JPH0589A - 遺伝子発現の誘導方法 - Google Patents
遺伝子発現の誘導方法Info
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- JPH0589A JPH0589A JP17480591A JP17480591A JPH0589A JP H0589 A JPH0589 A JP H0589A JP 17480591 A JP17480591 A JP 17480591A JP 17480591 A JP17480591 A JP 17480591A JP H0589 A JPH0589 A JP H0589A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】植物の光合成に関する集光性クロロフィルａ／
ｂ結合タンパク質の遺伝子およびそのプロモーターを提
供する。 【構成】集光性クロロフィルａ／ｂ結合のプロモータに
光を当てることによって行う、遺伝子発現の誘導方法で
ある。
ｂ結合タンパク質の遺伝子およびそのプロモーターを提
供する。 【構成】集光性クロロフィルａ／ｂ結合のプロモータに
光を当てることによって行う、遺伝子発現の誘導方法で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は植物の光合成に関する集
光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の遺伝子および
そのプロモーターに関するものであり、特に遺伝子組み
換えを利用した植物の新品種の開発や、代謝産物を生産
させる培養細胞の改変に利用されるものである。
光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の遺伝子および
そのプロモーターに関するものであり、特に遺伝子組み
換えを利用した植物の新品種の開発や、代謝産物を生産
させる培養細胞の改変に利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、植物における遺伝子組み換え技術
の利用が可能となり、双子葉植物での研究が活発に行わ
れている。中でも土壌細菌アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスのＴｉプラスミドを利用したベクター系が
作成され、植物の形質転換実験に用いられてきた。（Ｈ
ｏｅｋｅｍａら（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｉｇｙ５：８５−８９，Ｖｅｌｔｅｎ
ら（１９８４）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ３：
２７２３−２７３０）
の利用が可能となり、双子葉植物での研究が活発に行わ
れている。中でも土壌細菌アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスのＴｉプラスミドを利用したベクター系が
作成され、植物の形質転換実験に用いられてきた。（Ｈ
ｏｅｋｅｍａら（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｉｇｙ５：８５−８９，Ｖｅｌｔｅｎ
ら（１９８４）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ３：
２７２３−２７３０）
【０００３】しかし、アグロバクテリウム属は双子葉植
物と、限られた単子葉植物にしか感染しないため、単子
葉植物での形質転換実験は困難であった。エレクトロポ
レーション法はプロトプラストに電気的刺激を与えるこ
とにより、細胞表面にごく小さな穴をあけ、そこから遺
伝子を導入し、形質転換を行う技術である。このエレク
トロポレーション法によりイネ等において形質転換実験
が可能になった。従来用いられてきたベクター系におけ
るプロモーターはアグロバクテリウム・トゥメファシエ
ンスのＴｉプラスミドの遺伝子由来のプロモーターか、
またはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の遺
伝子由来のプロモーターがほとんどである。
物と、限られた単子葉植物にしか感染しないため、単子
葉植物での形質転換実験は困難であった。エレクトロポ
レーション法はプロトプラストに電気的刺激を与えるこ
とにより、細胞表面にごく小さな穴をあけ、そこから遺
伝子を導入し、形質転換を行う技術である。このエレク
トロポレーション法によりイネ等において形質転換実験
が可能になった。従来用いられてきたベクター系におけ
るプロモーターはアグロバクテリウム・トゥメファシエ
ンスのＴｉプラスミドの遺伝子由来のプロモーターか、
またはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の遺
伝子由来のプロモーターがほとんどである。
【０００４】
【本発明が解決しようとする問題点】これらのプロモー
ターは、遺伝子を植物細胞内で効率よく発現させるため
のプロモーターとして利用されてきたが、遺伝子導入後
の植物の生育時期や、植物の部位に関係なく常に遺伝子
を発現させるものであり、制御することが不可能なプロ
モーターであった。現在、植物細胞への遺伝子導入技術
は確立しており、強力なプロモーターが遺伝子発現のた
めに使用されている。しかし植物を育種する際には、生
育の時期または器官に特異的に発現させることができる
プロモーターや人為的に制御可能なプロモーターが望ま
れる。
ターは、遺伝子を植物細胞内で効率よく発現させるため
のプロモーターとして利用されてきたが、遺伝子導入後
の植物の生育時期や、植物の部位に関係なく常に遺伝子
を発現させるものであり、制御することが不可能なプロ
モーターであった。現在、植物細胞への遺伝子導入技術
は確立しており、強力なプロモーターが遺伝子発現のた
めに使用されている。しかし植物を育種する際には、生
育の時期または器官に特異的に発現させることができる
プロモーターや人為的に制御可能なプロモーターが望ま
れる。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】植物の葉緑体のチコラ
イド膜に存在している集光性クロロフィルａ／ｂ結合タ
ンパク質（以下、ＬＨＣＰIIと略す）は光合成系IIの集
光性クロロフィルを結合した複合体タンパク質であり、
光合成において重要な役割を果たしている。その遺伝子
は核ＤＮＡにコードされており、光によって誘導がかか
り葉緑体中で発現することが知られている。
イド膜に存在している集光性クロロフィルａ／ｂ結合タ
ンパク質（以下、ＬＨＣＰIIと略す）は光合成系IIの集
光性クロロフィルを結合した複合体タンパク質であり、
光合成において重要な役割を果たしている。その遺伝子
は核ＤＮＡにコードされており、光によって誘導がかか
り葉緑体中で発現することが知られている。
【０００６】本発明者らは、このＬＨＣＰII遺伝子のプ
ロモーターを利用することにより、光による遺伝子発現
の誘導を行えるのではないかと考え、ＬＨＣＰIIの遺伝
子をクローニングし、プロモーター部分の解析を行っ
た。そしてこのプロモーター部分を切り出し大腸菌由来
のβ−グルクロニダーゼ遺伝子に接続し、このキメラ遺
伝子を植物細胞に導入した。遺伝子導入を行った細胞を
培養したカルス（細胞塊）や、それより再分化した植物
体では光を照射することによってβ−グルクロニダーゼ
遺伝子が発現することが確認できた。従ってＬＨＣＰII
遺伝子のプロモーターは光によって誘導がかけられるこ
とが確認され、本発明を完成した。
ロモーターを利用することにより、光による遺伝子発現
の誘導を行えるのではないかと考え、ＬＨＣＰIIの遺伝
子をクローニングし、プロモーター部分の解析を行っ
た。そしてこのプロモーター部分を切り出し大腸菌由来
のβ−グルクロニダーゼ遺伝子に接続し、このキメラ遺
伝子を植物細胞に導入した。遺伝子導入を行った細胞を
培養したカルス（細胞塊）や、それより再分化した植物
体では光を照射することによってβ−グルクロニダーゼ
遺伝子が発現することが確認できた。従ってＬＨＣＰII
遺伝子のプロモーターは光によって誘導がかけられるこ
とが確認され、本発明を完成した。
【０００７】具体的なＬＨＣＰII遺伝子の単離、プロモ
ーターを利用したベクターを用いた植物の形質転換は以
下の通りである。ＬＨＣＰII遺伝子は次の様に単離す
る。ノシバの地上部より核ＤＮＡをＣＴＡＢ法により抽
出し、大腸菌のクローニング用のベクターに接続し、ノ
シバのゲノムライブラリーを作成する。イネのＬＨＣＰ
II遺伝子のＣＤＮＡをプローブとしてゲノムライブラリ
ーをスクリーニングし、ノシバのＬＨＣＰII遺伝子を単
離する。
ーターを利用したベクターを用いた植物の形質転換は以
下の通りである。ＬＨＣＰII遺伝子は次の様に単離す
る。ノシバの地上部より核ＤＮＡをＣＴＡＢ法により抽
出し、大腸菌のクローニング用のベクターに接続し、ノ
シバのゲノムライブラリーを作成する。イネのＬＨＣＰ
II遺伝子のＣＤＮＡをプローブとしてゲノムライブラリ
ーをスクリーニングし、ノシバのＬＨＣＰII遺伝子を単
離する。
【０００８】図１は単離したＬＨＣＰII遺伝子の全構造
およびプロモーター領域のＤＮＡ塩基配列を示す。枠で
囲んだ部分がＬＨＣＰII遺伝子の構造部分を示す。＋１
はＬＨＣＰII遺伝子の転写開始点を、また、＋９１のＡ
ＴＧは成熟ＬＨＣＰIIのタンパク質の第１番目のアミノ
酸をコードする塩基配列を示す。遺伝子の転写に必要な
ＴＡＴＡボックスは−４６に認められる。
およびプロモーター領域のＤＮＡ塩基配列を示す。枠で
囲んだ部分がＬＨＣＰII遺伝子の構造部分を示す。＋１
はＬＨＣＰII遺伝子の転写開始点を、また、＋９１のＡ
ＴＧは成熟ＬＨＣＰIIのタンパク質の第１番目のアミノ
酸をコードする塩基配列を示す。遺伝子の転写に必要な
ＴＡＴＡボックスは−４６に認められる。
【０００９】プロモーターとしての活性についての検討
は以下のように行う。プロモーター活性を持つと考えら
れる部分をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の５
´側上流に接続する。４−メチルウンベリフェロン（４
−ＭＵ）にグルクロン酸が結合した４−ＭＵＧを基質と
して反応し、その反応産物４−ＭＵが強い蛍光を発する
ことにより定量できる。（Ｒｉｃｈａｒｄら（１９８
９）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ６：３９０１−
３９０７）。ＬＨＣＰII遺伝子のプロモーターとＧＵＳ
遺伝子を接続したプラスミドｐＬＨ／ＧＵＳを植物のプ
ロトプラストにエレクロポレーション法により導入す
る。導入した植物細胞はカナマイシンで選択する。ｐＬ
Ｈ／ＧＵＳに葉ＮＰＴII遺伝子も含まれており、この酵
素が合成されるとカナマイシンに耐性となる。従って、
カナマイシン存在下で生き残る細胞はＬＨＣＰIIプロモ
ーターとＧＵＳ遺伝子のキメラ遺伝をを持つ可能性が高
くなる。
は以下のように行う。プロモーター活性を持つと考えら
れる部分をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の５
´側上流に接続する。４−メチルウンベリフェロン（４
−ＭＵ）にグルクロン酸が結合した４−ＭＵＧを基質と
して反応し、その反応産物４−ＭＵが強い蛍光を発する
ことにより定量できる。（Ｒｉｃｈａｒｄら（１９８
９）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ６：３９０１−
３９０７）。ＬＨＣＰII遺伝子のプロモーターとＧＵＳ
遺伝子を接続したプラスミドｐＬＨ／ＧＵＳを植物のプ
ロトプラストにエレクロポレーション法により導入す
る。導入した植物細胞はカナマイシンで選択する。ｐＬ
Ｈ／ＧＵＳに葉ＮＰＴII遺伝子も含まれており、この酵
素が合成されるとカナマイシンに耐性となる。従って、
カナマイシン存在下で生き残る細胞はＬＨＣＰIIプロモ
ーターとＧＵＳ遺伝子のキメラ遺伝をを持つ可能性が高
くなる。
【００１０】このように外来遺伝子を有すると考えられ
るカルスより、植物体を再分化させる。再分化した植物
体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植物体を茎、
葉、根の各器官ごとにＧＵＳ活性を測定することによ
り、いずれの植物体も葉で最も大きな発現量が確認され
る。従って本発明の方法によって、ＬＨＣＰII遺伝子の
プロモーターを利用することにより、光による遺伝子発
現が誘導できる。また、葉などの光合成器官を有する部
位に発現しやすいことから器官特異的に遺伝子を発現さ
せることができる可能性も開けた。
るカルスより、植物体を再分化させる。再分化した植物
体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植物体を茎、
葉、根の各器官ごとにＧＵＳ活性を測定することによ
り、いずれの植物体も葉で最も大きな発現量が確認され
る。従って本発明の方法によって、ＬＨＣＰII遺伝子の
プロモーターを利用することにより、光による遺伝子発
現が誘導できる。また、葉などの光合成器官を有する部
位に発現しやすいことから器官特異的に遺伝子を発現さ
せることができる可能性も開けた。
【００１１】
【実施例】ノシバゲノミックライブラリーは以下のよう
に作成した。ノシバ地上部６ｇよりＣＴＡＢ法（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｃｌｅｃｕｌａｒ Ｂ：ａｌｏｇｙ（１９８
５） ，６９）によってＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ１０
μｇを制限酵素ＥｃｏＲ｜（例えばＴｏｙｏｂｏ社製な
ど）によって完全分解した。約６ｋｂのＤＮＡ断片を入
ファージにクローニングし、ゲノミックライブラリーと
した。イネＬＨＣＰII遺伝子のＣＤＮＡをプローブとし
てゲノミックライブラリーのスクリーニングを行いポジ
ティブクローンを１つ得て、ジデオキシ法により塩基配
列を決定した。図１はノシバＬＨＣＰII遺伝子およびそ
のプロモーター領域の塩基配列である。
に作成した。ノシバ地上部６ｇよりＣＴＡＢ法（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｃｌｅｃｕｌａｒ Ｂ：ａｌｏｇｙ（１９８
５） ，６９）によってＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ１０
μｇを制限酵素ＥｃｏＲ｜（例えばＴｏｙｏｂｏ社製な
ど）によって完全分解した。約６ｋｂのＤＮＡ断片を入
ファージにクローニングし、ゲノミックライブラリーと
した。イネＬＨＣＰII遺伝子のＣＤＮＡをプローブとし
てゲノミックライブラリーのスクリーニングを行いポジ
ティブクローンを１つ得て、ジデオキシ法により塩基配
列を決定した。図１はノシバＬＨＣＰII遺伝子およびそ
のプロモーター領域の塩基配列である。
【００１２】次にＬＨＣＰII遺伝子のプロモーターの活
性を検討するために、ＬＨＣＰII遺伝子のプロモーター
部位を切り出し、ＧＵＳ遺伝子に接続した。すなわち−
２６５から＋７８までの部分を切り出し−２６５側には
制限酵素×ｂａＩのリンカーを、＋７８側には制限酵素
ＢａｍＨ｜部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分
にＬＨＣＰII遺伝子のプロモーター領域（ＬＨＣＰ−Ｐ
ｒｏ）を接続した（プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳ）。この
プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳを用いて形質転換実験を行
い、形質転換植物のＧＵＳ活性を検定した。
性を検討するために、ＬＨＣＰII遺伝子のプロモーター
部位を切り出し、ＧＵＳ遺伝子に接続した。すなわち−
２６５から＋７８までの部分を切り出し−２６５側には
制限酵素×ｂａＩのリンカーを、＋７８側には制限酵素
ＢａｍＨ｜部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分
にＬＨＣＰII遺伝子のプロモーター領域（ＬＨＣＰ−Ｐ
ｒｏ）を接続した（プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳ）。この
プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳを用いて形質転換実験を行
い、形質転換植物のＧＵＳ活性を検定した。
【００１３】タバコの葉からプロトプラストを調整し、
２×１０５ 個／ｍｌの濃度に緩衝液に懸濁した。この
溶液に図２に示す構造をもつｐＬＨ／ＧＵＳプラスミド
ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。この懸濁液をエ
レクトロプレーション用の容器に移し電気刺激を与えた
後、プロトプラストを回収しＭＳ培地で培養した。培養
開始後１週間の後、カナマイレンを５０μｇ／ｍｌの濃
度で培地添加し、さらに細胞を増殖させた。カルスが径
５〜１０ｍｍにまった時点で植物ホルモンフリーの培地
に移植し、再分化させた。この様にして再分化した植物
体の葉、茎、花弁、根についてＲｉｃｈａｒｄらの方法
にしたがってＧＵＳ遺伝子の産物である酵素が４ＭＵＧ
を分解した産物の４ＭＵの蛍光で測定した。その結果を
図３に示すが、この図から各固体間に差はあるが、いず
れにおいても葉においてＧＵＳ遺伝子の発現量が最も多
いことが分かる。
２×１０５ 個／ｍｌの濃度に緩衝液に懸濁した。この
溶液に図２に示す構造をもつｐＬＨ／ＧＵＳプラスミド
ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。この懸濁液をエ
レクトロプレーション用の容器に移し電気刺激を与えた
後、プロトプラストを回収しＭＳ培地で培養した。培養
開始後１週間の後、カナマイレンを５０μｇ／ｍｌの濃
度で培地添加し、さらに細胞を増殖させた。カルスが径
５〜１０ｍｍにまった時点で植物ホルモンフリーの培地
に移植し、再分化させた。この様にして再分化した植物
体の葉、茎、花弁、根についてＲｉｃｈａｒｄらの方法
にしたがってＧＵＳ遺伝子の産物である酵素が４ＭＵＧ
を分解した産物の４ＭＵの蛍光で測定した。その結果を
図３に示すが、この図から各固体間に差はあるが、いず
れにおいても葉においてＧＵＳ遺伝子の発現量が最も多
いことが分かる。
【００１４】
【本発明の効果】本発明により開発されたプロモーター
を用いることにより、導入遺伝子を光を照射することに
より発現することが可能になった。また、葉で最も発現
量が認められたことから、遺伝子を発現させる部位に特
異性を持たせられることが可能になった。
を用いることにより、導入遺伝子を光を照射することに
より発現することが可能になった。また、葉で最も発現
量が認められたことから、遺伝子を発現させる部位に特
異性を持たせられることが可能になった。
【図１】ノシバＬＨＣＰII遺伝子およびそのプロモータ
ー領域の塩基配列
ー領域の塩基配列
【図２】植物体形質転換用ベクターを示す図
【図３】再分化した植物体のＧＵＳ活性の測定結果を示
す図
す図
Claims (3)
- 【請求項１】 集光性クロロフィルａ／ｂ結合のプロモ
ータに光を当てることによって行う、遺伝子発現の誘導
方法 - 【請求項２】 ノシバを対象として行う、請求項１記載
の遺伝子発現の誘導方法 - 【請求項３】 集光性クロロフィルａ／ｂ結合のプロモ
ーターが、ＤＮＡ配列である、請求項１記載の遺伝子発
現の誘導方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17480591A JPH0589A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | 遺伝子発現の誘導方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17480591A JPH0589A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | 遺伝子発現の誘導方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0589A true JPH0589A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=15984976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17480591A Pending JPH0589A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | 遺伝子発現の誘導方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0589A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2256189A1 (en) | 2003-03-28 | 2010-12-01 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Process for producing a plant storage organ in which a GLP-1 derivative recombinant protein is highly produced. |
| CN103604124A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-26 | 卢振武 | 一种高效环保垃圾焚烧炉 |
| WO2020171192A1 (ja) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | 株式会社バイオパレット | 植物細胞のゲノム編集用核酸及びその用途 |
-
1991
- 1991-06-20 JP JP17480591A patent/JPH0589A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2256189A1 (en) | 2003-03-28 | 2010-12-01 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Process for producing a plant storage organ in which a GLP-1 derivative recombinant protein is highly produced. |
| CN103604124A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-26 | 卢振武 | 一种高效环保垃圾焚烧炉 |
| WO2020171192A1 (ja) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | 株式会社バイオパレット | 植物細胞のゲノム編集用核酸及びその用途 |
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