JPH0582400B2 - - Google Patents

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JPH0582400B2
JPH0582400B2 JP85135217A JP13521785A JPH0582400B2 JP H0582400 B2 JPH0582400 B2 JP H0582400B2 JP 85135217 A JP85135217 A JP 85135217A JP 13521785 A JP13521785 A JP 13521785A JP H0582400 B2 JPH0582400 B2 JP H0582400B2
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glycoprotein
ricin
aqueous solution
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Description

【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕 この発明は新規な抗腫瘍性糖タンパク質（グリ
コタンパク質）に係わり、特にその炭水化物単位
が過ヨウ素酸塩イオンで酸化、修飾された糖タン
パク質に関する。 本発明の新規な糖タンパク質はリボソームを不
活性化し、かつその効能が持続することを特徴と
する。 〔従来技術の説明〕 このリボソームを不活性化する糖タンパク質と
はリボソームを不活性化した真核細胞中でのタン
パク質合成を妨害する巨大分子のサツカライド単
位を有する全ての物質又はその分画物質を意味
し、それが天然のもの、又は生合成されたもの
で、細胞の遺伝型をこの目的のために修飾された
ものであつてもよく、さらにそのアミノ酸の官能
基が修飾され抗体と容易に結合するようにしたも
のであつてもよい。 このリボソームを不活性化する糖タンパク質を
以下“GPIR”と記号化して示す。 この明細書において、過ヨウ素酸塩イオンとは
IO4 -イオンを意味し、さらにメタ過ヨウ素酸塩
を呼称することもある。 このGPIRは抗体との結合により免疫毒素を製
造する際の中間体として特に有用である。 米国特許No.4340535、フランス特許No.2504010お
よびNo.2516794にはコンジユゲートと呼ばれる抗
ガン剤の製造について開示があり、これは２重結
合によりリシンのＡ鎖を、破壊されるべき細胞の
抗原に対する抗体又はその分画と結合することに
より得られるとしている。この種の生成物を本明
細書においては一般的に免疫毒素と呼ぶ。 上記のリシンＡ鎖を有する免疫毒素に類似する
コンジユゲートで、抗ガン剤として適当な物質も
知られており、これは２重結合により抗体又は抗
体分画物を他のリボソーム不活性化糖タンパク
質、たとえばゲロニウムマルチフローラム
（Gelonium multiflorum）、（Eur.J.Biochem.，
1981，116，447−454；Cancer Res.，1984，44，
129−133）、又はモモルデカカランチア
（Momordica charantia）（MOM）から抽出さ
れた抑止体（米国特許No.4368149）と結合するこ
とにより得られる。 これらのGPIRはリシンのＡ鎖と似た特性を有
し、分子量が20000ないし30000程度である
（Cance Survey，1982，１，489−520）。 これらの免疫毒素の細胞毒素活性を種々のアジ
ユバント物質、たとえばアンモニウム塩、アミ
ン、あるいはカルボキシルイオノフオア（たとえ
ばモネンシンおよびニゲリシン）で増強させるこ
とができることも知られている。 しかし、免疫毒素の治療効果は活性化されてい
るか否かを問わず、その抗体部分を介して破壊さ
れるべき目標細胞上に局在化し得る場合にのみ十
分に効果が発揮されるのである。この免疫毒素が
この目標細胞上に局在化し得るか否かは免疫毒素
が血流および細胞外流体内に、活性化状態で目標
細胞に到達し得る時間および対応する抗原に匹適
する十分な濃度を以つて留り得るか否かに依存し
ている。 静脈内注射後の免疫毒素の血漿による除去機構
が種々の動物について多く研究されている。その
結果が生物学的に活性な免疫毒素が注射後に急激
に減少することが明らかとなり、たとえばラビツ
トの場合、二硫化ブリツジを含む前肢を用い、リ
シンのＡ鎖をヒトＴリンパ球の抗原T65に対する
モノクロン抗体（抗体T101）と結合して合成さ
れた免疫毒素を用いたモデルにおいて、注射直後
の免疫毒素の97％が30分以内に消失し、17時間以
内に99.9％が消失する。 このような免疫毒性の急激な消失の結果、破壊
されるべき細胞中の目標抗原の高比率に対し飽和
するような免疫毒性の能力を十分に持続させるこ
とができなくなる。この免疫毒素の血漿中での消
失を相応する非接合抗体と比較すると、反対に、
血漿中の抗体は比較的長時間高い割合で保持され
ることが知られている。最高に精製された免疫毒
素製剤でも非接合抗体が常にある程度残留してい
る。この免疫毒素と非接合抗体の消失速度の差に
より、当初において、極めて小さい比率であつた
抗体が数時間の後に多数を占めるようになり、次
第に競争により免疫毒素の目標に対する固定のた
めの強力な拮抗体となる。 免疫毒素の血漿宿存性を活性状態で増大させ目
標抗原に対する占有時間および程度を増大させる
ことは極めて有意義なことである。 さらに、放射能でラベルしたリシンのＡ鎖を有
する免疫毒素を動物中に特定の目標を与えること
なく注射した生体局在化実験によれば注射数分後
にこの接合体は肝ぞうに多く局在することが分つ
た。これはリシンのＡ鎖を非結合状態で注射した
場合も同じ傾向が見られた。このことは免疫毒素
が細胞毒性サブユニツトを介して肝ぞう中に固定
することを示している。リシンのＡ鎖はマンノー
ス残渣およびＮ−アセチルグルコースアミン残渣
を含むポリオサイド基を有する糖タンパク質であ
り、このマンノース残渣のあるものは末端位置に
存在していることが知られている（Agri.Biol.
Chem.1978，42，501）。これらのマンノース残渣
を有する糖タンパク質を認識し得るリセプターが
肝ぞう中に存在する。これらのリセプター（クツ
ペー細胞に主として存在する）により認識される
糖タンパク質は血流から代謝細胞に固定されるこ
とにより急速に除去される。これは特に、β−グ
ルキユロニダーゼおよびリボヌクレアーゼＢの場
合に良く記録されている（Arch.Biochem.
Biophys.，1978，188，418；Advances in
Enzymology，ニユーヨーク、1974；Pediat.
Res.，1977，11，816）。これらの文献によればリ
シンのＡ鎖を有する免疫毒素の急激な解消は肝ぞ
う細胞、特にクツペー細胞でのリシンＡ鎖のマン
ノース残渣の認識により説明することができる。 他のGPIRについての血漿中での解消機構、た
とえばゲロニン又はMOMについて、静脈注射後
について研究した結果は、リシンのＡ鎖の場合と
同様にGPIRの血漿におけるレベルは急速に減少
することを示している。すなわち、ラビツトの場
合、精製ゲロニンの注射後血流中の93％が１時間
以内に消失し、24時間以内に99.99％が消失した。 糖タンパク質に含まれるようなオサイド構造を
過ヨード酸塩イオンで酸化することにより、隣接
する炭素原子が第１、第２ヒドロキシル基を有す
る炭素鎖の切断が生ずる。GPIR中の環状オーズ
（oses）の場合の如く、隣接するヒドロキシル基
が第２級の場合、酸化により炭素上に２つのアル
デヒド基を生じさせ、これらの間に切断が生ず
る。 〔本発明の具体的説明〕 ところで、抗腫瘍性糖タンパク質の炭水化物単
位が過ヨウ素酸塩イオンで酸化修飾された場合、
この糖タンパク質の生物学的活性が実質的に変化
せずに持続することが見い出された。 さらにリボソームを不活性化する糖タンパク質
の炭水化物単位が過ヨウ素酸塩イオンで酸化修飾
されたとき、生物学的活性が持続し、生体血流か
ら徐々に解消されるという２重の特徴を有する新
規な糖タンパク質が得られることが意外にも見い
出された。 又、生化学的研究の結果、過ヨウ素酸塩で
GPIRを酸化した場合、反応がGPIRのオサイド
部分に選択的に起り、ペプチド部を構成するアミ
ノ酸の配列に全く影響がないことが証明された。 このリボソームを不活性化し、持続性を有する
新規な糖タンパク質を以下、GPIR−Laと呼称す
る。 このGPIR−Laが抗体と結合したとき、このコ
ンジユゲート（接合体）は免疫毒性についての生
物学的特性を維持し、血漿における消失が遅いこ
とが見い出された。 したがつて、本発明は過ヨウ素酸塩イオンで酸
化修飾された炭水化物単位を有する新規な抗腫瘍
性糖タンパク質を提供するものである。この新規
な糖タンパク質は非修飾糖タンパク質と同様の活
性を示し、かつ半減期がより長い。さらに本発明
の新規な糖タンパク質はそのチオール基を、過ヨ
ウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で0.2〜24時間、
０〜15℃の温度、暗所で処理して保護し、必要に
よりチオール基の遮断を解除し、公知の方法で最
終製品を分離して得ることができる。 全ての抗腫瘍性糖タンパク質を公知の方法でそ
の炭水化物単位を過ヨウ素酸塩イオンで反応さ
せ、修飾させることができる。 本発明における全てのGPIRは極めてわずかな
細胞毒性を示す。なぜならば、これらは細胞に固
定されないが、特定の細胞を認識する抗体と結合
したのちは、この抗体が目標（ターゲツト）を認
識すると、これらの細胞に対し大きい細胞毒性を
示すことになる。 このGPIR出発物質の例としてはリシンＡ鎖、
ゲロニン、MOMからの抽出物がある。 その他のGPIRで過ヨウ素酸塩イオンに酸化さ
れる出発物質の例としては以下のものが挙げられ
る。 ジアンチン30……ジアンサス カルヨフイラス （Dianthin）（Dianthus Caryophyllus） ジアンチン32……同上 アグロスチンＡ……アグロステマ ギサゴ （AgrostinA）（Agrostemma githago） アグロスチンＢ……同上 アグロスチンＣ……同上 HCI……ヒユラ クレピタンス （Hura crepitans） アスパラガスオフイシ……アスパラガスオフイ
シナリス ナリス抑止体（Asparagus officinalis） この目的に沿つて修飾された遺伝型の細胞によ
り生合成的に製造された同様の物質も有効であ
る。 リボソームを不活性化する能力を示す限り上記
GPIRの分画を出発物質として用いることもでき
る。少なくともチオール基の一つが保護された天
然リシンのＡ鎖は好ましい出発物質の一つであ
る。 リシンのＡ鎖は多糖単位が異なるA1，A2とし
て表わされる２成分からなつている。過ヨウ素酸
塩による酸化はこれらA1，A2鎖に対し同様にお
こなわれ、これら２成分に同等の薬理効果の向上
を与える。 純粋なリシンＡ鎖の製法については米国特許No.
4340535に記載されている。ゲロニンおよび
MOMについても公知である。 GPIR出発物質のチオール基の保護はこのチオ
ール基が抗体と結合されるのに用いられる場合に
望ましい。 他の官能基がこの結合に用いられる場合、たと
えばチロシンのフエノールヒドロキシル基、又は
GPIRのアミノ基又はカルボキシル基が用いられ
る場合、この保護をおこなつても、あるいはおこ
なわなくてもよい。 ブロツキング（遮断）はSH基をチオール／二
硫化物置換又は還元により、のちに除去し得る化
合物との反応によりおこなうことができる。その
ような化合物の例としては２，2′−ジニトロ−
５，5′−ジチオジ安息香酸（DTNB）、３−（ピリ
ジン−２−イル−ジスルフアニル）プロピオン
酸、又はジピリジル−２，2′−ジスルフイド、あ
るいはジピリジル−４，4′−ジスルフイドであ
る。このような処理をおこなわない場合は酸化反
応の間に遊離チオールが消失し、その場合これら
は全体的に再生できない。過剰のブロツキング剤
は透析その他の処理により除去される。 過ヨウ素酸塩による酸化反応はPH３〜７、好ま
しくは５〜6.5でおこなわれる。この過ヨウ素酸
塩は過剰に用いられる。過ヨウ素酸塩の濃度を酸
化される隣位のジオールの濃度より大きくする。
すなわち、細胞毒素サブユニツト１〜10mg／mlの
濃度に対し過ヨウ素酸ナトリウム10〜50mMの濃
度が適当である。この処理は温度０〜15℃、好ま
しくは１〜５℃、暗所にて0.2〜24時間でおこな
われる。 反応は残留する過ヨウ素酸塩を消費する反応
剤、たとえば過剰のエチレングリコールの添加に
より停止することができ、ついで、副生成物を透
析等により除去する。この反応の結果得られた製
品は公知の方法により分離することができる。 出発物質のチオール基がブロツクされた場合、
このブロツキング解除はブロツクされたチオール
基、たとえば２−メルカプトエタノールを解放さ
せ得る還元剤で反応させておこなうことができ、
これによりリボソームを不活性化し、持続性を有
する新規な糖タンパク質が得られ、免疫毒素を与
える抗体との結合のために用いられる。 リシンＡの場合、得られる新規な分子（以下Ａ
−Laと記す）は下記の如き特徴を有する。 分子量は天然Ａ鎖と実質的に異るものでない。
ポリアクリルアミド勾配電気泳動で見る限り、こ
の修飾処理はこのタンパク質のポリマーを極めて
少量生成させ、劣化生成物は生じない。 遊離チオール基の割合が１モル当り0.7以上で
ある。 リシンのＡ鎖を抑止するラビツト抗体に対する
免疫反応性が天然Ａ鎖の免疫反応性と変らない。 非細胞モデルにおけるたんぱく質合成に対する
抑止性が天然Ａ鎖の等量によつてもたらされるも
のの50％以上である。 ラビツトに0.4mg／Kg（体重）の投与量で静脈
投与したのち23時間以内のＡ鎖（Ａ−La）の血
漿における残留率は10％以上（天然のＡ鎖につい
ては0.015％）であり500倍以上の増大を示す。 ゲロニンの場合も過ヨウ素酸塩で酸化して得た
分子は以下の如き特徴を有す。 分子量は天然のゲロニンのものと実質的に変ら
ない。 天然のゲロニンと変らない抗ゲロニンラビツト
抗体に対する免疫反応性を示す。 ラビツトに0.3mg／Kg（体重）の投与を静脈内
投与したのち24時間以内に、この修飾ゲロニンは
３％以上血漿に残留し（天然ゲロニンの場合0.01
％）、したがつて200倍以上の残留率の向上を示し
た。 このリボソームを不活性化する糖タンパク質か
らのコンジユゲート又は糖タンパク質の製造はた
とえば米国特許No.4340535に記載された方法でお
こなうことができる。もし、選ばれた細胞毒素サ
ブユニツトが天然に少なくとも一つのチオールを
有し結合に適合しているものであれば、この基は
活性化二硫化基を有する抗体又は抗体分画との反
応に用いられる。しかし、選ばれた細胞サブユニ
ツトが天然にチオール基を有するものでなけれ
ば、遊離チオールを有する官能基を少なくとも一
つ、公知の方法でこのサブユニツトに導入させる
ことができ、これにより上述の結合が継続され
る。この官能基の導入は過ヨウ素酸塩イオンによ
る酸化工程の前におこない、この場合、酸化工程
の間にこのチオールラジカルをブロツキングして
おき、酸化工程後にこのブロツキングを解放する
ようにしてもよいし、又酸化工程ののちにこの導
入をおこなつてもよい。 このようにして得られる修飾免疫毒素は薬理効
果について新規な特徴、すなわち本来の細胞毒性
に加えて、血漿中における消失遅延性（持続性）
が良好なものとなる。 実施例 １ SH基がＮ−エチルマレイミドでブロツキング
されたメチル化Ａ鎖の酸化。 正しく官能化されたリシンＡ鎖の製造 １ Ａ鎖のヘキサメチル化 Means and Feeneyの方法（Biochemistry
７，2192（1968））によりメチル化反応を０℃で
攪拌しながら0.2Mホウ酸塩緩衝液（PH＝10）
中でおこなつた。20mgのトリチエート化された
（tritiated）ホウ素化水素（9.5mCi／mmolを
含む）をＡ鎖35ml（３mg／ml）に加え、さらに
６％ホルムアルデヒド350μlを加えた（30分間
に亘り70μlづつ５回）。 過剰の添加物質を125mMリン酸塩緩衝剤
（PH７）を用いて連続的に透析除去した（40
を300ml／時間の割合で）、透析後、タンパク質
溶液を遠心分離し、ヘキサメチル化Ａ鎖（2.6
mg／ml含有）を36.5ml得た。 ２ Ｎ−エチルマレイミドを用いたブロツキング ヘキサメチル化Ａ鎖の天然SH基を
Enzymology11541（1967）に記載の方法でブロ
ツキングした。すなわち、前の工程で得たリシ
ンＡ鎖を20モル等量のＮ−エチルマレイミド
（Ａ鎖１モル当り）の存在下で30℃で２時間培
養した。ついでPH７の125mMリン酸塩緩衝液
を用いて連続的に透析して過剰の添加物質を除
去した。この操作を500ml／時間の割合で20時
間繰り返した。この濃縮ののち７mg／mlの割合
で含むリシンＡ鎖の溶液13mlを得、これには
ELLMAN試薬で判別し得るようなチオール基
はもはや存在しなかつた。このようにして得た
生成物を以下、ヘキサメチル化Ａ鎖（NEM）
と称呼する。 ３ 過ヨウ素酸塩による酸化 上述の工程で得たNEM溶液６mlを０℃、PH
＝4.5で暗所で40分間NaIO4（12.8mg）と反応さ
せ、ついで、この反応をエチレングリコール
600μを添加することにより停止させた。つ
いで、この反応媒体を0.1Mの炭酸塩緩衝液
（PH＝10）を用い連続的に透析した。（500ml／
時間の割合で20時間）。 非細胞モデルで測定した持続性Ａ鎖の酵素活
性 リシンＡ鎖の基本的生物学的特性はリボソーム
サブユニツト60Sの劣化により細胞中でのタンパ
ク質合成を阻害することである。 試験管による方法において、ラツトの肝ぞうの
下位細胞分画で適当に補完したものを用いた。こ
れは人工メツセンジヤーRNA、すなわちポリウ
リデイル酸の存在下で14C−フエニルアニリンを
組込むことができるものである。 この下位細胞分画の製造および14C−フエニル
アラニンの組込みの測定はBiochemica
Biophysica Acta 1973，312，608−615に記載さ
れている方法で、ミクロソーム分画およびラツト
肝細胞のサイトゾル分画を用いておこなつた。ま
ず、このＡ鎖を含むサンプルを適当に希釈した溶
液の形で、0.2％の２−メチルカプトエタノール
および15μg／mlのウシ血清アルブミンを含む
50mMトリスHCl緩衝液（PH＝7.6）中に導入し
た。 カウントデータを用い、抑止剤なしの対照媒体
との比較で、リシンＡ鎖を含む各反応媒体につい
てタンパク質中に組込まれる14C−フエニルアラ
ニン抑止率（％）を計算した。 この抑止活性を測定した結果、酸化Ａ鎖につい
てはIC50が2.7・10-10モル／ｌが認められた。他
方、対照Ａ鎖のIC50は1.03・10-10モル／ｌであ
り、したがつて、この修飾はＡ鎖の活性損失に影
響を与えていない。 実施例 ２ この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムで修飾した
リシンＡ鎖を静脈注射した場合の消失の遅延性を
証明するためのものである。 過ヨウ素酸ナトリウムによるリシンＡ鎖の修
飾 (1) DTNBを用いた天然SHのブロツキング リシンＡ鎖を米国特許No.4340535に記載されて
いる方法で製造、精製した。２，2′−ジニトロ−
５，5′−ジチオ２安息香酸（DTNB）の溶液20当
量、すなわち、PH７の125mMリン酸塩緩衝液に
溶かしたDTNBの0.1M溶液、385μ（この溶液
は水酸化ナトリウムでPH：７に調節した）を、
PBS緩衝液に溶かした5.6mg／mlの割合で含むリ
シンＡ鎖10ml溶液に加えた（りん酸塩については
20mM，NaClについては150mMのPH：７の緩衝
液）。培養は20℃で20分間続けた。この溶液を４
℃でPBS緩衝液を用いて透析し、チオール基を
ブロツキングしたＡ鎖を53mgを５mg／mlの割合で
含む溶液として得た。 (2) ブロツキングされたＡ鎖の過ヨウ素酸塩に
よる酸化 過ヨウ素酸ナトリウムの0.5M水溶液120μを、
1M酢酸でPH：６に調整したブロツキング済みＡ
鎖を５mg／ml含む溶液６ml中に加えた。培養は暗
所で４℃で16時間おこなつた。酸化反応停止はエ
チレングリコールの1M水溶液620μを加えるこ
とによりおこなつた。培養後、20℃で15分間、反
応媒体を４℃でPBS緩衝液で透析した。この過
ヨウ素酸塩による酸化によりタンパク質のわずか
な析出を得た。これを30分間、10000×Ｇで遠心
分離し除去し、酸化およびブロツキングされたＡ
鎖を3.4mg／mlの濃度で24mg得た。 (3) チオール基のブロツキング解放 ２−メルカプトエタノールを還元剤として最終
濃度１％で酸化、ブロツキング化Ａ鎖（PBS緩
衝液中に3.4mg／ml含む）６mlに加えた。培養を
20℃で１時間おこない。ついでこの溶液を４℃で
PBS緩衝液を用いて透析した。その結果酸化さ
れたＡ鎖を2.8mg／mlの濃度で19mg得た。 DTNB法（Enzymology，1972，25，457
Academic Press）を用い、この修飾されたＡ鎖
が１モル当り0.70の遊離チオール基を有すること
が判明した。この修飾Ａ鎖の分子量はドデシルサ
ルフエートの存在下でのポリアクリルアミド勾配
電気泳動により30000±3000であることが判明し
た。 多糖単位が酸化されたＡ鎖を、タンパク質合成
の抑止における酵素活性および薬理学的特性につ
いて研究した。 持続性Ａ鎖の酵素活性の非細胞モデルによる
測定 抑止活性を実施例１の方法で測定した。その結
果、酸化Ａ鎖のIC50は３×10-10モル／であり、
対照Ａ鎖のIC50は1.2×10-10モル／であつた。
したがつて修飾によるＡ鎖の活性損失は認められ
なかつた。 持続性Ａ鎖（Ａ−La）の薬理効果 このＡ鎖をラビツトに耳を介して静脈投与し
た。このＡ鎖投与量は0.415mg／Kgであつた。血
液サンプルをヘパリン上に間隔をおいて採取し
た。この血漿を下記にRIM−１の記号で示した
ラジオイムノアツセイテストで分析した。 この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得
る利点を有する。この判定をマイクロ滴定プレー
トを用いておこなつた。このプレートの蓋体には
過吸収剤スパイクが設けられていて、これがベー
ス中の穴に浸入するようになつている。これらの
スパイクは固体相からなるものである。リシンの
Ａ鎖を示し、親和性クロマトグラフイで精製され
た雌羊抗体（以下にAc1の記号で示す）をこの固
体相上に吸収させた。この目的のため、PBS緩
衝液中に10μg／ml含むAc1の溶液を上記穴に分
けて注入した。上記スパイクを４℃で24時間、
Ac1溶液と最初に接触させ、ついで20℃で３時
間、胎児ウシ血清と接触させ、全ての固定部位を
飽和させた。この飽和した免疫吸収剤を20℃、３
時間、種々の濃度の血漿サンプル、又は既知の濃
度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線を作成した。
PBS緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤をリシン
Ａ鎖を示す雌羊抗体（親和クロマトグラフイで精
製し、放射能ラベルを施したもの、以下Ac2と記
す）と20℃で２時間接触させた。このAc2の放射
能ラベルはクロラミンＴの存在下でヨウ素125を
用い、GreenwoodおよびHunterの方法
（Biochem.J.，1963，89，114）でおこなつた。
このラベルしたAc2抗体は５〜10マイクロキユー
リ−／μgを示した。このラベル化Ac2106cpmを
200μとして、0.1％ウシ血清アルブミンを含む
PBS緩衝液中に導入した。PBS緩衝液中で洗浄
ののち、上スパイクを取りはずし、結合したAc2
の量を放射能測定により計量した。サンプル中の
Ａ鎖の濃度は、異なる既知の濃度でＡ鎖を導入す
ることによつて作られた目盛曲線に対して参照す
ることにより測定した。持続性Ａ鎖を動物に注射
した際、同じＡ鎖を用い相当する目盛曲線を作成
した。 この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再
現性があり、信頼できるものである。この探知し
きい値は1ng／mlである。各実験間の再現性の検
討の結果、変化関数が１〜200ng／mlの濃度につ
いて10％以下であつた。 これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横
軸に、零時の血漿濃度理論値に対する記録された
生成物の血漿濃度の％をlogスケールで縦軸に示
した。この値、すなわち、“相対血漿濃度”
（RPC）は下記の式で計算される。 RPC＝時間“ｔ”で測定した濃度／注射量／血漿量×1
00 血漿量は動物の体重の１Kg当り36mlで考えられ
ている。 第１図は天然リシンＡ鎖を静脈注射した場合の
血漿における消失曲線を時間の関数として示した
ものである。この曲線(1)は２つの相を示してい
る。第１にこの天然リシンＡ鎖を注射後３時間で
血漿中に残る率はわずか0.1％（投与量に対して）
であり、血液から急激に消失することを示してい
る。第２の相においてはこの消失がよりゆるやか
である。 しかし、多糖単位が酸化されたＡ鎖において
は、この消失性は著るしく改められる。すなわ
ち、Ａ鎖製品の大部分が消失するもととなる第１
の消失相は著るしく抑制され、その結果、Ａ鎖の
血漿における残留レベルが著るしく増大する。注
射20時間後では酸化Ａ鎖の濃度は修飾されていな
いＡ鎖（曲線２）の場合の600倍にもなる。 実施例 ３ この実施例はNEMで保護されたＡ鎖の薬物動
態学的性質に対する過ヨウ素酸塩による酸化の効
果を検討するものである。 １ リシンのＡ鎖の修飾 ａ Ｎ−エチルマレイミドによる遊離SHの保護 リシンのＡ鎖を８mg／mlの割合で含有するリシ
ンＡ鎖水溶液40ml（Ａ鎖4.1マイクロモル）を２
−メルカプトエタノールの水溶液で処理してＡ鎖
の最終濃度が１％となるようにした。 この溶液を１時間放置した後、PH７の125mM
リン酸緩衝液で連続的に透析した。リン酸緩衝液
は毎時300mlの割合で40時間新しいものと交換し
た。エルマン（Ellman）の方法を用いて、リシ
ンのＡ鎖１モル当り0.9当量のSHが測定された。 このSH基を、メソツズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、11541（1967）
に記載されている方法によつてＮ−エチルマレイ
ミドで保護した。すなわち、上記工程で得たリシ
ンＡ鎖を、このＡ鎖１モル当り20当量のＮ−エチ
ルマレイミドの存在下に30℃で２時間インキユベ
ート。過剰の試薬をPH７の125mMリン酸緩衝液
で連続的に透析することによつて除去した。その
際、リン酸緩衝液は、毎時500mlの割合で20時間
にわたつて新しいものと交換した。これにより、
エルマンの試薬で測定し得るチオール基を含まな
いでＡ鎖を濃度７mg／mlで含む溶液を得た。こう
して得た生成物を以下Ａ鎖（NEM）ということ
とする。 ｂ 過ヨウ素酸塩によるＡ鎖（NEM）の酸化 過ヨウ素酸塩によるＡ鎖（NEM）の酸化は実
施例２の手法によつておこなつた。 ２ 酸化されたＡ鎖（NEM）の特性 ａ 酸化されたＡ鎖（NEM）の酵素活性 タンパク合成に対する阻害活性を実施例１の手
法を用いて測定した。その結果、酸化されたＡ鎖
（NEM）の酵素活性は、IC50で4.3×10-10モル／
リツトルであつた。 ｂ 酸化されたＡ鎖（NEM）の薬物動態学的性
質 酸化されたまたは酸化されていないＡ鎖
（NEM）をウサギの耳血管に一回注射した。注
射した鎖の量は0.100mg／Kgに相当するものであ
つた。23時間後に採取した血漿を、実施例２に記
載した免疫測定法を用いて分析した。結果を以下
の表に記載する。
【表】 注射してから23時間経過後、酸化Ａ鎖
（NEM）の濃度は、酸化していないＡ鎖
（NEM）のそれの800倍であつた。 実施例 ４ この実施例は、酸化処理時間が酸化Ａ鎖の薬物
動態学的性質に及ぼす重要性を検討するものであ
る。 過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた
以外は実施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖の
製剤を調製した。処理時間は次の通りであつた。
すなわち、０（エチレングリコールを用いて反応
を直ちに停止）、20分、40分、2.5時間、４時間、
および18時間であつた。 これら６種の製剤をウサギに注射し、23時間経
過後のＡ鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法に
より測定した。 結果を第２図に示す。この結果から、１）Ａ鎖
の血漿中濃度の増加は、確かに、過ヨウ素酸塩に
よる酸化に基づくこと（反応を直ちに停止したと
きは、Ａ鎖の血漿中濃度は生のＡ鎖についてのも
のと同一であるからである）、および２）最適の
効果を得るためには、反応処理時間を比較的長く
することが必要であることがわかる。 実施例 ５ この実施例は、酸化処理時間がNEMで保護さ
れたメチル化Ａ鎖の薬物動態学的性質に及ぼす重
要性を検討するものである。 １ 感応化リシンＡ鎖の調製 ａ Ｎ−エチルマレイミドによるＡ鎖の遊離SH
の保護 実施例１の手法を用いて、Ａ鎖の遊離SHをＮ
−エチルマレイミドで保護した。 ｂ Ａ鎖のメチル化 このメチル化反応は、ミーンズ（Means）お
よびフイーニー（Feeney）の方法（バイオケミ
ストリー（Biochemistry）７，2192，1968）を
用い、PH０の0.2Mホウ素酸緩衝液中０℃で攪拌
しながらおこなつた。チリチウム化水素化ホウ素
38mg（47mCi／ミリモル含有）をＡ鎖（NEM）
65.5ml（３mg／ml）に加え、これに６％ホルムア
ルデヒドヒド１mlを200マイクロリツトルづつ５
回に分けて30分で添加した。 過剰の試薬を、PH７の125mMリン酸緩衝液
（40ml）で断続的に透析することによつて除去し
た。透析後、タンパク溶液を遠心した。こうし
て、濃度mg／mlのメチル化Ａ鎖63mlを得た。 ｃ 過ヨウ素酸塩による酸化 過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた
以外は実施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖の
製剤を調製した。処理時間は次の通りであつた。
すなわち、０（エチレングリコールを用いて反応
を直ちに停止）、20分、40分、2.5時間、４時間、
および18時間であつた。 これら６種の製剤をウサギに注射し、23時間経
過後のＡ鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法に
より測定した。 結果を第３図の曲線２に示す。この結果から、
１）メチル化Ａ鎖（NEM）の血漿中濃度の増加
は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づくこ
と（反応を直ちに停止したときは、メチル化Ａ鎖
（NEM）の血漿中濃度はこのＡ鎖についてのも
のと同一であるからである）、および２）最適の
効果を得るためには、反応処理時間を比較的長く
することが必要であることがわかる。 実施例 ６ 本実施例は、Ａ鎖を構成する２つの分子鎖
（A1鎖とA2鎖）を別々に酸化した場合、その酸
化反応は、リシンのＡ鎖について実施例２で述べ
たものと類似の効果を及ぼすことを示している。 １ A1鎖とA2鎖の切断 10.9mg／mlのＡ鎖を含有するPH7.0の125mMリ
ン酸緩衝液28ml（Ａ鎖は309mg）を、上記緩衝液
中で平衡にあるコンカナバリン（以下、ConAと
略す）112mlとセフアローズの入つたカラムに注
いだ。A1鎖は同緩衝液で溶出させた時の最初の
ピークで得られ、A2鎖はPH6.0の0.1Mホウ酸緩衝
液で溶出された。この緩衝液は塩化ナトリウム水
溶液に対して0.5M、α−メチルマンノシドに対
して0.1Mの濃度にした。 この結果A1鎖は184mg、A2鎖は103mg得られ
た。A1鎖とA2鎖を窒素の加圧下で限外過によ
り濃縮した。A2鎖はPH7.0の125mMリン酸緩衝液
で透析させた。 Ａ鎖をSDS−アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた結果、分子量30000と33000に対応して２つの
バンドが現れた。濃く染色されたA1鎖が分子量
30000のバンドで、薄く染色されたA2鎖が分子量
33000のバンドだつた。 ２ リシンA1鎖およびA2鎖の過ヨウ素酸ナトリ
ウムによる修飾 この修飾は実施例２で述べたような効果を及ぼ
す。ポリサツカライドが酸化されたＡ鎖のタンパ
ク質合成阻害における酵素活性と薬物動態学的特
性を調べた。 ３ 無細胞系A1鎖及びA2鎖における酵素活性の
維持 阻害作用を実施例１で述べたようにして測定し
た。IC50は酸化されたA1鎖およびA2鎖に対して
それぞれ2.1×10-10mol／、2.1×10-10mol／
であつた。本実施例において比較例として用いた
生のA1鎖およびA2鎖のIC50はそれぞれ1.9×10-10
mol／、1.0×10-10mol／であつた。従つて
Ａ鎖から切断された分子鎖の修飾はその酵素活性
を減じない。 ４ A1鎖（A1−La）およびA2鎖（A2−La）に
おける薬物動態学的特性の維持 A1若しくはA1−La鎖またはA2若しくはA2−
La鎖をうさぎの耳の血管から、体重１Kg当たり
Ａ鎖415μgの割合で、１回注射した。20時間後に
採取した血漿サンプルを免疫試験RIM−１（実施
例２参照）によつて分析した。結果を下表に示
す。Ａ鎖及びＡ−La鎖の値を対照的に示す。
【表】 投与20時間後にはA1−La鎖およびA2−La鎖
の濃度はA1鎖およびA2鎖のそれぞれ500倍、350
倍になつている。 実施例 ７ 本実施例においてはＡ鎖とこれから切断された
A1鎖およびA2鎖の生および酸化された状態にお
ける生化学的パタメータを示す。 本実施例で用いたＡ鎖は実施例２及び６で説明
したようにして準備した。 １ 炭水化物部分 これらタンパク質の炭水化物部分は、クランプ
（Clamp）の方法（糖タンパク質：その構成、構
造及び機能（ゴツトシヤルク編）、5A巻、第300
−321項）を用い、ガスクロマトグラフイーによ
つて定量した。得られた結果を整理したものを２
つの表に示す。
【表】
【表】
【表】 これらの結果は過ヨウ素酸酸化はＡ鎖の糖類の
一部を破壊することを示している。Ａ鎖１分子当
りのＡ鎖、A1鎖及びA2鎖のマンノース残差は平
均してそれぞれ3.17，2.11，2.94残差減少し、フ
コース残基はほぼ完全に消失し、キシロース残基
は平均してそれぞれ1.24，1.00，1.05残基減少し
た。Ｎ−アセチルグルコサミン残基はわずかに減
少しただけである。 ２ Ｎ末端配列 Ａ鎖とこれから切断されたA1鎖およびA2鎖の
生および酸化状態におけるＮ末端アミノ酸残基を
アミノ酸配列分析装置によつて決定した。 得られた結果を整理して下表に示す。
【表】
【表】 生状態及び酸化状態のＡ鎖、A1鎖およびA2鎖
におけるＮ未端アミノ酸９個の配列は互いに全く
同じことがわかつた。これは酸化処理はアミノ酸
配列に影響を与えないことを示している。またＡ
鎖のＮ末端アミノ酸９個の配列は本発明に先立つ
てフナツ（農芸生物化学、第43巻、2221頁、1979
年）によつてリシンのＡ鎖について決定されたも
のと全く同じこともわかる。 ３ ConA／セフアロースに対する親和性 DTNB ５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）でマスクされたＡ鎖即ちＡ（DTNB），Ａ
（DTNB）−La，A1（DTNB），A1（DTNB）−
La，A2（DTNB）及びA2（DTNB）−La鎖の
ConA／セフアロースに対する親和性を調べた。
Ａ鎖を１mg含む溶液１mlをConAが１ml入つたカ
ラムに注いだ。280nmにおける吸光度を測つた後
クロマトグラフイーにかけた。PH7.0の125mMリ
ン酸緩衝液で洗浄し、ConAによつて保持されな
かつた最初のピークが基線水準に戻つた後、カラ
ムを0.1Mホウ酸緩衝液で洗浄した。この緩衝液
は塩化ナトリウム水溶液に対して0.5M，α−メ
チルマンノシドに対して0.1Mの濃度にした。
280nmにおける吸光度を百分率で表示した結果を
下表にまとめた。
【表】 ConAはマンノース末端をもつた糖タンパク質
に親和性をもつていることが知られている。この
ような残基をもつたＡ鎖はConAと結合する。こ
れはより多くマンノースで置換されたA2鎖にお
いて特に顕著にわかる。また酸化するとこの親和
性が消失することが見い出されるが、これはこの
種の糖質残基に共通に認められる。 ４ モル吸光係数（Ｅ１％ １cm）の決定 280nmにおける吸収係数（Ｅ１％ １cm）とは１ml当
たりタンパク質を１mg含む溶液の280nmにおける
吸収係数で、これを用いて標準純度のウシ血清ア
ルブミンを使つたFOLIN試験によつてタンパク
質濃度を決定した。 結果を下表に要約した。
【表】 分子鎖中のチオール基をDTNBでマスクする
とニトロベンゾイル基を生じるため280nmにおけ
る吸収が大きく増加する。酸化後は280nmにおけ
る吸収に大きな変化は観察されなかつた。これは
酸化は280nmにおける吸収に関係するアミノ酸に
影響を与えなかつたことを示している。 ５ 等電点電気泳動 Ａ鎖を等電点泳動によつて分離するとPH7.5な
いし8.0の間に等電点バンドを生じ、これはＡ鎖、
A1鎖及びA2鎖のどれも同じであつた。 生状態及び酸化状態のＡ鎖、A1鎖およびA2鎖
の等電点を比較したところ、マスクされていない
場合はＡ鎖に特徴的なバンド全てがPHで0.5、酸
性方向に移動した。この等電点移動は生状態と酸
化状態のものが重なることなく起こつたので、Ａ
鎖の分子は全て酸化によつて影響を受けたと考え
られる。 実施例 ８ 本実施例においては生のゲロニンを動物に静脈
注射した場合のその急消失と過ヨウ素酸ナトリウ
ムによつて変性させたゲロニンを同様に注射した
後のそのゆつくりとした消失について説明する。 １ 過ヨウ素酸ナトリウムによるゲロニンの修飾 ゲロニンをゲロニウムムルチフロールム
（Gelonium multiflorum）から生化学ジヤーナ
ル、第255巻、6947−6953頁、1980年に述べてあ
る方法で抽出し、精製した。実施例２でリシンＡ
鎖について述べたのと同じ方法で酸化反応を行つ
た。しかしチオール基のDTNBによるマスクは
行つていない。 実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてゲロ
ニンと抗体をカツプリングさせることはあまり行
なわれていないので、チオール基は、酸化後、ガ
ン研究（Cancer Res.）、第44巻、129−133頁、
1984年において説明された技術を用いて人工的に
導入した。過ヨウ素酸ナトリウム0.5M水溶液21μ
を１ml当たり１mgのゲロニンを含む溶液１mlに
リン酸緩衝溶液中で加え、1M酢酸でPHを６にし
た。これを暗所で16時間４℃に保つた。反応は
1Mエチレングリコール水溶液を105μ加えて終
結させた。これを20℃で４分間保温した後、反応
物を４℃でリン酸緩衝液中において透析した。30
分間10000×ｇで遠心分離にかけると、ここから
濃度2.5mg／mlの酸化ゲロニン2.9mgが得られた。 リシンＡ鎖と同じように、ゲロニンの基本的特
性はリボソームの60Sサブユニツトの分解によつ
て真核細胞におけるタンパク質合成を阻害するこ
とである（バイオケミカルジヤーナル、第207巻、
505〜509頁、1982年）。ゲロニンの場合にも過ヨ
ウ素酸酸化による修飾は、活性の損失を生じさせ
ないことがわかつた。 ゲロニンにおける薬物動態学的特性の維持 生の、或いは上述の手続で修飾されたゲロニン
をうさぎの耳の血管から一回注射した。投与した
ゲロニンの量は0.3ないし0.4mg／Kgであつた。ヘ
パリンの存在下で血液を時々採取した。血漿は以
下RIM−２と略称する放射線免疫試験を用いて
分析した。 この試験はRIM−１試験と同じ技術を用いる。
ただしAc1溶液が本例ではアフイニテイークロマ
トグラフイーで精製された抗ゲロニンウサギ抗体
溶液である。Ac2抗体はRIM−１試験と同じ抗体
を放射性同位体で標識したものである。同一標本
中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの濃度をそ
れぞれ標本とは異つた既知の濃度の検量線と比較
することによつて決定した。放射標識の技術は
RIM−１で説明したものと同じである。RIM−
２試験はRIM−１試験と同等の信頼性と再現性
を示した。本実験の結果は実施例２でリシンのＡ
鎖について示したのと同じ方法で示す。 図４は生の及び修飾したゲロニンを静脈注射し
た場合の血漿中濃度曲線を時間の関数として表わ
している。生のゲロニンは99.99％が24時間で消
失したことから、生のリシンＡ鎖と同じように血
中から非常に急速に消失することがわかる（曲線
１）。ゲロニンのポリサツカリド単位が酸化され
ている場合は曲線形が大きく違う。投与24時間後
に酸化したゲロニンの濃度は生のゲロニンの300
倍ある（曲線２）。 従つてこれらの結果はリシンＡ鎖と同じよう
に、過ヨウ素酸酸化はゲロニンの消失を測るのに
用いられる糖類を、この機能を妨げる程度にまで
修飾することを示している。 実施例 ９ 本実施例は(1)モモルデイカ・カランテイア
（momordica charantia）から抽出したGPIR
MOMを動物へ静脈注射した後のその急速な消失
と(2)過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したGPIR
MOMを同じように注射した後のゆつくりとした
消失に関する。 １ GPIR MOMの過ヨウ素酸ナトリウムによる
修飾 GPIR MOMをMomordica charantia種子の
内生胞子から、バイオケミカルジャーナル
（Biochemical Journal）第186巻、443−452頁、
1980年で説明されている方法で抽出し精製した。
生のMOM及び修飾されたMOMの薬物動態学的
特性を放射標識したGPIR MOMを用いて調べ
た。MOMはクロラミンＴの存在下で125Iを用い
て標識した。放射性125Iを１ml当り100μCi含む溶
液10μとクロラミンＴを１ml当り2.5mg含む溶液
30μを、MOMを１ml当り１mg含む溶液100μ
にリン酸緩衝溶液中で加えた。反応液を室温で１
分間保つた、反応は１ml当りメタ重亜硫酸ナトリ
ウム0.5mgを含む溶液400μを加えて終結させた。
反応物は未反応のヨウ素を放射標識されたタンパ
ク質から分離するためにSephadex Ｇ 25のカラ
ムを用い0.1％のゲラチンを含むリン酸緩衝液で
ゲル過した。10000×ｇで30分間遠心分離にか
けたところ、濃度0.04mg／mlの放射標識された
MOMが80μg得られた。 酸化反応は実施例２においてリシンのＡ鎖につ
いて説明したのと同じ条件下で行なわれた。但し
チオール基をDTNBでマスクする処理はなく、
タンパク質の濃度は125倍低く40μg／ｍであ
る。0.5M過ヨウ素酸ナトリウム水溶液20μを放
射標識されたMOMを（１ml当たり）0.04mg含む
溶液１mlに加え、1M酢酸でPHを６にした。この
反応液を暗所で16時間４℃に保つた。反応は1M
エチレングリコール水溶液を100μ加えて終結
させた。15分間20℃に保つた後、反応物を４℃の
下にリン酸緩衝液で透析した。10000×ｇで30分
間遠心分離にかけたところ濃度0.021mg／mlの酸
化されたMOMが32μg得られた。 こうして得られた新しい分子の分子量は生の
MOMと実質的に相違がない。クーマシーブルー
で染色し、ポリアクリルアミド電気泳動にかけて
みた限りでは、修飾処理はごく少量のタンパク質
ポリマーを生じさせるのみで、何らの分解も引き
起さなかつた。 ２ MOMの薬物動態学的特性の持続 放射標識されたMOMを、前述の手続による酸
化の有無を問わず、うさぎの耳の血管に一回注射
した。投与されたMOMの量は3.50ないし
3.55μg／Kgである。ヘパリン存在下で時々採血を
した。血漿を濃度25％のトリクロロ酢酸（TCA）
200μと一緒に４℃で30分間保温した。酸で沈
殿させた沈降物中の放射能を測定した。この分析
法によれば、影響を受けなかつたMOM分子の血
漿レベルの測定が可能になる。TCAで沈殿しな
い低分子の分解生成物は考慮に入れなかつた。こ
れらの実験結果は血中に残存する放射能を初期量
に対する百分率にして時間の関数で表した。この
値は“初期血漿放射能百分率（％IPR）と呼ば
れ、次式で算出する。 ％I.P.R.＝ｒ×PV×100／0.2×Ｒ ここでｒは0.2mlのブラズマからｔ時間後に検
出された放射能、Ｒは投与された全放射能、PV
は血漿量（うさぎの体重１Kg当り36mlあると考え
られている）である。 図５に示したのは、酸化されたまたは酸化され
ないMOMを静脈注射した後の血漿中濃度であ
る。MOMは、血中のMOMの99.9％が８時間で
消失したことから、生のリシンＡ鎖と同じよう
に、血中から急速に消失することがわかる（曲線
１）。MOMの糖質残基が酸化された場合は、濃
度の減少速度が低下した（曲線２）。投与８時間
後に酸化されたMOMの濃度は酸化されていない
MOMのそれの60倍になつた。従つてこれらの結
果は過ヨウ素酸酸化はMOMの短時間消失の原因
である糖類を修飾することを示している。 実施例 10 本実施例は(1)デイアントウス・カリオフイルス
（Dianthus caryophyllus）から抽出したGRIRデ
イアンチンを動物へ静脈注射した後のその急速な
消失と(2)過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したGRIR
デイアンチンを同じように注射した後のゆつくり
とした消失に関する。 １ デイアンチン30の過ヨウ素酸ナトリウムによ
る修飾 デイアンチン30をDianthus caryophyllusの葉
からバイオケミカルジヤーナル（Biochemical
Journal）第195巻、339−405頁、1981年で説明さ
れている方法で抽出し、精製した。酸化された又
は酸化されていないデイアンチン30の薬物動態学
的特性を放射標識したデイアンチンを用いて調べ
た。ヨウ素化及び酸化反応は実施例９でMOMに
ついて説明したのと同じ条件下で行つた。 こうして得られた新しく酸化されたデイアンチ
ン分子の分子量は生のデイアンチン30と実質的に
相違がない。 ２ デイアンチン30の薬物動態学的特性の持続 放射標識されたデイアンチンを前述の手続によ
る酸化の有無を問わず、うさぎの耳の血管に一回
注射した。デイアンチンの血漿中濃度は実施例９
でMOMについて説明したのと同じ方法で測定し
た。図６は酸化されたデイアンチン（曲線１）又
は酸化されないデイアンチン（曲線２）の血漿中
濃度を時間の関数で表わしたものである。デイア
ンチン30はMOMと同じように初期量の99.9％が
２時間以内に急速に消失している。一方デイアン
チン30の糖質残基が酸化された場合は、濃度の減
少速度が大きく低下した。投与２時間後に酸化さ
れたデイアンチンの濃度は酸化されていない
MOMのそれの80倍になつた。酸化されたデイア
ンチンの濃度は24時間たつてもまだ高かつた（初
期量の３％）。 これらの結果もまた、過ヨウ素酸酸化はデイア
ンチンの短時間消失の原因である糖質を修飾する
ことを示している。 実施例 11 リシンＡ鎖を活性化されたジスルフイド基で置
換し人間のＴ細胞を阻害する抗体と反応させた抱
合体を準備する。 ａ 人間のＴ細胞を阻害する抗体（T101抗体） この抗体は免疫学ジヤーナル（Journal of
Immunology）第125（２）巻、725−737頁、1980
年において説明された方法によつて準備した。 ｂ 酸化されたリシンのＡ鎖 リシンのＡ鎖は実施例２で説明した方法によつ
て準備した。 人間のＴ細胞を阻害する活性化抗体 １−エチル−３−ジメチルアミノプロピル−３
−カルボジイミドを１ml当り60.3mg含む溶液20μ
を３−（ピリジニル−２−ジスフアニル）プロ
ピオン酸を１ml当り20mg含む溶液100μにtert−
ブタノール中で加え、混合物を３分間室温で放置
した。こうして得られた溶液68μを、１ml当り
抗体8.9mgを含む溶液２mlにリン酸緩衝液中で加
えた。この混合物を15分間30℃で攪拌し、その後
４℃下でリン酸緩衝液において透析した。次いで
タンパク質溶液を遠心分離し、活性化抗体を7.9
mg／mlの濃度で15mg得た。２−メルカプトエタノ
ールとの交換反応によつて放出されたピリジン−
２−チオンの343nmにおける吸収をみると、この
抗体は1mol当り3.8個の活性化された混合ジスル
フイド基を有していることがわかつた。 持続作用のあるリシンＡ鎖を含有する免疫毒
素の準備 修飾されたＡ鎖を１ml当り2.87mg含む溶液2.46
mlと上述の方法によつて得られた活性化抗体の溶
液1.5mlを準備し（濃度7.9mg／ml：即ち活性化抗
体を11.8mg含む）、この混合物を20℃で20時間放
置した。この溶液を遠心分離にかけ、セフアデツ
クスG100を用いて過し、精製した。溶出物の
光学密度を280nmで測定した。抗体とＡ鎖の両方
を含む分画を合わせると免疫毒素を１ml当り0.7
mg含む溶液15ml（即ち免疫毒素は10.5mg）が得ら
れた。この溶液は抗体とカツプリングされた酸化
Ａ鎖を１ml当り0.14mg含有する。 従つてこの方法による平均カツプリング度は抗
体1molにつき酸化Ａ鎖1.2molである。 上記の方法で得た酸化されたリシンＡ鎖を含む
免疫毒素IT（Ａ−La）T101について、その薬物
動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒性を調べ
た。 実施例 12 本実施例においては、持続作用をもつリシンＡ
鎖を含む免疫毒素（IT（Ａ−La）T101と略す）
の血漿中濃度がゆつくりと減少するという性質を
獲得することを示す。 方法 実施例11で説明した手続で準備された抱合体を
うさぎの耳の血管に一度注射した。投与された量
はＡ鎖について体重１Kg当たり0.415mgである。
ペパリンの存在下で血液を時々採血した。血漿を
放射線免疫試験（RIM−３と略す）によつて
（２箇所）分析した。 この試験はRIM−１と同じ技術を用いて行わ
れた。但しAc2溶液は本試験においてはRIM−１
の技術を用いてアフイニテイークロマトグラフイ
ーによつて精製され、放射標識されたマウスの
IgGを阻害するヤギの抗体である。このサンプル
における修飾された免疫毒素の濃度は既知の異つ
た濃度から導いた検量線を用いて決定した。
RIM−３試験はRIM−１と同じ信頼性及び再現
性を有する。 比較対照のため、生のリシンＡ鎖を活性化され
たジスルフイド基で置換した抗体の反応から得ら
れたITT101の抱合体と同じ条件下で比較例の試
験を行つた。この抱合体の準備と細菌毒性はフラ
ンス国特許出願第2516794号で説明した方法によ
つて行つた。これらの実験結果は実施例２でカツ
プリングされていないＡ鎖について行つたのと同
じ方法で示した。 結果 図７は静脈注射されたITT101及びIT（Ａ−La）
T101の血漿中濃度曲線を示している。投与24時
間後にIT（Ａ−La）T101活性細胞毒素はITT101
の140倍になつていた。この事実は酸化されたＡ
鎖の薬物動態学的特性は抗体とカツプリングされ
た後も保持されていることを示している。 実施例 13 本実施例においてはIT（Ａ−La）T101の標的
細胞に対する細胞毒素特性の保存について述べ
る。 リシンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中の
タンパク質合成をリボソームの60Sサブユニツト
の分解によつて阻害することである。 この方法は培養中のガン細胞に14Cで標識した
ロイシン（以下14C−ロイシンをいう）を取り込
ませて研究されている物質の効果を測定する細胞
系を用いる。 用いられる細胞は、抗原T65を運ぶ人間のＴ白
血病から誘導されるCEM細胞系に属する。この
細胞は目的の物質の存在下で保温した後、細胞へ
の14C−ロイシンの取り込みの程度を測定した。
この測定には生物化学ジャーナル（Journal of
Biological Chemistry）第249巻11号、3557−
3562頁で説明された、タンパク質合成量を測定す
るのに14C−ロイシンのトレーサーを用いる方法
によつて行う。取り込まれた放射能はろ過した細
胞の全体について測定した。 定量の基準として線量／効果曲線を描くことが
できる。この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモ
ル濃度、縦軸には、タンパク質合成を阻害する物
質の存在しない比較細胞における14C−ロイシン
の取り込み量に対する百分率をプロツトして得ら
れる。 こうしてそれぞれの物質について14C−ロイシ
ン取り込み量を50％阻害する濃度または50％阻害
濃度（IC50）を決定することができる。 図８は恒温媒体中で10mM塩化アンモニウムの
存在下でIT（Ａ−La）T101とカツプリングされ
ていないＡ鎖について行つた同じ実験から曲線を
示している。この図をみるとIT（Ａ−La）T101
は同一条件で測定されたカツプリングも酸化され
ていないＡ鎖に比べ約８万倍の非常に強い細胞毒
性（IC50＝5.5×10-12Ｍ）を有することがわかる。 実施例 14 本実施例はクローン原性試験において確認され
たCEM標的細胞に対するIT（Ａ−La）T101と
ITT101の細胞毒性的効能の比較を示す。免疫毒
素は標的細胞を一つ一つ破壊する作用を担う。こ
の作用は感度の高い技術を用いて測定することが
できる。コロニー形成阻害試験によれば、一個の
生存細胞を数百万の死んだ細胞から見い出せるた
めこの可能性がある。これは人間のCEMリンパ
系に応じたゲル媒体における最適な培養条件によ
つて可能になる。 コロニー形成阻害試験による細胞毒素の測定
技術 クローニングに用いられる媒体はケトグルタル
酸ナトリウム１ミリmol、オキサロ酢酸ナトリウ
ム１ミリmol、５％の不活性仔ウシ血清及び10％
の不活性ウマ血清が加えられたRPMI1640であ
る。最初に0.3％の寒天溶液（アガロース型、
シグマ（SIGMA）研究所製）をペトリ皿のこの
媒体中に薄層のようにして用意し、４℃で凝固さ
せた。細胞は37℃に保温した0.275％寒天溶液と
混ぜ合せ、それから最初の寒天層上に流し込んで
凝固させた。これに用いた寒天の濃度は、クロー
ニングの効率、コロニーの大きさ及び媒体の均一
性の三者を同時に最適化する目的で行つた予備試
験の結果から定めた。恒温に保つてから15日後
に、自動コロニー計数器（“アルチツク”、ダイナ
テツク社、米国）を用いてコロニーを計数した。
クローニング効率、即ち免疫毒素処理で生き残つ
た細胞の正確な数を決定するには、接種された細
胞の数を形成されたコロニーの数の関数として表
す検量線をつくることが大切である。発明者等は
この検量線から得られるクローニング効率は、細
胞を免疫毒素処理した場合よくみられるように、
死んだ細胞が高い割合であつても影響されないこ
とを証明した。 免疫毒素処理は、10％の不活性仔ウシ血清と10
ミリmolの塩化アンモニウムを含むRPMI1640媒
体の全量１mlに対してそれぞれ異つた濃度のIT
（Ａ−La）T101及びITT101の免疫毒素を用い、
指数的に成長している細胞を保温することによつ
て行う。保温は５％の二酸化炭素を含む雰囲気下
で試験管を水平方向に振ること（ニユーブルンス
ウイツク社“ジラトリ−Ｇ−２”攪拌器を用いて
2500rpmのペース）によつて37℃に保つた。生存
細胞の数が検量線によつて最大感度範囲で測定で
きるように寒天溶液と混合する前に、細胞を洗浄
し、それぞれ異つた希釈にして準備した。結果は
次の関係式を用い、クローニング効率から外挿し
て生存細胞の絶対数で表した。生存細胞の絶対数
は次式で表わされる。Ｃ×ｄ／Ｅ、ここでＣはペト リ皿１皿当りのクローンの数、ｄは細胞の希釈因
子、Ｅは検量線の勾配から求められたクローニン
グ効率である。それぞれの値は３回の試験結果の
平均をとつた。 結果 図９は塩化アンモニウム10ミリmolの存在下に
おけるCEM細胞に対するIT（Ａ−La）T101及び
ITT101免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫毒素の濃
度（Ａ鎖のモル濃度）の関数として表している。
これら２つの毒素の効率は同じオーダーの大きさ
であることは明らかである。細胞数減少の度合は
両者とも大きいが、これは10-11Ｍ程度の低い濃
度においては残存生存細胞の割合は初期値に比べ
て0.001％のオーダーになつてしまうからである。
この効果は高度に特異的である。何故ならこれら
の濃度においてはカツプリングされていないＡ鎖
と非特異的な免疫毒素は、これらの細胞に対して
効果をもつていないことが証明されたからであ
る。 本実施例によつてIT（Ａ−La）T101は従来の
ITT101と実質的に同一な特異細胞毒性を有する
ことがわかる。 実施例 15 リシンの酸化され官能基を導入したＡ鎖
（NEM）と活性化されたジスルフイド基で置換
した人間のＴ細胞を阻害する抗体（T62抗原に作
用する抗体）との抱合体。カツプリングは活性化
されたジルフイド基とＡ鎖の官能基を導入された
糖質残基の間で起こる。 １ 免疫毒素の準備 ａ 官能基を導入したＡ鎖の準備 Ａ鎖のSH基をＮ−エチルマレイミドでマスク
し、次いで実施例３で説明した方法を用いて18時
間かけて酸化した。 シスタミンとのカツプリング PH9.5の炭酸緩衝液で透析した後、タンパク質
を１ml当り4.65mg含む溶液5.2mlを塩酸シスタミ
ン18mgと共に25℃で２時間保温した。こうして保
温したものをホウ水素化ナトリウム（Ａ鎖１モル
につき200等量即ち0.1N水酸化ナトリウム溶液１
mlに17.6mgのホウ水素化ナトリウムを含む溶液
156μ）を用い、25℃で２時間還元した。 過剰の試薬はPH７のリン酸緩衝液125mMで連
続透析して除去した。固定したシスタミンのジス
ルフイドブリツジを30℃で１時間後に濃度５％に
なるような２−メルカプトエタノールで還元し、
その後さらにPH７の125mMリン酸緩衝液で連続
透析（毎時300mlで全量20）した。透析及び遠
心分離後、Ａ鎖1mol当り0.25個のSH基をエルマ
ン法によつて定量した。 ｂ 抗体の準備（実施例11参照） ｃ カツプリング反応 修飾されたリシンＡ鎖の溶液1.5ml（Ａ鎖は
0.058μmol）を前記ｂ）で得られた活性化抗体溶
液211μ（抗体は0.006μmol）に加えた。この混
合物を30℃で18時間反応させた。次いでこの反応
物をリン酸緩衝液（リン酸塩10mM、塩化ナトリ
ウム140mMの割合でPH7.4）で透析した。遠心分
離後、ポリアクリロアミド電気泳動にかけると、
得られた免疫毒素は平均して抗体1mol当りＡ鎖
0.8個のカツプリング度を有することがわかつた。 ２ 免疫毒素IT（Ａ（NEM）−La−システアミン）
T101の性質 ａ 特異的細胞毒素活性 前述の手続で準備した免疫毒素はCEM標的細
胞に対して非常に強力な細胞毒素活性（IC50＝
1.2×10-11、実施例13で説明した測定法による）
を有する。 ｂ 血漿中濃度の減少 免疫毒素をうさぎの耳の血管に一回注射した。
血漿サンプルは22時間後に採取して、RIA−３免
疫検定法（実施例12参照）によつて分析した。結
果を下表に示す。IT101の値は相対的な値で示し
てある。
【表】 投与22時間後に、修飾されたＡ鎖を含むITの
濃度はITT101の30倍あつた。 実施例 16 メチル化され、酸化され、官能基を導入された
リシンＡ鎖（NEM）と人間のＴ細胞を阻害する
抗体（T65抗原に対する抗体）の抱合体。カツプ
リングは活性化されたジスルフイド基とＡ鎖の修
飾された糖質残基の間で起こる。 １ 免疫毒素の準備 ａ 官能基を導入したＡ鎖の準備 Ａ鎖のSH基をＮ−エチルマレイミドでマスク
し、次いで実施例５で説明した方法を用いて18時
間かけてメチル化と酸化を行つた。 システミンとのカツプリング PH9.5の0.1M炭酸緩衝液で透析した後、タンパ
ク質を１ml当り4.65mg含む溶液18.5mlを塩酸シス
テミン35.6mgと共に25℃で２時間保温した。こう
して保温したものをホウ水素化ナトリウム（Ａ鎖
１モルにつき、200等量即ち0.1N水酸化ナトリウ
ム溶液１mlに17.6mgのホウ水素化ナトリウムを含
む溶液395μ）を用い25℃で２時間還元した。 過剰の試薬はPH７のリン酸緩衝液125mMで連
続透析して除去した。固定したシステミンのジス
ルフイドブリツジを30℃で１時間後に濃度５％に
なるような２−メルカプトエタノールで還元し、
その後さらにPH７の125mMリン酸緩衝液で連続
透析（毎時300mlで全量20）した。透析及び遠
心分離後Ａ鎖1mol当り0.32個のSH基をエルマン
法によつて定量した。 ｂ 修飾された抗体の準備 エチルアルコール中にＮ−サクシニミデイル−
３−ピリジニル−２−ジチオプロピオネート2.12
mgを含む溶液をT101抗体を１ml当り4.4mg含む溶
液23.5ml（抗体は0.68μmolになる）に加えた。混
合物を30分間25℃で攪拌し、次いでPH７の
125mMリン酸緩衝液で透析した。その後タンパ
ク質溶液を遠心分離にかけ、修飾された抗体を１
ml当り4.2mg含む溶液23.5mlを得た。 ２−メルカプトエタノールとの交換反応によつ
て放出されたピリジン−２−チオンの343nmにお
いて分光分析したところ、得られた抗体は１モル
当り3.2個の活性化された混合ジスルフイド基を
有していることがわかつた。 ｃ カツプリング反応 修飾されたリシンＡ鎖の溶液7.3ml（Ａ鎖は
0.275μmol）を前記ｂ）で得られた活性化抗体溶
液781μ（抗体0.022μmol）に加えた。この混合
物を30℃で18時間反応させた。次いでこの反応物
をリン酸緩衝液（リン酸塩10mM、塩化ナトリウ
ム120mMの割合でPH7.4）で透析した。 遠心分離後、ポリアクリロアミド電気泳動にか
けると得られた免疫毒素は平均して抗体1mol当
り酸化されメチル化されたＡ鎖（NEM）0.8個の
カツプリング度を有することがわかつた。 上述の方法で得たメチル化され酸化されたリシ
ンＡ鎖（NEM）を含む免疫毒素の薬物動態学的
特性と標的細胞に対する特異的細胞毒性を調べ
た。 ２ IT（メチル化Ａ（NEM）−La−シスタアミン）
T101免疫毒素の特性 ａ 特異的細胞毒素活性 前述の手続で準備した免疫毒素はCEM標的細
胞に対して非常に強力な細胞毒素活性（IC50＝７
×10-12、実施例13で説明した測定法による）を
有する。 ｂ 血漿中濃度の減少 免疫毒素をうさぎの耳の血管に一回注射した。
血漿サンプルは22時間後に採取して、RIA−３免
疫検定法（実施例12参照）によつて分析した。結
果を下表に示す。IT101の値は相対的な値で示し
てある。
【表】 投与22時間後に、修飾されたＡ鎖を含むITの
濃度はITT101の17.5倍あつた。 実施例 17 酸化されたＡ鎖の動物の体全体への毒物学的特
性（免疫毒素の毒性は等モル量におけるＡ鎖と同
じオーダーの大きさである）を調べることは重要
である。これはチヤールズリバーフランスCD1マ
ウスに静脈注射された酸化Ａ鎖の半数致死量を生
のＡ鎖との比較において決定することによつて行
われる。 その結果を下表に示す。
【表】 上の結果は酸化されたＡ鎖の毒性は生のＡ鎖よ
り低いことを示している。これはＡ鎖が酸化によ
つて修飾されるとＡ鎖の血漿中濃度は著しく増加
するけれども、その毒性は増加するどころか、反
対にかなり減少することを意味している。 従つて修飾された細胞毒性サブユニツトを包む
免疫毒素は人間の治療薬として使える。これらの
修飾された免疫毒素は、標的細胞が免疫毒素を準
備するのに用いられる抗体によつて識別されるよ
うなガンまたはガンでない病気の治療に用いられ
る。最適な投与量と治療時間は問題の病気にかか
つた患者とその病気の特質に応じて定められるべ
きである。 より一般的な言葉でいえば、糖質単位が過ヨウ
素イオンによつて修飾され、対応する修飾のない
抗腫瘍糖タンパク質よりも半減期の長い抗腫瘍糖
タンパク質は薬として有用だということである。 従つてもう一つの特徴によれば、本発明は糖質
単位が過ヨウ素酸イオンの酸化によつて修飾され
ている抗腫瘍糖タンパク質が注射好ましくは静脈
注射に適して形態になつている抗腫瘍薬に関す
る。
【図面の簡単な説明】
第１図ないし第９図は本発明の糖タンパク質の
特性を示す線図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 糖鎖単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化によ
    つて修飾されている、抗腫瘍作用を有する糖タン
    パク。 ２ リボソームを不活化する糖タンパクであつ
    て、その糖鎖単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化
    によつて修飾されており、リボソームを不活化す
    る未修飾糖タンパクと実質に同一の活性を有しか
    つそれよりも長い活性半減期を有する糖タンパ
    ク。 ３ リボソームを不活化し、延長された作用を有
    する糖タンパクであつて、当該チオール基が場合
    に応じて保護されている糖タンパクの水溶液を過
    ヨウ素酸アルカリ金属の水溶液で、光の不存在下
    に、０℃ないし15℃の温度で0.2ないし24時間処
    理し、場合に応じてチオール基の保護基を除去
    し、および得られた生成物を単離することによつ
    て得られた糖タンパク。 ４ 糖タンパクの水溶液がリシンのＡ鎖の水溶液
    である特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 ５ リシンのＡ鎖が感応化されている特許請求の
    範囲第３項記載の糖タンパク。 ６ リシンのＡ鎖がメチル化によつて感応化され
    ている特許請求の範囲第５項記載の糖タンパク。 ７ 糖タンパクの水溶液がゲロニンの水溶液であ
    る特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 ８ 糖タンパクの水溶液がGPIR MOMの水溶液
    である特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 ９ 糖タンパクの水溶液がGPIRジアンチン30の
    水溶液である特許請求の範囲第３項記載の糖タン
    パク。 １０ 糖タンパクの水溶液が、ジアンチン32、ア
    グロスチンＡ、アグロスチンＢ、HCIまたはアス
    パラガス・オフイシナリス由来阻害剤の水溶液で
    ある特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 １１ 生のリシンもしくは生のリシンのＡ鎖断片
    であるリシンＡ鎖から、または遺伝型が修飾され
    た細胞によつて生合成されたリシンＡ鎖もしくは
    その断片から製造された特許請求の範囲第４項記
    載の糖タンパク。 １２ 少なくとも１つのチオール基が２，2′−ジ
    ニトロ−５，5′−ジチオジベンゾエートとの反応
    により保護されているリシンＡ鎖の水溶液を過ヨ
    ウ素酸ナトリウムの水溶液で、光の不存在下に、
    約４℃の温度で0.2ないし24時間処理し、ついで
    ２−メルカプトエタノールで処理し、得られた生
    成物を単離することによつて得られた特許請求の
    範囲第１１項記載の糖タンパク。 １３ ゲロニンの水溶液を過ヨウ素酸ナトリウム
    の水溶液で、光の不存在下に、約４℃の温度で
    0.2ないし24時間処理し、ついで２−メルカプト
    エタノールで処理し、得られた生成物を単離する
    ことによつて得たものである特許請求の範囲第７
    項記載の糖タンパク。 １４ 未修飾の、抗腫瘍性糖タンパクを過ヨウ素
    酸イオンによる酸化処理に供することを特徴とす
    る抗腫瘍作用を有する糖タンパクの製造方法。 １５ リボソームを不活化し、延長された作用を
    有する糖タンパクの製造方法であつて、当該チオ
    ール基が場合に応じて保護されている糖タンパク
    の水溶液を過ヨウ素酸アルカリ金属の水溶液で、
    光の不存在下に、０℃ないし15℃の温度で0.2な
    いし24時間処理し、場合に応じてチオール基の保
    護基を除去し、および得られた生成物を単離する
    ことを特徴とする製造方法。 １６ 出発糖タンパクが生のリシンもしくは生の
    リシンのＡ鎖断片であるリシンＡ鎖、または遺伝
    型が修飾された細胞によつて生合成されたリシン
    Ａ鎖もしくはその断片である特許請求の範囲第１
    ５項記載の製造方法。
JP60135217A 1984-06-20 1985-06-20 抗腫瘍作用を有する糖タンパクおよびその製造方法 Granted JPS6112628A (ja)

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