JPH0597701A - 腎成長促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、黄体化ホルモン・サブユニットを
含むハイブリッド体を有効成分とする腎成長促進剤に関
するものである。 【効果】 腎機能の増強、活性化が図られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物系物質由来の腎成
長促進剤に関するものであり、更に詳細には本発明は、
黄体化ホルモン・サブユニットを含むハイブリッド体を
有効成分とする腎成長促進剤に関するものである。

【０００２】本発明においては、黄体化ホルモンと活性
の異なる他のホルモンとのハイブリッド体の中で、黄体
化ホルモンのアルファ−サブユニットあるいはベーター
サブユニットを含むハイブリッド体に腎成長促進活性の
あることを確認したもので、本発明の腎成長促進剤を投
与すれば、腎細胞が減少した腎臓や腎機能の低下した腎
臓を活性化し、腎細胞の増加、腎機能の増強を期待でき
るものであり、医薬界に貢献するところ大なるものがあ
る。

【０００３】

【従来の技術】本発明者らは先に下垂体を摘出したマウ
スにおいて、腎重量の減少が顕著であるところから、下
垂体に腎成長を司る何らかの因子が存在するのではない
かとの発想から、下垂体に存在する腎成長因子を求めて
鋭意研究したところ、下垂体から腎成長を促進するホル
モン様成分を分離し、これにＲＧＦ（又はレノトロピ
ン）と名づけたのである。（日本臨床第４４巻第１号
（昭和６１年１月号）別冊８４〜８８頁）

【０００４】そして、さらに、ここに得られたＲＧＦは
黄体化ホルモンアイソフォームの混合物であることが明
らかとなったのである。

【０００５】本発明者らは、ＲＧＦをより精製された物
質として収得するために更に研究を行い、先に黄体化ホ
ルモン・アイソフォーム混合物として得た分画を等電点
の差異によって分離精製したところ、意外にも有効成分
が単一バンドに単離されたアイソフォームの集合体とな
ることを見出したのである。（特開昭６３−２６４５３
０）

【０００６】従来、黄体化ホルモン（以下ＬＨと略す）
及び絨毛性性腺刺激ホルモン（以下ＣＧと略す）及び、
卵胞刺激ホルモン（以下ＦＳＨと略す）は、分子として
みると、アルファー（以下αと略す）サブユニットとベ
ーター（以下βと略す）サブユニットが１ヶづつ会合し
た二量体である。しかし、αサブユニット、βサブユニ
ットそれぞれに分子を構成しているアミノ酸鎖に長さの
長短、結合糖鎖の構成糖に差異が存在し、いわゆるマイ
クロヘテロジェネイティーがあるため、ＬＨ、ＣＧ及び
ＦＳＨは微細構造に差異がある分子種の集合体であるこ
とが知られている。

【０００７】本発明では、ＬＨ、ＣＧ及びＦＳＨの中
で、それぞれの微細構造の差異により分画されたＬＨ、
ＣＧ及びＦＳＨ分子種あるいは、分子種の集合体をアイ
ソフォームという。

【０００８】黄体化ホルモンはα及びβサブユニットの
２つのサブユニットから構成され、αサブユニットに２
ヶ所、βサブユニットに１ヶ所糖鎖が結合した糖蛋白質
ホルモンであることは公知である。同様にαとβの２つ
のサブユニット蛋白質が会合して成る類似の糖蛋白質ホ
ルモンとして、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、卵胞
刺激ホルモン（ＦＳＨ）が知られている。これらはその
生物学的活性からも性腺刺激ホルモンとして一つのファ
ミリーと考えられている物質である。

【０００９】一般に、これらのホルモンはαとβサブユ
ニット単独に分離した場合、その生物活性が消失するこ
と、そして再会合させると活性が復活することが知られ
ている。

【００１０】黄体化ホルモンの生物活性（ＬＨ活性）
は、ＬＨαとＣＧβ、ＦＳＨβを再会合させたハイブリ
ッド体では、復活されないが、ＬＨβとＣＧα、ＦＳＨ
αとのハイブリッド体では復活することが知られてい
る。たとえば、Ｔｈｏｍａｓらは豚、羊由来のＬＨとヒ
トＣＧ（以下ｈＣＧと略す）を用いて、αサブユニット
とβサブユニットを組合わせたハイブリッド体を作製
し、これらが同様にＬＨ活性を保持することを報告して
いる。（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０９，６，１
９３３−１９４２，１９８１）

【００１１】しかしながら、彼等はかようなハイブリッ
ド体に腎成長促進活性が存在することは全く報告してい
ない。

【００１２】また、これらのホルモンの一次構造分析の
結果から、ＬＨのαサブユニットのアミノ酸配列が、ｈ
ＣＧ、ＦＳＨのαサブユニットとほぼ等しいこと、及び
βサブユニットで異なることが判明するにいたり、ＬＨ
活性にＬＨのβサブユニットが直接関与していることが
推定されている。

【００１３】従来、ＬＨを含むハイブリッド体に腎成長
促進作用のあることは、全く知られていなかった。

【００１４】更にＣＧ、ＦＳＨには腎成長促進作用が無
い事も本発明者らは確認している。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
起源の安全性にすぐれた新しい腎成長促進剤、つまりバ
イオ系の腎成長促進剤を開発することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであるが、ＬＨを含むハイブ
リッド体は既知であってもその作用特に腎成長促進作用
については全く知られていないという当業界の技術レベ
ル、及び、他の性腺刺激ホルモン例えばＣＧ、ＦＳＨに
も腎成長促進作用が認められないという知見に敢えて挑
戦し、これら糖蛋白質ホルモンのハイブリッド体の中
で、ＬＨのαサブユニットあるいはβサブユニットを含
むように結合させたものに敢えて着目して各種検討の結
果、全く予期せざることに、ハイブリッド体に腎成長促
進作用を発現できることを見出し、この新知見を基礎と
して本発明が完成されたのである。

【００１７】すなわち本発明は、ＬＨ・サブユニットを
含むハイブリッド体を有効成分とすることを重要なポイ
ントとする腎成長促進剤に関するものである。

【００１８】本発明においては、ＬＨ・サブユニットと
会合させてハイブリッド体を調製するのであるが、会合
させる相手としては、ホルモン、リンホカインその他各
種生理活性物質、蛋白質が適宜使用される。ホルモンの
例としては、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨
毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）等の性腺刺激ホルモン及び
甲状腺刺激ホルモン（以下ＴＳＨと略す）が挙げられ
る。

【００１９】このように本発明によれば別の活性を有す
るホルモンや生理活性物質とのハイブリッドを製造する
ことが可能になるため、必要としない活性を消失させた
り、又、複数の活性を発現させたり、更に活性を増強さ
せたりする可能性を提供できるものである。

【００２０】本発明において、原料となるＬＨ、ＣＧ、
ＦＳＨ等を得るには、天然に存在する原料からの抽出法
や人工的な生産法を用いることができる。抽出法として
はマウス、ヒツジ、ブタなど哺乳動物の尿、血液あるい
は臓器より得られるホルモン抽出物が使用される。人工
的な生産法としては、哺乳動物のＬＨ、ＣＧあるいはＦ
ＳＨの二量体あるいはそれぞれのホルモンのサブユニッ
ト単量体を生産すべく設計した遺伝子を導入した細胞を
培養し、その培養系より抽出する。または、合成化学反
応系より得られる物にも適用できる。

【００２１】たとえば、ＬＨの例をいえば、臓器より得
る場合には、下垂体に硫安水溶液を加えてホモゲナイズ
し、遠心分離し、上澄液を精製し、凍結乾燥し、凍結乾
燥物を溶解して、ＳＰセファデックスクロマト、セファ
デックスＧ１００クロマト、ＣＭセルロースクロマト、
ｃｏｎＡクロマト、セファデックスＧ１００クロマト等
の精製処理を重ねて、ＬＨ粗精製物が得られる。

【００２２】既に公知の抽出法を用いて全く同様にＣ
Ｇ、ＦＳＨ等の抽出物を得ることができる。

【００２３】また、必要により、得られたＬＨ粗精製物
は、等電点の差異によって、分離・精製する処理等の常
法を行うことによって、腎成長促進活性を有する更に精
製された物質をいくつかの単一バンドとして収得するこ
とができる。

【００２４】かようにして得られたＬＨ粗精製物あるい
は精製物を構成成分であるαとβサブユニットに分離
し、ハイブリッド体調製に用いることができる。同様
に、ＣＧ、ＦＳＨ等を公知の方法にてサブユニットに分
離し、用いることができる。

【００２５】これらを会合してＬＨとのハイブリッドを
調製するには、ナトリウムアジド存在下バッファー中で
両者をインキューベートする等既知の会合方法を適宜利
用し、それぞれのホルモンのサブユニットからハイブリ
ッド体を調整することができる。

【００２６】また、人工的に直接ハイブリッド体を生産
する方法として、ＬＨとＣＧ、ＦＳＨのハイブリッド体
を生産すべく設計された遺伝子を導入した細胞を培養
し、その培養系により抽出する。

【００２７】次に本発明の実施例を示す。

【００２８】

【実施例１】

【００２９】

【（１）ヒツジ黄体化ホルモンの調製】

【００３０】羊脳下垂体粉末（Ｗａｉｔａｋｉ ＮＺ
Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｉｎｇ ＬＴＤ）１５０ｇを０．
１５Ｍ硫安水溶液１．５ｌに懸濁させ、フェニルメチル
スルフォニルフルオライドを１０ｍＭ加えたのち、冷却
しながらワーリング・ブレンダーにて２分間ホモゲナイ
ズした。ｐＨを４．０に調節したのち、冷却下に充分放
置したのち、遠心分離を行い、上澄液を集め、更に０．
５Ｍメタリン酸水溶液にてｐＨを３．０に調節したの
ち、遠心分離を行い、上澄液を集めた。上澄液のｐＨを
６．５〜７．０に調節したのち、０．５飽和になるまで
硫安を添加し、再び冷却下に充分放置した。遠心分離を
行い、沈殿を集め５０〜１００ｍｌの０．２Ｍリン酸二
カリウム溶液に懸濁させた。透析チューブへ移し、冷却
下で充分透析を行ったのち、内容液を採り出し、ｐＨを
再度８．５に１Ｎ水酸化ナトリウムにて調節し、凍結乾
燥した。

【００３１】得られた凍結乾燥粉末７ｇを、０．０１Ｍ
リン酸二ナトリウム溶液で溶解したのち、同緩衝液で平
衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）カラムにかけ、０．１Ｍリン酸二ナトリウム溶出画
分を集めた。該当画分を凍結乾燥した。

【００３２】この凍結乾燥粉末を少量の０．０５Ｍ炭酸
水素アンモニウム溶液に溶解したのち、同緩衝液を用い
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）カラムを用いて分子篩による分画を行った。約４万
前後の画分を集めたのち、凍結乾燥を行った。

【００３３】乾燥粉末を少量の１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解し
たのち、同緩衝液を用いたＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム
を用いて分画し、０．２Ｍメチルマンノシドにて溶出さ
れる画分を集めた。該当画分を冷却下にて充分に透析を
行ったのち、凍結乾燥を行い、ＬＨ粗精製物１７ｍｇを
得た。

【００３４】つづいて、該粗精製物を等電点による分画
精製を行った。ＬＫＢ等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ
Ｐｒｏｄｕｃｋｔｅｒ ＡＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅ
ｄｅｎ）（４４０ｍｌ容量）を用いた。キャリアーアン
ホライトとして、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ３．５〜１
０（ＬＫＢ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ９〜１１（Ｌ
ＫＢ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ７〜９（ＬＫＢ）を
用いた。５〜５０％のソルビトール密度勾配を作成し、
該粗精製物５ｍｇを２ｍｌのｄｅｎｓｅ ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎに溶解したのちカラム中央部に重層した。電極液と
して、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液及び０．０１Ｍ酢酸溶
液を用いた。４℃、６００Ｖから１４００Ｖで２４時間
の通電を行った。通電終了後分取用フラクションコレク
ターを用いて、５ｍｌづつ分取した。直ちに各画分のｐ
Ｈ（４℃）を測定した。（電気化学工業（株）製ＣＯＭ
−１１、電極タイプＣＥ １０５Ｃ、和光純薬工業
（株）製標準緩衝液）。同時に各画分の蛋白質の定量を
行った。それぞれの各画分をまとめて、ｐＩ＞９．８
５、ｐＩ９．８５〜９．６０、ｐＩ９．６０〜９．１
０、ｐＩ９．１０〜８．６０、ｐＩ８．６０〜７．３
０、ｐＩ＜７．３０の画分にまとめた。

【００３５】それぞれの画分を冷却下にて充分に透析を
行い、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ及びソルビトールを除去した
のち、凍結乾燥を行って粉末化した。

【００３６】本発明者らは既に、特開昭６３−２６４５
３０で記述している如く、これらのいづれの画分および
ＬＨ粗精製物にも腎成長促進作用があるか確認してい
る。

【００３７】

【（２）ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの精製】ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の精製は、Ｂｅｌｌ ｅ
ｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ８４，２９
８，（１９６９）に記載された方法に沿って行った。

【００３８】市販の粗精製ｈＣＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｏ
ｓｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）４ｇを０．０５Ｍ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）１リットルに溶解
し、同緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０
に吸着させたのち、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ５．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウムで溶出させ
た。主要ピークをなす画分を集め、透析したのち、凍結
乾燥した。得られた粉末５００ｍｇを０．０５Ｍ炭酸水
素アンモニウム溶液５０ｍｌに溶解したのち、同溶液で
平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１５０カラムに通じ、
主要ピーク画分を集め、透析後、凍結乾燥した。次に、
得られた粉末４００ｍｇを０．０２Ｍ炭酸水素アンモニ
ウム溶液７５ｍｌに溶解し、アンモニア水にてｐＨを
８．５に調節した。同溶液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ａ−５０カラムに添加し、０．０２Ｍか
ら０．４Ｍまでの濃度勾配を作成した炭酸水素アンモニ
ウム溶液（ｐＨ８．５）で溶出した。主要ピークをなす
画分を集め、透析後、凍結乾燥して、精製ｈＣＧ粉末を
得た。

【００３９】

【（３）α及びβサブユニットへの分離】ＬＨ（粗精製
物あるいはＬＨアイソフォーム）を高速液体クロマトグ
ラフィーによりαとβの両サブユニットへと分離・分画
した。

【００４０】逆相カラム（Ｂａｋｅｒ Ｂｏｎｄ ｗｉ
ｄｅ ｐｏｒｅ ｂｕｔｙｌ Ｃ４：Ｂａｋｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用し、０．１％
ＴＦＡ存在下、水−有機溶媒（アセトニトリル：イソプ
ロパノール、３：７）のリニアーグラジエント系（有機
溶媒１０％から６０％）にて分離した。相対的に早期に
溶出されるαサブユニットと遅れて溶出されるβサブユ
ニットに分画した。次いで両画分を減圧下に乾燥し粉末
とした。

【００４１】精製ｈＣＧも同様な操作によりαとβの両
サブユニットの分離・分画を行った。

【００４２】

【（４）ハイブリッド体の作製】ＬＨ粗精製物より得ら
れたサブユニットと精製ｈＣＧより得られたサブユニッ
トをそれぞれ同量づつ混合し、少量の０．５Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ６．５）、０．０１％ＮａＮ₃水溶液中にて、
３７℃、４８時間、インキュベーションし、再会合させ
た。つづいて可及的に会合していないサブユニット単量
体を除くため、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム
（東ソー（株））を使用した高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製し、透析後、凍結乾燥した。

【００４３】

【腎成長促進活性の測定】上述のいずれのハイブリッド
体が腎成長促進を有するか判定した。

【００４４】なお、腎成長促進効果は腎細胞のＤＮＡ合
成能の促進を指標とした。

【００４５】平均体重１００ｇ、同日出生日のＣＤラッ
ト（日本チャールズ・リバー株式会社）オスを下垂体摘
出手術及び去勢手術を施し９日間飼育した。手術が適切
に行なわれたラットを確認したのち、対照区も含めて５
匹以上のラットを一群としてそれぞれの実験区を設け
た。

【００４６】ハイブリッド体、それぞれ８５μｇを１５
０μｌ（５０ｍＭホウ酸、緩衝液ｐＨ７．５、０．１％
牛血清アルゴミン）に溶解し、ラットに皮下注射した。
８時間後、断頭し、脱血したのち、直ちに左及び右腎を
摘出し、被膜を剥離したのち、ｃｏｒｔｉｃｏｍｅｄｕ
ｌｌａｒｙ ａｘｉｓに沿ってスライスを各々２枚作成
した。２枚のスライスは２ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇ
ｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ７．５）中
にて、３７℃、２時間のインキュベーションを行った。
同緩衝液は予じめ９５％酸素、５％炭酸ガス混合ガスに
て通気を行い、且つ１，２−メチル３Ｈ−サイミジン
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ
ｓ．）を２μＣｉ／ｍｌ添加した。インキュベーション
終了後、４ｍＭサイミジン溶液にてスライスをリンスし
たのち、−２０℃にて保存した。

【００４７】保存されたスライスに蒸留水４ｍｌを加
え、ウルトラディスパーサ（ヤマト科学）を用い、ホモ
ゲナイズしたのち、Ｆｌｅｃｋ Ａ ａｎｄ Ｍｕｎｒ
ｏ ＨＮ（１９６２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ ５５，５７１）の方法に従ってＤＮＡの
抽出を行い、Ｗａｎｎｅｍａｃｈｅｒ ＪＲＷａｎｄＢ
ａｎｋｓ ＪＷＬ．Ｗｕｎｎｅｒ ＷＨ（１９６５，Ａ
ｎｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１：３２０）の方法に従
ってＤＮＡの加水分解を行い、ＢｕｒｔｏｎＫ（１９５
６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６２：３１５）の方法に従っ
て牛胸腺ＤＮＡ（ｔｙｐｅＩ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）を標準ＤＮＡとして、ＤＮＡ定量を行
った。又、同時に抽出ＤＮＡ０．５ｍｌ中のラジオアク
ティビティーを常法に従い、測定した。

【００４８】腎ＤＮＡのＤＮＡ合成能は、ラジオアクテ
ィビティー／ＤＮＡ量で計算し、対照区を１００％とし
た実験区の百分率で算出した。

【００４９】その結果、ＬＨα−ｈＣＧβ １２７％、
ｈＣＧα−ＬＨβ １３１％の増加が見られ、ｈＣＧα
−ｈＣＧβ及び各サブユニット単独には、ＤＮＡ合成促
進能は無かった（９５〜１０３％）。

【００５０】本発明の腎成長促進剤は、ＬＨサブユニッ
トを含むハイブリッド体を有効成分とし、必要あれば常
用される各種試薬を用いて常法にしたがって各種の剤型
に製剤し、経口又は非経口投与する。本発明に係るハイ
ブリッド体は天然由来であるので安全性がきわめて高
く、通常のホルモン剤の投与量に準じて投与すればよ
い。

【００５１】

【発明の効果】本発明に係る腎成長促進剤を投与すれ
ば、腎細胞が減少した腎臓や腎機能の低下した腎臓を活
性化し、腎細胞の増加、腎機能の増強を期待できる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 黄体化ホルモン・サブユニットを含むハ
   イブリッド体を有効成分とする腎成長促進剤。
2. 【請求項２】 黄体化ホルモン・アルファーサブユニッ
   トあるいは、ベータ・サブユニットを含む性腺刺激ホル
   モン・ハイブリッド体を有効成分とする腎成長促進剤。
3. 【請求項３】 性腺刺激ホルモンが絨毛性性腺刺激ホル
   モンである請求項２の腎成長促進剤。