【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔産業上の利用分野〕
本発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方
法に関し、更に詳しく言えば、キチンの酸による
部分加水分解工程、アルカリによる中和工程及び
中和溶液からの特定の脱塩工程からなるＮ−アセ
チルキトオリゴ糖の新規な製造方法に関する。
〔従来の技術及び問題点〕
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグ
ルサミンがβ−１，４結合で２〜７個結合した少
糖類（オリゴ糖）であり、カニ、エビ、オキアミ
等の甲皮に含まれる多糖類キチンを部分加水分解
することによつて得られるものである。また、オ
リゴ糖は、グルコース、フラクトース等の単糖が
数個結合した糖類であり、最近新しい物質として
注目を集めてきている。例えば、シユクロースの
グルコース分子にグルコースが１〜８個結合した
カツプリングシユガー、シユクロースにフラクト
ースが１〜４個結合したフラクトオリゴ糖、グル
コースがα−１，４結合で３〜10個結合したマル
トオリゴ糖等が挙げられる。これらは、低う蝕性
（虫歯になりにくい性質）あるいは非消化性等の
特性を生かした甘味剤としての利用、乳製品中へ
のビフイズス因子としての利用、試薬や医薬への
利用等、その将来性は大きいものである。Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖も同様の物質であり、次に示
す構造からも非常に興味深い物質である。
[Industrial Application Field] The present invention relates to a method for producing N-acetylchitooligosaccharides, and more specifically, the present invention relates to a method for producing N-acetylchitooligosaccharides, and more specifically, a process of partial hydrolysis of chitin with an acid, a neutralization process with an alkali, and a specific decomposition process from a neutralized solution. The present invention relates to a novel method for producing N-acetyl chito-oligosaccharides that includes a salt step. [Prior art and problems] N-acetylchito-oligosaccharide is a oligosaccharide in which 2 to 7 N-acetylglucamines are bonded through β-1,4 bonds, and it is used in crabs, shrimps, krill, etc. It is obtained by partially hydrolyzing the polysaccharide chitin contained in the carapace of the carapace. Furthermore, oligosaccharides are saccharides in which several monosaccharides such as glucose and fructose are linked together, and have recently been attracting attention as new substances. For example, coupling sugars in which 1 to 8 glucose molecules are linked to sucrose molecules, fructooligosaccharides in which 1 to 4 fructose molecules are linked to sucrose molecules, and maltooligosaccharides in which 3 to 10 glucose molecules are linked to sucrose molecules through α-1,4 bonds. etc. These are used as sweeteners that take advantage of their low cariogenicity (property that prevents tooth decay) and indigestibility, their use as bifidus factors in dairy products, their use in reagents and medicines, etc. The future potential is great. N-acetylchito-oligosaccharide is a similar substance, and is also a very interesting substance from the structure shown below.
〔発明の構成〕[Structure of the invention]
本発明は、キチンを酸により部分加水分解し、
アルカリにより中和してＮ−アセチルキトオリゴ
糖を生成せしめ、該中和溶液から副生塩を分離除
去することからなるＮ−アセチルキトオリゴ糖の
製造方法において、上記中和溶液からの脱塩をイ
オン交換膜電気透析法で行うことを特徴とするＮ
−アセチルキトオリゴ糖の製造法を新規に提供す
るものである。
本発明においては、中和溶液からの脱塩をイオ
ン交換膜電気透析法で行うことが重要である。す
なわち、中和溶液をイオン交換膜電気透析にかけ
ると、副生塩が効率良く分離除去され、有用なＮ
−アセチルグルコサミンをも含めて生成したＮ−
アセチルキトオリゴ糖を全部回収することができ
る。従来の吸着分離方法では回収できなつかつた
Ｎ−アセチルグルコサミンが円滑有利に回収可能
となるだけでなく、活性炭による吸着及びアルコ
ール等による溶出という方法に見られる損失等の
難点もなく、生成したＮ−アセチルキトオリゴ糖
のほぼ全部を取得できるものである。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明において用いられるキチンは、エビ、カ
ニ、オキアミ等、甲殻類の甲皮を塩酸処理でカル
シウム分を除去し、さらに水酸解化ナトリウム処
理により蛋白質を除去するなどにより調製され
る。勿論、その他の入手経路、調製手段などによ
り得られるチキンであつても良い。而して、キチ
ンの酸による部分加水分解は、塩酸、蟻酸、酢
酸、硫酸等を用いて行なわれるが、好ましくは濃
塩酸を用い、30〜50℃で２〜３時間攪拌しながら
行なわれる。次に、加水分解反応を終了させるた
めに、部分加水分解液と同容量程度の水で希釈
し、さらに温度が上昇しないように例えば25〜50
％水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、アルカ
リによる中和を行う。得られる中和水溶液は、糖
の分解により多少褐色味を呈し、また未分解の不
溶性キチンも残存しているが、これらは少量の活
性炭及び濾紙を用いた吸引濾過により除去するこ
とができ、無色透明な中和溶液として得ることが
できる。本発明においては、以上の酸による部分
加水分解及びアルカリによる中和は、特に限定さ
れることなく、従来より公知及至周知の各種手
段、条件などを適宜採用して実施することができ
る。
かくして得られる中和溶液は、キチンの部分加
水分解に使用する酸の種類や使用量あるいは希釈
水量、中和に使用するアルカリの種類や使用量、
各工程における採用条件などにより多少異なる
が、好適な実施態様においては、固型分15〜20
％、塩分10〜15％のものが例示され得る。
この中和溶液は、本発明に従つてイオン交換膜
電気透析法により脱塩処理にかけられる。イオン
交換膜電気透析装置は、一般的に、陰イオン交換
膜と陽イオン交換膜が交互に多数配列され、両端
に一対の電極が配置されたものである。そして、
電極間に直流電流を通じると、中和溶液中の陽イ
オンは陰極の方へ移動し、陰イオンは陽極へ向か
つて移動する。ところが、陽イオンは陽イオン交
換膜を透過するが陰イオン交換膜を透過せず、ま
た一方、陰イオンは陰イオン交換膜を透過するが
陽イオン交換幕を透過しない。その結果、イオン
の濃縮される室（濃縮室）と、イオンが除去され
る室（脱塩室）ができる。中和溶液中の塩類、例
えば食塩やＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチ
ル化物であるＤ−グルコサミン塩酸塩、脱アセチ
ル化反応により生成する酢酸ナトリウムなどはイ
オンの濃縮される室に移動し、電荷をもたないＮ
−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖は脱塩室に残り、中和溶液の脱塩が行なわれ
る。
本発明において使用することのできるイオン交
換膜は、特に限定されずに、従来より公知乃至周
知のものが種々例示され得る。例えば、ネオセプ
タCL−25T，CM−１〜２，AM−１〜３（徳山
曹達株式会社製）セレミオンCMV AMV（旭硝
子株式会社製）などがあげられる。また各メーカ
ーでは、これらをシステム化したイオン交換膜電
気透析装置も販売しているので容易に扱うことが
できる。本発明によれば、キチンを酸で加水分解
し、中和した溶液中の食塩をほぼ100％除去する
ことができる。かくして得られた脱塩溶液は、そ
のまま凍結乾燥機あるいはスプレードライヤーを
用い粉末化しても良いが、好ましくは、完全な脱
色や高純度精製のため、イオン交換樹脂による前
処理をするのが好ましい。
本発明により得られるＮ−アセチルキトオリゴ
糖は、単糖であるＮ−アセチルグルコサミンを含
有し、Ｎ−アセチルキトビオースからＮ−アセチ
ルキトヘプタオースまで含む特徴的なもので、し
かも大量かつ容易に製造できるものである。
〔実施例〕
次に、本発明の実施例について更に具体的に説
明するが、かかる説明によつて本発明が何ら限定
されるものでないことは勿論である。なお、以下
の実施例において、割合は特に明示しない限り重
量基準である。
［実施例 １］
キチン400ｇ（20メツシユ粉砕品）を濃塩酸1.2
に加え、40℃で３時間攪拌しながら加水分解を
おこなつた。加水分解終了後、同容量の水で希釈
し、25％水酸化ナトリウム水溶液でPH7.0まで中
和した。この中和溶液に100ｇの活性炭を加え、
東洋濾紙No.２で吸引濾過後、さらに少量の水で残
渣を洗浄し、この洗液も合わせて無色透明の濾液
４を得た。
この濾液（固型分19.6％、塩分13.4％）を、陽
イオン交換膜“ネオセプタCM−１”、陰イオン
交換膜“ネオセプタAM−１”の10対で構成され
る脱塩室10室、有効膜面積2dm2／枚のTS−２−
10型電気透析装置（徳山曹達株式会社製）を使用
して、脱塩室に前記濾液４を、濃縮室に13％食
塩水４を、電極室に２％食塩水４をそれぞれ
使用し、液温14〜35℃、電流８〜1.5A、電圧10
〜24Vの条件で、210分間電気透析を行つた。電
気透析の終了した脱塩液量は1.7固型分5.6％、
食塩濃度0.002％であり、脱塩率は99.98％とな
る。
次に、上記脱塩液を、陽イオン交換樹脂“アン
バーライト1R120B”（オルガノ会社製）を充填
したカラム（φ4.5×30cm）と陰イオン交換樹脂
“アンバーライト1RA400”（オルガノ会社製）を
充填したカラム（φ4.5×30cm）に通すことによ
り、完全な脱色と精製を行つた。さらに、この液
を減圧濃縮して300mlとし、凍結乾燥機を用いて
乾燥させ、白色の粉末176ｇを得た。原料キチン
400ｇ基準の収率は44.0％であつた。また、上記
白色粉末の組成は、Ｎ−アセチルグルコサミン31
％、Ｎ−アセチルキトビオース19％、Ｎ−アセチ
ルキトトリオース19％、Ｎ−アセチルキトテトラ
オース15％、Ｎ−アセチルキトペンタオース10
％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース５％、Ｎ−ア
セチルキトヘプタオース１％であつた。
［実施例 ２］
キチン１Kg（20メツシユ粉砕品）を濃塩酸３
に加え、40℃で３時間攪拌しながら加水分解を行
つた。分解終了後、同容量の水で希釈し25％水酸
化ナトリウム溶液でPH7.0まで中和した。この中
和溶液に、250ｇの活性炭を加え東洋濾紙No.２で
吸引濾過後、さらに少量の水で残渣を洗浄しこの
洗液も合わせて無色透明の濾液12を得た。
この濾液（固形分15.4％、塩分11.0％）を実施
例１と同じ“TS−２−10型”電気透析装置（徳
山曹達株式会社製）を使用して、脱塩室に前記濾
液４を、濃縮室に10％食塩水４を、電極液に
２％食塩水４を使用し、液温19〜28℃、電流８
〜0.5A、電圧９〜23Vの条件下で180分間電気透
析を行つた。電気透析の終了した脱塩液量は2.1
、固形分8.4％、食塩濃度0.001％で、脱塩率
99.99％となる。以上の脱塩操作を３回分行い、
脱塩室の洗液と合わせて合計8.5の脱塩液を得
た。
この脱塩液を実施例１と同様にイオン交換樹脂
を通して完全な脱色と精製を行つた。この液をス
プレードライヤーを用いて乾燥させ、白色の粉末
448ｇを得た。キチン１Kgからの収率は、44.8％
であつた。またその組成は、Ｎ−アセチルグルコ
サミン26％、Ｎ−アセチルキトビオース16％、Ｎ
−アセチルキトトリオース17％、Ｎ−アセチルキ
トテトラオース15％、Ｎ−アセチルキトペンタオ
ース13％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース９％、
Ｎ−アセチルキトヘプタオース４％であつた。
〔発明の効果〕
本発明によれば、キチンの部分加水分解及び中
和により生成するＮ−アセチルキトオリゴ糖を円
滑有利に回収する事ができ、効率良く脱塩が行な
われるという優れた効果を達成可能である。ま
た、従来の吸着分離方法では回収出来なかつた有
用なＮ−アセチルグルコサミンをも一緒に回収で
きるという効果も達成される。本発明によれば、
従来の吸着分離方法における吸着剤の大量使用、
溶出溶剤の大量使用などの難点が解消され、キチ
ンを原料としてＮ−アセチルグルコサミンをも含
めて多量のＮ−アセチルキトオリゴ糖を効率良く
製造可能である。
The present invention partially hydrolyzes chitin with acid,
A method for producing N-acetylchitooligosaccharides, which comprises neutralizing with an alkali to produce N-acetylchitooligosaccharides, and separating and removing by-product salts from the neutralized solution, which includes desalting from the neutralized solution. N characterized in that it is carried out by ion exchange membrane electrodialysis method.
- A novel method for producing acetylchitooligosaccharides is provided. In the present invention, it is important to desalinate the neutralized solution by ion exchange membrane electrodialysis. In other words, when a neutralized solution is subjected to ion exchange membrane electrodialysis, by-product salts are efficiently separated and removed, and useful N is released.
-N produced including acetylglucosamine-
All acetylchitooligosaccharide can be recovered. Not only can N-acetylglucosamine, which could not be recovered by conventional adsorption separation methods, be recovered smoothly and advantageously, but also the generated N can be recovered smoothly and advantageously, without the drawbacks such as losses that are seen in methods of adsorption with activated carbon and elution with alcohol, etc. -Almost all of the acetyl chito-oligosaccharide can be obtained. The present invention will be explained in more detail below. The chitin used in the present invention is prepared by treating the carapace of crustaceans such as shrimp, crabs, and krill with hydrochloric acid to remove calcium, and then treating the carapace with sodium hydroxide to remove protein. Of course, chicken obtained by other acquisition routes, preparation methods, etc. may also be used. Partial hydrolysis of chitin with an acid is carried out using hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, sulfuric acid, etc., but it is preferably carried out using concentrated hydrochloric acid and stirring at 30 to 50°C for 2 to 3 hours. Next, in order to complete the hydrolysis reaction, dilute the partial hydrolysis solution with about the same volume of water, and add 25 to 50 ml of water to prevent further temperature rise.
Neutralize with alkali using % sodium hydroxide aqueous solution. The resulting neutralized aqueous solution has a slightly brownish color due to the decomposition of sugar, and undecomposed insoluble chitin remains, but these can be removed by suction filtration using a small amount of activated carbon and filter paper, leaving it colorless. It can be obtained as a clear neutralized solution. In the present invention, the above-described partial hydrolysis with an acid and neutralization with an alkali are not particularly limited, and can be carried out by appropriately employing various conventionally known means and conditions. The neutralization solution obtained in this way is determined by the type and amount of acid used for partial hydrolysis of chitin or the amount of dilution water, the type and amount of alkali used for neutralization,
Although it varies somewhat depending on the conditions employed in each process, in a preferred embodiment, the solid content is 15 to 20
%, with a salt content of 10 to 15%. This neutralized solution is subjected to a desalination treatment according to the invention by ion exchange membrane electrodialysis. An ion exchange membrane electrodialysis device generally has a large number of anion exchange membranes and cation exchange membranes arranged alternately, and a pair of electrodes arranged at both ends. and,
When a direct current is passed between the electrodes, the cations in the neutralizing solution move toward the cathode, and the anions move toward the anode. However, cations pass through the cation exchange membrane but not the anion exchange membrane, and on the other hand, anions pass through the anion exchange membrane but not the cation exchange membrane. As a result, a chamber where ions are concentrated (concentration chamber) and a chamber where ions are removed (desalination chamber) are created. Salts in the neutralization solution, such as table salt, D-glucosamine hydrochloride, which is a deacetylated product of N-acetylglucosamine, and sodium acetate produced by the deacetylation reaction, move to the chamber where ions are concentrated and lose their charge. Tanai N
-Acetylglucosamine and N-acetylchitooligosaccharide remain in the desalting chamber, and the neutralized solution is desalted. The ion exchange membrane that can be used in the present invention is not particularly limited, and various conventionally known or well-known ones can be exemplified. Examples include Neocepta CL-25T, CM-1 to 2, AM-1 to 3 (manufactured by Tokuyama Soda Co., Ltd.), Selemion CMV AMV (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), and the like. Each manufacturer also sells ion-exchange membrane electrodialysis devices that are systematized, so they can be easily handled. According to the present invention, it is possible to hydrolyze chitin with an acid and remove almost 100% of the salt in the neutralized solution. The desalted solution thus obtained may be pulverized as it is using a freeze dryer or a spray dryer, but it is preferably pretreated with an ion exchange resin for complete decolorization and high purity purification. The N-acetylchito-oligosaccharide obtained by the present invention is characteristic in that it contains the monosaccharide N-acetylglucosamine and contains N-acetylchitobiose to N-acetylchitoheptaose, and is easily produced in large quantities. It can be manufactured in [Examples] Next, Examples of the present invention will be described in more detail, but it goes without saying that the present invention is not limited by such explanations. In addition, in the following examples, the proportions are based on weight unless otherwise specified. [Example 1] 400g of chitin (pulverized 20 mesh) was mixed with concentrated hydrochloric acid 1.2
In addition, hydrolysis was carried out with stirring at 40°C for 3 hours. After the hydrolysis was completed, it was diluted with the same volume of water and neutralized to pH 7.0 with a 25% aqueous sodium hydroxide solution. Add 100g of activated carbon to this neutralized solution,
After suction filtration with Toyo Roshi No. 2, the residue was further washed with a small amount of water, and this washing liquid was combined to obtain a colorless and transparent filtrate 4. This filtrate (solid content: 19.6%, salt content: 13.4%) is transferred to 10 demineralization chambers, each consisting of 10 pairs of cation exchange membrane “Neosecepta CM-1” and anion exchange membrane “Neosecepta AM-1”. Membrane area 2dm 2 /sheet TS-2-
Using a 10-type electrodialysis machine (manufactured by Tokuyama Soda Co., Ltd.), use the filtrate 4 in the desalting chamber, 13% saline 4 in the concentration chamber, and 2% saline 4 in the electrode chamber. Temperature 14~35℃, current 8~1.5A, voltage 10
Electrodialysis was performed for 210 minutes at ~24V. The volume of desalted solution after electrodialysis is 1.7%, solid content 5.6%,
The salt concentration is 0.002%, and the desalination rate is 99.98%. Next, the desalination solution was transferred to a column (φ4.5 x 30 cm) filled with a cation exchange resin “Amberlite 1R120B” (manufactured by Organo Company) and an anion exchange resin “Amberlite 1RA400” (manufactured by Organo Company). Complete decolorization and purification were performed by passing through a packed column (φ4.5×30 cm). Further, this liquid was concentrated under reduced pressure to 300 ml and dried using a freeze dryer to obtain 176 g of white powder. raw material chitin
The yield based on 400g was 44.0%. In addition, the composition of the above white powder is N-acetylglucosamine 31
%, N-acetylchitobiose 19%, N-acetylchitotriose 19%, N-acetylchitotetraose 15%, N-acetylchitopentaose 10%
%, N-acetylchitohexaose 5%, and N-acetylchitoheptaose 1%. [Example 2] 1 kg of chitin (20 mesh pulverized product) was mixed with 3 ml of concentrated hydrochloric acid.
In addition, hydrolysis was carried out with stirring at 40°C for 3 hours. After the decomposition was completed, it was diluted with the same volume of water and neutralized to pH 7.0 with 25% sodium hydroxide solution. To this neutralized solution, 250 g of activated carbon was added, and after suction filtration with Toyo Roshi No. 2, the residue was further washed with a small amount of water, and this washing liquid was combined to obtain a colorless and transparent filtrate 12. This filtrate (solid content 15.4%, salt content 11.0%) was transferred to the desalination chamber using the same "TS-2-10" electrodialysis apparatus (manufactured by Tokuyama Soda Co., Ltd.) as in Example 1. 10% saline solution 4 was used in the concentration chamber, 2% saline solution 4 was used as the electrode solution, the liquid temperature was 19 to 28℃, and the current was 8.
Electrodialysis was performed for 180 minutes under the conditions of ~0.5A and a voltage of 9 to 23V. The amount of desalinated liquid after electrodialysis is 2.1
, solid content 8.4%, salt concentration 0.001%, desalination rate
It will be 99.99%. Perform the above desalting operation three times,
A total of 8.5 desalting solutions were obtained including the washing solution in the desalting chamber. This desalted solution was completely decolorized and purified by passing it through an ion exchange resin in the same manner as in Example 1. Dry this liquid using a spray dryer to form a white powder.
Obtained 448g. Yield from 1Kg of chitin is 44.8%
It was hot. Its composition is 26% N-acetylglucosamine, 16% N-acetylchitobiose,
- Acetylchitotriose 17%, N-acetylchitotetraose 15%, N-acetylchitopentaose 13%, N-acetylchitohexaose 9%,
The content was 4% N-acetylchitoheptaose. [Effects of the Invention] According to the present invention, N-acetylchitooligosaccharide produced by partial hydrolysis and neutralization of chitin can be smoothly and advantageously recovered, and desalination can be carried out efficiently. It is achievable. Furthermore, the effect that useful N-acetylglucosamine, which could not be recovered by conventional adsorption separation methods, can also be recovered is also achieved. According to the invention,
The large amount of adsorbent used in traditional adsorption separation methods,
Difficulties such as the use of a large amount of elution solvent are solved, and a large amount of N-acetylchito-oligosaccharides including N-acetylglucosamine can be efficiently produced using chitin as a raw material.