578396A JP 2419240 A JP2419240 A JP 2419240A JP 41924090 A JP41924090 A JP 41924090A JP H0578396 A JPH0578396 A JP H0578396A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
［目的］ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白Ｉ（ＴＢＰ−Ｉ）の
製造法及びＴＢＰ−Ｉの前駆体並びに類似体を提供す
る。 ［構成］全Ｉ型ヒトＴＮＦレセプターもしくはその可溶
性領域をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで真
核細胞をトランスフェクションし、次いで該トランスフ
ェクションされた細胞を培養して可溶性蛋白を培地へ分
泌させることによって、ＴＢＰ−Ｉ、その前駆体及びそ
の類似体が製造される。
製造法及びＴＢＰ−Ｉの前駆体並びに類似体を提供す
る。 ［構成］全Ｉ型ヒトＴＮＦレセプターもしくはその可溶
性領域をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで真
核細胞をトランスフェクションし、次いで該トランスフ
ェクションされた細胞を培養して可溶性蛋白を培地へ分
泌させることによって、ＴＢＰ−Ｉ、その前駆体及びそ
の類似体が製造される。
Description
【０００１】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結
合蛋白Ｉ（以下、ＴＢＰ−Ｉと称する）に関し、更に詳
しくは該蛋白をコードする遣伝子のクローニングと、宿
主細胞中での該蛋白の発現に関する。
合蛋白Ｉ（以下、ＴＢＰ−Ｉと称する）に関し、更に詳
しくは該蛋白をコードする遣伝子のクローニングと、宿
主細胞中での該蛋白の発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＴＮＦ−αとＴＮＦ−β（リンフォトキ
シン）は構造上関連のあるポリペプチド性サイトカイン
であり、主に単核白血球により産生され、その細胞機能
への作用は炎症応答の誘導において主要な因子であるこ
とである。ＴＮＦ類は異なる方法で細胞に作用し、その
あるものは他の炎症メディエーター（例えばインターロ
イキン−１（ＩＬ−１）とインターロイキン−６（ＩＬ
−６））の作用様式に似ている。ＴＮＦ類の活性に関し
て最も特徴的と思えるものは、その作用の多くは細胞や
組織の破壊につながることである。これらの破壊的活性
の過剰誘導は多くの疾患の病因となっているという証拠
が増加していることは、その機構と制御方法を解明する
ことを興昧あるものにしている（Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．（１
９８８）Ｓｃｉ．Ａｍ．Ｖｏｌ．２５８，ｐ４１−４
９）。
シン）は構造上関連のあるポリペプチド性サイトカイン
であり、主に単核白血球により産生され、その細胞機能
への作用は炎症応答の誘導において主要な因子であるこ
とである。ＴＮＦ類は異なる方法で細胞に作用し、その
あるものは他の炎症メディエーター（例えばインターロ
イキン−１（ＩＬ−１）とインターロイキン−６（ＩＬ
−６））の作用様式に似ている。ＴＮＦ類の活性に関し
て最も特徴的と思えるものは、その作用の多くは細胞や
組織の破壊につながることである。これらの破壊的活性
の過剰誘導は多くの疾患の病因となっているという証拠
が増加していることは、その機構と制御方法を解明する
ことを興昧あるものにしている（Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．（１
９８８）Ｓｃｉ．Ａｍ．Ｖｏｌ．２５８，ｐ４１−４
９）。
【０００３】ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの結合する高親和
性リセプター（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．
（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１６１，ｐ
９８４−９９５）は、これらのサイトカインに対する応
答の開始と調節に中心的な役割を果たしている。これら
のリセプターは種々の異なる細胞の表面上に発現されて
いる。これらの細胞外部分と反応する抗体は、ＴＮＦ類
に非常によく似た方法で細胞に作用することを証明して
いる研究は、それらに関連したリセプターや細胞成分
は、ＴＮＦ類の作用の細胞内シグナルを与えるのに充分
であることを示している（Ｅｓｐｅｖｉｋ，Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．
１７１，ｐ４１５−４２６）。
性リセプター（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．
（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１６１，ｐ
９８４−９９５）は、これらのサイトカインに対する応
答の開始と調節に中心的な役割を果たしている。これら
のリセプターは種々の異なる細胞の表面上に発現されて
いる。これらの細胞外部分と反応する抗体は、ＴＮＦ類
に非常によく似た方法で細胞に作用することを証明して
いる研究は、それらに関連したリセプターや細胞成分
は、ＴＮＦ類の作用の細胞内シグナルを与えるのに充分
であることを示している（Ｅｓｐｅｖｉｋ，Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．
１７１，ｐ４１５−４２６）。
【０００４】他の研究はＴＮＦリセプターに関連した分
子（ＴＮＦ−Ｒｓ）はまた、可溶性の型で存在すること
を証明している。このような可溶性ＴＮＦ−Ｒｓの免疫
学的に異なる２つの種（ＴＮＦ結合蛋白ＩとＩＩ、即ち
それぞれＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩ）が、最近ヒトの尿
から単離された（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，ｅｔａ
ｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．
２６４，ｐ１１９７４−１１９８０；Ｅｎｇｅｌｍａｎ
ｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６；Ｏ
ｌｓｓｏｎ，ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｖｏｌ．４２，ｐ２７０−
２７５；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，
（１９８９ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６
４，ｐ１１９６６−１１９７３）。免疫学的証拠はこの
２つの蛋白は、細胞表面ＴＮＦ−Ｒの２つの分子種（そ
れぞれＩ型とＩＩ型のリセプター）に、構造的に関連し
ていることを示している。この２つの可溶性蛋白のそれ
ぞれに対する抗体は、２つのリセプターの１つに対する
ＴＮＦの結合を特異的に阻止することが証明されてお
り、リセプターを免疫沈降させるのに使用することがで
きる。この２つの可溶性蛋白の１つ（ＴＢＰ−Ｉ）に対
する抗体はまた、免疫学的に交差反応性のある細胞リセ
プターを発現する細胞中でＴＮＦに特徴的な作用を誘導
することが見いだされた（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，
ｅｔ ａｌ．，（１９９０）同上）。ＴＮＦの細胞表面
リセプターのように、これらのリセプターの可溶性型は
特異的にＴＮＦに結合し、もってその細胞への結合を妨
害することができる。これらはＴＮＦ活性の生理学的イ
ンヒビターとして機能することが示唆された（Ｅｎｇｅ
ｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９（同上）；Ｏｌｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９（同上）；Ｓｅｃｋｉ
ｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９ａ（同上））。
子（ＴＮＦ−Ｒｓ）はまた、可溶性の型で存在すること
を証明している。このような可溶性ＴＮＦ−Ｒｓの免疫
学的に異なる２つの種（ＴＮＦ結合蛋白ＩとＩＩ、即ち
それぞれＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩ）が、最近ヒトの尿
から単離された（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，ｅｔａ
ｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．
２６４，ｐ１１９７４−１１９８０；Ｅｎｇｅｌｍａｎ
ｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６；Ｏ
ｌｓｓｏｎ，ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｖｏｌ．４２，ｐ２７０−
２７５；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，
（１９８９ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６
４，ｐ１１９６６−１１９７３）。免疫学的証拠はこの
２つの蛋白は、細胞表面ＴＮＦ−Ｒの２つの分子種（そ
れぞれＩ型とＩＩ型のリセプター）に、構造的に関連し
ていることを示している。この２つの可溶性蛋白のそれ
ぞれに対する抗体は、２つのリセプターの１つに対する
ＴＮＦの結合を特異的に阻止することが証明されてお
り、リセプターを免疫沈降させるのに使用することがで
きる。この２つの可溶性蛋白の１つ（ＴＢＰ−Ｉ）に対
する抗体はまた、免疫学的に交差反応性のある細胞リセ
プターを発現する細胞中でＴＮＦに特徴的な作用を誘導
することが見いだされた（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，
ｅｔ ａｌ．，（１９９０）同上）。ＴＮＦの細胞表面
リセプターのように、これらのリセプターの可溶性型は
特異的にＴＮＦに結合し、もってその細胞への結合を妨
害することができる。これらはＴＮＦ活性の生理学的イ
ンヒビターとして機能することが示唆された（Ｅｎｇｅ
ｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９（同上）；Ｏｌｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９（同上）；Ｓｅｃｋｉ
ｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９ａ（同上））。
【０００５】細胞表面リセプターの可溶性型は、蛋白分
解により、又はＩＬ−４とＩＬ−７に対するリセプター
のｃＤＮＡのクローニングについて記載している最近の
２つの研究で提唱された異なる機構により、リセプター
の細胞表面型から得られる。リセプターの全長をコード
するｃＤＮＡクローンに加えて、これらのリセプターの
先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、可溶性型をコー
ドするクローンもまたこれらの研究で単離された。後者
のクローンは、リセプターの可溶性型を特異的にコード
する転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）由来であり、細胞
表面型をコードする同じ遺伝子から転写されるが、スプ
ライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）が異なることが示唆さ
れている（Ｍｏｓｌｅｙ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９
８９）Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．５９，ｐ３３５−３４８；Ｇ
ｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，（１９９０）Ｃ
ｅｌｌ Ｖｏｌ．６０，ｐ９４１−９５１）。
解により、又はＩＬ−４とＩＬ−７に対するリセプター
のｃＤＮＡのクローニングについて記載している最近の
２つの研究で提唱された異なる機構により、リセプター
の細胞表面型から得られる。リセプターの全長をコード
するｃＤＮＡクローンに加えて、これらのリセプターの
先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、可溶性型をコー
ドするクローンもまたこれらの研究で単離された。後者
のクローンは、リセプターの可溶性型を特異的にコード
する転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）由来であり、細胞
表面型をコードする同じ遺伝子から転写されるが、スプ
ライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）が異なることが示唆さ
れている（Ｍｏｓｌｅｙ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９
８９）Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．５９，ｐ３３５−３４８；Ｇ
ｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，（１９９０）Ｃ
ｅｌｌ Ｖｏｌ．６０，ｐ９４１−９５１）。
【０００６】最近の２つの研究でヒトＩ型ＴＮＦ細胞表
面リセプターの分子クローニングと発現が記載された
（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９
０）Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．６１，ｐ３５１−３５９；Ｓｃ
ｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃｅ
ｌｌ Ｖｏｌ．６１，ｐ３６１−３７０）。
面リセプターの分子クローニングと発現が記載された
（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９
０）Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．６１，ｐ３５１−３５９；Ｓｃ
ｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃｅ
ｌｌ Ｖｏｌ．６１，ｐ３６１−３７０）。
【０００７】
【発明の要旨】本発明は、ヒトＴＢＰ−１、その前駆体
及びその類似体の製造法であって、真核細胞、好ましく
はＣＨＯ細胞を、全Ｉ型ヒトＴＮＦレセプターまたはそ
の可溶性領域をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクタ
ーでトランスフェクションすることを含む該製造法に関
する。全ＤＮＡ分子を用いる場合には、該トランスフェ
クションされた細胞から、細胞表面レセプターとともに
可溶性蛋白が産生され、培地中に分泌される。
及びその類似体の製造法であって、真核細胞、好ましく
はＣＨＯ細胞を、全Ｉ型ヒトＴＮＦレセプターまたはそ
の可溶性領域をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクタ
ーでトランスフェクションすることを含む該製造法に関
する。全ＤＮＡ分子を用いる場合には、該トランスフェ
クションされた細胞から、細胞表面レセプターとともに
可溶性蛋白が産生され、培地中に分泌される。
【０００８】更に本発明は、全ヒトＩ型ＴＮＦレセプタ
ーまたはその可溶性領域をコードするＤＮＡ分子でトラ
ンスフェクションされた真核細胞により培地中に分泌さ
れるＴＢＰ−Ｉの前駆体及びその類似体から選ばれる可
溶性蛋白に関する。
ーまたはその可溶性領域をコードするＤＮＡ分子でトラ
ンスフェクションされた真核細胞により培地中に分泌さ
れるＴＢＰ−Ｉの前駆体及びその類似体から選ばれる可
溶性蛋白に関する。
【０００９】図面の説明 図１ はＩ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配
列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列を示
す。
列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列を示
す。
【００１０】（Ａ）は、該ｃＤＮＡのスクリーニングに
使用されるプローブを示し、ここで： （ａ）はＴＢＰ−ＩのＮＨ２−末端アミノ酸配列を示
し；（ｂ）は、ＮＨ２−末端アミノ酸配列に基づいてデ
ザインした、最初のスクリーニングに使用される合成オ
リゴヌクレオチドプローブを示し、（ｃ）と（ｄ）は、
（ｂ）と重複するプローブであり、最初のスクリーニン
グで単離されたクローンの正当性を確認するために使用
される。
使用されるプローブを示し、ここで： （ａ）はＴＢＰ−ＩのＮＨ２−末端アミノ酸配列を示
し；（ｂ）は、ＮＨ２−末端アミノ酸配列に基づいてデ
ザインした、最初のスクリーニングに使用される合成オ
リゴヌクレオチドプローブを示し、（ｃ）と（ｄ）は、
（ｂ）と重複するプローブであり、最初のスクリーニン
グで単離されたクローンの正当性を確認するために使用
される。
【００１１】（Ｂ）はヒトの大腸（Ｃ２）とＣＥＭ−リ
ンパ球（Ｅ１３）ライブラリーから単離されたｃＤＮＡ
クローンと、完全なｃＤＮＡ構造の模式図である。翻訳
されていない配列は線で示してある。コード領域は四角
で囲ってある。影をつけた部分は、シグナルペプチドと
経膜領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍｅｉｎ）
をコードする配列を示す。
ンパ球（Ｅ１３）ライブラリーから単離されたｃＤＮＡ
クローンと、完全なｃＤＮＡ構造の模式図である。翻訳
されていない配列は線で示してある。コード領域は四角
で囲ってある。影をつけた部分は、シグナルペプチドと
経膜領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍｅｉｎ）
をコードする配列を示す。
【００１２】（Ｃ）はＴＮＦリセプターの予想されるア
ミノ酸配列のハイドロパシープロフィール（ｈｙｄｒｏ
ｐａｔｈｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）を示す。疎水性（線の
上）と親水性（線の下）の値は、ウィスコンシン大学遺
伝子学コンピューターグループのＫｙｔｅとＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ（１９８２）の配列解析ソフトウェアを用いて
求めた。曲線は、９つの残基上の各残基の疎水性指数の
平均である。
ミノ酸配列のハイドロパシープロフィール（ｈｙｄｒｏ
ｐａｔｈｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）を示す。疎水性（線の
上）と親水性（線の下）の値は、ウィスコンシン大学遺
伝子学コンピューターグループのＫｙｔｅとＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ（１９８２）の配列解析ソフトウェアを用いて
求めた。曲線は、９つの残基上の各残基の疎水性指数の
平均である。
【００１３】（Ｄ）はＩ型ＴＮＦリセプターのヌクレオ
チドと、予想されるアミノ酸配列を示す。推定される開
始シグナルと停止シグナルは星印で示してあり；ＴＢＰ
−Ｉ由来の３つの配列は上に破線で示してあり；経膜領
域とリーダー領域は角の丸い四角で囲ってあり；細胞外
領域の４つの繰り返し配列は、太い下線で示してある。
サイトカイン残基は四角で囲ってある。グリコシル化部
位は上に線が引いてあり、推定されるポリアデニル化シ
グナルは下線で示してある。
チドと、予想されるアミノ酸配列を示す。推定される開
始シグナルと停止シグナルは星印で示してあり；ＴＢＰ
−Ｉ由来の３つの配列は上に破線で示してあり；経膜領
域とリーダー領域は角の丸い四角で囲ってあり；細胞外
領域の４つの繰り返し配列は、太い下線で示してある。
サイトカイン残基は四角で囲ってある。グリコシル化部
位は上に線が引いてあり、推定されるポリアデニル化シ
グナルは下線で示してある。
【００１４】図２は、Ｅ１３ｃＤＮＡでトランスフェク
ションされたＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモ
ノクローナル抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出
を示す。
ションされたＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモ
ノクローナル抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出
を示す。
【００１５】ＣＨＯ細胞、クローンＲ−１８（発現ベク
ターでトランスフェクションされており、Ｅ１３ｃＤＮ
ＡはＳＶ４０プロモーターの調節下にある）とＣ−６
（対照；発現ベクターでトランスフェクションされた細
胞のクローンであり、Ｅ１３は逆の配向である）、そし
てＨｅｌａ細胞を、抗ＴＢＰ−Ｉモノクローナル抗体１
７、１８、２０そして３０で染色した後、ＦＩＴＣ結合
抗マウスＦ（ａｂ）でインキュベートした。染色の最初
の段階で対照としてＴＮＦに対するモノクローナル抗体
を使用して観察されたものと、蛍光強度と比較した。
ターでトランスフェクションされており、Ｅ１３ｃＤＮ
ＡはＳＶ４０プロモーターの調節下にある）とＣ−６
（対照；発現ベクターでトランスフェクションされた細
胞のクローンであり、Ｅ１３は逆の配向である）、そし
てＨｅｌａ細胞を、抗ＴＢＰ−Ｉモノクローナル抗体１
７、１８、２０そして３０で染色した後、ＦＩＴＣ結合
抗マウスＦ（ａｂ）でインキュベートした。染色の最初
の段階で対照としてＴＮＦに対するモノクローナル抗体
を使用して観察されたものと、蛍光強度と比較した。
【００１６】図３は、Ｉ型ＴＮＦ−ＲのＣＨＯ−産生、
可溶性型の逆相ＨＰＬＣを示す。
可溶性型の逆相ＨＰＬＣを示す。
【００１７】ＣＨＯＲ−１８クローン（図２参照）の調
整培地の濃縮物と、純粋な３ｎｇのＴＢＰ−Ｉを添加し
たＣＨＯＣ−６クローンの濃縮物を、Ａｑｕａｐｏｒｅ
ＲＰ３００カラムにかけた。０．３％のトリフルオロ酢
酸水溶液中のアセトニトリルのグラジエントで溶出した
（……）。画分の蛋白含量（―）とＥＬＩＳＡにより ＢＰ−Ｉを添加しない時、ＣＨＯＣ−６クローンの濃縮
物の溶出画分はいずれも、検出されるだけの可溶性型の
リセプターを含んでいないことがわかった（示してな
い）。
整培地の濃縮物と、純粋な３ｎｇのＴＢＰ−Ｉを添加し
たＣＨＯＣ−６クローンの濃縮物を、Ａｑｕａｐｏｒｅ
ＲＰ３００カラムにかけた。０．３％のトリフルオロ酢
酸水溶液中のアセトニトリルのグラジエントで溶出した
（……）。画分の蛋白含量（―）とＥＬＩＳＡにより ＢＰ−Ｉを添加しない時、ＣＨＯＣ−６クローンの濃縮
物の溶出画分はいずれも、検出されるだけの可溶性型の
リセプターを含んでいないことがわかった（示してな
い）。
【００１８】図４は、カルボキシペプチダーゼＹによる
ＴＢＰ−ＩのＣＯＯＨ−末端のアミノ酸の放出の経時変
化を示す。
ＴＢＰ−ＩのＣＯＯＨ−末端のアミノ酸の放出の経時変
化を示す。
【００１９】図５は、プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰの作
成を示し、これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター
（ｓｔｒｏｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−Ｉをコードする
ＤＮＡ配列を含有する。
成を示し、これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター
（ｓｔｒｏｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−Ｉをコードする
ＤＮＡ配列を含有する。
【００２０】図６は、プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの
作成を示し、これはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーターと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ
配列を含有する。
作成を示し、これはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーターと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ
配列を含有する。
【００２１】
【発明の説明】ヒトの尿から単離された精製ＴＢＰ−Ｉ
は、本出願人による日本特許出願Ｎｏ．２２８３０７／
８８に記載されており、図１Ａａに示すＮ−末端アミノ
酸配列を含むことが証明された。
は、本出願人による日本特許出願Ｎｏ．２２８３０７／
８８に記載されており、図１Ａａに示すＮ−末端アミノ
酸配列を含むことが証明された。
【００２２】いまやＴＢＰ−ＩのＣＯＯＨ−末端が決定
され、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（図１Ｄの１７８−
１８０位に上に破線が引いて示されている）を含む主要
な画分と、少なくとも１つの小さな画分（さらに少なく
とも２つのアミノ酸Ｖａｌ−Ｌｙｓを１８１−１８２位
に含む）を含むことが証明された。
され、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（図１Ｄの１７８−
１８０位に上に破線が引いて示されている）を含む主要
な画分と、少なくとも１つの小さな画分（さらに少なく
とも２つのアミノ酸Ｖａｌ−Ｌｙｓを１８１−１８２位
に含む）を含むことが証明された。
【００２３】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白Ｉ
（ＴＢＰ−Ｉ）、及びその生物学的に活性な前駆体と類
似体より選択される可溶性組換え蛋白の産生方法に関
し、 １） 全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプター又はその可溶性領域
をコードするＤＮＡ分子よりなる発現ベクターで真核細
胞をトランスフェクションし、 ２） 該トランスフェクションされた細胞を培養し、も
って目的の蛋白を産生させ、培地に分泌させる、ことよ
りなる。
（ＴＢＰ−Ｉ）、及びその生物学的に活性な前駆体と類
似体より選択される可溶性組換え蛋白の産生方法に関
し、 １） 全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプター又はその可溶性領域
をコードするＤＮＡ分子よりなる発現ベクターで真核細
胞をトランスフェクションし、 ２） 該トランスフェクションされた細胞を培養し、も
って目的の蛋白を産生させ、培地に分泌させる、ことよ
りなる。
【００２４】全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプターをコードする
ＤＮＡ配列は図１Ｄに記載されている。その可溶性領域
は１８０位（Ａｓｎ）又は１８２位（Ｌｙｓ）までの配
列、又は１８２位以後にいくつかのアミノ酸を追加的に
含む配列を含む。
ＤＮＡ配列は図１Ｄに記載されている。その可溶性領域
は１８０位（Ａｓｎ）又は１８２位（Ｌｙｓ）までの配
列、又は１８２位以後にいくつかのアミノ酸を追加的に
含む配列を含む。
【００２５】本発明の方法によりトランスフェクション
された細胞により産生され、培地中に分泌される可溶性
蛋白は、Ｎ−末端に、図１Ｄ（ＴＢＰ−Ｉ）の２０−２
３位に上に破線で示してある配列Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａ
ｌ、又は９−１１位の配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、又
は１−３位のＩｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、又はＩｌｅ（＋
１）とＡｓｐ（２０）の間の任意の他の配列を有してい
てもよい。この蛋白はＣＯＯＨ−末端に上記の任意の配
列を有していてもよい。ＴＢＰ−Ｉ様の活性を有し生物
学的に活性な場合は、これらのすべての可溶性蛋白は、
ＴＢＰ−Ｉの前駆体及び類似体として本発明に包含され
る。
された細胞により産生され、培地中に分泌される可溶性
蛋白は、Ｎ−末端に、図１Ｄ（ＴＢＰ−Ｉ）の２０−２
３位に上に破線で示してある配列Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａ
ｌ、又は９−１１位の配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、又
は１−３位のＩｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、又はＩｌｅ（＋
１）とＡｓｐ（２０）の間の任意の他の配列を有してい
てもよい。この蛋白はＣＯＯＨ−末端に上記の任意の配
列を有していてもよい。ＴＢＰ−Ｉ様の活性を有し生物
学的に活性な場合は、これらのすべての可溶性蛋白は、
ＴＢＰ−Ｉの前駆体及び類似体として本発明に包含され
る。
【００２６】本発明によれば、ＴＢＰ−ＩのＮＨ２−末
端に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプロー
ブは、公知の方法で合成され、ｃＤＮＡライブラリー中
の、ＴＢＰ−ＩをコードするｃＤＮＡのスクリーニング
のために使用した。ヒトの大腸のｃＤＮＡライブラリー
中に、該プローブとハイブリダイゼーションするＣ２ｃ
ＤＮＡ挿入体が見いだされ、これをさらに、ヒトＣＥＭ
−リンパ球ラムダＺＡＰｃＤＮＡライブラリー中でスク
リーニングするために使用し、図１Ｄに示すｃＤＮＡに
到達した。
端に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプロー
ブは、公知の方法で合成され、ｃＤＮＡライブラリー中
の、ＴＢＰ−ＩをコードするｃＤＮＡのスクリーニング
のために使用した。ヒトの大腸のｃＤＮＡライブラリー
中に、該プローブとハイブリダイゼーションするＣ２ｃ
ＤＮＡ挿入体が見いだされ、これをさらに、ヒトＣＥＭ
−リンパ球ラムダＺＡＰｃＤＮＡライブラリー中でスク
リーニングするために使用し、図１Ｄに示すｃＤＮＡに
到達した。
【００２７】次に当業者に公知の方法を使用して、適当
に作成した発現ベクター中に、陽性クローンのＤＮＡを
挿入した。目的の蛋白の発現を可能にするため、該蛋白
の遺伝子発現と産生を可能とするような方法で、該目的
の蛋白をコードするＤＮＡに結合した転写及び翻訳制御
情報を含有する特異的ヌクレオチド配列を、発現ベクタ
ーは含有していなければならない。遺伝子が転写される
ためにはその前にプロモーターがなければならない。多
種のこのようなプロモーターの使用が可能であり、異な
る効率で作用する（強いプロモーター及び弱いプロモー
ター）。
に作成した発現ベクター中に、陽性クローンのＤＮＡを
挿入した。目的の蛋白の発現を可能にするため、該蛋白
の遺伝子発現と産生を可能とするような方法で、該目的
の蛋白をコードするＤＮＡに結合した転写及び翻訳制御
情報を含有する特異的ヌクレオチド配列を、発現ベクタ
ーは含有していなければならない。遺伝子が転写される
ためにはその前にプロモーターがなければならない。多
種のこのようなプロモーターの使用が可能であり、異な
る効率で作用する（強いプロモーター及び弱いプロモー
ター）。
【００２８】シグナルペプチドのヌクレオチド配列と、
機能的に結合した転写と翻訳制御シグナルがその前に存
在する、ＴＢＰ−Ｉのアミノ酸配列を含む蛋白（即ちＴ
ＢＰ−Ｉ、又はその前駆体及び類似体）をコードするヌ
クレオチド配列よりなるＤＮＡ分子を、宿主細胞染色体
中に目的の遺伝子配列を組み込むことができるベクター
の中に挿入する。その染色体中に導入されたＤＮＡを安
定的に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主
細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーを
導入することにより、選択される。
機能的に結合した転写と翻訳制御シグナルがその前に存
在する、ＴＢＰ−Ｉのアミノ酸配列を含む蛋白（即ちＴ
ＢＰ−Ｉ、又はその前駆体及び類似体）をコードするヌ
クレオチド配列よりなるＤＮＡ分子を、宿主細胞染色体
中に目的の遺伝子配列を組み込むことができるベクター
の中に挿入する。その染色体中に導入されたＤＮＡを安
定的に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主
細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーを
導入することにより、選択される。
【００２９】好適な態様において、導入されたＤＮＡ分
子は、受容体宿主中での自律的増殖が可能なプラスミッ
ド又はウイルスベクター中に組み込まれる。特定のプラ
スミッド又はウイルスベクターの選択にさいして重要な
因子は、ベクターを含有する受容体細胞の認識や、ベク
ターを含まない受容体細胞からの選択が容易であるこ
と；特定の宿主中で望ましいベクターのコピー数、そし
て異なる宿主細胞間でベクターを「シャトル」（”ｓｈ
ｕｔｔｌｅ”）できることが好ましいか否かである。発
現のためにベクター、又は作成体を含むＤＮＡ配列がい
ったん調製されると、種々の適当な手段で適当な宿主細
胞中に、ＤＮＡ作成体が導入される（形質転換、トラン
スフェクション、結合、プロトプラスト融合、エレクト
ロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、
リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション
など）。
子は、受容体宿主中での自律的増殖が可能なプラスミッ
ド又はウイルスベクター中に組み込まれる。特定のプラ
スミッド又はウイルスベクターの選択にさいして重要な
因子は、ベクターを含有する受容体細胞の認識や、ベク
ターを含まない受容体細胞からの選択が容易であるこ
と；特定の宿主中で望ましいベクターのコピー数、そし
て異なる宿主細胞間でベクターを「シャトル」（”ｓｈ
ｕｔｔｌｅ”）できることが好ましいか否かである。発
現のためにベクター、又は作成体を含むＤＮＡ配列がい
ったん調製されると、種々の適当な手段で適当な宿主細
胞中に、ＤＮＡ作成体が導入される（形質転換、トラン
スフェクション、結合、プロトプラスト融合、エレクト
ロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、
リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション
など）。
【００３０】本発明で使用される宿主細胞は真核細胞又
は原核細胞でもよい。例えば細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｉ））のような原核細胞宿主は、細胞をトランスフェク
ションするのにＩ型ＴＮＦリセプターの可溶性領域をコ
ードするｃＤＮＡが使用される時のみ、使用される。こ
のような条件下では、該蛋白はグリコシル化されない。
原核細胞宿主は、発現プラスミッド中のレプリコンと調
節配列に対して融和性がなければならない。
は原核細胞でもよい。例えば細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｉ））のような原核細胞宿主は、細胞をトランスフェク
ションするのにＩ型ＴＮＦリセプターの可溶性領域をコ
ードするｃＤＮＡが使用される時のみ、使用される。こ
のような条件下では、該蛋白はグリコシル化されない。
原核細胞宿主は、発現プラスミッド中のレプリコンと調
節配列に対して融和性がなければならない。
【００３１】真核細胞宿主は、全Ｉ型ＴＮＦリセプター
をコードするｃＤＮＡよりなるプラスミッドで、本発明
に従いトランスフェクションされる。好適な真核細胞宿
主は哺乳動物の細胞（例えばヒト、サル、マウス及びチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）である。こ
れらは細胞表面リセプターに加えて、該蛋白の可溶性型
を与え、蛋白分子に対して翻訳後の修飾（例えば正しい
部位での正しい折たたみ又はグリコシル化を含む）を与
える。真核細胞は、Ｉ型ヒトＴＮＦレセプター分子の可
溶性領域をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドでトラ
ンスフェクションすることもできる。本発明において好
適な哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
をコードするｃＤＮＡよりなるプラスミッドで、本発明
に従いトランスフェクションされる。好適な真核細胞宿
主は哺乳動物の細胞（例えばヒト、サル、マウス及びチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）である。こ
れらは細胞表面リセプターに加えて、該蛋白の可溶性型
を与え、蛋白分子に対して翻訳後の修飾（例えば正しい
部位での正しい折たたみ又はグリコシル化を含む）を与
える。真核細胞は、Ｉ型ヒトＴＮＦレセプター分子の可
溶性領域をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドでトラ
ンスフェクションすることもできる。本発明において好
適な哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３２】ベクターの導入後に、宿主細胞は選択培地
中で増殖され、もってベクター含有細胞の増殖を選択す
る。クローン化遺伝子配列の発現により、目的の可溶性
蛋白が産生され、これが培地中に分泌され、次に任意の
従来法（例えば抽出、沈降、クロマトグラフィー、電気
泳動など）で単離・精製される。
中で増殖され、もってベクター含有細胞の増殖を選択す
る。クローン化遺伝子配列の発現により、目的の可溶性
蛋白が産生され、これが培地中に分泌され、次に任意の
従来法（例えば抽出、沈降、クロマトグラフィー、電気
泳動など）で単離・精製される。
【００３３】好適な態様において、ＣＨＯ細胞は図１Ｄ
に示すＩ型ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡでトランスフェクション
され、これらが細胞表面リセプターとＴＢＰ−Ｉ、その
可溶性型、及び／又はその前駆体及び類似体を産生す
る。
に示すＩ型ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡでトランスフェクション
され、これらが細胞表面リセプターとＴＢＰ−Ｉ、その
可溶性型、及び／又はその前駆体及び類似体を産生す
る。
【００３４】本出願に示したデータは、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒ
の可溶性型のＴＢＰ−Ｉはこのリセプターの細胞表面型
の断片を構成し、その細胞外領域に相当するという考え
方に一致する。このリセブターは、この蛋白の数種の位
置的に異なるエピトープと相互作用をするＴＢＰ−Ｉに
対する数種のモノクローナル抗体により認識される。該
細胞外領域のアミノ酸配列は、ＴＢＰ−Ｉの配列に一致
する。
の可溶性型のＴＢＰ−Ｉはこのリセプターの細胞表面型
の断片を構成し、その細胞外領域に相当するという考え
方に一致する。このリセブターは、この蛋白の数種の位
置的に異なるエピトープと相互作用をするＴＢＰ−Ｉに
対する数種のモノクローナル抗体により認識される。該
細胞外領域のアミノ酸配列は、ＴＢＰ−Ｉの配列に一致
する。
【００３５】ＴＢＰ−Ｉの形成機構に関して特に有用な
知見は、本出願に記載された、ＴＮＦ−Ｒの可溶性型は
ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＨ
Ｏ細胞により産生されるという知見である。これは、細
胞表面型をコードするのと同じ転写体がＴＮＦ−Ｒの可
溶性型の形成を可能にする何らかの機構を細胞が所有し
ていることを示している。
知見は、本出願に記載された、ＴＮＦ−Ｒの可溶性型は
ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＨ
Ｏ細胞により産生されるという知見である。これは、細
胞表面型をコードするのと同じ転写体がＴＮＦ−Ｒの可
溶性型の形成を可能にする何らかの機構を細胞が所有し
ていることを示している。
【００３６】Ｅ１３でトランスフェクションしたＣＨＯ
細胞による可溶性型のＩ型ＴＮＦ−Ｒの低い産生速度
は、必ずしも最高速度を反映したものではない。ＨＴ２
９細胞では可溶性型のＩ型ＴＮＦ−Ｒの自然の放出は、
ＣＨＯ−Ｒ−１８クローンで観察された速度より約１０
倍速い速度で起きる。
細胞による可溶性型のＩ型ＴＮＦ−Ｒの低い産生速度
は、必ずしも最高速度を反映したものではない。ＨＴ２
９細胞では可溶性型のＩ型ＴＮＦ−Ｒの自然の放出は、
ＣＨＯ−Ｒ−１８クローンで観察された速度より約１０
倍速い速度で起きる。
【００３７】細胞表面型をコードするのと同じ転写体か
ら可溶性型のＴＮＦリセプターが得られるのに可能性の
ある機構は、蛋白分解である。事実ＴＢＰ−ＩのＮＨ２
−末端に対応するアミノ酸残基に隣接して、リセプター
のアミノ酸配列内に、トリプシン様プロテアーゼによる
切断部位となる２つの基本的なアミノ酸残基（Ｌｙｓ−
Ａｒｇ）がある。ＴＢＰ−ＩのＣＯＯＨ末端で起きる切
断を引き起こすプロテアーゼについては不明である。
ら可溶性型のＴＮＦリセプターが得られるのに可能性の
ある機構は、蛋白分解である。事実ＴＢＰ−ＩのＮＨ２
−末端に対応するアミノ酸残基に隣接して、リセプター
のアミノ酸配列内に、トリプシン様プロテアーゼによる
切断部位となる２つの基本的なアミノ酸残基（Ｌｙｓ−
Ａｒｇ）がある。ＴＢＰ−ＩのＣＯＯＨ末端で起きる切
断を引き起こすプロテアーゼについては不明である。
【００３８】以下の例により本発明を例示する。
【００３９】例１：操作法 Ａ）ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩ内のアミ
ノ酸配列の決定 ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩはすでに記載
されているように（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏ
ｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６）、 リガンド（Ｔ
ＮＦ）アフィニティクロマトグラフィーの後に逆相ＨＰ
ＬＣを用いる方法により、尿の蛋白の濃縮調製物から単
離した。ＴＢＰ−Ｉを臭化シアンで切断して２つのペプ
チドを得た後、還元とアルキル化を行い、逆相ＨＰＬＣ
で単離した。この２つのペプチド（表１のＣＮＢｒ−１
とＣＮＢｒ−２）をパルス液体気体蛋白マイクロシーケ
ンサー（ｐｕｌｓｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｇａｓ ｐｈａ
ｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒ）（モデル４７５Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）
でＮＨ２−末端配列解析を行った。該ペプチドの１つ
（ＣＮＢｒ−１）の配列は、全ＴＢＰ−Ｉ蛋白のＮＨ２
−末端と同じであった。
ノ酸配列の決定 ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩはすでに記載
されているように（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏ
ｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６）、 リガンド（Ｔ
ＮＦ）アフィニティクロマトグラフィーの後に逆相ＨＰ
ＬＣを用いる方法により、尿の蛋白の濃縮調製物から単
離した。ＴＢＰ−Ｉを臭化シアンで切断して２つのペプ
チドを得た後、還元とアルキル化を行い、逆相ＨＰＬＣ
で単離した。この２つのペプチド（表１のＣＮＢｒ−１
とＣＮＢｒ−２）をパルス液体気体蛋白マイクロシーケ
ンサー（ｐｕｌｓｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｇａｓ ｐｈａ
ｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒ）（モデル４７５Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）
でＮＨ２−末端配列解析を行った。該ペプチドの１つ
（ＣＮＢｒ−１）の配列は、全ＴＢＰ−Ｉ蛋白のＮＨ２
−末端と同じであった。
【００４０】ＴＢＰ−Ｉ中のＣＯＯＨ−末端アミノ酸配
列は、カルボキシペプチダーゼＹで蛋白を消化した後、
放出されたアミノ酸の配列解析を行い決定した。純粋な
ＴＢＰ−Ｉ（３２μｇ）を１ｎｍｏｌｅのノルロイシン
（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）（内部標準物質として）と混
合し、完全に乾燥し、０．８μｇのカルボキシペプチダ
ーゼＹ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有
する８μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．
５中に再懸濁した。消化は室温で行った。異なる時間に
２μｌずつ採取して、３μｌの１０％酢酸を添加して酸
性にした後、１５μｌの０．５％ＥＤＴＡを添加した。
次に自動アミノ酸解析を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｋ．モデル４２０Ａ）。その結
果（図４に示す）は配列−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃ
ＯＯＨを示す。２つ又はそれ以上のアミノ酸を追加的に
含有する小さな画分が検出された。
列は、カルボキシペプチダーゼＹで蛋白を消化した後、
放出されたアミノ酸の配列解析を行い決定した。純粋な
ＴＢＰ−Ｉ（３２μｇ）を１ｎｍｏｌｅのノルロイシン
（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）（内部標準物質として）と混
合し、完全に乾燥し、０．８μｇのカルボキシペプチダ
ーゼＹ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有
する８μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．
５中に再懸濁した。消化は室温で行った。異なる時間に
２μｌずつ採取して、３μｌの１０％酢酸を添加して酸
性にした後、１５μｌの０．５％ＥＤＴＡを添加した。
次に自動アミノ酸解析を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｋ．モデル４２０Ａ）。その結
果（図４に示す）は配列−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃ
ＯＯＨを示す。２つ又はそれ以上のアミノ酸を追加的に
含有する小さな画分が検出された。
【００４１】ＴＢＰ−ＩＩ内の配列は、蛋白のトリプシ
ン分解ペプチドを作成して決定した。純粋なＴＢＰ−Ｉ
Ｉ（２００μｇ）の試料を還元し、アルキル化し、Ａｑ
ｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００逆相ＨＰＬＣカラムで精製
した。修飾された蛋白を含有する画分を集めて、ＮａＨ
ＣＯ３でｐＨを８．０に調整した。酵素対基質比１：２
０（Ｗ／Ｗ）で室温で１６時間、ＴＰＣＫトリプシン
（２３８Ｕ／ｍｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，
Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）で消化した。消化物をＣ１３
ＲＰ−Ｐ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｌｉ
ｎｄｅｎ，ＩＮ）にかけ、該ペプチドを０．３％トリフ
ルオロ酢酸水溶液中の０から４０％のアセトニトリルの
直線勾配で分離した。該ペプチドと無傷（ｉｎｔａｃ
ｔ）の蛋白（Ｎ−末端）のＮＨ２−末端アミノ酸配列を
表１に示す。ペプチドは、ＲＰ−Ｐカラムからの溶出の
順番に番号をつけた。配列の不均一性が観察された３
９、４４、４６、５３そして５４の画分では、主要な配
列とそれ以下の配列も示してある。
ン分解ペプチドを作成して決定した。純粋なＴＢＰ−Ｉ
Ｉ（２００μｇ）の試料を還元し、アルキル化し、Ａｑ
ｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００逆相ＨＰＬＣカラムで精製
した。修飾された蛋白を含有する画分を集めて、ＮａＨ
ＣＯ３でｐＨを８．０に調整した。酵素対基質比１：２
０（Ｗ／Ｗ）で室温で１６時間、ＴＰＣＫトリプシン
（２３８Ｕ／ｍｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，
Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）で消化した。消化物をＣ１３
ＲＰ−Ｐ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｌｉ
ｎｄｅｎ，ＩＮ）にかけ、該ペプチドを０．３％トリフ
ルオロ酢酸水溶液中の０から４０％のアセトニトリルの
直線勾配で分離した。該ペプチドと無傷（ｉｎｔａｃ
ｔ）の蛋白（Ｎ−末端）のＮＨ２−末端アミノ酸配列を
表１に示す。ペプチドは、ＲＰ−Ｐカラムからの溶出の
順番に番号をつけた。配列の不均一性が観察された３
９、４４、４６、５３そして５４の画分では、主要な配
列とそれ以下の配列も示してある。
【００４２】ｂ）ｃＤＮＡクローンの単離 ＴＢＰ−Ｉ（図１Ａａ）のＮＨ２−末端アミノ酸配列か
ら得られたヌクレオチド配列から作成される合成オリゴ
ヌクレオチドプローブの３つの混合物（図１Ａｂ、１Ａ
ｃ）を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用
した。コドンがあいまいなため４つのヌクレオチドが考
えられる場合はデオキシイノシンを導入して、４８倍縮
重、２６量体で最初のスクリーニングを行った（図１Ａ
ｂ）。２６塩基プローブに対応する配列の一部を構成す
る２つの重複アミノ酸配列に対応して、９６縮重と１２
８縮重を有する２つの混合１７量体ヌクレオチド配列と
のハイブリダイゼーションを試験することにより、陽性
クローンの正当性を評価した（図１Ａｃとｄ）。縮重プ
ローブで単離した部分的ｃＤＮＡクローンの最も長いク
ローンの５’末端に近接している配列に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブ（図１Ｄ中のヌクレオチド４７８
−４５８）を、全長ｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡライブ
ラリーをさらにスクリーニングするために適用した。Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるプローブの３２Ｐ
標識、細菌集落上へのファージのプレーティング（ｐｌ
ａｔｉｎｇ）、放射標識プローブを使用してのそれらの
スクリーニング、陽性クローンの単離、そしてｃＤＮＡ
挿入体のサブクローニングは、標準的方法に従い実施し
た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｔｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ）。
ら得られたヌクレオチド配列から作成される合成オリゴ
ヌクレオチドプローブの３つの混合物（図１Ａｂ、１Ａ
ｃ）を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用
した。コドンがあいまいなため４つのヌクレオチドが考
えられる場合はデオキシイノシンを導入して、４８倍縮
重、２６量体で最初のスクリーニングを行った（図１Ａ
ｂ）。２６塩基プローブに対応する配列の一部を構成す
る２つの重複アミノ酸配列に対応して、９６縮重と１２
８縮重を有する２つの混合１７量体ヌクレオチド配列と
のハイブリダイゼーションを試験することにより、陽性
クローンの正当性を評価した（図１Ａｃとｄ）。縮重プ
ローブで単離した部分的ｃＤＮＡクローンの最も長いク
ローンの５’末端に近接している配列に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブ（図１Ｄ中のヌクレオチド４７８
−４５８）を、全長ｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡライブ
ラリーをさらにスクリーニングするために適用した。Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるプローブの３２Ｐ
標識、細菌集落上へのファージのプレーティング（ｐｌ
ａｔｉｎｇ）、放射標識プローブを使用してのそれらの
スクリーニング、陽性クローンの単離、そしてｃＤＮＡ
挿入体のサブクローニングは、標準的方法に従い実施し
た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｔｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ）。
【００４３】ｃ）ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列 陽性ラムダＧＴ１１組換えファージから単離されたｃＤ
ＮＡ挿入体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）ベ
クター中にサブクローニングした。ラムダＺＡＰファー
ジ中に見いだされた挿入体は、Ｒ４０８ヘルパーファー
ジ（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１６，ｐ
７８５３−７６００）を用いて、プラスミッドｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターを切断することに
より取り出した。両方向への配列決定は、ジデオキシ鎖
停止方法により行った。ｃＤＮＡをエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩ（”Ｅｒａｓｅ ａ ｂａｓｅ”キット、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で消
化して、両方への配向のｃＤＮＡの、重複する欠失クロ
ーンを作成した。Ｒ４０８ファージを用いて得られる１
本鎖鋳型は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定法（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）により、配列を決定した。
ＮＡ挿入体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）ベ
クター中にサブクローニングした。ラムダＺＡＰファー
ジ中に見いだされた挿入体は、Ｒ４０８ヘルパーファー
ジ（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１６，ｐ
７８５３−７６００）を用いて、プラスミッドｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターを切断することに
より取り出した。両方向への配列決定は、ジデオキシ鎖
停止方法により行った。ｃＤＮＡをエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩ（”Ｅｒａｓｅ ａ ｂａｓｅ”キット、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で消
化して、両方への配向のｃＤＮＡの、重複する欠失クロ
ーンを作成した。Ｒ４０８ファージを用いて得られる１
本鎖鋳型は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定法（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）により、配列を決定した。
【００４４】ｄ）ＣＨＯ細胞中のＩ型ヒトＴＮＦ−Ｒの
構成的発現 修飾したｐＳＶＬ発現ベクター中へＥ１３挿入体を導入
した。リン酸カルシウム沈澱法を用いて、この作成体
を、ＤＨＦＲｃＤＮＡを含有するｐＳＶ２−ＤＨＦＲブ
ラスミッドとともに、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトラ
ンスフェクションした。Ｅ１３を逆方向に有する組換え
ｐＳＶＬベクターによるトランスフェクションを対照と
した。リン酸緩衝化生理食塩水で予め透析した、胎児牛
血清を含むヌクレオチドを含まないＭＥＭアルファ培地
中での増殖により、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞を選
択した。各クローンを採取し、５００ｎＭメソトレキセ
ートナトリウムの存在下での増殖によりトランスフェク
ションしたｃＤＮＡを増幅してさらに選択した。
構成的発現 修飾したｐＳＶＬ発現ベクター中へＥ１３挿入体を導入
した。リン酸カルシウム沈澱法を用いて、この作成体
を、ＤＨＦＲｃＤＮＡを含有するｐＳＶ２−ＤＨＦＲブ
ラスミッドとともに、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトラ
ンスフェクションした。Ｅ１３を逆方向に有する組換え
ｐＳＶＬベクターによるトランスフェクションを対照と
した。リン酸緩衝化生理食塩水で予め透析した、胎児牛
血清を含むヌクレオチドを含まないＭＥＭアルファ培地
中での増殖により、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞を選
択した。各クローンを採取し、５００ｎＭメソトレキセ
ートナトリウムの存在下での増殖によりトランスフェク
ションしたｃＤＮＡを増幅してさらに選択した。
【００４５】ｅ）ＣＨＯ細胞中での表面発現Ｉ型ＴＮＦ
−Ｒの検出 細胞（２．５×１０５細胞／平板の濃度で１５ｍｍ組織
培養平板上に接種した）への放射標識ヒトｒＴＮＦの結
合を、すでに記載された方法（Ｈｏｌｔｍａｎｎ ａｎ
ｄ Ｗａｌｌａｃｈ，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｒａ
ｌ．，１８９，ｐｐ．１１６１−１１６７）で定量し
た。ＣＨＯ細胞に対するＴＢＰ−Ｉのモノクローナル抗
体の結合を試験するために、５ｍＭＥＤＴＡを含有する
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：１４０ｍＭＮａＣ
ｌ、１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭＮａＨＰＯ４、
２．７ｍＫＣｌ、０．５ｍＭｇＣｌ２、０．９ｍＣａＣ
ｌ２）中でインキュベートした後、０．５％牛血清アル
ブミンと１５ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ）中で５０μｇ／ｍｌの試験モノクローナル
抗体と、０℃で４５分インキュベートすることにより分
離した。ＰＢＳ／ＢＳＡで細胞を洗浄した後、マウスＩ
ｇＧのＦ（ａｂ）断片に対するアフィニティ精製したＦ
ＩＴＣ標識ヤギ抗体（ＰＢＳ／ＢＳＡ中１：２０）（Ｂ
ｉｏ−Ｍａｋｏｒ，Ｉｓｒａｅｌ）で、０℃でさらに３
０分間インキュベートし、次にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ蛍光活性化セルソーター４４０を用いて１０
４個の細胞の試料中の蛍光強度を測定して解析した。交
差競合解析（ｃｒｏｓｓ ｃｉｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）によりＴＢＰ−Ｉ分子中の４つの位置
的に異なるエピトープを認識することが証明された（欧
州特許出願Ｎｏ．９０１１５１０５．０）ＴＢＰ−Ｉに
対する３つのモノクローナル抗体（クローン１７、１
８、２０）と、対照としてＴＮＦ−αに対するモノクロ
ーナル抗体（すべて硫酸アンモニウム沈澱により腹水か
ら精製され、ＩｇＧ２アイソタイプである）を使用し
た。
−Ｒの検出 細胞（２．５×１０５細胞／平板の濃度で１５ｍｍ組織
培養平板上に接種した）への放射標識ヒトｒＴＮＦの結
合を、すでに記載された方法（Ｈｏｌｔｍａｎｎ ａｎ
ｄ Ｗａｌｌａｃｈ，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｒａ
ｌ．，１８９，ｐｐ．１１６１−１１６７）で定量し
た。ＣＨＯ細胞に対するＴＢＰ−Ｉのモノクローナル抗
体の結合を試験するために、５ｍＭＥＤＴＡを含有する
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：１４０ｍＭＮａＣ
ｌ、１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭＮａＨＰＯ４、
２．７ｍＫＣｌ、０．５ｍＭｇＣｌ２、０．９ｍＣａＣ
ｌ２）中でインキュベートした後、０．５％牛血清アル
ブミンと１５ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ）中で５０μｇ／ｍｌの試験モノクローナル
抗体と、０℃で４５分インキュベートすることにより分
離した。ＰＢＳ／ＢＳＡで細胞を洗浄した後、マウスＩ
ｇＧのＦ（ａｂ）断片に対するアフィニティ精製したＦ
ＩＴＣ標識ヤギ抗体（ＰＢＳ／ＢＳＡ中１：２０）（Ｂ
ｉｏ−Ｍａｋｏｒ，Ｉｓｒａｅｌ）で、０℃でさらに３
０分間インキュベートし、次にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ蛍光活性化セルソーター４４０を用いて１０
４個の細胞の試料中の蛍光強度を測定して解析した。交
差競合解析（ｃｒｏｓｓ ｃｉｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）によりＴＢＰ−Ｉ分子中の４つの位置
的に異なるエピトープを認識することが証明された（欧
州特許出願Ｎｏ．９０１１５１０５．０）ＴＢＰ−Ｉに
対する３つのモノクローナル抗体（クローン１７、１
８、２０）と、対照としてＴＮＦ−αに対するモノクロ
ーナル抗体（すべて硫酸アンモニウム沈澱により腹水か
ら精製され、ＩｇＧ２アイソタイプである）を使用し
た。
【００４６】ｆ）ＥＬＩＳＡによる可溶性型のＩ型ＴＮ
Ｆ−Ｒの定量 ＴＢＰ−Ｉ特異的モノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体を使用して、サンドイッチ法の高感度酵素結合免
疫吸着定量法を作成した。ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌの抗
体濃度の溶液とともに３７℃で２時間インキュベートす
ることにより、抗ＴＢＰ−Ｉモノクローナル抗体クロー
ン２０（欧州特許出願Ｎｏ．９０１１５１０５．０）を
９６ウェル（ｗｅｌｌ）のＥＬＩＳＡプレート（ｍａｘ
ｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させ
た。リン酸緩衝化生理食塩水、１％ＢＳＡ、０．０２％
ＮａＮ３そして０．０５％ツイーン２０を含む溶液（ブ
ロッキング溶液）で、３７℃でウェルをさらに２時間イ
ンキュベートして蛋白の非特異的吸着をブロックした
後、試験試料を５０μｌ／ウェルで適用した。次に、プ
レートを３７℃で２時間インキュベートした後、０．０
５％ツイーン２０を加えたＰＢＳ（洗浄液）で３回洗浄
し、ブロッキング溶液で１：５００に希釈したＴＢＰ−
Ｉに対するウサギ抗血清をウェルに加えた。４℃でさら
に１２時間インキュベートした後、プレートを再び洗浄
し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合精製ヤギ抗ウサギ
ＩｇＧで２時間インキュベートした。基質として２，２
−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６スル
ホン酸）（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色させた。６００ｎ
ｍで酵素的生成物を比色定量した。精製ＴＢＰ−Ｉを標
準物質として用いた。
Ｆ−Ｒの定量 ＴＢＰ−Ｉ特異的モノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体を使用して、サンドイッチ法の高感度酵素結合免
疫吸着定量法を作成した。ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌの抗
体濃度の溶液とともに３７℃で２時間インキュベートす
ることにより、抗ＴＢＰ−Ｉモノクローナル抗体クロー
ン２０（欧州特許出願Ｎｏ．９０１１５１０５．０）を
９６ウェル（ｗｅｌｌ）のＥＬＩＳＡプレート（ｍａｘ
ｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させ
た。リン酸緩衝化生理食塩水、１％ＢＳＡ、０．０２％
ＮａＮ３そして０．０５％ツイーン２０を含む溶液（ブ
ロッキング溶液）で、３７℃でウェルをさらに２時間イ
ンキュベートして蛋白の非特異的吸着をブロックした
後、試験試料を５０μｌ／ウェルで適用した。次に、プ
レートを３７℃で２時間インキュベートした後、０．０
５％ツイーン２０を加えたＰＢＳ（洗浄液）で３回洗浄
し、ブロッキング溶液で１：５００に希釈したＴＢＰ−
Ｉに対するウサギ抗血清をウェルに加えた。４℃でさら
に１２時間インキュベートした後、プレートを再び洗浄
し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合精製ヤギ抗ウサギ
ＩｇＧで２時間インキュベートした。基質として２，２
−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６スル
ホン酸）（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色させた。６００ｎ
ｍで酵素的生成物を比色定量した。精製ＴＢＰ−Ｉを標
準物質として用いた。
【００４７】ｇ）トランスフェクションしたＣＨＯ細胞
の培地中での可溶性型Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出とその逆相
ＨＰＬＣによる解析 培地交換後４８時間目に集めた、試験ＣＨＯ細胞の培地
の試料中の可溶性型Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの量を、上記の免疫
測定法で定量した。逆相ＨＰＬＣによる可溶性リセプタ
ーの解析のために、無血清培地（ヌクレオチドを含まな
いＭＥＭα）中で４８時間培養した。ＡｍｉｃｏｎＰＭ
５膜による限外濾過により培地試料を１００倍濃縮した
後、予め０．３％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化した
ＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００カラム（４．５×３０ｍ
ｍ、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂｓ）にかけた。非結合の
蛋白がすべて除去されるまで０．５ｍｌ／分の速度で、
この溶液でカラムを洗浄した後、前記（Ｅｎｇｅｌｍａ
ｎｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６４，ｐ１１９７４−１１９
８０）のように０．３％トリフルオロ酢酸水溶液中のア
セトニトリルの濃度勾配で溶出した。０．５ｍｌの画分
を集め、真空中で濃縮した後、１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液ペ
プチドは９．０で中和した。画分中の可溶性Ｉ型ＴＮＦ
−Ｒの量をＥＬＩＳＡで定量し、蛋白濃度はフルオレス
カミン法により定量した。
の培地中での可溶性型Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出とその逆相
ＨＰＬＣによる解析 培地交換後４８時間目に集めた、試験ＣＨＯ細胞の培地
の試料中の可溶性型Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの量を、上記の免疫
測定法で定量した。逆相ＨＰＬＣによる可溶性リセプタ
ーの解析のために、無血清培地（ヌクレオチドを含まな
いＭＥＭα）中で４８時間培養した。ＡｍｉｃｏｎＰＭ
５膜による限外濾過により培地試料を１００倍濃縮した
後、予め０．３％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化した
ＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００カラム（４．５×３０ｍ
ｍ、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂｓ）にかけた。非結合の
蛋白がすべて除去されるまで０．５ｍｌ／分の速度で、
この溶液でカラムを洗浄した後、前記（Ｅｎｇｅｌｍａ
ｎｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６４，ｐ１１９７４−１１９
８０）のように０．３％トリフルオロ酢酸水溶液中のア
セトニトリルの濃度勾配で溶出した。０．５ｍｌの画分
を集め、真空中で濃縮した後、１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液ペ
プチドは９．０で中和した。画分中の可溶性Ｉ型ＴＮＦ
−Ｒの量をＥＬＩＳＡで定量し、蛋白濃度はフルオレス
カミン法により定量した。
【００４８】例２ ａ）Ｉ型ＴＮＦ−ＲのｃＤＮＡのクローニング ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−Ｉとその関連蛋白ＴＮＦリセプ
ターのｃＤＮＡをクローニングするために、ＴＢＰ−Ｉ
のＮＨ２−末端アミノ酸配列に基づきデザインした３つ
の重複オリゴヌクレオチドプローブ（図１Ａ）を用いて
数個のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒ
ト大腸のｍＲＮＡから得られるラムダＧＴ１１ライブラ
リー（ランダムにプライム（ｐｒｉｍｅ）されている、
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に、
３つのプローブとハイブリダイゼーションする４つの組
換えファージが検出された。これらの４つのファージの
挿入体は同じ大きさであり、制限マッピングと配列解析
により重複することが見いだされた。
ターのｃＤＮＡをクローニングするために、ＴＢＰ−Ｉ
のＮＨ２−末端アミノ酸配列に基づきデザインした３つ
の重複オリゴヌクレオチドプローブ（図１Ａ）を用いて
数個のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒ
ト大腸のｍＲＮＡから得られるラムダＧＴ１１ライブラ
リー（ランダムにプライム（ｐｒｉｍｅ）されている、
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に、
３つのプローブとハイブリダイゼーションする４つの組
換えファージが検出された。これらの４つのファージの
挿入体は同じ大きさであり、制限マッピングと配列解析
により重複することが見いだされた。
【００４９】この４つのうちで一番長いもの（図１Ｂの
Ｃ２、１９８９年６月２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）、
パリ、フランスに寄託された、寄託Ｎｏ．Ｉ−９１７）
の配列の完全な解析から、全長に伸びたオープンリーデ
ィングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍ
ｅ）が明らかになった。このリーディングフレームにコ
ードされているポリペプチド鎖は、ＴＢＰ−ＩのＮＨ２
−末端アミノ酸配列に充分一致する。Ｃ２挿入体には開
始コドンも停止コドンも見いだされなかった。Ｃ２に見
いだされる配列（例１：操作法を参照）に対応する別の
プローブを使用して再度大腸ｃＤＮＡライブラリーを再
スクリーニングすると、Ｃ２挿入体に重複する挿入体を
含有する数個の他の組換えファージが得られた。しかし
これらのどれも５’又は３’方向へのｃＤＮＡに関して
配列の情報を与えなかった。ＣＥＭリンパ球のｍＲＮＡ
から得られるラムダＺＡＰｃＤＮＡライブラリー（オリ
ゴｄＴで、ランダムにプライムされている、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）の中に、このプローブとハイブリダイゼーショ
ンする５つのファージがあり、これらはＣ２より有意に
長い挿入体を含有していた。
Ｃ２、１９８９年６月２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）、
パリ、フランスに寄託された、寄託Ｎｏ．Ｉ−９１７）
の配列の完全な解析から、全長に伸びたオープンリーデ
ィングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍ
ｅ）が明らかになった。このリーディングフレームにコ
ードされているポリペプチド鎖は、ＴＢＰ−ＩのＮＨ２
−末端アミノ酸配列に充分一致する。Ｃ２挿入体には開
始コドンも停止コドンも見いだされなかった。Ｃ２に見
いだされる配列（例１：操作法を参照）に対応する別の
プローブを使用して再度大腸ｃＤＮＡライブラリーを再
スクリーニングすると、Ｃ２挿入体に重複する挿入体を
含有する数個の他の組換えファージが得られた。しかし
これらのどれも５’又は３’方向へのｃＤＮＡに関して
配列の情報を与えなかった。ＣＥＭリンパ球のｍＲＮＡ
から得られるラムダＺＡＰｃＤＮＡライブラリー（オリ
ゴｄＴで、ランダムにプライムされている、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）の中に、このプローブとハイブリダイゼーショ
ンする５つのファージがあり、これらはＣ２より有意に
長い挿入体を含有していた。
【００５０】最も長い挿入体（Ｅ１３、図１Ｂ）の配列
を完全に決定し（図１Ｄ）、５’と３’末端にそれぞれ
翻訳されない２５５と５５５ヌクレオチドの領域に隣接
して１３６５塩基対の長いオープンリーディングフレー
ムの中にＣ２配列（図１Ｄのヌクレオチド３４６−１２
７７）を含むことが見いだされた。このヌクレオチド配
列中の２５６−２５８位にあるＡＴＧ開始コドンと考え
られる部位（図１Ｄで星印で示してある）は、その上流
にフレーム内停止コドンが２４４−２４６塩基にある。
この開始位置は、翻訳開始コンセンサス配列（ＧＧＣＡ
ＴＧＧ、ヌクレオチド配列２５３−２５９）の代替配列
の可能性のある１つに一致する。
を完全に決定し（図１Ｄ）、５’と３’末端にそれぞれ
翻訳されない２５５と５５５ヌクレオチドの領域に隣接
して１３６５塩基対の長いオープンリーディングフレー
ムの中にＣ２配列（図１Ｄのヌクレオチド３４６−１２
７７）を含むことが見いだされた。このヌクレオチド配
列中の２５６−２５８位にあるＡＴＧ開始コドンと考え
られる部位（図１Ｄで星印で示してある）は、その上流
にフレーム内停止コドンが２４４−２４６塩基にある。
この開始位置は、翻訳開始コンセンサス配列（ＧＧＣＡ
ＴＧＧ、ヌクレオチド配列２５３−２５９）の代替配列
の可能性のある１つに一致する。
【００５１】ｃＤＮＡの３’末端の近くには特徴のある
ポリ（Ａ）追加シグナルは存在しない。ヌクレオチド配
列２０４５−２０５０の配列ＡＣＴＡＡＡは、このシグ
ナルの代わりになるかも知れないが、効率は低いであろ
う。ヌクレオチド配列１９６５−２０００に配列Ｇ
（Ｔ）ｎ（ｎは４から８の間で変化する）の６つの連続
的繰り返しがある。
ポリ（Ａ）追加シグナルは存在しない。ヌクレオチド配
列２０４５−２０５０の配列ＡＣＴＡＡＡは、このシグ
ナルの代わりになるかも知れないが、効率は低いであろ
う。ヌクレオチド配列１９６５−２０００に配列Ｇ
（Ｔ）ｎ（ｎは４から８の間で変化する）の６つの連続
的繰り返しがある。
【００５２】ｃＤＮＡにコードされる蛋白の大きさ（約
５０キロダルトン）は、ＴＢＰ−Ｉより有意に大きい。
この蛋白のアミノ酸配列（図１Ｃ）のハイドロパシー指
数の計算から、２つの主要な疎水性領域が明らかになっ
た（図１Ｄの角の丸い四角で囲った部分を参照）。ＮＨ
２−末端にある１つはおそらくシグナルペプチドであ
り、切断部位はグリシンとイソロイシン（図１Ｄでそれ
ぞれ−１と＋１で表示されている）の間であろう。１９
１と２１３残基の間に位置するもう１つの主要な疎水性
領域は、膜のアンカリング領域（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ
ｒｅｇｉｏｎ）に特徴的な数個の荷電アミノ酸が両端に
隣接している。他の数種の経膜蛋白のように、ＣＯＯＨ
−末端の疎水性領域を囲っているアミノ酸は塩基性であ
る。経膜領域は予想される蛋白を、ほとんど同じ大きさ
の細胞外と細胞内領域の２つに切断している。
５０キロダルトン）は、ＴＢＰ−Ｉより有意に大きい。
この蛋白のアミノ酸配列（図１Ｃ）のハイドロパシー指
数の計算から、２つの主要な疎水性領域が明らかになっ
た（図１Ｄの角の丸い四角で囲った部分を参照）。ＮＨ
２−末端にある１つはおそらくシグナルペプチドであ
り、切断部位はグリシンとイソロイシン（図１Ｄでそれ
ぞれ−１と＋１で表示されている）の間であろう。１９
１と２１３残基の間に位置するもう１つの主要な疎水性
領域は、膜のアンカリング領域（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ
ｒｅｇｉｏｎ）に特徴的な数個の荷電アミノ酸が両端に
隣接している。他の数種の経膜蛋白のように、ＣＯＯＨ
−末端の疎水性領域を囲っているアミノ酸は塩基性であ
る。経膜領域は予想される蛋白を、ほとんど同じ大きさ
の細胞外と細胞内領域の２つに切断している。
【００５３】細胞外領域は、アスパラギン結合グリコシ
ル化の３つの推定部位を有している（図１Ｄで上に線が
引いてある）。細胞外領域のオリゴヌクレオチドの量が
現在ＴＢＰ−Ｉについて報告されているもの（Ｓｅｃｋ
ｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９ｂ） サ
イトカインＩ、Ｖｏｌ．１４９（要約））と同じである
と仮定すると、成熟蛋白の分子の大きさは、Ｉ型リセプ
ターについて推定されているもの（約５８キロダルト
ン）に非常に近い（Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｈ．Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏ
ｌ．２６４，ｐ１４９２７−１４９３４）。
ル化の３つの推定部位を有している（図１Ｄで上に線が
引いてある）。細胞外領域のオリゴヌクレオチドの量が
現在ＴＢＰ−Ｉについて報告されているもの（Ｓｅｃｋ
ｉｎｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９ｂ） サ
イトカインＩ、Ｖｏｌ．１４９（要約））と同じである
と仮定すると、成熟蛋白の分子の大きさは、Ｉ型リセプ
ターについて推定されているもの（約５８キロダルト
ン）に非常に近い（Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｈ．Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏ
ｌ．２６４，ｐ１４９２７−１４９３４）。
【００５４】ｂ）Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの予想されるアミノ酸
配列の特徴とＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩの構造の関係 Ｅ１３ｃＤＮＡでコードされる蛋白の細胞外領域のアミ
ノ酸配列は、ＴＢＰ−Ｉで決められた数種のアミノ酸配
列に充分一致する（表１）。それは、アミノ酸２０−３
２にＴＢＰ−ＩのＮＨ２−末端アミノ酸配列（図１Ｄと
図１Ａａを比較せよ）、アミノ酸１７８−１８０にＴＢ
Ｐ−ＩのＣＯＯＨ−末端に対応する配列；そしてまたコ
ードされた蛋白のさらに下流に位置する最初のメチオニ
ンに隣接して、ＴＢＰ−Ｉの臭化シアン切断断片のＮＨ
２−末端アミノ酸配列と同一の配列（図１Ｄの破線）を
含有する。また細胞外領域とＴＢＰ−Ｉのアミノ酸組成
に顕著な類似性がある（表２）。
配列の特徴とＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩの構造の関係 Ｅ１３ｃＤＮＡでコードされる蛋白の細胞外領域のアミ
ノ酸配列は、ＴＢＰ−Ｉで決められた数種のアミノ酸配
列に充分一致する（表１）。それは、アミノ酸２０−３
２にＴＢＰ−ＩのＮＨ２−末端アミノ酸配列（図１Ｄと
図１Ａａを比較せよ）、アミノ酸１７８−１８０にＴＢ
Ｐ−ＩのＣＯＯＨ−末端に対応する配列；そしてまたコ
ードされた蛋白のさらに下流に位置する最初のメチオニ
ンに隣接して、ＴＢＰ−Ｉの臭化シアン切断断片のＮＨ
２−末端アミノ酸配列と同一の配列（図１Ｄの破線）を
含有する。また細胞外領域とＴＢＰ−Ｉのアミノ酸組成
に顕著な類似性がある（表２）。
【００５５】このアミノ酸組成の最も目だつ特徴は、シ
ステイン残基の含量が非常に高いことである（図１Ｄで
四角で囲ってある）。細胞外領域内の他のアミノ酸とと
もにシステインの位置は、４倍の繰り返しパターンを示
す（図１Ｄで下線で示してある）。ＴＢＰ−ＩのＣＯＯ
Ｈ−末端配列に対応するＴＮＦ−Ｒの細胞外領域内のア
ミノ酸配列（表１と図７を参照）は、システインの多い
繰り返し領域のＣＯＯＨ−末端に存在している。ＴＢＰ
−ＩのＮＨ２−末端配列に対応する配列は、細胞外領域
内のこの領域のＮＨ２−末端のアミノ酸数個分上流に位
置する配列に対応する（図１Ｄの破線）。
ステイン残基の含量が非常に高いことである（図１Ｄで
四角で囲ってある）。細胞外領域内の他のアミノ酸とと
もにシステインの位置は、４倍の繰り返しパターンを示
す（図１Ｄで下線で示してある）。ＴＢＰ−ＩのＣＯＯ
Ｈ−末端配列に対応するＴＮＦ−Ｒの細胞外領域内のア
ミノ酸配列（表１と図７を参照）は、システインの多い
繰り返し領域のＣＯＯＨ−末端に存在している。ＴＢＰ
−ＩのＮＨ２−末端配列に対応する配列は、細胞外領域
内のこの領域のＮＨ２−末端のアミノ酸数個分上流に位
置する配列に対応する（図１Ｄの破線）。
【００５６】ＴＢＰ−ＩとＩ型ＴＮＦリセプターの間の
アミノ酸配列の同一性に対して、可溶性型のＩＩ型ＴＮ
Ｆ−Ｒで調べた配列（ＴＢＰ−ＩＩ、表１）は、Ｉ型Ｔ
ＮＦ−Ｒのどの配列にも対応しなかった。２つのリセプ
ターの間に免疫学的交差反応性が欠如していることか
ら、これは予想されることであった（Ｅｎｇｅｌｍａｎ
ｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６）。
アミノ酸配列の同一性に対して、可溶性型のＩＩ型ＴＮ
Ｆ−Ｒで調べた配列（ＴＢＰ−ＩＩ、表１）は、Ｉ型Ｔ
ＮＦ−Ｒのどの配列にも対応しなかった。２つのリセプ
ターの間に免疫学的交差反応性が欠如していることか
ら、これは予想されることであった（Ｅｎｇｅｌｍａｎ
ｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６５，ｐ１５３１−１５３６）。
【００５７】Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの推定される細胞外領域の
システイン残基の含量が非常に高いのに対して、細胞内
領域にはシステイン残基は５つしかない。経膜領域に近
い２つ（２２７と２８３位）の間には、プロリン残基が
多く（残基の１５％）、セリンとスレオニンがもっと多
く（３６％）、その大部分はお互いに非常に接近して又
は隣接して存在している、５５個のアミノ酸が伸びてい
る。
システイン残基の含量が非常に高いのに対して、細胞内
領域にはシステイン残基は５つしかない。経膜領域に近
い２つ（２２７と２８３位）の間には、プロリン残基が
多く（残基の１５％）、セリンとスレオニンがもっと多
く（３６％）、その大部分はお互いに非常に接近して又
は隣接して存在している、５５個のアミノ酸が伸びてい
る。
【００５８】例３ Ｉ型ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡの発現 Ｅ１３ｃＤＮＡそしてさらにＴＢＰ−Ｉにコードされる
蛋白の関係を探るために、この蛋白をＣＨＯ細胞中で発
現させた。Ｅ１３ｃＤＮＡを発現ベクター中に導入し、
ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ
を含有する組換えベクターでＤＨＦＲ欠損細胞中にコト
ランスフェクションした。ヌクレオチドを含まない培地
中で増殖させて選択した後、各クローンをメソトレキセ
ート存在下で増殖させて増幅した。ＴＢＰ−Ｉの位置的
に異なるエピトープに結合する数個のモノクローナル抗
体と反応するいくつかのクローンが検出された（図
２）。蛋白の発現は、ヒトＴＮＦの細胞への特異的結合
の増加に相関した（表３）。
蛋白の関係を探るために、この蛋白をＣＨＯ細胞中で発
現させた。Ｅ１３ｃＤＮＡを発現ベクター中に導入し、
ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ
を含有する組換えベクターでＤＨＦＲ欠損細胞中にコト
ランスフェクションした。ヌクレオチドを含まない培地
中で増殖させて選択した後、各クローンをメソトレキセ
ート存在下で増殖させて増幅した。ＴＢＰ−Ｉの位置的
に異なるエピトープに結合する数個のモノクローナル抗
体と反応するいくつかのクローンが検出された（図
２）。蛋白の発現は、ヒトＴＮＦの細胞への特異的結合
の増加に相関した（表３）。
【００５９】この蛋白に対するポリクローナル抗体とモ
ノクローナル抗体を使用した高感度の免疫測定法（操作
法、例１ｆ）を適用して、その表面にヒトＴＮＦ−Ｒを
発現するＣＨＯ細胞の培地中に、また可溶性型の蛋白が
検出された（表３）。ＴＮＦ−Ｒを発現した５つの異な
るＣＨＯクローンのすべてがこの可溶性蛋白を産生し
た。この細胞表面リセプターを発現しない他のいくつか
のトランスフェクションされたクローンは、その可溶性
型も産生しなかった。逆相ＨＰＬＣで解析すると、ＣＨ
Ｏ酸性可溶性ＴＮＦ−Ｒは単一のピークとして溶出し、
保持時間はＴＢＰ−Ｉと同じであった（図３）。
ノクローナル抗体を使用した高感度の免疫測定法（操作
法、例１ｆ）を適用して、その表面にヒトＴＮＦ−Ｒを
発現するＣＨＯ細胞の培地中に、また可溶性型の蛋白が
検出された（表３）。ＴＮＦ−Ｒを発現した５つの異な
るＣＨＯクローンのすべてがこの可溶性蛋白を産生し
た。この細胞表面リセプターを発現しない他のいくつか
のトランスフェクションされたクローンは、その可溶性
型も産生しなかった。逆相ＨＰＬＣで解析すると、ＣＨ
Ｏ酸性可溶性ＴＮＦ−Ｒは単一のピークとして溶出し、
保持時間はＴＢＰ−Ｉと同じであった（図３）。
【００６０】例４ ＴＢＰ−ＩをコードするｃＤＮＡのクローニングとチャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのＴＢＰ−
Ｉの発現 哺乳動物細胞中でのＩ型ヒトＴＮＦレセプターの可溶性
領域をコードするＤＮＡの効率的な発現に適したプラス
ミッドを得るため、図１Ｄで示した２５６−８５８の位
置のＤＮＡ配列を発現ベクター中でクローン化した：１
つのプラスミッドでは遺伝子発現はＳＶ４０初期遺伝子
下にあり；２つ目のプラスミッドでは遣伝子発現はサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあ
る。これらのベクターはＣａＰＯ４沈澱法により、プラ
スミッドＤＨＦＲ選択遣伝子マーカーとともにＣＨＯ細
胞に導入された。
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのＴＢＰ−
Ｉの発現 哺乳動物細胞中でのＩ型ヒトＴＮＦレセプターの可溶性
領域をコードするＤＮＡの効率的な発現に適したプラス
ミッドを得るため、図１Ｄで示した２５６−８５８の位
置のＤＮＡ配列を発現ベクター中でクローン化した：１
つのプラスミッドでは遺伝子発現はＳＶ４０初期遺伝子
下にあり；２つ目のプラスミッドでは遣伝子発現はサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあ
る。これらのベクターはＣａＰＯ４沈澱法により、プラ
スミッドＤＨＦＲ選択遣伝子マーカーとともにＣＨＯ細
胞に導入された。
【００６１】発現ベクターの作成 １）ＳＶ４０初期プロモーター−ＴＢＰ−Ｉ融合；プラ
スミッドｐＳＶ−ＴＢＰ ＴＢＰ−Ｉの構成的発現は、強いＳＶ４０初期プロモー
ターに融合したＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含
有する発現ベクターを用いることにより、可能である
（図５）。
スミッドｐＳＶ−ＴＢＰ ＴＢＰ−Ｉの構成的発現は、強いＳＶ４０初期プロモー
ターに融合したＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含
有する発現ベクターを用いることにより、可能である
（図５）。
【００６２】段階１：ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ断
片（そのシグナルペプチドを含み、アミノ酸１８０に伸
びている）をＰＣＲ増幅法により調製した。増幅のため
に２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し
た：５’末端プライマーは、シグナルペプチドの最初の
７つのアミノ酸をコードする配列を含み、その前に６つ
のヌクレオチドがある：３’末端オリゴヌクレオチド
は、アミノ酸残基１７４から１８０までをコードする配
列を含有し、その後に２つの停止コドンがある（ＴＧＡ
とＴＡＡ）。
片（そのシグナルペプチドを含み、アミノ酸１８０に伸
びている）をＰＣＲ増幅法により調製した。増幅のため
に２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し
た：５’末端プライマーは、シグナルペプチドの最初の
７つのアミノ酸をコードする配列を含み、その前に６つ
のヌクレオチドがある：３’末端オリゴヌクレオチド
は、アミノ酸残基１７４から１８０までをコードする配
列を含有し、その後に２つの停止コドンがある（ＴＧＡ
とＴＡＡ）。
【００６３】ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである。
【００６４】段階２： 配列を証明した後、増幅したＤ
ＮＡ断片を、ブラント末端結合法により、プラスミッド
ｐＧＥＭ−１のＨｉｎｃＩＩ制限部位にクローン化し
た。プラスミッドｐＴＢＰ−１６とｐＴＢＰ−１７はこ
うして得られた２つのプラスミッドであり、クローニン
グベクターに関してＴＢＰ−Ｉ挿入体の配向が異なる。
ＮＡ断片を、ブラント末端結合法により、プラスミッド
ｐＧＥＭ−１のＨｉｎｃＩＩ制限部位にクローン化し
た。プラスミッドｐＴＢＰ−１６とｐＴＢＰ−１７はこ
うして得られた２つのプラスミッドであり、クローニン
グベクターに関してＴＢＰ−Ｉ挿入体の配向が異なる。
【００６５】段階３： ２つの隣接制限部位ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（５’末端）とＢａｍＨＩ（３’末端）を使用し
て、プラスミッドｐＴＢＰ−１７からＴＢＰ−Ｉを含む
ＤＮＡ断片を切り出した。
ＩＩ（５’末端）とＢａｍＨＩ（３’末端）を使用し
て、プラスミッドｐＴＢＰ−１７からＴＢＰ−Ｉを含む
ＤＮＡ断片を切り出した。
【００６６】段階４： 最後にこの断片を、発現ベクタ
ーｐＳＶＥ３のＨｉｎｄＩＩＩとＢｃｌＩ制限部位の間
にクローン化した。
ーｐＳＶＥ３のＨｉｎｄＩＩＩとＢｃｌＩ制限部位の間
にクローン化した。
【００６７】得られるプラスミッドをｐＳＶ−ＴＢＰと
呼ぶ（図５）。
呼ぶ（図５）。
【００６８】２）ＣＭＶプロモーター−ＴＢＰ−Ｉ融
合：プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰ 別の方法では、ＴＢＰ−Ｉの構成的発現は、ＣＭＶプロ
モーターに融合されたＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターを使用して行われる（図
６）。
合：プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰ 別の方法では、ＴＢＰ−Ｉの構成的発現は、ＣＭＶプロ
モーターに融合されたＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターを使用して行われる（図
６）。
【００６９】ＣＭＶに基づくベクターの作成の最初の２
つの段階は、上記のＳＶ４０−ＴＢＰ−Ｉ融合プラスミ
ッドの作成について記載したものと同じである。
つの段階は、上記のＳＶ４０−ＴＢＰ−Ｉ融合プラスミ
ッドの作成について記載したものと同じである。
【００７０】段階３： ２つの隣接制限部位ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（５’末端）とＸｂａＩ（３’末端）を使用して、
プラスミッドｐＴＢＰ−１７からＴＢＰ−Ｉを含むＤＮ
Ａ断片を切り出した。
ＩＩ（５’末端）とＸｂａＩ（３’末端）を使用して、
プラスミッドｐＴＢＰ−１７からＴＢＰ−Ｉを含むＤＮ
Ａ断片を切り出した。
【００７１】段階４： 最後にこの断片を、発現ベクタ
ーＲｃ／ＣＭＶのＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限部位の
間にクローン化した。
ーＲｃ／ＣＭＶのＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限部位の
間にクローン化した。
【００７２】こうして得られるプラスミッドをｐＣＭＶ
−ＴＢＰと呼ぶ。
−ＴＢＰと呼ぶ。
【００７３】ＣＨＯ細胞中でのヒトＴＢＰ−Ｉの発現 ＤＨＦＲ活性の欠如したＣＨＯ細胞ＣＨＯ−Ｋ１ＤＨＦ
Ｒ−を、切断されていないｐＳＶ−ＴＢＰＤＮＡ（７３
μｇ）とｍｐＳＶ２ＤＨＦＲ（６μｇ）の１２：１混合
物とともに、ＣａＰＯ４共沈澱法により形質転換させ
た。後者は選択マーカーである。 あるいはＣＨＯ細胞
をｐＣＭＶ−ＴＢＰ（３０μｇ）とｍｐＳＶ２ＤＨＦＲ
（６μｇ）の５：１混合物で形質転換させた。
Ｒ−を、切断されていないｐＳＶ−ＴＢＰＤＮＡ（７３
μｇ）とｍｐＳＶ２ＤＨＦＲ（６μｇ）の１２：１混合
物とともに、ＣａＰＯ４共沈澱法により形質転換させ
た。後者は選択マーカーである。 あるいはＣＨＯ細胞
をｐＣＭＶ−ＴＢＰ（３０μｇ）とｍｐＳＶ２ＤＨＦＲ
（６μｇ）の５：１混合物で形質転換させた。
【００７４】１０％の胎児牛血清（ＦＣＳ）を含む栄養
混合物Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で、５％ＣＯ２で３７℃
で細胞を増殖させた。ＤＮＡトランスフェクションのた
めに、５×１０個の細胞を９ｃｍのプレート中で１日培
養した。０．４５ｍｌのトリス−塩酸ｐＨ７．９、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解したプラスミッドＤＮＡを０．
０５ｍｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２と混合して、ＣａＰＯ
４−ＤＮＡ共沈澱物を調製した；次に０．５ｍｌの２８
０ｍＭＮａ２ＰＯ４、５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ
７．１を、静かに攪拌しながら加えた。沈澱を形成させ
るため、混合物を室温で３０−４０分間放置した。Ｃａ
ＰＯ４−ＤＮＡを細胞に添加して、細胞を室温に３０分
間放置して、９ｍｌの栄養混合物Ｆ１２、１０％ＦＣＳ
を加え、培養物を４時間ＣＯ２インキュベーターに戻し
た。培地を除去し、Ｆ１２中１０％のグリセロールで浸
透圧ショックを与えた。非選択培地中で４８時間増殖の
後、細胞をトリプシン分解し、選択培地（ダルベッコー
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｈ２１，Ｇｉｂｃｏ）
１５０μｇ／ｍｌプロリン、そして１０％ＦＣＳから成
り、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で充分透析して
ある）中にサブ培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）した。あ
る場合には、ヌクレオチドのないＭＥＭアルファ培地
（Ｆ２０、Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培養物を３７℃に
維持し、３−４日毎に１０％ＣＯ２と培地を交換した。
約１５日後にクローンを単離し、トリプシン分解し、増
殖させて大量培養した。
混合物Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で、５％ＣＯ２で３７℃
で細胞を増殖させた。ＤＮＡトランスフェクションのた
めに、５×１０個の細胞を９ｃｍのプレート中で１日培
養した。０．４５ｍｌのトリス−塩酸ｐＨ７．９、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解したプラスミッドＤＮＡを０．
０５ｍｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２と混合して、ＣａＰＯ
４−ＤＮＡ共沈澱物を調製した；次に０．５ｍｌの２８
０ｍＭＮａ２ＰＯ４、５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ
７．１を、静かに攪拌しながら加えた。沈澱を形成させ
るため、混合物を室温で３０−４０分間放置した。Ｃａ
ＰＯ４−ＤＮＡを細胞に添加して、細胞を室温に３０分
間放置して、９ｍｌの栄養混合物Ｆ１２、１０％ＦＣＳ
を加え、培養物を４時間ＣＯ２インキュベーターに戻し
た。培地を除去し、Ｆ１２中１０％のグリセロールで浸
透圧ショックを与えた。非選択培地中で４８時間増殖の
後、細胞をトリプシン分解し、選択培地（ダルベッコー
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｈ２１，Ｇｉｂｃｏ）
１５０μｇ／ｍｌプロリン、そして１０％ＦＣＳから成
り、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で充分透析して
ある）中にサブ培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）した。あ
る場合には、ヌクレオチドのないＭＥＭアルファ培地
（Ｆ２０、Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培養物を３７℃に
維持し、３−４日毎に１０％ＣＯ２と培地を交換した。
約１５日後にクローンを単離し、トリプシン分解し、増
殖させて大量培養した。
【００７５】チミジンが欠如した培地（透析血清を含む
ＤＭＥＭ）中で増殖する形質転換体を得た。例１ｆに記
載した酵素結合免疫定量法により、分泌された蛋白の濃
度を測定して、各形質転換クローンの培養上澄液又は混
合物集団の培養上澄液をＴＢＰ−Ｉについてスクリーニ
ングした。混合物細胞集団の培養上澄液に１０ｎｇ／ｍ
ｌ迄の濃度のＴＢＰ−Ｉが検出された。
ＤＭＥＭ）中で増殖する形質転換体を得た。例１ｆに記
載した酵素結合免疫定量法により、分泌された蛋白の濃
度を測定して、各形質転換クローンの培養上澄液又は混
合物集団の培養上澄液をＴＢＰ−Ｉについてスクリーニ
ングした。混合物細胞集団の培養上澄液に１０ｎｇ／ｍ
ｌ迄の濃度のＴＢＰ−Ｉが検出された。
【００７６】この例は、Ｉ型ＴＮＦリセプターの可溶性
領域をコードするＤＮＡで、哺乳動物細胞をトランスフ
ェクションすることにより、ＴＢＰ−Ｉ又は類似の可溶
性蛋白が得られることを示している。
領域をコードするＤＮＡで、哺乳動物細胞をトランスフ
ェクションすることにより、ＴＢＰ−Ｉ又は類似の可溶
性蛋白が得られることを示している。
【００７７】例５ 大腸菌でのＴＢＰ−Ｉの発現 大腸菌でのＴＢＰ−Ｉの発現のために、シグナルペプチ
ドと最初の１９個のアミノ酸（Ａｒｇ）をコードする配
列を除去しなければならない。さらにＡｓｐ残基の前に
はＭｅｔ残基がなければならない。次に好適な断片を、
ハイブリッドｔｒｙｐ−ｌａｃプロモーターを含む発現
ベクターｐＫＫ２２３−３中にクローン化した。この目
的の達成のために、プラスミッドｐＴＢＰ−１６（図
５）を、２つのユニークな制限部位ＳｔｙＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断した。ＳｔｙＩ制限部位はは、Ｃ／ＣＡＡ
ＧＧであり、従ってこれはＰｒｏ２４のあとで切断され
る。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位はプラスミッドのポリリン
カー中に位置し、Ａｓｎ１８０に続く２つの添加した停
止コドンの下流にある（図５）。
ドと最初の１９個のアミノ酸（Ａｒｇ）をコードする配
列を除去しなければならない。さらにＡｓｐ残基の前に
はＭｅｔ残基がなければならない。次に好適な断片を、
ハイブリッドｔｒｙｐ−ｌａｃプロモーターを含む発現
ベクターｐＫＫ２２３−３中にクローン化した。この目
的の達成のために、プラスミッドｐＴＢＰ−１６（図
５）を、２つのユニークな制限部位ＳｔｙＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断した。ＳｔｙＩ制限部位はは、Ｃ／ＣＡＡ
ＧＧであり、従ってこれはＰｒｏ２４のあとで切断され
る。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位はプラスミッドのポリリン
カー中に位置し、Ａｓｎ１８０に続く２つの添加した停
止コドンの下流にある（図５）。
【００７８】ＴＢＰ−Ｉをコードする得られるＤＮＡ断
片は、無傷の３’末端と先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ）５’末端（ＳｔｙＩ部位に先行する配列をＡｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏをコードする配列が
除去されている）を有する。
片は、無傷の３’末端と先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ）５’末端（ＳｔｙＩ部位に先行する配列をＡｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏをコードする配列が
除去されている）を有する。
【００７９】ＳｔｙＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の発現ベク
ターｐＫＫ２２３−３へのクローニングのために、以下
の合成オリゴヌクレオチドを使用した：
ターｐＫＫ２２３−３へのクローニングのために、以下
の合成オリゴヌクレオチドを使用した：
【化１】
【００８０】この２本鎖オリゴヌクレオチドの１つの端
はＥｃｏＲＩ制限部位である。この末端は、ｔｒｙｐ−
ｌａｃプロモーターの下流に位置するプラスミッドｐＫ
Ｋ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位に結合されている。この
２本鎖オリゴヌクレオチドの２つ目の端は、ＴＢＰＩＤ
ＮＡ断片のＳｔｙＩに結合したＳｔｙＩ制限部位であ
る。
はＥｃｏＲＩ制限部位である。この末端は、ｔｒｙｐ−
ｌａｃプロモーターの下流に位置するプラスミッドｐＫ
Ｋ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位に結合されている。この
２本鎖オリゴヌクレオチドの２つ目の端は、ＴＢＰＩＤ
ＮＡ断片のＳｔｙＩに結合したＳｔｙＩ制限部位であ
る。
【００８１】残りの配列は、最初の５つのアミノ酸をコ
ードするコドンは復元され、Ａｓｐ２０の前に追加のＭ
ｅｔコドンが加えられているようなものである。Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドｐＫＫ２
２３−３を、２本鎖合成オリゴヌクレオチドとＳｔｙＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩＴＢＰ−Ｉ断片に結合することによ
り、発現ベクターが得られる。
ードするコドンは復元され、Ａｓｐ２０の前に追加のＭ
ｅｔコドンが加えられているようなものである。Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドｐＫＫ２
２３−３を、２本鎖合成オリゴヌクレオチドとＳｔｙＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩＴＢＰ−Ｉ断片に結合することによ
り、発現ベクターが得られる。
【００８２】ＴＢＰ−Ｉを得るために、大腸菌細胞をこ
の発現ベクターでトランスフェクションする。
の発現ベクターでトランスフェクションする。
【図１】図１はＩ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸
配列を示す。
オチド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸
配列を示す。
【図２】図２は、Ｅ１３ｃＤＮＡでトランスフェクショ
ンされたＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモノク
ローナル抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出を示
す。
ンされたＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモノク
ローナル抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出を示
す。
【図３】図３は、Ｉ型ＴＮＦ−ＲのＣＨＯ−産生、可溶
性型の逆相ＨＰＬＣを示す。
性型の逆相ＨＰＬＣを示す。
【図４】図４は、カルボキシペプチダーゼＹによるＴＢ
Ｐ−ＩのＣＯＯＨ−末端のアミノ酸の放出の経時変化を
示す。
Ｐ−ＩのＣＯＯＨ−末端のアミノ酸の放出の経時変化を
示す。
【図５】図５は、プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰの作成を
示し、これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓ
ｔｒｏｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮ
Ａ配列を有する。
示し、これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓ
ｔｒｏｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮ
Ａ配列を有する。
【図６】図６は、プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの作成
を示し、これはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ
ーターと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
を示し、これはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ
ーターと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１月３０日
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】Ｉ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
【図１Ｂ】Ｉ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
【図１Ｃ】Ｉ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
【図１Ｄ】Ｉ型ＴＮＦリセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
ド配列と、コードされた蛋白の予想されるアミノ酸配列
を示す。
【図２】Ｅ１３ｃＤＮＡでトランスフェクションされた
ＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモノクローナル
抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出を示す。
ＣＨＯ細胞中での、ＴＢＰ−Ｉに対するモノクローナル
抗体を使用しての、Ｉ型ＴＮＦ−Ｒの検出を示す。
【図３】Ｉ型ＴＮＦ−ＲのＣＨＯ−産生、可溶性型の逆
相ＨＰＬＣを示す。
相ＨＰＬＣを示す。
【図４】カルボキシペプチダーゼＹによるＴＢＰ−Ｉの
ＣＯＯＨ−末端のアミン酸の放出の経時変化を示す。
ＣＯＯＨ−末端のアミン酸の放出の経時変化を示す。
【図５Ａ】プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰの作成を示し、
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
【図５Ｂ】プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰの作成を示し、
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
【図５Ｃ】プラスミッドｐＳＶ−ＴＢＰの作成を示し、
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
これは強いＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（ｓｔｒｏ
ｎｇ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ）と融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列
を有する。
【図６Ａ】プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの作成を示
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
【図６Ｂ】プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの作成を示
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
【図６Ｃ】プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの作成を示
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
【図６Ｄ】プラスミッドｐＣＭＶ−ＴＢＰの作成を示
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
し、これはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーと融合した、ＴＢＰ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 オリバー ケムパー ドイツ連邦共和国 ボツケンハイム，アネ モネン ベグ 10 (72)発明者 ハルトムツト エンゲルマン ドイツ連邦共和国 ミユンヘン，ヨゼフ− ルツツ−ベグ 35 (72)発明者 コルト ブラケブスク ドイツ連邦共和国 ブラウンスクヴアイ グ，ザルツバルメル ベグ ９ (72)発明者 ダン アデルカ イスラエル国 ホロン，アビビム ストリ ート ４
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白Ｉ（ＴＢＰ−
Ｉ）、及びその生物学的に活性な前駆体と類似体より選
択される可溶性組換え蛋白の産生方法において、 １） 全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプター又はその可溶性領域
をコードするＤＮＡ分子よりなる発現ベクターで真核細
胞をトランスフェクションし、 ２） 該トランスフェクションされた細胞を培養し、も
って目的の蛋白を産生させ、培地に分泌させる、ことよ
りなる、上記方法。 - 【請求項２】 全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプターをコードす
るＤＮＡ分子は、図１Ｄに記載の配列を有するｃＤＮＡ
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該ｃＤＮＡは発現ベクターに導入され、
ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ
を含有する組換えベクターで、ＤＨＦＲ−欠損チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にコトランスフェク
ション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される、請求
項２に記載の方法。 - 【請求項４】 該細胞はヌクレオチドを含まない培地中
での増殖により選択され、各クローンはメソトレキセー
ト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）存在下での増殖により
増幅され、増殖培地中に分泌される該可溶性蛋白は、Ｔ
ＢＰ−Ｉに対するモノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体との反応により検出される、請求項３に記載の方
法。 - 【請求項５】 培地中に分泌される可溶性蛋白は、逆相
ＨＰＬＣで分析するときＴＢＰ−Ｉと保持時間が同じで
ある、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】 ヒトＴＢＰ−Ｉの産生のための請求項１
から５までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 ヒトＴＢＰ−Ｉの前駆体又は類似体の産
生のための請求項１から５までのいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項８】 全Ｉ型ヒトＴＮＦリセプター又はその可
溶性領域をコードするｃＤＮＡでトランスフェクション
された真核細胞の培地中に分泌されるＴＢＰ−Ｉの前駆
体及びその類似体から選ばれる可溶性蛋白。 - 【請求項９】 図１Ｄに記載されるｃＤＮＡ分子でトラ
ンスフェクションされたＣＨＯ細胞の増殖培地中に分泌
される請求項８の可溶性蛋白。
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| IL095064 | 1990-07-12 | ||
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