JPH0587235B2 - - Google Patents
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- JPH0587235B2 JPH0587235B2 JP2307355A JP30735590A JPH0587235B2 JP H0587235 B2 JPH0587235 B2 JP H0587235B2 JP 2307355 A JP2307355 A JP 2307355A JP 30735590 A JP30735590 A JP 30735590A JP H0587235 B2 JPH0587235 B2 JP H0587235B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
- Y10S435/897—Streptomyces griseus
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
Description
２
【式】
の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置を
有する型−制限エンドヌクレアーゼを使用する
ことを特徴とする、補足性二本鎖DNA−配列： 5′−CA GCCGGC TＧ−3′ を認識し、かつ切断する方法。
有する型−制限エンドヌクレアーゼを使用する
ことを特徴とする、補足性二本鎖DNA−配列： 5′−CA GCCGGC TＧ−3′ を認識し、かつ切断する方法。
［産業上の利用分野］
本発明は新規の型制限エンドヌクレアーゼ
SgrAI、これを得る方法及びその使用に関する。 ［従来の技術］ 型制限エンドヌクレアーゼは、特定のDNA
−配列を認識し、切断することのできるエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。この際、目的配
列中のホスホジエステル橋が、しかも各ポリヌク
レオチド鎖中の１個が加水分解される。従つて、
型制限エンドヌクレアーゼは、DNA−分子の
分析にとつて重要である。多くのDNA−配列に
対して特異的な型制限エンドヌクレアーゼは既
に公知であるが、なお、DNA−配列に対して特
異的であり、従来、公知の制限エンドヌクレアー
ゼのいずれによつても認識されない、他の型制
限エンドヌクレアーゼを提供することが必要にな
つている。 ［発明が解決しようとする課題］ 従つて、本発明は、従来は、この種のいずれの
酵素によつても認識されなかつた配列を特異的に
認識しかつ切断することのできる新規の制限エン
ドヌクレアーゼを提供することを課題としてい
る。 ［課題を解決するための手段］ この課題は、本発明により、次の認識配列及び
標識により定義された切断位置：
SgrAI、これを得る方法及びその使用に関する。 ［従来の技術］ 型制限エンドヌクレアーゼは、特定のDNA
−配列を認識し、切断することのできるエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。この際、目的配
列中のホスホジエステル橋が、しかも各ポリヌク
レオチド鎖中の１個が加水分解される。従つて、
型制限エンドヌクレアーゼは、DNA−分子の
分析にとつて重要である。多くのDNA−配列に
対して特異的な型制限エンドヌクレアーゼは既
に公知であるが、なお、DNA−配列に対して特
異的であり、従来、公知の制限エンドヌクレアー
ゼのいずれによつても認識されない、他の型制
限エンドヌクレアーゼを提供することが必要にな
つている。 ［発明が解決しようとする課題］ 従つて、本発明は、従来は、この種のいずれの
酵素によつても認識されなかつた配列を特異的に
認識しかつ切断することのできる新規の制限エン
ドヌクレアーゼを提供することを課題としてい
る。 ［課題を解決するための手段］ この課題は、本発明により、次の認識配列及び
標識により定義された切断位置：
【式】
を有する型制限エンドヌクレアーゼにより解決
される。 本発明による新規制限エンドヌクレアーゼ（以
後SgrAIと称する）は、37℃に至適温度を有す
る、この酵素は、PH7.5〜8.5で、DTE（ジチオス
レイトール）1.0mモル／、MgCl10mモル／
及び酢酸カリウム66mモル／を含有するトリス
−酢酸−緩衝液33mモル／中で良好な活性を有
する。至適PHは約PH7.9である。SprAIに対する
アイソシゾマー（Ｉ soschizomer）である酵素
は知られていない。 その認識配列は、ウイルスSV40及びアデノ２、
フアージラムダ、phiX1174及びフアージ誘導体
M13mp8及びプラスミドpBR322及びpBR328の
DNAの完全消化により確認できる。これらの
DNA分子をSgrAIで処理する。 第１表に、次の配列： 5′CA GCCGGC TＧ−3′ を認識する酵素に関する、実験的に観察された切
断位置特異性とコンピユータで測定された切断位
置特異性とを比較して示す。
される。 本発明による新規制限エンドヌクレアーゼ（以
後SgrAIと称する）は、37℃に至適温度を有す
る、この酵素は、PH7.5〜8.5で、DTE（ジチオス
レイトール）1.0mモル／、MgCl10mモル／
及び酢酸カリウム66mモル／を含有するトリス
−酢酸−緩衝液33mモル／中で良好な活性を有
する。至適PHは約PH7.9である。SprAIに対する
アイソシゾマー（Ｉ soschizomer）である酵素
は知られていない。 その認識配列は、ウイルスSV40及びアデノ２、
フアージラムダ、phiX1174及びフアージ誘導体
M13mp8及びプラスミドpBR322及びpBR328の
DNAの完全消化により確認できる。これらの
DNA分子をSgrAIで処理する。 第１表に、次の配列： 5′CA GCCGGC TＧ−3′ を認識する酵素に関する、実験的に観察された切
断位置特異性とコンピユータで測定された切断位
置特異性とを比較して示す。
【表】
この酵素の認識配列内の切断位置は、ユニバー
サルな配列決定プライマー（Messing J.等の
Nucl.Acids Res.９309〜321）の結合位置に対し
て約30〜200塩基の距離にこの認識配列を有する
M13−誘導体で測定できる。M13−誘導体の１本
鎖DNAで、まずユニバーサルな配列決定プライ
マーを用いてジデソキシ連鎖中断法による配列決
定反応を実施する（Sanger F.等による（1977）、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、560〜564、
Messing.J.等による（1981）、Nucl.Acids Res.9，
309〜321）。 これと並行して、配列決定プライマーをT4−
ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［γ-32p］ATP
を用いて、5′−末端の所で放射能標識付けをす
る。この5′−末端標識付けされた配列決定プライ
マーの１本鎖M13−DNAへのハイブリド結合の
後に、DNAポリメラーゼＩ（クレノフ酵素）及び
dATP、dCTP、dGTP及びdTTPからのデソキ
シヌクレオチドホスフエート混合物での挿入反応
で、部分的２本鎖DNAを製造する。新規に合成
された鎖の5′−末端の所で放射能標識されている
このDNAを制限エンドヌクレアーゼSgrAIで切
断する。この切断バツチの半分を、付加的に、な
お、平滑DNA末端を得るために、全ての４種の
デソキシヌクレオチドホスフエートの混合物の存
在でT4DNAポリメラーゼで処理する。 反応生成物の分析を、配列決定ゲル（尿素８モ
ル／、ポリアクリルアミド５％）上での電気泳
動及び引続くオートラジオグラフイにより行な
う。結果の解析は、ブラウン（Brown）N.L.及
びスミス（Smith）M.による方法（Methods in
Enzymology65、（1980）、391〜401）で実施す
る。放射能標識されたフラグメントの移動距離と
配列リーダー（Sequenzleiter）との比較により、
切断位置を決定する。付加的にT4DNSポリメラ
ーゼで処理された試料は、単にSgrAIで切断され
た試料と比べて4bpだけ短かいバンドの移動距離
を示す。従つて、SgrAIは、4bpだけ5′−突出し
ているDNA7−末端を生じることが明らかであ
る。従つて、SgrAIでの切断は、次の特異性：
サルな配列決定プライマー（Messing J.等の
Nucl.Acids Res.９309〜321）の結合位置に対し
て約30〜200塩基の距離にこの認識配列を有する
M13−誘導体で測定できる。M13−誘導体の１本
鎖DNAで、まずユニバーサルな配列決定プライ
マーを用いてジデソキシ連鎖中断法による配列決
定反応を実施する（Sanger F.等による（1977）、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、560〜564、
Messing.J.等による（1981）、Nucl.Acids Res.9，
309〜321）。 これと並行して、配列決定プライマーをT4−
ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［γ-32p］ATP
を用いて、5′−末端の所で放射能標識付けをす
る。この5′−末端標識付けされた配列決定プライ
マーの１本鎖M13−DNAへのハイブリド結合の
後に、DNAポリメラーゼＩ（クレノフ酵素）及び
dATP、dCTP、dGTP及びdTTPからのデソキ
シヌクレオチドホスフエート混合物での挿入反応
で、部分的２本鎖DNAを製造する。新規に合成
された鎖の5′−末端の所で放射能標識されている
このDNAを制限エンドヌクレアーゼSgrAIで切
断する。この切断バツチの半分を、付加的に、な
お、平滑DNA末端を得るために、全ての４種の
デソキシヌクレオチドホスフエートの混合物の存
在でT4DNAポリメラーゼで処理する。 反応生成物の分析を、配列決定ゲル（尿素８モ
ル／、ポリアクリルアミド５％）上での電気泳
動及び引続くオートラジオグラフイにより行な
う。結果の解析は、ブラウン（Brown）N.L.及
びスミス（Smith）M.による方法（Methods in
Enzymology65、（1980）、391〜401）で実施す
る。放射能標識されたフラグメントの移動距離と
配列リーダー（Sequenzleiter）との比較により、
切断位置を決定する。付加的にT4DNSポリメラ
ーゼで処理された試料は、単にSgrAIで切断され
た試料と比べて4bpだけ短かいバンドの移動距離
を示す。従つて、SgrAIは、4bpだけ5′−突出し
ているDNA7−末端を生じることが明らかであ
る。従つて、SgrAIでの切断は、次の特異性：
【式】
を有する認識配列内で行なわれる。
実験的に測定された切断位置の数は、配列：
5′CA GCCGGC TＧ−3′
に関する種々のDNAを用いてコンピユータ分析
により得られた切断位置の数と同じである（第１
表参照）。付加的にこれらのデータを、Gen10
（1980）357〜370に記載の表と比較した。 有利に、SgrAIは、ストレプトマイセス属の微
生物を培養し、その細胞から酵素を取得する方法
で得られる。ストレプトマイセス・グリセウス
（Streptmyces griseus）DSM5621を使用するの
が有利である。 この微生物ストレプトマイセス・グリセウス、
DSM（Deutschen Sammlung von Mikr−
oorganismen、Manscheroder Weg 1b、
3300Braunschweig、BRD）に寄託されており、
DSM5621の寄託番号を有する。 その取得のために、慣用の生物学的精製法が使
用され、この際、その都度に得られるフラクシヨ
ンで、その認識配列の切断により、この酵素の存
在を容易に立証することができる。基質として
は、例えばλ−DNAが好適である。得られる
DNA−フラグメントは、フラグメント分離のた
めに慣用の緩衝剤系中でのアガロースゲルで、臭
化エチジウムの存在下に電気泳動により分離され
うる。 この酵素の取得のために使用される微生物は、
好気的に、M111−培地（イーストエキス10ｇ／
＋麦芽エキス10ｇ／）中で生長する。 至適生長条件は、26℃、PH6.5〜7.5である。２
倍化時間は約2.5倍時間である。 この酵素を、慣用の化学的及び機械的方法例え
ば高圧分散、超音波又は酵素的崩壊法により単離
しかつ精製する。本発明方法の有利な１実施形で
は、細胞をフレンチプレス（French−Presse）
により崩壊させる。上澄みを更に精製すること
は、有利にアフイニテイクロマトグラフイ及びイ
オン交換体クロマトグラフイにより実施されう
る。アフイニテイクロマトグラフイ用材料として
は、例えばヘパリン−セフアロースCL−6B
（Heparin−Sepharose CL−6B；Pharmacia）
が好適である。好適なカチオン交換体は例えばホ
スホーセルロース（phospho−cellulose；
Whatman）である。 アニオン交換体としては、DEAEセフアセル
（DEAE Sephacel；Pharmacia）なる名称で入
手される製品が好適である。しかしながら、当業
者に公知の他のクロマトグラフイ材料も好適であ
る。 ［実施例］ 次の例で本発明を詳述する。 例 １ ストレプトマイセス・グリセウスDSM5621を
25℃で５時間培養し、対数期に収穫する。培養媒
体としてM111−培地を使用する。 細胞ペースト（湿重量30ｇ）を、プロテアーゼ
阻害剤を含有する緩衝液Ａ（トリス−HCL40mモ
ル／、PH8.0、EDTA0.1モル／、２−メルカ
プトエタノール7mモル／）2.4容量中に再懸濁
される。引続き、この細胞を、23000lb／in2でフ
レンチプレスに２回通すことにより崩壊させ、沈
殿を分離させる。上澄みにNH4Clを加え（最終
濃度1.3モル／）、ポリミン沈殿法を用いて核酸
を除去する。引続き、遠心分離された上澄みを55
％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリン−
セフアロスーカラムを通して分別する。溶離のた
めにNaCl0〜１モル／の勾配溶液を使用する。
SgrAIはNaCl0.4〜0.6モル／の間のフラクシヨ
ン中に認められる。この活性フラクシヨンを緩衝
液Ｂ（トリス−HCL 40mモル／、PH8.0、
EDTA 0.1mモル／、２−メルカプトエタノー
ル7mモル／、グリセリン10（ｗ／ｖ）％）に対
して平衡化させ、DEAE−セフアセルカラム上で
分別させる。溶離のためにNaCl0〜0.5モル／
の勾配溶液を用いる。活性フラクシヨンを緩衝剤
液Ｂに対して透析させる。 引続き、これを、緩衝液Ｂで平衡化されたホス
ホーセルロース（Phospho−Cellulose）−カラム
上に装入する。溶離のために、緩衝液Ｂ中の
NaCl0〜１モル／の勾配溶液を用いる。SgrAI
はNaCl0.3〜0.5モル／の間のフラクシヨン中に
認められる。 活性フラクシヨンを一緒に、貯蔵緩衝液（La
−gerpuffer：トリス−HCL 20mモル／、PH
8.0、２−メルカプトエタノール10mモル／、
NaCl100mモル／、EDTA 0.1mモル／及び
グリセリン50（ｖ／ｖ）％）に対して透析させる。 例 ２ 活性の測定 酵素単位の定義：SgrAIUは、ラムダDNAlμg
を最終量25μ中、37℃で１時間以内に切断す
る。 インキユベーシヨン緩衝液（トリス−
HCL100mモル／、PH7.5、37℃、塩化マグネシ
ウム100mモル／及びDTE 10mモル／）2.5μ
の混合物に、水17，9μ、ラムダDNA（光学
密度：5.6OD，／ml）3.6μ並びにSprAI−溶液
（IU／μ）／μを加える。この溶液を37℃で
１時間インキユベートし、氷上で冷却し、尿素
7mモル／、サツカロース20（ｖ／ｖ）％、
EDTA 60mモル／及びブロムフエノールブル
ー0.01（ｖ／ｖ）％より成る停止試薬（Abstopp
−Reagenses）5μを加える。引続き、１％アガ
ロースゲル中、100Vで３〜４時間の電気泳動に
より、分離を実施する。得られるバンドをDNA
−長さ標準との比較により同定する。
により得られた切断位置の数と同じである（第１
表参照）。付加的にこれらのデータを、Gen10
（1980）357〜370に記載の表と比較した。 有利に、SgrAIは、ストレプトマイセス属の微
生物を培養し、その細胞から酵素を取得する方法
で得られる。ストレプトマイセス・グリセウス
（Streptmyces griseus）DSM5621を使用するの
が有利である。 この微生物ストレプトマイセス・グリセウス、
DSM（Deutschen Sammlung von Mikr−
oorganismen、Manscheroder Weg 1b、
3300Braunschweig、BRD）に寄託されており、
DSM5621の寄託番号を有する。 その取得のために、慣用の生物学的精製法が使
用され、この際、その都度に得られるフラクシヨ
ンで、その認識配列の切断により、この酵素の存
在を容易に立証することができる。基質として
は、例えばλ−DNAが好適である。得られる
DNA−フラグメントは、フラグメント分離のた
めに慣用の緩衝剤系中でのアガロースゲルで、臭
化エチジウムの存在下に電気泳動により分離され
うる。 この酵素の取得のために使用される微生物は、
好気的に、M111−培地（イーストエキス10ｇ／
＋麦芽エキス10ｇ／）中で生長する。 至適生長条件は、26℃、PH6.5〜7.5である。２
倍化時間は約2.5倍時間である。 この酵素を、慣用の化学的及び機械的方法例え
ば高圧分散、超音波又は酵素的崩壊法により単離
しかつ精製する。本発明方法の有利な１実施形で
は、細胞をフレンチプレス（French−Presse）
により崩壊させる。上澄みを更に精製すること
は、有利にアフイニテイクロマトグラフイ及びイ
オン交換体クロマトグラフイにより実施されう
る。アフイニテイクロマトグラフイ用材料として
は、例えばヘパリン−セフアロースCL−6B
（Heparin−Sepharose CL−6B；Pharmacia）
が好適である。好適なカチオン交換体は例えばホ
スホーセルロース（phospho−cellulose；
Whatman）である。 アニオン交換体としては、DEAEセフアセル
（DEAE Sephacel；Pharmacia）なる名称で入
手される製品が好適である。しかしながら、当業
者に公知の他のクロマトグラフイ材料も好適であ
る。 ［実施例］ 次の例で本発明を詳述する。 例 １ ストレプトマイセス・グリセウスDSM5621を
25℃で５時間培養し、対数期に収穫する。培養媒
体としてM111−培地を使用する。 細胞ペースト（湿重量30ｇ）を、プロテアーゼ
阻害剤を含有する緩衝液Ａ（トリス−HCL40mモ
ル／、PH8.0、EDTA0.1モル／、２−メルカ
プトエタノール7mモル／）2.4容量中に再懸濁
される。引続き、この細胞を、23000lb／in2でフ
レンチプレスに２回通すことにより崩壊させ、沈
殿を分離させる。上澄みにNH4Clを加え（最終
濃度1.3モル／）、ポリミン沈殿法を用いて核酸
を除去する。引続き、遠心分離された上澄みを55
％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリン−
セフアロスーカラムを通して分別する。溶離のた
めにNaCl0〜１モル／の勾配溶液を使用する。
SgrAIはNaCl0.4〜0.6モル／の間のフラクシヨ
ン中に認められる。この活性フラクシヨンを緩衝
液Ｂ（トリス−HCL 40mモル／、PH8.0、
EDTA 0.1mモル／、２−メルカプトエタノー
ル7mモル／、グリセリン10（ｗ／ｖ）％）に対
して平衡化させ、DEAE−セフアセルカラム上で
分別させる。溶離のためにNaCl0〜0.5モル／
の勾配溶液を用いる。活性フラクシヨンを緩衝剤
液Ｂに対して透析させる。 引続き、これを、緩衝液Ｂで平衡化されたホス
ホーセルロース（Phospho−Cellulose）−カラム
上に装入する。溶離のために、緩衝液Ｂ中の
NaCl0〜１モル／の勾配溶液を用いる。SgrAI
はNaCl0.3〜0.5モル／の間のフラクシヨン中に
認められる。 活性フラクシヨンを一緒に、貯蔵緩衝液（La
−gerpuffer：トリス−HCL 20mモル／、PH
8.0、２−メルカプトエタノール10mモル／、
NaCl100mモル／、EDTA 0.1mモル／及び
グリセリン50（ｖ／ｖ）％）に対して透析させる。 例 ２ 活性の測定 酵素単位の定義：SgrAIUは、ラムダDNAlμg
を最終量25μ中、37℃で１時間以内に切断す
る。 インキユベーシヨン緩衝液（トリス−
HCL100mモル／、PH7.5、37℃、塩化マグネシ
ウム100mモル／及びDTE 10mモル／）2.5μ
の混合物に、水17，9μ、ラムダDNA（光学
密度：5.6OD，／ml）3.6μ並びにSprAI−溶液
（IU／μ）／μを加える。この溶液を37℃で
１時間インキユベートし、氷上で冷却し、尿素
7mモル／、サツカロース20（ｖ／ｖ）％、
EDTA 60mモル／及びブロムフエノールブル
ー0.01（ｖ／ｖ）％より成る停止試薬（Abstopp
−Reagenses）5μを加える。引続き、１％アガ
ロースゲル中、100Vで３〜４時間の電気泳動に
より、分離を実施する。得られるバンドをDNA
−長さ標準との比較により同定する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・グリセウスDSM5621
から得られ、至適温度約37℃及び至適PH値8.0を
有する。 【式】 の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置を
有する型−制限エンドヌクレアーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3938143A DE3938143A1 (de) | 1989-11-16 | 1989-11-16 | Typ ii-restriktionsendonuklease sgrai |
| DE3938143.9 | 1989-11-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03172178A JPH03172178A (ja) | 1991-07-25 |
| JPH0587235B2 true JPH0587235B2 (ja) | 1993-12-15 |
Family
ID=6393675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2307355A Granted JPH03172178A (ja) | 1989-11-16 | 1990-11-15 | ２型―制限エンドヌクレアーゼＳｇｒＡＩ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5134069A (ja) |
| EP (1) | EP0432454B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03172178A (ja) |
| AT (1) | ATE111155T1 (ja) |
| DE (2) | DE3938143A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5391487A (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-21 | Promega Corporation | Restriction endonuclease SgfI from Streptomyces griseoruber |
| EP0655496A3 (en) * | 1993-11-30 | 1996-07-17 | Takara Shuzo Co | Restriction endonuclease Sse 1825I. |
| JP3017019B2 (ja) * | 1994-07-28 | 2000-03-06 | 寳酒造株式会社 | 新規制限酵素 |
-
1989
- 1989-11-16 DE DE3938143A patent/DE3938143A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-11-08 EP EP90121351A patent/EP0432454B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-08 AT AT90121351T patent/ATE111155T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 DE DE59007057T patent/DE59007057D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-15 JP JP2307355A patent/JPH03172178A/ja active Granted
- 1990-11-16 US US07/615,439 patent/US5134069A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE111155T1 (de) | 1994-09-15 |
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