JPH0592928A

JPH0592928A - 記憶障害改善治療剤

Info

Publication number: JPH0592928A
Application number: JP3278252A
Authority: JP
Inventors: Ryuzo Sasaki; 隆造佐々木; Masaji Ueda; 正次上田
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1993-04-16
Anticipated expiration: 2016-04-16
Also published as: JP3156236B2

Abstract

(57)【要約】【構成】エリスロポエチン蛋白質を有効成分として含
有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤【効果】神経細胞の細胞内カルシウム濃度を上げ、コ
リンアセチルトランスフェラーゼ活性を高めてアルツハ
イマー型記憶障害を予防・改善あるいは治療することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイトカインの一種、
造血因子であるエリスロポエチン（以下ＥＰＯと略す
る）蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型
記憶障害の予防・改善・治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＥＰＯは、分子量30〜40kDa の高度に糖
付加された蛋白質で赤血球産生を促進する造血因子とし
て発見され、すでにその全アミノ酸配列が明かにされて
いる〔Jacobs et al, Nature, 313, 806-810 (198
5)〕。また、ヒト・ＥＰＯは、遺伝子工学的手段により
高純度のものが大量に生産され貧血治療薬としてすでに
応用されている〔Urabe et al, Int. J. Cell Cloling,
6, 179-191 (1988)〕。ＥＰＯの作用は、ＥＰＯの標的
細胞表面に存在するＥＰＯレセプターを介して行われて
おり、ＥＰＯレセプターは、サイトカインスパーファミ
リーに属することが明かにされている〔D'Andrea et a
l, J. Clin. Invest., 86, 681-687 (1990)〕。中枢神
経障害修復の観点に立ち、サイトカインの神経栄養因子
としての作用に関する研究も近年活発に行われ、ＩＬ−
３が培養ラット中隔野神経細胞やコリン作動性ニューロ
ン由来ＰＣ−１２細胞のコリンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣｈＡＴ活性）を高めること〔田平武他, 平
成２年度ヒューマンサイエンス研究報告、第３分野 3-4
-1-A, 288-302 (1991)〕や、ＩＬ−６がＰＣ−１２細胞
の樹状突起の進展を促進すること〔鳥居邦夫, 代謝, 2
6,臨時増刊号, 脳代謝とその異常, 195-201 (1989)〕が
報告されている。

【０００３】一方、アルツハイマー病患者においては、
脳や髄液中のＣｈＡＴ活性の著しい低下が認められる
〔中村重信, 蛋白質核酸酵素, 36, 30-40 (1991)〕。即
ち、アルツハイマー型痴呆病のような中枢退行性疾患に
おいては、前脳基底部（中隔野、ブロッカー対角帯およ
びマイネルト基底核）のコリン作動性神経細胞の変性脱
落により、神経伝達物質であるアセチルコリンが生産さ
れず顕著な低下が惹起される。アセチルコリンの低下
が、アルツハイマー型痴呆病の記憶学習障害の原因と考
えられている〔Whiteahouse et al, Science, 215, 123
7-1239 (1982); Coyle et al, Science, 219, 1184-119
0 (1983)〕。実験的には、ラットの前脳基底部のコリン
作動性神経細胞を破壊するとアセチルコリン量の低下と
記憶障害が惹起されることが報告されている〔Helper e
t al, J Neurosci, 5, 866-873 (1985)〕。１９８０年
代に入って、海馬の長期増強と学習・記憶の相関が注目
され、細胞内カルシウムの上昇がカルモジュリン依存性
キナーゼないしＣキナーゼを介して長期増強を誘導す
ることによって脳を活性化すると考えられている〔中川
八郎, 代謝, 26, 臨時増刊号, 脳代謝とその異常, 37-4
4 (1989)〕。

【０００４】以上のことからコリン作動性神経細胞に作
用してＣｈＡＴ活性を上昇させる薬物（例えばＮＧＦ）
や神経細胞内カルシルム濃度を上昇させる物質は、アル
ツハイマー型痴呆症のような中枢退行性疾病に対して予
防・治療の作用を有すると考えられている。尚、近年、
高齢化に伴い急増する老人性疾患の中でも、とりわけ老
人性アルツハイマー型痴呆症は、有効な治療法がなく、
社会問題となり、その有効な治療薬の開発が切望されて
いる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経細胞に
作用し、ＣｈＡＴ活性を上昇させる薬剤をアルツハイマ
ー型記憶障害の予防、改善、治療に応用するものであ
る。すなわち、本発明の課題は、ＣｈＡＴ活性を上昇さ
せてアルツハイマー型記憶障害を予防、改善あるいは治
療する薬剤を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の技
術背景に立ち、サイトカインの中から赤血球造血因子で
あるＥＰＯに着目し、ヒト神経芽細胞株（コリン作動性
ニューロン由来）ＰＣ−１２細胞に対するＥＰＯの作用
を精査したところ、ＥＰＯがＰＣ−１２細胞に作用し、
細胞内Ｃａ²⁺濃度を上昇させ、細胞内ＣｈＡＴ活性を上
昇させる作用を有することを見出し、本発明を完成し
た。

【０００７】すなわち、本発明は、ＥＰＯ蛋白質を有効
成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・
改善・治療剤に関する。上記ＥＰＯ蛋白質は、ＥＰＯ活
性、即ち赤血球前駆細胞の分化・増殖作用を有する物質
であればいずれでもよい。このようなＥＰＯ蛋白質とし
ては、天然のヒト尿由来のＥＰＯ蛋白質でもよく、ま
た、遺伝子工学的手法によって製造したＥＰＯ蛋白質、
あるいは、ミュテインでもよい。ＥＰＯミュテインとし
ては、例えば、特開平３−１５１３９９号公報に記載し
たミュテインが挙げられる。上記ＥＰＯミューテインと
しては、もとの糖蛋白質のペプチド鎖のAsnがGln に変
異し、結合するＮ結合型糖鎖の結合数が変異したものが
ある。また他に、アミノ酸変異としては、特開平２−５
９５９９号公報、特開平３−７２８５５号公報記載のも
のが挙げられる。即ち、ＥＰＯの有するＥＰＯレセプタ
ーへの作用特性を失わない限り、アミノ酸の変異、欠
失、付加は何個でもよい。

【０００８】本発明のＥＰＯは貧血治療薬としてすでに
臨床に応用されており、特筆すべき副作用も報告されて
いない。このように、治療剤は低毒性であるので、安全
に使用することができる。ＥＰＯはＰＣ−１２細胞に作
用し細胞中のアセチルコリン含量を高める作用があるの
で脳の神経細胞に作用して、アセチルコリン量を上昇さ
せる作用があり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改
善・治療に用いることができる。あるいは、脳神経細胞
に作用して神経細胞内Ｃａ²⁺濃度を調節し長期増強を誘
導する。本治療剤は、公知の製剤学的製造法に準じ薬学
的に許容しうる液体に１万〜１０万単位で加え分散させ
て調製することができる。また、得られる溶液を凍結乾
燥し、用時生理食塩水に溶解して用いる用時溶解型とし
てもよい。さらに、安定化剤として公知の生物学的製剤
に使用される一般的薬剤、例えば、ヒト血清アルブミン
や糖を添加することにより安定に使用することができ
る。さらに、他の配合剤として、アミノ酸や、脂肪酸を
加えることもできる。

【０００９】本記憶障害の改善・治療剤は、投与の方法
として直接脳組織内に投与することにより、アルツハイ
マー型記憶障害の改善・治療を促進させることができ
る。投与部位としては脳内中隔野に直接注入することが
望ましい。また、投与量は障害の程度によって適宜変更
しうるが、成人の場合、一回あたり１０００〜１０００
００ＩＵ程度を投与する。

【００１０】次に実施例及び実験例を挙げて、本発明を
より具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施
例及び実験例に限定されるものではない。

【実施例１】アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造人尿由来ＥＰＯ６，０００，０００ＩＵヒト血清アルブミン２，５００ｍｇ注射用蒸留水にて全量を１ｌとする。この組成を１ｍｌ
ずつアンプルに充填し、滅菌を行い、ＥＰＯ６０００
ＩＵ注射液を作成した。

【００１１】

【実施例２】アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造遺伝子組換ＥＰＯ１２０，０００，０００ＩＵヒト血清アルブミン２，５００ｍｇ注射用蒸留水にて全量を１ｌとする。この組成液をミリ
ポアフィルターによりろ過し、滅菌バイアル瓶に１ｍｌ
づつ分注し、凍結乾燥後密封した。このバイアル瓶の内
容を１ｍｌの生理食塩水に溶解することにより、１２
０，０００ＩＵの注射液を作成した。

【００１２】

【実施例３】アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造遺伝子組換ＥＰＯ原液２．４４ｍｌ（２，１０
０，０００ＩＵ）２０％ヒト血清アルブミン７．７５ｍｌ注射用蒸留水１４４．８１ｍｌ全量を混合溶解後、ミリポアフィルターでろ過し、滅菌
バイアル瓶に０．５ｍｌづつ充填し、凍結乾燥後密封し
た。本バイアルは６，０００ＩＵに相当する。

【００１３】以下に本発明の治療剤を用いた実験例を示
す。

【実験例１】神経細胞由来ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプター測定レセプターアッセイ並びにレセプターの分子サイズの測
定はSasakiらの方法〔Eur. J. Biochem., 168, 43-48
(1987)〕に従い実施した。ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１７２１）１〜８×１０⁶細胞／１５０μｌ、
ＥＰＯ濃度０．５〜１０ｎＭとし、１５℃、２〜３時間
反応を行った。ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターのＥ
ＰＯに対する結合親和常数はＫｄ＝８ｎＭ、レセプター
数は細胞あたり約１０００個と算出された。また、ＳＤ
Ｓ電気泳動法によるＥＰＯレセプターの分子サイズは、
約６６ｋＤａと算出された。

【００１４】

【実験例２】ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターの特性実験例１と同様に、ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプター
に対するＥＰＯの親和性と、糖、キレート剤、サイトカ
イン類、ホルモンの結合阻害性を測定した。測定は¹²⁵
I-rHuEPOを用い、この特異的結合に対する阻害能を測定
した。特異的結合は、無添加時の¹²⁵I-EPOの結合阻害率
を１００とした相対率で表した。数値が小さいほど¹²⁵I
-EPOとＰＣ−１２細胞の結合阻害が大きい。すなわち添
加した物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力が強い。
このように測定したＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプター
の特性を表１〜表３に記載した。ＥＰＯレセプターは、
ヒトＥＰＯ、Ｎ結合型糖鎖結合部位を欠く変異ＥＰＯ並
びにマウスＥＰＯを認識した（表１）。表１に示したｒ
ＨｕＥＰＯとは遺伝子組換ＥＰＯであり、ｒＨｕＥＰＯ
（Ｎ−グリカナーゼ処理）は、遺伝子組換ＥＰＯを津田
らの方法(Tsuda et.al., J.Biochem, vol.188, 405-41
1, 1990)に従って調製したものであり、ＮＱ１２３は特
開平３−１５１３９９号公報に開示された方法に従い調
製したＮ結合型糖鎖を一分子当たり３本を欠くｒＨｕＥ
ＰＯミュテインである。また、他の各種サイトカイン
（表３）および糖（表２）は、ＥＰＯとレセプターの結
合に影響しなかった。即ち、ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレ
セプターは、ＥＰＯと特異的に結合した。

【００１５】

【表１】ＰＣ−１２細胞に対する各種ＥＰＯ結合の特異性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物添加量 ¹²⁵I-rHuEPOの（ng in 150μl) 特異的結合 (%) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 ── １００ｒＨｕＥＰＯ１５１６ｒＨｕＥＰＯ（N-ク゛リカナーセ゛処理）１５２９ＮＱ１２３（Ｎ結合型糖鎖結合部位を欠くrHuEPOミュテイン）１５２１ラットＥＰＯ１５２３ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊ｒＨｕＥＰＯ：遺伝子組換ヒトエリスロポエチン＊¹²⁵I-rHuEPOの特異的結合は、無添加時の¹²⁵I-EPOと
ＰＣ−１２細胞の結合量の相対値であらわした。数値が
小さいほど添加物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力
が強い。

【００１６】

【表２】ＰＣ−１２細胞とＥＰＯの結合に対する糖、キレート剤の影響 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物添加量 (mM) ¹²⁵I-rHuEPO の特異的結合 (%) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ なし ── １００ N-アセチルガラクトサミン１０１０５ガラクトース１０９５ EDTA ４０９８（エチレンジアミンテトラ酢酸塩） EGTA ４０９１（エチレングリコール・ビス・ベータ・アミノエチルエーテルN N N'N'-4酢酸塩） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊¹²⁵I-rHuEPOとＰＣ−１２細胞の特異的結合量を１０
０とした相対値で表した。数値が小さいほど結合阻害が
おおきい。すなわち添加物のＥＰＯレセプターへの結合
親和力が強い。

【００１７】

【表３】ＰＣ−１２細胞に対する各種サイトカイン、ホルモンの結合特異性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物添加量 ¹²⁵I-rHuEPO の (ng in 150μl) 特異的結合 (%) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 ─── １００ｒＨｕＥＰＯ１２５１６ヒト・ＩＬ−２５０１０２サル・ＩＬ−３５０１１７ヒト・ＩＬ−６２００９２マウス・Ｇ−ＣＳＦ５００９２ヒト・ＧＭ−ＣＳＦ５００８２ヒト・ＥＤＦ５００１００ヒト・ＴＮＦ５００９９ヒト・ＨＧＦ５００１０２マウス・ＮＧＦ５００９１ヒト・ＥＧＦ５００９７ヒト・インシュリン１０００１０２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊¹²⁵I-rHuEPOの特異的結合は、無添加時の¹²⁵I-rHuE
POとＰＣ−１２細胞の結合量の相対値で表した。数値が
小さいほど添加物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力
が強い。

【００１８】

【実験例３】rHuEPOのＰＣ−１２細胞内カルシウム濃度上昇活性の測
定細胞内カルシウム濃度の測定は、Grynkiewiez ら〕J.Bi
o. Chem., 260, 3440-3450 (1985)）方法に準じ、ＰＣ
−１２細胞５×１０⁶ｃｅｌｌ／ｍｌで行った。ＥＰＯ
２０単位／ｍｌのＰＣ−１２細胞内カルシウム濃度の
上昇は、ブラジキニン１０μＭ添加時の効果に匹敵
した。ＥＰＯ添加量と細胞内カルシウム濃度を表４に示
した。

【００１９】

【表４】ＰＣ−１２細胞カルシウムレベルに対するＥＰＯの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物添加量細胞内カルシウム濃度測定回数の相対増加率（%) （対 basal level) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＥＰＯ０．３単位／ｍｌ１４３±４０１２〃３〃１４９±４６１２〃１０〃１６０±４８１２〃２０〃１６９±４５７ＥＰＯ (20年単位／ml) 添加後EGTA(1mM) １２６± ９３を添加ブラジキニン１０μＭ１６９±４０１０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 以上の実験の結果、ＥＰＯは神経細胞の細胞内カルシウ
ム濃度を上げ、ＣｈＡＴ活性を上昇させることが確認さ
れた。

【００２０】

【発明の効果】本発明のＥＰＯ蛋白質を有効成分とする
製剤は、神経細胞に対し神経栄養因子として働き、アル
ツハイマー型記憶障害の予防、改善、治療作用を有する
もので、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療
剤として有利に用いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エリスロポエチン蛋白質を有効成分とし
て含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治
療剤。
【請求項２】エリスロポエチン蛋白質が遺伝子工学的
手法によって作製されたエリスロポエチンまたはエリス
ロポエチンミュテイン蛋白質である請求項１記載の予防
・改善・治療剤。
【請求項３】剤型が脳内中隔野直接注入剤である請求
項１または２に記載の予防・改善・治療剤。