JPH0582194B2 - - Google Patents
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- JPH0582194B2 JPH0582194B2 JP60187518A JP18751885A JPH0582194B2 JP H0582194 B2 JPH0582194 B2 JP H0582194B2 JP 60187518 A JP60187518 A JP 60187518A JP 18751885 A JP18751885 A JP 18751885A JP H0582194 B2 JPH0582194 B2 JP H0582194B2
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- Japan
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- malic acid
- acid
- bacterial cells
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、Ｌ−リンゴ酸の製法に関するもので
あり、更に詳しくは、フマラーゼ活性を有する微
生物に対し、その活性を保持したまま、副反応で
あるコハク酸の生成に関与する酵素活性を抑制す
ることにより、Ｌ−リンゴ酸を効率的に製造する
方法に関する。 （従来の技術及びその課題） 従来、フマラーゼによるフマール酸又はその塩
からのＬ−リンゴ酸の製造に関しては、フマラー
ゼ活性を有する微生物菌体をそのまま、もしくは
固定化等の処理を行つてから用いる方法が知られ
ている。（特公昭37−4511号、特公昭44−1191号
公報等）本発明者らもブレビバクテリウム属細菌
を用いた製法を確立している。（特願昭60−
105649号明細書） しかしながら、これらの方法は微生物菌体を用
いるためにフマール酸よりコハク酸が副生するこ
とがしばしばみとめられ、この副生されたコハク
酸をＬ−リンゴ酸から効率よく分離することは困
難なことから、フマール酸からのコハク酸の副生
を抑制することが工業的製法として重要となる。 コハク酸の副生を抑制する方法としては、固定
化微生物を有機溶媒に接触させる方法（特公昭52
−8396号公報）、固定化微生物を胆汁酸に接触さ
せる方法（特公昭52−31952号公報）が知られて
いる。 しかしながらこれらの方法は、有機溶媒を用い
る場合には溶媒の性質上、安全等に格別の配慮が
必要なことから、特殊な装置類が必要となるこ
と、胆汁酸を用いる場合には、胆汁酸が高価なこ
と、処理時間が長いこと等、工業的には未だ問題
点を残しており、より簡便な処理法が望まれてい
た。 ここにおいて本発明者らは、微生物菌体をＬ−
リンゴ酸又はその塩を含有し、菌体の生育に必要
な他の物質を含有しない水溶液中にて予め加熱処
理例えば約10分〜５時間、40〜60℃にて処理する
ことにより、コハク酸の副生を抑制しうるという
工業的に優れた方法を見出し本発明を完成した。 （発明の構成及びその効果） 即ち、本発明は、フマラーゼ活性を有する菌体
もしくはその固定化物の存在下、フマール酸又は
その塩よりＬ−リンゴ酸を製造する方法におい
て、該菌体もしくはその固定化物を、Ｌ−リンゴ
酸もしくはその塩を含有し、菌体の生育に必要な
他の物質を含有しない水溶液中で予め加熱処理し
た後上記反応に用いることを特徴とするＬ−リン
ゴ酸の製造方法である。 本発明において用いられるフマラーゼ活性を有
する菌体としては、例えば微工研に寄託されてい
るブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
（FERM BP−1497（特公昭57−26755号公報参
照））の菌体及びこの菌よりα−アミノ−ｎ−酪
酸耐性株として取得したMJ−233−AB−41
（FERM BP−1498（特公昭59−28398号公報参
照）の菌体等がある。 これらの菌体は遊離菌体のまま用いることがで
きるが、更には該菌体、或いはその含有する酵素
（フマラーゼ）を固定化したものを反応に供して
もよい。この固定化物の副反応抑制処理である加
熱処理は固定化の前後いずれでもよい。固定化と
しては、この種の菌体又は酵素の固定化に通常用
いられる方法が使用可能で、例えばポリアクリル
アミドゲル、カラギーナンゲル、膜状高分子等に
固定化して用いられる。 コハク酸副生の抑制処理条件としては、加熱温
度は40〜60℃が用いられるが好ましくは40℃を越
え55℃迄、PHが好ましくは、４〜10、より好まし
くはPH５〜９、Ｌ−リンゴ酸濃度が好ましくは
0.01〜5M、より好ましくは０，01〜0.3M、処理
時間は菌体濃度によつても異なるが通常10分〜５
時間が用いられる。 この際の温度は上記範囲より高温では目的反応
のフマラーゼ活性まで失活するので、また低温で
は副反応の抑制効果が減ずるので不適当となる。
またＬ−リンゴ酸濃度については上記より高濃度
では効果が飽和し不経済であり、低濃度では副反
応のみを抑制する効果が出せなくなる。 上述の様にして得た菌体又はその固定化物は、
コハク酸副生活性が著しく低下している為、該菌
体又は固定化物を用いたＬ−リンゴ酸の生産に際
しては、コハク酸の副生を抑制しうることが明ら
かとなつた。それ故、この処理菌体又は固定化物
の存在下にフマール酸又はそのナトリウム、アン
モニウム等のフマール酸塩から効率的にＬ−リン
ゴ酸を生産することができる。この酵素反応は約
15〜60℃の温度範囲で実施することが可能である
が、フマラーゼの安定性を考慮して20〜55℃で実
施するのが望ましい。 本発明の方法によれば、菌体内に含まれるフマ
ラーゼ活性を損なうことなく、コハク酸の副生の
みを除去した菌体又はその固定化物を用いるの
で、この処理菌体をＬ−リンゴ酸の生産に使用す
れば対フマール酸収率が著しく向上する。従つて
本発明はＬ−リンゴ酸の工業的生産に大いに貢献
する。 以下、本発明の実施例を示し、本発明を更に詳
しく説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。 実施例 １ 第１表に示した培地100mlを500ml容の三角フラ
スコに分注し、120℃、15分間加圧滅菌したもの
にエタノールを２容量％添加後、前記のブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−AB−41
（FERM BP−1498）を一白金耳量植菌し、30℃
で24時間振とう培養を行なつた。 この培養液20mlを２容ジヤーフアーメンター
中の第２表に示した培地１に接種し、33℃、PH
7.6、通気量1vvmの条件にて培養し、エタノール
濃度が１〜1.5容量％に保たれるようにエタノー
ルを断続的に添加し、30時間培養を行なつた。 培養終了後、培養液を遠心分離（6000rpm，15
分）して得た菌体を供試菌体とした。該菌体2.5
ｇを0.2M、PH6.0のＬ−リンゴ酸水溶液からなる
副反応抑制液50mlに懸濁した後、均一に５分割
し、35℃から55℃まで、５℃間隔の何れかの温度
で別々に処理し、それぞれ遠心集菌した。それぞ
れの菌体について、更に0.1M PH7.8リン酸カリ
ウム緩衝液で２回洗浄した後、フマラーゼ活性及
びコハク酸生成活性を測定した。フマラーゼ活性
の測定は、第３表に示した反応液100mlに上記の
菌体を懸濁 第１表 尿素 4.0ｇ 硫酸アンモニウム 14.0ｇ KH2PO4 0.5ｇ K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5ｇ FeSO4・7H2Ｏ 6.0ｇ MnSO4・４〜6H2Ｏ 6.0ｇ 酵母エキス 1.0ｇ カザミノ酸 1.0ｇ ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml PH 7.6 第２表 硫酸アンモニウム 23.0ｇ KH2PO4 0.5ｇ K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5ｇ FeSO4・7H2Ｏ 20mg MnSO4・４〜6H2Ｏ 20mg 酵母エキス ３ｇ カザミノ酸 ３ｇ ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml 第３表 1.0M フマール酸水溶液 PHを7.0にNaOHで調整させ、45℃、２時間反
応させた後、生成Ｌ−リンゴ酸量を硫酸酸性下、
２，７−ナフタレンジオールと反応させて発色さ
せる方法により定量した。コハク酸はその生成量
を高速液体クロマトグラフイー（HPLC）にて測
定した。なお、酵素活性は抑制処理をしない菌体
での活性を100とする相対比活性をもつて表示し
た。その結果を第４表に示す。
あり、更に詳しくは、フマラーゼ活性を有する微
生物に対し、その活性を保持したまま、副反応で
あるコハク酸の生成に関与する酵素活性を抑制す
ることにより、Ｌ−リンゴ酸を効率的に製造する
方法に関する。 （従来の技術及びその課題） 従来、フマラーゼによるフマール酸又はその塩
からのＬ−リンゴ酸の製造に関しては、フマラー
ゼ活性を有する微生物菌体をそのまま、もしくは
固定化等の処理を行つてから用いる方法が知られ
ている。（特公昭37−4511号、特公昭44−1191号
公報等）本発明者らもブレビバクテリウム属細菌
を用いた製法を確立している。（特願昭60−
105649号明細書） しかしながら、これらの方法は微生物菌体を用
いるためにフマール酸よりコハク酸が副生するこ
とがしばしばみとめられ、この副生されたコハク
酸をＬ−リンゴ酸から効率よく分離することは困
難なことから、フマール酸からのコハク酸の副生
を抑制することが工業的製法として重要となる。 コハク酸の副生を抑制する方法としては、固定
化微生物を有機溶媒に接触させる方法（特公昭52
−8396号公報）、固定化微生物を胆汁酸に接触さ
せる方法（特公昭52−31952号公報）が知られて
いる。 しかしながらこれらの方法は、有機溶媒を用い
る場合には溶媒の性質上、安全等に格別の配慮が
必要なことから、特殊な装置類が必要となるこ
と、胆汁酸を用いる場合には、胆汁酸が高価なこ
と、処理時間が長いこと等、工業的には未だ問題
点を残しており、より簡便な処理法が望まれてい
た。 ここにおいて本発明者らは、微生物菌体をＬ−
リンゴ酸又はその塩を含有し、菌体の生育に必要
な他の物質を含有しない水溶液中にて予め加熱処
理例えば約10分〜５時間、40〜60℃にて処理する
ことにより、コハク酸の副生を抑制しうるという
工業的に優れた方法を見出し本発明を完成した。 （発明の構成及びその効果） 即ち、本発明は、フマラーゼ活性を有する菌体
もしくはその固定化物の存在下、フマール酸又は
その塩よりＬ−リンゴ酸を製造する方法におい
て、該菌体もしくはその固定化物を、Ｌ−リンゴ
酸もしくはその塩を含有し、菌体の生育に必要な
他の物質を含有しない水溶液中で予め加熱処理し
た後上記反応に用いることを特徴とするＬ−リン
ゴ酸の製造方法である。 本発明において用いられるフマラーゼ活性を有
する菌体としては、例えば微工研に寄託されてい
るブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
（FERM BP−1497（特公昭57−26755号公報参
照））の菌体及びこの菌よりα−アミノ−ｎ−酪
酸耐性株として取得したMJ−233−AB−41
（FERM BP−1498（特公昭59−28398号公報参
照）の菌体等がある。 これらの菌体は遊離菌体のまま用いることがで
きるが、更には該菌体、或いはその含有する酵素
（フマラーゼ）を固定化したものを反応に供して
もよい。この固定化物の副反応抑制処理である加
熱処理は固定化の前後いずれでもよい。固定化と
しては、この種の菌体又は酵素の固定化に通常用
いられる方法が使用可能で、例えばポリアクリル
アミドゲル、カラギーナンゲル、膜状高分子等に
固定化して用いられる。 コハク酸副生の抑制処理条件としては、加熱温
度は40〜60℃が用いられるが好ましくは40℃を越
え55℃迄、PHが好ましくは、４〜10、より好まし
くはPH５〜９、Ｌ−リンゴ酸濃度が好ましくは
0.01〜5M、より好ましくは０，01〜0.3M、処理
時間は菌体濃度によつても異なるが通常10分〜５
時間が用いられる。 この際の温度は上記範囲より高温では目的反応
のフマラーゼ活性まで失活するので、また低温で
は副反応の抑制効果が減ずるので不適当となる。
またＬ−リンゴ酸濃度については上記より高濃度
では効果が飽和し不経済であり、低濃度では副反
応のみを抑制する効果が出せなくなる。 上述の様にして得た菌体又はその固定化物は、
コハク酸副生活性が著しく低下している為、該菌
体又は固定化物を用いたＬ−リンゴ酸の生産に際
しては、コハク酸の副生を抑制しうることが明ら
かとなつた。それ故、この処理菌体又は固定化物
の存在下にフマール酸又はそのナトリウム、アン
モニウム等のフマール酸塩から効率的にＬ−リン
ゴ酸を生産することができる。この酵素反応は約
15〜60℃の温度範囲で実施することが可能である
が、フマラーゼの安定性を考慮して20〜55℃で実
施するのが望ましい。 本発明の方法によれば、菌体内に含まれるフマ
ラーゼ活性を損なうことなく、コハク酸の副生の
みを除去した菌体又はその固定化物を用いるの
で、この処理菌体をＬ−リンゴ酸の生産に使用す
れば対フマール酸収率が著しく向上する。従つて
本発明はＬ−リンゴ酸の工業的生産に大いに貢献
する。 以下、本発明の実施例を示し、本発明を更に詳
しく説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。 実施例 １ 第１表に示した培地100mlを500ml容の三角フラ
スコに分注し、120℃、15分間加圧滅菌したもの
にエタノールを２容量％添加後、前記のブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−AB−41
（FERM BP−1498）を一白金耳量植菌し、30℃
で24時間振とう培養を行なつた。 この培養液20mlを２容ジヤーフアーメンター
中の第２表に示した培地１に接種し、33℃、PH
7.6、通気量1vvmの条件にて培養し、エタノール
濃度が１〜1.5容量％に保たれるようにエタノー
ルを断続的に添加し、30時間培養を行なつた。 培養終了後、培養液を遠心分離（6000rpm，15
分）して得た菌体を供試菌体とした。該菌体2.5
ｇを0.2M、PH6.0のＬ−リンゴ酸水溶液からなる
副反応抑制液50mlに懸濁した後、均一に５分割
し、35℃から55℃まで、５℃間隔の何れかの温度
で別々に処理し、それぞれ遠心集菌した。それぞ
れの菌体について、更に0.1M PH7.8リン酸カリ
ウム緩衝液で２回洗浄した後、フマラーゼ活性及
びコハク酸生成活性を測定した。フマラーゼ活性
の測定は、第３表に示した反応液100mlに上記の
菌体を懸濁 第１表 尿素 4.0ｇ 硫酸アンモニウム 14.0ｇ KH2PO4 0.5ｇ K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5ｇ FeSO4・7H2Ｏ 6.0ｇ MnSO4・４〜6H2Ｏ 6.0ｇ 酵母エキス 1.0ｇ カザミノ酸 1.0ｇ ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml PH 7.6 第２表 硫酸アンモニウム 23.0ｇ KH2PO4 0.5ｇ K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5ｇ FeSO4・7H2Ｏ 20mg MnSO4・４〜6H2Ｏ 20mg 酵母エキス ３ｇ カザミノ酸 ３ｇ ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml 第３表 1.0M フマール酸水溶液 PHを7.0にNaOHで調整させ、45℃、２時間反
応させた後、生成Ｌ−リンゴ酸量を硫酸酸性下、
２，７−ナフタレンジオールと反応させて発色さ
せる方法により定量した。コハク酸はその生成量
を高速液体クロマトグラフイー（HPLC）にて測
定した。なお、酵素活性は抑制処理をしない菌体
での活性を100とする相対比活性をもつて表示し
た。その結果を第４表に示す。
【表】
実施例 ２
実施例１と同様の培養を行ない菌体を得た。該
集菌体2.5ｇをそれぞれ0.1M、0.2M、0.4M、
0.6M、1M濃度よりなるPH6.0L−リンゴ酸水溶液
からなる抑制処理用液50mlに懸濁した後、45℃，
２時間の処理をし遠心集菌した。更に0.1M PH
7.8リン酸カリウム緩衝液で２回洗浄したそれぞ
れの菌体についてフマラーゼ活性及びコハク酸生
成活性を測定した。その結果を第５表に示す。
集菌体2.5ｇをそれぞれ0.1M、0.2M、0.4M、
0.6M、1M濃度よりなるPH6.0L−リンゴ酸水溶液
からなる抑制処理用液50mlに懸濁した後、45℃，
２時間の処理をし遠心集菌した。更に0.1M PH
7.8リン酸カリウム緩衝液で２回洗浄したそれぞ
れの菌体についてフマラーゼ活性及びコハク酸生
成活性を測定した。その結果を第５表に示す。
【表】
実施例３ （Ｌ−リンゴ酸の製造）
実施例１と同様の培養を行ない菌体を得た。該
集菌体2.5ｇを実施例１と同様の抑制液50mlに懸
濁し、45℃にて２時間振盪してコハク酸副生の抑
制処理を行なつた。 この後、遠心分離により集菌し、該集菌体を第
３表に示した反応液（フマール酸水溶液）にて２
度洗浄後、200ml容三角フラスコ中の、上記反応
液100mlに添加し、45℃にて２時間振とうしなが
ら反応を行つた。 反応終了後、遠心分離により菌体を除いた反応
残液中のＬ−リンゴ酸濃度を測定した。リンゴ酸
量は実施例１にも示した比色定量法によつた。ま
た、コハク酸はHPLCによつた。 結果を第６表に、コハク酸副生の抑制処理を行
なわない菌体による反応結果と共に示す。
集菌体2.5ｇを実施例１と同様の抑制液50mlに懸
濁し、45℃にて２時間振盪してコハク酸副生の抑
制処理を行なつた。 この後、遠心分離により集菌し、該集菌体を第
３表に示した反応液（フマール酸水溶液）にて２
度洗浄後、200ml容三角フラスコ中の、上記反応
液100mlに添加し、45℃にて２時間振とうしなが
ら反応を行つた。 反応終了後、遠心分離により菌体を除いた反応
残液中のＬ−リンゴ酸濃度を測定した。リンゴ酸
量は実施例１にも示した比色定量法によつた。ま
た、コハク酸はHPLCによつた。 結果を第６表に、コハク酸副生の抑制処理を行
なわない菌体による反応結果と共に示す。
【表】
収率：フマール酸に対するモル収率
Claims (1)
- １ フマラーゼを含有する菌体もしくはその固定
化物の存在下、フマール酸又はその塩よりＬ−リ
ンゴ酸を製造する方法において、該菌体もしくは
その固定化物を、Ｌ−リンゴ酸もしくはその塩を
含有し、菌体の生育に必要な他の物質を含有しな
い水溶液中で予め加熱処理した後、上記反応に用
いることを特徴とするＬ−リンゴ酸の製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18751885A JPS6248388A (ja) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | Ｌ−リンゴ酸の製造方法 |
| GB08612030A GB2175304B (en) | 1985-05-17 | 1986-05-16 | Method of preparing l-malic acid |
| US06/864,212 US4912043A (en) | 1985-05-17 | 1986-05-19 | Method of preparing L-malic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18751885A JPS6248388A (ja) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | Ｌ−リンゴ酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6248388A JPS6248388A (ja) | 1987-03-03 |
| JPH0582194B2 true JPH0582194B2 (ja) | 1993-11-17 |
Family
ID=16207477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18751885A Granted JPS6248388A (ja) | 1985-05-17 | 1985-08-28 | Ｌ−リンゴ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6248388A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61260889A (ja) * | 1985-05-14 | 1986-11-19 | Takara Shuzo Co Ltd | リンゴ酸カルシウムの製造方法 |
-
1985
- 1985-08-28 JP JP18751885A patent/JPS6248388A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6248388A (ja) | 1987-03-03 |
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