JPH0585156B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は動物細胞（接着性細胞）を倍よ皿上に
特殊な方法により増殖させ、連続的に生理活性物
質を産生させる細胞培養装置に関するものであ
る。

（従来技術） 従来接着性細胞の培養に当たつては大量培養装
置として(A)細胞の接着面積を大きくするために容
器内に多数の板を平行に設けたものがあり、その
うちの１つの型は液封方式ともいうべきもので板
に細胞を付着させた後PH、DO（溶存酸素）を制
御しながら培養液を循環させる型式、他の１つは
レコード板のようなものを平行に円筒中に並べ、
まず始めに垂直に立て（板は水平になる）細胞懸
濁液を流し込み、細胞を板に接着させ、次いで横
にして回転方式で培養する形式である。

以上のようなものの他(B)プラスチツクフイルム
を渦巻状にしたものを円筒におさめたもので細胞
培養はローラー培養と同様に行い、次いで垂直に
立て、空気等を送り込むことにより培養液を循環
させる形式がある。

更に(C)重箱構造のもので(A)と異なる点は気相が
存在することである。この方式は原理的にはルー
ビンと同じで静置培養であり、培養液を循環させ
る必要はない。マルチトレー方式と呼ばれるもの
である。

次は(D)酸素あるいは炭素ガスの透過性のプラス
チツクバツグを消防ホースのようにまき込んだス
タイルのもので、DOやPH制御を容易にしてい
る。培養液はホース内に通ずるプラスチツクバツ
グ形式である。中空繊維（ホローフアイバー）形
式は(E)人工腎臓などで用いられている透析用の中
空繊維の表面に細胞を接着、増殖させようとする
もので栄養の供給を細胞層の裏側からも行うこと
ができる。

又、(F)容易に充填したガラスビーズ表面に細胞
を接着、増殖させるものでPHやDOを調整した培
養液を循環させるガラスビーズ充填カラム形式の
他(G)ガラスビーズではなく20〜40回転／分位のゆ
るい攪拌下で培養液に浮遊する程度の比重の微少
ビーズ表面に細胞を培養、増殖させるもの、すな
わちマイクロキヤリア方式がある。しかしなが
ら、これは剪断力のダメージを受け易く、かつコ
ロニー形成率の低い細胞にとつて、マイクロキヤ
リア培養は非常に困難である。

（発明が解決しようとする問題点） 以上述べたようにそれぞれ特徴をもつたいろい
ろな装置あるいは方法が接着性細胞の大量培養化
のために考案されているが実用的な細胞生産物の
量産システムとしてはまだあまり用いられていな
く試験用段階で終わつてしまつたものが多い。

現在でもこの種の細胞の大量培養そしてインタ
ーフエロンやワクチンの量産などのためにまだロ
ーラーびん方式が使用されているという手工業的
なレベルに近い状況にある。

（問題点を解決するための手段） したがつて本発明の技術的課題は接着性細胞の
大量培養のできる実用的な細胞培養装置を提供す
ることを目的とするものでこの技術的課題を解決
する本発明の技術的手段は多段式トレー培養シス
テムを採用するものである。

すなわち、底面が外周に向かつて下向きに傾斜
し、かつ外周に断面山形の立縁を形成した培養皿
を一定の間隔を隔てて培養槽内に多段に設け、か
つ各培養皿の中央部分には焼結金属フイルターを
設けてここから培地が供給されるように構成し、
更に培養槽底面にはオーバーフロー培地出口を設
けたものである。

（発明の効果） この技術的手段によれば培地供給口から培地を
各培養皿に設けて焼結金属フイルターを介して供
給するもので、細胞の増殖によつて培地成分を消
費した培地は山状になつている培養皿の周囲から
オーバーフローして回収される。回収された培地
は廃液又は新鮮培地と混合することにより再利用
できるし、培養皿の底面は勾配があり、培地が供
給されると培養皿にたまつていた培地は中心部よ
り押し出され、山状の立縁からオーバーフローす
るけれども皿の周囲は山状となつているのでオー
バーフローした培地は周囲に飛散し、下段の皿に
混入しない。

したがつて本発明のものは連続培養が可能であ
り、また細胞は攪拌されることなく、培地は坦体
上に増殖した細胞の間を焼結金属フイルターを介
して、放射状に滲出、循環されるためマイクロキ
ヤリア法と比較して細胞の剪断力によるダメージ
は極めて小さく、細胞増殖を最適条件で行える。

しかして、培養皿の液深は小さく、またヘツド
スペースも大きくとれることから、ガス移動は行
われ易く、またマルチトレー方式とは異なつて全
てのステツプを自動化することが可能である。
又、高密度培養が可能であり、蒸気滅菌の可能な
坦体の利用により、一連の生産プロセスをインラ
インで蒸気滅菌でき、それにより汚染の危険性は
極めて少ないものとなる。

（実施例） 以下図面に示す実施例について説明する。第１
図において１は培養槽であり、２は培養槽１の中
央に立設された中心軸筒であり、３はこれに一定
間隔へだてて取付けられた培養皿である。

培養皿は底面３ａが外周に向かつて下向きに傾
斜し、かつ外周に断面山形の立縁３ｂが形成され
ている。この培養皿３に面する中心軸筒２の開口
部２ｄには焼結金属フイルター４がある。

２ａは中心軸筒２の培地入口であり、２ｂは中
心軸筒２の培地出口である。５は培養槽１の蓋体
でこれに気相入口６と気相出口７がある。８は培
養槽１の底部に開口したオーバーフロー培地出
口、９は培養槽１の覗窓である。

以上のような培養槽１には培地供給口２ａから
培養皿３に設けた焼結金属フイルター４を介して
培地を供給する。

細胞の増殖によつて培地成分を消費した培地は
山状になつている培養皿３の周囲を立縁３ｂから
オーバーフロー、培地出口８から排出され回収さ
れる。回収された培地は廃液又は新鮮培地と混合
することにより再利用される。

培養皿３の底面３ａは下向きに傾斜しているの
で培地が供給されると培養皿３にたまつていた培
地は中心部より前述した如く押し出され立縁３ｂ
からオーバーフローする。立縁３ｂは山状となつ
ているためオーバーフローした培地は周囲に飛散
して下段の皿には混入することはない。

焼結金属フイルター４のポアサイズは100μmで
動物細胞の大きさは10〜100μmであり、十分この
焼結金属フイルターを通過することができる。
又、金属イオンの溶出から細胞により増殖阻害を
起こすので焼結金属フイルター、培養皿および装
置は全てSUS316製とする。一般に動物細胞装置
はSUS316、SUS316Lが使用される。

以上のような装置を用いての培養方法について
述べると培養皿３には、細胞接着性のある 微細な網状フイルターを張る。

多孔性セラミツクフラグメントを敷き詰め
る。

等の方法によりＳ／Ｖ値を大きくすることができ
る。因にＳは表面積であり、Ｖは培地量である。
すなわち、Ｓ／Ｖ値はマイクロキヤリヤーには劣
るものの、マルチトレー、プラスチツクバツグ、
スパイラルバツグ、ガラスビーズ等を大きく上回
り、ホローフアイバーに匹敵しうるものができ
る。

については培養皿３の勾配部分と同じ大きさ
を有するフイルターを円盤状に張り、その上に同
材質でできているフイルターをヒダ状に折り曲げ
組み立てる。第２図の１０はこれを示す。

このようにすることによりフイルター表面積は
7000cm²となる。特殊フイルターの表面積は見かけ
の表面積の約７倍あり、10cm四方の表面積は10×
10×７＝700cm²となる。

一枚のデイスクで7000cm²あるのでこれは通常用
いられているローラーボトル（850cm²）の８本分
に相当する。つまり本装置は５段あるので35000
cm²（ローラーボトル41本分）となる。

についても多孔セラミツクフラグメントを敷
き詰めたことにより相当量の表面積となる。

以下に本装置の、他の装置と比較した場合の優
位性について述べる。

動物細胞ことに接着性細胞の培養装置として、
種々のものが考案、また一部は実用化されている
現状にある。中でも、微少のビーズ（100〜
200μm）への細胞の接着を利用したマイクロキヤ
リヤー用培養装置は、トンクラスのものが実用化
されている。

しかしながら、剪断力のダメージを受けやす
く、かつコロニー形成率の低い細胞にとつて、マ
イクロキヤリヤー培養は非常に困難である。剪断
力による影響を低減化するためには、静置法のよ
うに細胞自身は接着表面に固定され、かつ培地交
換が効率的に行えるシステムが望ましい。

その意味において、ガラス平板を多段にしたマ
ルチトレー法や中空繊維に細胞を接着させるホロ
ーフアイバー法が実用化されている。マルチトレ
ー法はコンパクトで簡便な方法であるが、細胞接
種、培地交換、生産物回収等を手作業で行う部分
が多く、商業的生産には不適である。また、ホロ
ーフアイバー法は培地容積当たりの接着表面積、
すなわちＳ／Ｖ値が高く、高密度培養の可能なも
のであるが、現状ではホローフアイバー自体高価
であり、再使用も難しく、かつ蒸気滅菌が不可能
であることから、商業生産する上で大きな障害と
なるものと思われる。

しかるに、本培養装置は上記方法の欠点を補う
ものである。すなわち、本装置では、細胞は各デ
イスク上の坦体に接着、増殖し、その間を培地が
循環し、かつ焼結金属フイルターより培地は放射
上に滲出されるため、剪断力は極めて小さい。

また、マルチトレー方式とは異なつて、すべて
のステツプを自動化することが可能である。

トレーやデイスクにかかわらず、多段システム
に培地を循環供給する場合、各段に順次、培地を
供給していくと、新鮮培地は入口に近い段でその
栄養分の消費は進み、出口近くの段では逆に細胞
自身の生産する乳酸、アンモニア等の成育阻害物
質の濃度が高くなる。その結果、入口に近い段で
は良好な増殖はみられるものの、出口に近い段に
おいて、増殖は阻害されることになる。

本装置では、培地は焼結金属フイルターを介し
て各段に均等に分配され、かつフイルターの細か
な目を通して、放射上に移動するため、段間、ま
た一つの段においても増殖の局存化はおこりにく
い。

本装置を用いた各段への均一な培地の供給は、
培地が滲出する金属フイルター部分の長さを調節
することによつても可能ではあるが、各段への培
地供給速度をより均等に制御するために第５図に
示すような方法に改善することができる。本装置
のデイスク上に細胞の接着しうる坦体、すなわち
ガラス、プラスチツクフイルム、特に三次元構造
をもつ多孔性セラミツクフラグメント、繊維状フ
イルムを装填することによりＳ／Ｖはマイクロキ
ヤリヤーには劣るものの、マルチトレー、プラス
チツクバツグ、スパイラルフイルム、ガラスビー
ズカラム等を大きく上回り、ホローフアイバーに
匹敵しうるものとなる。

また、蒸気滅菌の可能な坦体の利用により、一
連の生産プロセスをインラインで蒸気滅菌でき、
それにより汚染の危険性は極めて少ないものとな
る。

さらに、本装置デイスク内の液深は小さく、ま
たヘツドスペースも大きくとれることからガス移
動は行われ易くなり、充填カラム式にみられる培
地の酸素不足をふせぐことができる。

又、フイルターの再利用は難しいがセラミツク
は酸、アルカリによる再生処理や蒸気滅菌が可能
でありホローフアイバーやマイクロキヤリアと比
較して安価に入手することができる。ホローフア
イバー、マイクロキヤリアは酸、アルカリによる
再生処理や蒸気滅菌が不可能で高価なものであ
る。

第３，４図は変形実施例で培地は各培養皿３に
対応して配置された培地供給管１１から供給さ
れ、焼結金属フイルター４を介して各培養皿３に
供給される。

培養槽１の底部にはオーバーフロー培地出口８
があり、各培養皿３における培地量を検出するた
めのセンサー用として更に又、サンプリング用と
しての孔１２がある。

１３，１４は蓋体に取付けた安全弁と隔膜式圧
力計を示す。又、９は覗窓である。

第１図に示すものによれば培地が下方から供給
されるためヘツド圧によつて各培養皿３に供給さ
れる培地の量が均一でなく、したがつて各培養皿
３において調整する必要があるが、第３図のもの
によれば各培養皿３個々に供給管１１を介して供
給されるのでその必要はない。

第５図のものは前述した如く培養皿への培地供
給量を調節するもので、焼結金属フイルター４の
開口度をリング１５の遮蔽度によつて調節する。
リング１５の取付具１５ａにはてこ杆１６の一端
が取付けられ、他端は蓋体５の懸吊杆１８にピン
止め１８ａされている。そして、てこ杆１６の中
間は培養皿３の支持具１７に支点１７ａ止めされ
ている。

そこで懸吊杆１８のナツト１９の螺合度により
懸吊杆１８は昇降し、これによつて、てこ杆１６
の一端１８ａは昇降するのでてこ杆１６の他端は
逆の昇降を行い、リング１５を昇降させ焼結金属
フイルター４の開口度を調節する。

てこ杆１６と取付具１５ａとの連結は次のよう
になつている。すなわち、てこ杆１６の内孔２０
にスプリング２１が介装され、このスプリング２
１で押圧されるスライド自在なピン２２が取付具
１５ａにピン止めされている。したがつてリング
１５はスプリング２１によつて緩衝される。

図示のものは中央軸筒２に取付けられた培養皿
３のボス３ｃ上にリング１５が位置している。

中央軸筒２内の焼結金属フイルター４はリング
状をなし、中央軸筒２の拡大径部２ｃのスリツト
部２ｄに臨んでいる。

したがつてリング１５内部形状もこれに対応し
た形状となつている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明培養装置の切断面図、第２図は
特殊なフイルターをヒダ状にした使用する場合の
斜面図、第３，４図は他の実施例にかかる本発明
装置の切断面図と平面図、第５図は培地供給量調
節装置を示す切断面図、第６，７図は焼結金属フ
イルター部分の切断面図と正面図、第８，９図は
リングの切断面図と正面図、第１０，１１図は焼
結金属フイルター部にリングを取付けた状態の切
断面図と正面図である。 １……培養槽、２……中央軸筒、３……培養
皿、４……焼結金属フイルター、５……蓋体、
６，７……気相出入口、８……オーバーフロー培
地出口、９……覗窓。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 底面が外周に向かつて下向きに傾斜し、かつ
   外周に断面山形の立縁を形成した培養皿を一定の
   間隔を隔てて培養槽内に多段に設け、かつ各培養
   皿の中央部分には焼結金属フイルターを設けてこ
   こから培地が供給されるように構成し、更に培養
   槽底面にはオーバーフロー培地出口を設けたこと
   を特徴とする細胞培養装置。