JPH0585559B2 - - Google Patents

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JPH0585559B2
JPH0585559B2 JP13215784A JP13215784A JPH0585559B2 JP H0585559 B2 JPH0585559 B2 JP H0585559B2 JP 13215784 A JP13215784 A JP 13215784A JP 13215784 A JP13215784 A JP 13215784A JP H0585559 B2 JPH0585559 B2 JP H0585559B2
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Shell Internationale Research Maatschappij BV
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は非水性溶剤および非水性／水性混合溶
剤中にペプチド類を溶解する方法に関する。 ペプチド類は、カルボニル基とアミノ基との結
合体であるペプチド結合によつて互に連結した２
個または２個よりも多いアミノ酸からなる生物的
または人工的な化合物である。本特許出願におい
て、ペプチドという用語は４個またはそれよりも
多いアミノ酸を含むオリゴペプチド、高級なポリ
ペプチドおよび蛋白質を指し、一方ペプチド類と
いう用語は、さらに酵素およびそれに関連する物
質、すなわちオリゴペプチド鎖および／またはポ
リペプチド鎖を含む化合物、のようなペプチドの
誘導体も包含している。 出願人はメタノールおよびエタノールのような
非水性溶剤にペプチド類を溶解することを試みた
が、多くの場合有望な結果は得られなかつた。と
ころが、ある濃度のクラウンエーテル（crown−
ether）が存在する場合には、非水性溶剤および
非水性／水性溶剤中にそれらのペプチド類を首尾
よく溶解できることがここに発見された。 本出願において、クラウンエーテルという用語
は、静電的な相互作用を経てアルカリ陽イオンお
よびアルカリ土類陽イオンのような金属イオンと
錯体を形成することができる高度に選択的な錯化
剤を意味している。環状クラウンエーテル、ジア
ザ−クラウンエーテル、非環状クラウンエーテル
およびクリプタンド（cryptand）のような幾つ
かの型のクラウンエーテルはJ.Chem.Soc.Perkin
Trans.，1982年第2359−2363頁から公知であ
り、そしてそれらはすべてポリエーテルである
か、または酸素原子のうちの１個または２個以上
が窒素原子および／または別のヘテロ原子によつ
て置換されているポリエーテルである。 クラウンエーテルが非水性溶剤または非水性／
水性混合溶剤からなる溶剤系において大きな蛋白
質分子でさえ溶液にすることができると思われる
事実は、急速に膨脹しつつある生物工学の分野に
おいて広範囲に使用できる可能性を切り開いてい
る。 それゆえ、本発明は10−100000の範囲にあるク
ラウンエーテル／ペプチドのモル比のクラウンエ
ーテルの存在下において、非水性媒体また非水
性／水性混合媒体にペプチド類を溶解する方法を
提供する。好ましくはクラウンエーテル／ペプチ
ドのモル比が50−30000の範囲にある。クラウン
エーテルは、１種のクラウンエーテルでもまたは
数種のクラウンエーテルの混合物であってもよ
い。 好ましくは非水性媒体は水素結合性の溶剤であ
る。さらに非水性媒体は好ましくは25℃において
20−100の範囲にある誘電率を有する。適当な誘
電率を有する好ましい溶剤はメタノール、エタノ
ールおよびジメチルスルホキシドからなる群から
選ばれる。非水性媒体または非水性／水性混合媒
体は、好適には上記の水素結合性の溶剤に加え
て、例えば酢酸エチル、アセトンおよびクロロホ
ルムのような水素結合性でない溶剤を含むことが
できる。 好適なクラウンエーテルおよびすべて本発明の
範囲内にあると考えられるクラウン−関連性の大
環状化合物、クリプタンドおよび非環式マルチデ
ンテート（acyclic multidentate）のようなクラ
ウンエーテルに関連した化合物はChemical
Reviews1979年第79巻、第５号、第389−445頁
（1979年アメリカン ケミカル ソサイアテイ）
に記載された高分子配位子の群および米国特許第
4156683号に記載された大環状化合物から選ぶこ
とができる。本方法において好ましく使用される
クラウンエーテルは12−クラウン−４，15−クラ
ウン−５，18−クラウン−６，21−クラウン−
７、ジベンゾ−18−クラウン−６およびクリプタ
ンド〔2.2.2〕からなる群から選ばれる。クラウ
ンエーテルの存在下において非水性の有機溶剤に
容易に溶解するゆえに好ましいペプチド類は、ミ
オグロビン（くじらの筋肉）、うし血清アルブミ
ン、うしインシユリン、チトクロームＣ（うまの
心臓）、コレステロールエステラーゼ（微生物）、
パパイン、リパーゼ（リゾプス アルヒズス）、
アセチルエステラーゼおよびヒストン類からなる
群から選ばれる。 ペプチド類が実質的に金属塩を含まないときに
最良の結果が得られるようである。しがたつてペ
プチド類が金属塩を実質的に含まないのが好まし
い。 非水性媒体および非水性／水性媒体中へのペプ
チド類の溶解は、好ましくはペプチド類にクラウ
ン−エーテルを化学的に結合させることによつて
遂行することができ、この方法もまた当然本発明
の範囲内にあると考えられる。本発明が、特に非
水性溶液および非水性／水性溶液中にペプチド
類、殊に蛋白質が溶解できることが必須の利用の
ための生物工学の分野において可能な利用の全範
囲を提供することが理解されるであろう。例えば
分別沈澱および／または分別結晶、クロマトグラ
フイー法および電気泳動法を使用することができ
る有機溶剤または水と有機溶剤との混合物中に蛋
白質または酵素を溶解することができるならば、
蛋白質と酵素の精製および分離は一層首尾よく遂
行することができる。 その他の潜在的な利用は、例えば重合体のクラ
ウンエーテルおよび重合体と結合したクラウンエ
ーテルの使用を含む蛋白質および酵素の固定方
法、有機溶剤および水を有機溶剤との混合物中の
酵素の活性の変性および最適化、および酵素を含
む溶剤混合物から酵素活性の回復において見出さ
れる。さらに、酵素−クラウンエーテル錯体は好
ましくは洗浄剤として使用できる一方、ペプチド
−クラウンエーテル錯体は好ましくは薄膜材料と
して使用することができる。 本発明はここに以下の実施例を参照してさらに
詳細に説明される。 実施例 ペプチド類の溶解 次の表には或種のクラウンエーテルの存在下に
おいてメタノール、エタノールまたはジメチルス
ルホキシドに溶解するペプチド類が示されてい
る。
【表】 実施例 蛋白質の分離、精製におけるクラウンエーテ
ル／クリプタンドの使用 ａ α−キモトリプシンからチトクロームの分離 α−キモトリプシンはメタノールに全く溶けな
いが、チトクロームＣは比較的低濃度のクラウン
エーテルとともにメタノールに容易に溶解する。
したがつて、メタノール（２ml）中でチトクロー
ムＣとα−キモトリプシン（各々10mg、それぞれ
8.1×10-4および４×10-4ミリモル）との混合物
を18−クラウン−６（28mg，0.11ミリモル）で処
理した。溶解しなかつた蛋白質（α−キモトリプ
シン）から赤色溶液を別し、そして水、ついで
緩衝液（トリス、PH7.5，0.10M）で透析した。
分離したものの純度を確かめるために導電集中法
（isoelectric focusing）を使用して液と過さ
れた蛋白質部分の両方を試験した（結果は第２表
に示される）。 ｂ チトクロームＣ，BSAおよびα−キモトリ
プシンの混合物からチトクロームＣの分離 α−キモトリプシンはメタノールに不溶性であ
る一方、チトクロームＣはBSAよりも低濃度の
クラウンエーテルによつてメタノール中に溶解す
る。メタノール（２ml）中でチトクロームＣ、
BSAおよびα−キモトリプシン（各々10mg、そ
れぞれ8.1×10-4，1.4×10-4および４×10-4ミリ
モル）の混合物を18−クラウン−６（50mg，0.19
ミリモル）で処理し、生成した赤色溶液を過し
てから水、ついで緩衝液（トリス、PH7.5，
0.01M）で透析してクラウンエーテルと水を除去
した。導電集中法を使用して可溶性部分と不溶性
部分の両方を試験した（結果を第２表に示す）。
【表】 失は、変性、および吸光度の測定を邪魔する微量の
クラウンエーテルによつて蛋白質の測定が不正
確になるという事実に起因するものと考えられる(
ラウリー法)。
いずれの場合も液は一成分のチトクロームＣ
しか含んでいなかつた。不溶性の部分は一層少な
い可溶性蛋白質を含み、０−４℃において添加剤
として硫酸アンモニウムを使用するとさらに高い
収率が得られる。 実施例 ２ 蛋白質の結晶化におけるクラウンエーテルの
使用 クラウンエーテルと安定剤としての硫酸アンモ
ニウムを含むチトクロームＣおよびうしのインシ
ユリンのような蛋白質をメタノール溶液から結晶
質複合物として各々得ることができた。例えば、
18−クラウン−６（55mg，0.21ミリモル）と硫酸
アンモニウム（50mg，0.38ミリモル）を含むメタ
ノール（10ml）溶液でチトクロームＣ（20mg，1.6
×10-3ミリモル）を処理した。沈澱用の共溶剤と
して酢酸エチルを含む外側の管内に、可溶化した
蛋白質溶液を４℃において貯蔵した。１週間後に
過できる結晶質物質が生成し、これは水溶性で
あることがわかつた。蛋白質の分析はその固体物
質が20重量％の蛋白質を含むことを示していた。
円偏光二色性（CD）および紫外線／可視光線の
分光学はもとのままの蛋白質の存在を示した。う
しのインシユリンを含む結晶質物質はメタノール
（５ml）中にうしのインシユリン（５mg，8.6×
10-4ミリモル）、18−クラウン−６（300mg，1.4ミ
リモル）および硫酸アンモニウム（300mg，2.3ミ
リモル）および沈澱用溶剤として酢酸エチルを含
む溶液から得ることができた。DCスペクトルは
予め処理した蛋白質（225−200nmにおいて負の
縞）のそれと同様であつた。 実施例 蛋白質と酵素の固定のために重合体と結合した
クラウンエーテルを使用すること 蛋白質（例えばチトクロームＣ）と酵素（例え
ばα−キモトリプシン）のための固定化支持材料
として、Merck−Schuchardtから得られ、かつ
メリフイールド（MERRIFIELD）重合体と結合
したアリール−クリプタンド〔2.2.1〕を含む、
重合体と結合したクリプタンド
KRYPTOFIX221B重合体）を使用することがで
きる。４℃において緩衝液の中に約0.4−４×
10-3ミリモルの蛋白質（酵素）を重合体物質と共
に16−200時間単に懸濁させることによつて、蛋
白質（酵素）を温和な条件下（さらに別の化学的
な変性を必要としない）で固定することができ
た。固定化した酵素物質を別し、そして評価に
先立つて徹底的に（約30mlの緩衝液）洗浄した。
α−キモトリプシンの場合、４℃において
0.001N塩酸（ml）の中に40mgの蛋白質と500mgの
重合体を16時間懸濁させた。チトクロームの場
合、４℃において１mlのトリス緩衝液（0.01M，
PH7.5）の中に５mg（0.4×10-3ミリモル）の蛋白
質と15mgの支持体を200時間懸濁させた。クリプ
タンドを含まないMERRIFIELD重合体について
得られた結果とともに、酵素活性および蛋白質の
負荷量を第３表に一覧で示す。
【表】 実施例 クラウンエーテルを使用する非水性媒体および
非水性／水性混合媒体から酵素活性を回復する
こと 酵素の活性を有機媒体から水溶液に戻すことに
よつてクラウンエーテル／蛋白質の錯体化現象の
可逆性を示すことができる。錯化剤と溶剤から酵
素を分離するために使用される透析およびゲル
過のような簡単でしかも穏かに操作できる方法を
使用することによつて酵素の活性を回復すること
ができる。必要ならば、クラウンエーテルの錯化
能力を邪魔しないで蛋白質を不可逆的な変性から
守る安定剤（例えば硫酸アンモニウム）を使用す
ることもできる。温度が重要であつて、操作中に
４℃よりも低く保つべきものと考えられる。 下記の２種の酵素を試験した。 コレステロールエステラーゼ−これは有機溶
剤／クラウンエーテル混合物中に溶解する。 α−キモトリプシン−これはメタノールとクラ
ウンエーテルとの混合物に溶けないが、最初に酵
素の濃厚水溶液を調製すれば、その後蛋白質の沈
澱を起こさずにクラウンエーテルを含むメタノー
ルを添加することができる（メタノール：水の
比、約85：15）。 ａ クラウンエーテルを使用して有機溶剤／メタ
ノール混合物からコレステロールエステラーゼ
の活性を回復する方法 典型的な実験において、硫酸アンモニウム溶液
中の懸濁物の形にある微生物のステロール−エス
テルアシルヒドロラーゼから得られた約0.4−0.6
mg，10−15U（Ｕ＝1984年のベーリンガー・マン
ハイムのカタログで定義されたのと同じ基質であ
るオレイン酸コレステロールに対する酵素の比活
性度の単位）のコレステロールエステラーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム製）を、０−４℃におい
て18−クラウン−６（0.1−0.3ｇ，0.4−1.1ミリモ
ル）を含むメタノール溶液（２−６ml）中に溶か
した。その混合物を水に対して透析してから（16
時間）、短いセフアデツクス（Sephadex）G25カ
ラム（空隙容積８ml）を通し、燐酸ナトリウム緩
衝液（PH6.2，0.1M）で溶離させた。ラウリー法
（H.O.Lowry，N.H.Rosenbrough，A.L.Farrお
よびR.J.Randell著、J.Biol.Chem.、第193号、
1951年、第265頁）によつて蛋白質の評価を測定
した。タウロコール酸ナトリウムと3.3％のイソ
プロパノールを含む燐酸塩緩衝液（37℃において
PH6.5，0.05M）中の基質としてセチルアルコー
ル（1.72mM）とオレイン酸（2.37mM）を使用
して、溶離された試料を酵素活性について評価し
た。クロロホルム（２ml）への抽出（酵素混合物
９mlから分割した0.5ml）および気液クロマトグ
ラフイーによる検出（長さ２フイート、内径２mm
の３％SE充填カラム、100−260℃の間で10°／分
の速さで計画された、30ml／分で導入される担体
ガスの窒素を使用して、水素炎イオン化検出器を
有するVarian3700型ガスクロマトグラフにおい
て実施）によつて、エステラーゼ活性の生成物で
あるオレイン酸セチルを監視した。 コレステロールエステラーゼ活性の１オレイン
酸セチル単位は、評価の条件下において毎分1μ
モルのオレイン酸セチルを合成するのに必要な酵
素の量（mg）として定義される。酵素活性の結果
を第４表に要約する。
【表】
【表】 ｂ クラウンエーテルを使用して非水性／水性混
合溶剤系からα−キモトリプシン活性を回復す
る方法 18−クラウン−６（0.9M）を含み、そして場合
により活性点を保護するために酵素抑制剤である
インドール（0.034M）を含むメタノール５mlの
溶液でα−キモトリプシンの濃厚液（うしのパン
クレアーゼ、Sigma Chemical社製、0.001M塩
酸中〜1.2mM，0.75ml）を40℃において注意深く
（ゆつくりと添加）処理することによつて手順を
遂行する。ついで繰返し透析し（0.001N塩酸で
約５回）てから溶離剤0.001N塩酸および３×40
cmの寸法のSephadexG25カラムを使用するゲル
過によつて酵素混合物を精製した。 0.1Mのトリス−HC1緩衝液（PH7.8、塩化カル
シウム0.1Mを含む）中で調製したＮ−ベンゾイ
ル−Ｌ−チロシンエチルエステル（BTEE）を使
用する分光光度法（1970年Academic Press 発
行、G.E.PearlmannおよびL.Lornad編、
Enzymology、第巻に記載された方法）を用
いて、酵素試料および対応する対照物を活性につ
いて評価した。活性点の滴定剤として２−ヒドロ
キシ−α−トルエンスルホン酸スルトンを使用し
て活性点のモル濃度を測定した。α−キモトリプ
シン活性の1BTEE単位は評価の条件下において
毎分BTEE1μモルを加水分解するのに必要な量に
基いて定義した。 メタノール水溶液中における溶解後のα−キモ
トリプシン活性の結果を第５表に要約する。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 10−100000の範囲にあるクラウンエーテル／
    ペプチドのモル比のクラウンエーテルの存在下に
    おいて、非水性媒体または非水性／水性混合媒体
    にペプチド類を溶解する方法。 ２ クラウンエーテル／ペプチドのモル比が50−
    30000の範囲にある、特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ３ 非水性媒体が水素結合性の溶剤である、特許
    請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４ 非水性媒体が25℃において20−100の範囲に
    ある誘電率を有する、特許請求の範囲第１項ない
    し第３項のいずれか１つに記載の方法。 ５ 溶剤がメタノール、エタノールおよびジメチ
    ルスルホキシドからなる群から選ばれる、特許請
    求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１つに記
    載の方法。 ６ クラウンエーテルが12−クラウン−４，15−
    クラウン−５，18−クラウン−６，21−クラウン
    −７、ジベンゾ−18−クラウン−６およびクリプ
    タンド〔2.2，２〕からなる群から選ばれる、特
    許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１つ
    に記載の方法。 ７ ペプチドがミオグロビン、うし血清アルブミ
    ン、うしインシユリン、チトクロームＣ、コレス
    テロールエステラーゼ、パパイン、リパーゼ、ア
    セチルエステラーゼおよびヒストン類からなる群
    から選ばれる、特許請求の範囲第１項ないし第６
    項のいずれか１つに記載の方法。 ８ ペプチド（類）が金属塩を実質的に含まな
    い、特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれ
    か１つに記載の方法。
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