JPH06102034B2 - タンパク質の生産方法 - Google Patents
タンパク質の生産方法Info
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- JPH06102034B2 JPH06102034B2 JP50161184A JP50161184A JPH06102034B2 JP H06102034 B2 JPH06102034 B2 JP H06102034B2 JP 50161184 A JP50161184 A JP 50161184A JP 50161184 A JP50161184 A JP 50161184A JP H06102034 B2 JPH06102034 B2 JP H06102034B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、組換えDNAバイオテクノロジーを使用したタ
ンパク質生産の技術分野に関する。より詳しく言うと、
本発明は、タンパク質のコードとなる遺伝子を含むベク
ターで形質転換された宿主生物により不溶性の形態で生
産されたタンパク質の復元方法に関する。
ンパク質生産の技術分野に関する。より詳しく言うと、
本発明は、タンパク質のコードとなる遺伝子を含むベク
ターで形質転換された宿主生物により不溶性の形態で生
産されたタンパク質の復元方法に関する。
背景技術 現在、異種の遺伝物質を発現することができる宿主生物
を培養することにより大量生産することができる、商業
的に価値のあるタンパク質の例が多数ある。タンパク質
が宿主生物により産生された場合、通常所望のタンパク
質を得るために宿主生物を或る方法で処理することが必
要である。幾つかのケースでは、例えば大腸菌中でのイ
ンターフェロンの産生のように、溶菌又は透過処理を行
うだけでも充分満足のゆく収量を提供することができ
る。しかし、幾つかのタンパク質は、溶菌又は透過処理
だけでは抽出され得ない不溶性のタンパク質集合体の形
態で宿主生物内に産生される。大腸菌中に産生されるヒ
トのインシュリンの融合タンパク質は、不溶性タンパク
質の集合体の形態を成しているということが報告されて
いる（D.C.ウィリアムズ他（1982）サイエンス215 687
〜689参照）。
を培養することにより大量生産することができる、商業
的に価値のあるタンパク質の例が多数ある。タンパク質
が宿主生物により産生された場合、通常所望のタンパク
質を得るために宿主生物を或る方法で処理することが必
要である。幾つかのケースでは、例えば大腸菌中でのイ
ンターフェロンの産生のように、溶菌又は透過処理を行
うだけでも充分満足のゆく収量を提供することができ
る。しかし、幾つかのタンパク質は、溶菌又は透過処理
だけでは抽出され得ない不溶性のタンパク質集合体の形
態で宿主生物内に産生される。大腸菌中に産生されるヒ
トのインシュリンの融合タンパク質は、不溶性タンパク
質の集合体の形態を成しているということが報告されて
いる（D.C.ウィリアムズ他（1982）サイエンス215 687
〜689参照）。
タンパク質は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸
の鎖として存在している。タンパク質の正常で生物学的
に活性な形態（以後、自然的形態と呼ぶ）では、この鎖
は熱力学的に好ましい三次元構造に折り畳まれており、
この配座は、水素結合、疎水相互作用、電荷相互作用の
ような比較的弱い原子間力によって保持されている。イ
オウ原子間の共有結合は、インシュリンのような多数の
サブユニットより成るタンパク質の異なるポリペプチド
鎖間における分子間のジスルフィド架橋のように、ポリ
プペチド鎖中で分子内のジスルフィド架橋を形成するこ
とができる。幾つかの例で産生される不溶性のタンパク
質は、それらの自然のものが有する機能的活性を示さ
ず、このため一般的には商業的生産物としては殆ど利用
価値のないものである。機能的活性の欠如は、多くの要
因に帰せられるであろうが、形質転換された宿主生物に
より生産されたタンパク質は、それらの自然的形態のも
のとは異なる配座で形成されているということが言えよ
う。また、これらのタンパク質は、分子内のジスルフィ
ド結合に加えて、自然のタンパク質の機能的活性には必
要でない不要の分子間ジスルフィド結合も持っているの
かも知れない。このようなタンパク質の変更された三次
元構造は、不溶性に結びつくだけではなく、タンパク質
の生物学的活性を減少させたり、亡くしたりさせてい
る。所定の宿主生物により発現された所定のタンパク質
が可溶性となるか、又は不溶性となるかを予言すること
はできない。
の鎖として存在している。タンパク質の正常で生物学的
に活性な形態（以後、自然的形態と呼ぶ）では、この鎖
は熱力学的に好ましい三次元構造に折り畳まれており、
この配座は、水素結合、疎水相互作用、電荷相互作用の
ような比較的弱い原子間力によって保持されている。イ
オウ原子間の共有結合は、インシュリンのような多数の
サブユニットより成るタンパク質の異なるポリペプチド
鎖間における分子間のジスルフィド架橋のように、ポリ
プペチド鎖中で分子内のジスルフィド架橋を形成するこ
とができる。幾つかの例で産生される不溶性のタンパク
質は、それらの自然のものが有する機能的活性を示さ
ず、このため一般的には商業的生産物としては殆ど利用
価値のないものである。機能的活性の欠如は、多くの要
因に帰せられるであろうが、形質転換された宿主生物に
より生産されたタンパク質は、それらの自然的形態のも
のとは異なる配座で形成されているということが言えよ
う。また、これらのタンパク質は、分子内のジスルフィ
ド結合に加えて、自然のタンパク質の機能的活性には必
要でない不要の分子間ジスルフィド結合も持っているの
かも知れない。このようなタンパク質の変更された三次
元構造は、不溶性に結びつくだけではなく、タンパク質
の生物学的活性を減少させたり、亡くしたりさせてい
る。所定の宿主生物により発現された所定のタンパク質
が可溶性となるか、又は不溶性となるかを予言すること
はできない。
本出願人の同時係属中の英国特許出願GB2100737Aにおい
て、本出願人はタンパク質分解酵素であるキモシンの生
産方法について述べた。この方法には、関連するタンパ
ク質のコードとなる遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れた宿主生物により産生されたキモシン前駆体タンパク
質の切断が含まれている。本発明者達は、研究中にキモ
シン前駆体タンパク質はそれらの自然的形態で産生され
るのではなく、不溶性の集合体として産生されるという
ことを見出した。切断された後活性な自然のキモシンと
なる自然的形態のキモシン前駆体を生産するため、タン
パク質の精製と切断に関する標準的技術を使用する前
に、宿主生物により生産されたタンパク質を可溶化させ
てそれらの自然的形態に転換させた。
て、本出願人はタンパク質分解酵素であるキモシンの生
産方法について述べた。この方法には、関連するタンパ
ク質のコードとなる遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れた宿主生物により産生されたキモシン前駆体タンパク
質の切断が含まれている。本発明者達は、研究中にキモ
シン前駆体タンパク質はそれらの自然的形態で産生され
るのではなく、不溶性の集合体として産生されるという
ことを見出した。切断された後活性な自然のキモシンと
なる自然的形態のキモシン前駆体を生産するため、タン
パク質の精製と切断に関する標準的技術を使用する前
に、宿主生物により生産されたタンパク質を可溶化させ
てそれらの自然的形態に転換させた。
本出願人の同時係属している国際公開された国際特許出
願W083/04418において、キモシン前駆体タンパク質の可
溶化のために使用した方法が記載されている。通常上述
した方法では、タンパク質を変性させた後変性剤を取り
除き、これによりタンパク質を復元させている。１例で
使用した変性剤は、尿素、グアニジンハイドロクロライ
ドのような化合物である。不溶性の前駆体を尿素又はグ
アニジンハイドロクロライドで処理すると、この前駆体
は可溶化する。変性済を例えば透析により取り除くと、
タンパク質がキモシン前駆体の場合、タンパク質は活性
のキモシンに変わり得る、熱力学的に安定な配座に戻
る。
願W083/04418において、キモシン前駆体タンパク質の可
溶化のために使用した方法が記載されている。通常上述
した方法では、タンパク質を変性させた後変性剤を取り
除き、これによりタンパク質を復元させている。１例で
使用した変性剤は、尿素、グアニジンハイドロクロライ
ドのような化合物である。不溶性の前駆体を尿素又はグ
アニジンハイドロクロライドで処理すると、この前駆体
は可溶化する。変性済を例えば透析により取り除くと、
タンパク質がキモシン前駆体の場合、タンパク質は活性
のキモシンに変わり得る、熱力学的に安定な配座に戻
る。
可溶化したタンパク質は、遠心分離又は濾過により不溶
性の細胞片から分離することができる。然るべく形質転
換された宿主生物からのタンパク質の生産は潜在的に大
きな商業的価値を有するものである。関係する操作は、
研究質的規模から工業的規模に拡大することができるタ
イプのものである。しかしながら、生産されたタンパク
質が不溶性の集合体として生成された場合には、操作に
おける潜在的な複雑さが実施可能なレベルを超える程生
産費を増大させる可能性がある。上述した可溶化の技術
は、このようなタンパク質の可溶化には有効であるが、
比較的高価であり、かなりの生産費となることを意味す
る。
性の細胞片から分離することができる。然るべく形質転
換された宿主生物からのタンパク質の生産は潜在的に大
きな商業的価値を有するものである。関係する操作は、
研究質的規模から工業的規模に拡大することができるタ
イプのものである。しかしながら、生産されたタンパク
質が不溶性の集合体として生成された場合には、操作に
おける潜在的な複雑さが実施可能なレベルを超える程生
産費を増大させる可能性がある。上述した可溶化の技術
は、このようなタンパク質の可溶化には有効であるが、
比較的高価であり、かなりの生産費となることを意味す
る。
本発明者達は、一般的な態様では比較的高価な試薬を必
要としない、広く応用可能な可溶化方法を見出した。
要としない、広く応用可能な可溶化方法を見出した。
発明の開示 本発明に基づき、可溶性で自然のタンパク質の生産方法
を提供する。この生産方法では、不溶性の形態のタンパ
ク質を、タンパク質のコードとなる遺伝子を含むベクタ
ーで形質変換された宿主生物により生産する。そして、
不溶性の形態のタンパク質を、タンパク質の配座を保持
するのに関与する一つ又は二つ以上のグループのタンパ
ク質の解離を促進するように選定したpHのアルカリ性水
溶液中で変性させ、次にこのタンパク質を、タンパク質
の変性された状態を維持するのに必要なpH以下に溶液の
pHを下げることにより再変性させて、可溶性で自然の形
態のタンパク質を生産する。
を提供する。この生産方法では、不溶性の形態のタンパ
ク質を、タンパク質のコードとなる遺伝子を含むベクタ
ーで形質変換された宿主生物により生産する。そして、
不溶性の形態のタンパク質を、タンパク質の配座を保持
するのに関与する一つ又は二つ以上のグループのタンパ
ク質の解離を促進するように選定したpHのアルカリ性水
溶液中で変性させ、次にこのタンパク質を、タンパク質
の変性された状態を維持するのに必要なpH以下に溶液の
pHを下げることにより再変性させて、可溶性で自然の形
態のタンパク質を生産する。
不溶性のタンパク質を変性させるためにアルカリ性水溶
液を使用することにより、操作の試薬コストが減少す
る。このアルカリ性水溶液のpHは、操作を適用するタン
パク質に応じて選択する。特に、このpHは、分子内の結
合又は力により若しくはタンパク質集合体の場合には多
分非機能的な分子間の結合又は力により、タンパク質を
自然でない配座に保持させている複数のグループが、pH
が下がったとき、タンパク質が自然の配座に再び折り畳
まれるように解離するpHに選ぶ。タンパク質を自然でな
い配座に保持させているグループは、イオン化可能なグ
ループであり得るが、この場合にはpHは、関連するイオ
ン化可能なグループのpKaに合うように選ぶことが好ま
しい。
液を使用することにより、操作の試薬コストが減少す
る。このアルカリ性水溶液のpHは、操作を適用するタン
パク質に応じて選択する。特に、このpHは、分子内の結
合又は力により若しくはタンパク質集合体の場合には多
分非機能的な分子間の結合又は力により、タンパク質を
自然でない配座に保持させている複数のグループが、pH
が下がったとき、タンパク質が自然の配座に再び折り畳
まれるように解離するpHに選ぶ。タンパク質を自然でな
い配座に保持させているグループは、イオン化可能なグ
ループであり得るが、この場合にはpHは、関連するイオ
ン化可能なグループのpKaに合うように選ぶことが好ま
しい。
我々の研究室の研究により、分子間のジスルフィド結合
が、大腸菌（E.coli）により産生されたプロキモシンの
集合体中に存在することが明らかになった（シャーメイ
カー他（1984）PNASに提出）。自然のプロキモシンはモ
ノマーであり、３つの分子内ジスルフィド結合を有して
いる（フォルトマン他（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.74 2321〜2324頁）。従って、１分子当り６個のチ
オール基がタンパク質集合体中の分子間及び分子内結合
を形成するのに寄与していることになる。このため、変
性及び復元させてうまくプロキモシンを可溶化させるた
めには、ジスルフィド結合を壊して適当に再形成させる
必要がある。これは、pH10.7（±0.5）のアルアリ性水
溶液を使用することにより実現可能である。システイン
の遊離のチオール基は、pKa値が10.46である。
が、大腸菌（E.coli）により産生されたプロキモシンの
集合体中に存在することが明らかになった（シャーメイ
カー他（1984）PNASに提出）。自然のプロキモシンはモ
ノマーであり、３つの分子内ジスルフィド結合を有して
いる（フォルトマン他（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.74 2321〜2324頁）。従って、１分子当り６個のチ
オール基がタンパク質集合体中の分子間及び分子内結合
を形成するのに寄与していることになる。このため、変
性及び復元させてうまくプロキモシンを可溶化させるた
めには、ジスルフィド結合を壊して適当に再形成させる
必要がある。これは、pH10.7（±0.5）のアルアリ性水
溶液を使用することにより実現可能である。システイン
の遊離のチオール基は、pKa値が10.46である。
ここで使用する“不溶性”という用語は、実質的に中性
の状態（例えば、5.5から8.5の範囲のpH）では、実質的
に不溶性の形態か、宿主生物細胞の溶解で出来た不溶性
物質との不溶化した結合状態の形態にあることを意味す
る。不溶性産物は、宿主生物の細胞中に不溶性で比較的
高い分子量を持つ集合体の形態で産生されるか、又は単
に不溶性の細胞膜物質と結びついているだけである。こ
の操作には、溶解したタンパク質の不溶性の細胞片から
の分離が含まれている。
の状態（例えば、5.5から8.5の範囲のpH）では、実質的
に不溶性の形態か、宿主生物細胞の溶解で出来た不溶性
物質との不溶化した結合状態の形態にあることを意味す
る。不溶性産物は、宿主生物の細胞中に不溶性で比較的
高い分子量を持つ集合体の形態で産生されるか、又は単
に不溶性の細胞膜物質と結びついているだけである。こ
の操作には、溶解したタンパク質の不溶性の細胞片から
の分離が含まれている。
本操作では適当なアルカリであれば何でも使用すること
ができ、例えばNaOH又はKOHのようなアルカリ金属の水
酸化物の水溶液、緩衝液、トリエチルアミンのような有
機塩基の水溶液を使用することができる。
ができ、例えばNaOH又はKOHのようなアルカリ金属の水
酸化物の水溶液、緩衝液、トリエチルアミンのような有
機塩基の水溶液を使用することができる。
アルカリ性水溶液のpHは、９から11.5とするのが好まし
く、より好ましくは10から11までの間である。
く、より好ましくは10から11までの間である。
不溶性のタンパク質をアルカリ性水溶液で処理しても、
常にタンパク質が完全に可溶化されるというわけではな
い。不溶性の物質は常に存在するのであるから、多くの
物質移動効果は重要になる。大きな抽出容量で行った場
合であっても、アルアリで１回抽出するより複数回抽出
した方がより効果的であることがわかった。このことは
また、可溶化したタンパク質がアルカリと接触している
時間を最小にするという利点も有している。従って、変
性したタンパク質に１回又は２回以上抽出操作を施すこ
とが好ましい。
常にタンパク質が完全に可溶化されるというわけではな
い。不溶性の物質は常に存在するのであるから、多くの
物質移動効果は重要になる。大きな抽出容量で行った場
合であっても、アルアリで１回抽出するより複数回抽出
した方がより効果的であることがわかった。このことは
また、可溶化したタンパク質がアルカリと接触している
時間を最小にするという利点も有している。従って、変
性したタンパク質に１回又は２回以上抽出操作を施すこ
とが好ましい。
公開された英国特許出願GB2100737Aと国際公開された国
際特許出願W0 83/04418に記載されている、グアニジン
ハイドロクロライド又は尿素のような強い変性剤中で可
溶化させる方法及び本発明の一般的態様に基づきアルカ
リを使用して可溶化させる方法では、それぞれ宿主生物
からの抽出物に存在する不溶性タンパク質のかなりの割
合を可溶化する。しかしながら、自然のタンパク質の復
元という点からは、どちらの方法も完全な量的対応性を
持っているというわけではない。この理由ははっきりわ
かっているわけではないが、多分この２種類の可溶化現
象について異なるものである。グアニジンハイドロクロ
ライドは存在する全ての物質を可溶化するが、一部分だ
けがグアニシンハイドロクロライドを取り除いた後、自
然のタンパク質に変えられるようである。アルカリ処理
は、完全な復元を生じさせて自然的形態のタンパク質を
形成させることはできず、また全ての不溶性の形態のタ
ンパク質を可溶化させるわけではない。本発明者達は、
これらの２つの方法を組合せることにより大幅に増大し
た収量の自然のタンパク質が得られることを見出した。
際特許出願W0 83/04418に記載されている、グアニジン
ハイドロクロライド又は尿素のような強い変性剤中で可
溶化させる方法及び本発明の一般的態様に基づきアルカ
リを使用して可溶化させる方法では、それぞれ宿主生物
からの抽出物に存在する不溶性タンパク質のかなりの割
合を可溶化する。しかしながら、自然のタンパク質の復
元という点からは、どちらの方法も完全な量的対応性を
持っているというわけではない。この理由ははっきりわ
かっているわけではないが、多分この２種類の可溶化現
象について異なるものである。グアニジンハイドロクロ
ライドは存在する全ての物質を可溶化するが、一部分だ
けがグアニシンハイドロクロライドを取り除いた後、自
然のタンパク質に変えられるようである。アルカリ処理
は、完全な復元を生じさせて自然的形態のタンパク質を
形成させることはできず、また全ての不溶性の形態のタ
ンパク質を可溶化させるわけではない。本発明者達は、
これらの２つの方法を組合せることにより大幅に増大し
た収量の自然のタンパク質が得られることを見出した。
本発明の好適な態様に基づき、先ず、不溶性の形態のタ
ンパク質を水溶液中で変性させ、次に、得られた溶液を
タンパク質の配座を保持するのに関与する一つ又は二つ
以上のグループのタンパク質の解離を促進するように選
定したpHのアルカリ性水溶液中で希釈し、そしてタンパ
ク質を変性された状態に維持するのに必要なpH以下に溶
液のpHを下げることにより、タンパク質を再変性させ
て、可溶性で自然の形態のタンパク質を生産する。
ンパク質を水溶液中で変性させ、次に、得られた溶液を
タンパク質の配座を保持するのに関与する一つ又は二つ
以上のグループのタンパク質の解離を促進するように選
定したpHのアルカリ性水溶液中で希釈し、そしてタンパ
ク質を変性された状態に維持するのに必要なpH以下に溶
液のpHを下げることにより、タンパク質を再変性させ
て、可溶性で自然の形態のタンパク質を生産する。
希釈は、例えばアルカリ性の変性溶液の中和による再変
性が生じる前に、変性した分子間に物理的な分離を引き
起こしている。希釈して変性した分子に物理的な分離を
生じさせることは、自然的形態への再変性に役立ってい
るようである。メチオニン−プロキモシンの場合、直ぐ
上に述べた可溶化操作は、例えば、やはり上述した多数
回のアルカリ抽出の10から20％と比較して、30％以上の
回収率に達するものである。
性が生じる前に、変性した分子間に物理的な分離を引き
起こしている。希釈して変性した分子に物理的な分離を
生じさせることは、自然的形態への再変性に役立ってい
るようである。メチオニン−プロキモシンの場合、直ぐ
上に述べた可溶化操作は、例えば、やはり上述した多数
回のアルカリ抽出の10から20％と比較して、30％以上の
回収率に達するものである。
アルカリ性水溶液のpHは９から11.5が好ましく、より好
ましくは10から11の間である。
ましくは10から11の間である。
希釈率は、10倍から50倍が好ましい（即ち、全容量を10
から50容量に希釈することである。）。
から50容量に希釈することである。）。
上述の組合せた可溶化操作において、不溶性のタンパク
質は、少なくとも7Mの濃度の尿素より成る水溶液中又は
少なくとも6Mの濃度のグアニジンハイドロクロライドよ
り成る溶液中で変性させるのが好ましい。
質は、少なくとも7Mの濃度の尿素より成る水溶液中又は
少なくとも6Mの濃度のグアニジンハイドロクロライドよ
り成る溶液中で変性させるのが好ましい。
不溶性のタンパク質は、宿主生物により産生された組換
え型の動物タンパク質とすることができる。このような
タンパク質の例は、免疫グロブリンのＬ鎖とＨ鎖のポリ
ペプチド、口蹄疫抗原、チモシンとインシュリンのタン
パク質である。
え型の動物タンパク質とすることができる。このような
タンパク質の例は、免疫グロブリンのＬ鎖とＨ鎖のポリ
ペプチド、口蹄疫抗原、チモシンとインシュリンのタン
パク質である。
この宿主生物は、自然に生じた生物又は不溶性のタンパ
ク質を産生することができる突然変異した生物とするこ
とができる。宿主生物は、宿主生物に対して異種であ
り、不溶性の形態で産生されるタンパク質の産生のコー
ドとなる異種のDNA配列による組換えDNA技術を使用して
形質転換した生物又は生物の子孫が好ましい。宿主生物
は、酵母又は動物又は植物の細胞のような真核生物とす
ることができる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces Cerevisiae）とクルイベロミセス（Kl
uyveromyces）とするのが好ましい。代わりとして、宿
主生物は、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、
B.ステアロサーモフィリス（B.stearothermophilis）又
はシュードモナス（P.seudomonas）のような細菌とする
ことができる。特定の宿主生物系の例としては、大腸菌
HB101（E.coli HB101）、大腸菌X1776（E.coli X177
6）、大腸菌X2882（E.coli X2882）、大腸菌PS410（E.c
oli PS410）、大腸菌PV308（E.coli PV308）、大腸菌MR
C1（E.coli MRC1）がある。
ク質を産生することができる突然変異した生物とするこ
とができる。宿主生物は、宿主生物に対して異種であ
り、不溶性の形態で産生されるタンパク質の産生のコー
ドとなる異種のDNA配列による組換えDNA技術を使用して
形質転換した生物又は生物の子孫が好ましい。宿主生物
は、酵母又は動物又は植物の細胞のような真核生物とす
ることができる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces Cerevisiae）とクルイベロミセス（Kl
uyveromyces）とするのが好ましい。代わりとして、宿
主生物は、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、
B.ステアロサーモフィリス（B.stearothermophilis）又
はシュードモナス（P.seudomonas）のような細菌とする
ことができる。特定の宿主生物系の例としては、大腸菌
HB101（E.coli HB101）、大腸菌X1776（E.coli X177
6）、大腸菌X2882（E.coli X2882）、大腸菌PS410（E.c
oli PS410）、大腸菌PV308（E.coli PV308）、大腸菌MR
C1（E.coli MRC1）がある。
宿主生物は、colE1,pCR1,pBR322,RP4,ファージλDNA又
はこれらの誘導体のようなプラスミドを含んだ適当なベ
クター分子で形質転換することができる。
はこれらの誘導体のようなプラスミドを含んだ適当なベ
クター分子で形質転換することができる。
本発明に係る操作で処理する前に、宿主細胞に生産物の
回収を容易にするため、適当な溶解処理又は透過処理を
施しておくことができる。例えば、宿主生物をリソゾー
ムのような酵素で処理したり、細胞を破壊するための機
械的細胞破壊装置で処理しておくことができる。
回収を容易にするため、適当な溶解処理又は透過処理を
施しておくことができる。例えば、宿主生物をリソゾー
ムのような酵素で処理したり、細胞を破壊するための機
械的細胞破壊装置で処理しておくことができる。
次に、本発明の操作では、不溶性の生産物を可溶化し、
そして得られた溶液を不溶性の細胞膜断片のような固形
細胞物質から分離する。濾過又は遠心分離を含む適当な
方法を用いて、固形細胞物質から可溶化したタンパク質
を含む溶液を分離することができる。
そして得られた溶液を不溶性の細胞膜断片のような固形
細胞物質から分離する。濾過又は遠心分離を含む適当な
方法を用いて、固形細胞物質から可溶化したタンパク質
を含む溶液を分離することができる。
本発明を、下記の実施例に基づき詳細に説明する。
実施例１ ベクターpMP3で形質転換した大腸菌細胞により産生され
た不溶性の免疫グロブリンＬ鎖のポリペプチドの可溶化
を、アルアリ変性を用いて行うという実験を実施した。
形質転換した大腸菌細胞系の調製法は、同時係属してい
る同日の国際特許出願No.PCT/GB84/に説明されている。
４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル アセチル（NP）
が結合しているモノクローナル抗体S43のλ1Ｌ鎖のコー
ドとなる遺伝子を含むプラスミドpMP3で形質転換した大
腸菌細胞を誘導条件の下で成長させた。細胞を回収し、
この細胞を130μg/mlのリソチームを含む0.05MトリスpH
8.0,0.233M NaCl,5％（V/V）グリセリン溶液中で再懸濁
させた後、４℃又は室温で20分間培養した。次に、デオ
キシコール酸ナトリウムを最終濃度が0.05％になるまで
添加した後、大腸菌の湿重量1g当り10μｇの（ウシの膵
臓からの）DNAアーゼ１を添加した。次に、この溶液を1
5℃で30分間培養し、この時間で溶液の粘度は著しく減
少した。次に、得られた混合物を遠心分離した（遠心分
離は、10000×ｇで、小容量（1ml）の場合、15分間、こ
れ以上の容量の場合、１時間で行う）。免疫沈降反応に
よる研究結果は、λＬ鎖のタンパク質は、可溶性分画よ
りは不溶性分画の方に存在していることを示していた。
た不溶性の免疫グロブリンＬ鎖のポリペプチドの可溶化
を、アルアリ変性を用いて行うという実験を実施した。
形質転換した大腸菌細胞系の調製法は、同時係属してい
る同日の国際特許出願No.PCT/GB84/に説明されている。
４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル アセチル（NP）
が結合しているモノクローナル抗体S43のλ1Ｌ鎖のコー
ドとなる遺伝子を含むプラスミドpMP3で形質転換した大
腸菌細胞を誘導条件の下で成長させた。細胞を回収し、
この細胞を130μg/mlのリソチームを含む0.05MトリスpH
8.0,0.233M NaCl,5％（V/V）グリセリン溶液中で再懸濁
させた後、４℃又は室温で20分間培養した。次に、デオ
キシコール酸ナトリウムを最終濃度が0.05％になるまで
添加した後、大腸菌の湿重量1g当り10μｇの（ウシの膵
臓からの）DNAアーゼ１を添加した。次に、この溶液を1
5℃で30分間培養し、この時間で溶液の粘度は著しく減
少した。次に、得られた混合物を遠心分離した（遠心分
離は、10000×ｇで、小容量（1ml）の場合、15分間、こ
れ以上の容量の場合、１時間で行う）。免疫沈降反応に
よる研究結果は、λＬ鎖のタンパク質は、可溶性分画よ
りは不溶性分画の方に存在していることを示していた。
組換えＬ鎖を精製するため、上述したように得られた大
腸菌のペレット分画を50mM K2HPO4,0.1M NaCl,1mM EDTA
より成るpH11.5の緩衝液中で再懸濁させた。この懸濁液
を少なくとも１時間（から16時間まで）放置し、上述し
たように遠心分離した後、上清のpHを濃塩酸の添加によ
り8.0に調整した。最初ペレット中に存在していたかな
りの割合のλＬ鎖タンパク質が上清中に見出され、これ
は可溶性の形態であった。
腸菌のペレット分画を50mM K2HPO4,0.1M NaCl,1mM EDTA
より成るpH11.5の緩衝液中で再懸濁させた。この懸濁液
を少なくとも１時間（から16時間まで）放置し、上述し
たように遠心分離した後、上清のpHを濃塩酸の添加によ
り8.0に調整した。最初ペレット中に存在していたかな
りの割合のλＬ鎖タンパク質が上清中に見出され、これ
は可溶性の形態であった。
実施例２ 大腸菌中に一緒に産生された不溶性の免疫グロブリンＨ
鎖とＬ鎖の可溶化を、尿素で変性した後アルカリ中に希
釈するという方法を用いて行うという実験を実施した。
形質転換した細胞系の調整法は、同時係属中で同日出願
の国際特許出願No.PCT/GB 84に記載されている。
鎖とＬ鎖の可溶化を、尿素で変性した後アルカリ中に希
釈するという方法を用いて行うという実験を実施した。
形質転換した細胞系の調整法は、同時係属中で同日出願
の国際特許出願No.PCT/GB 84に記載されている。
免疫グロブリンの両Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子を発現する大腸
菌細胞から機能的抗体を産生させるため、細胞を溶解
し、不溶性物質を洗った後、超音波処理を施した（３分
間に３回）。次に、この物質を9M 尿素、50mM グリシ
ン−Na+ pH10.8,1mM EDTA,20mM2−メルカプトエタノー
ル溶液中で溶解した。この抽出物を、20容量の100mM HC
l,50mM グリシン−Na+ pH10.8,5％ グリセリン、0.5m
M EDTA,0.5mM還元形グルタチオン、0.1mM酸化形グルタ
チオン溶液に対して３回、40時間かけて透析を行った。
透析物を30000Xgで15分間遠心分離して澄ませた後、直
ぐにDEAEセファセルに詰め、10mM トリス−HCl,0.5mM
EDTA pH8.0溶液中にKClが０から0.5Mまで直線的な濃度
勾配となるように含まれた溶液を用いて展開を行った。
菌細胞から機能的抗体を産生させるため、細胞を溶解
し、不溶性物質を洗った後、超音波処理を施した（３分
間に３回）。次に、この物質を9M 尿素、50mM グリシ
ン−Na+ pH10.8,1mM EDTA,20mM2−メルカプトエタノー
ル溶液中で溶解した。この抽出物を、20容量の100mM HC
l,50mM グリシン−Na+ pH10.8,5％ グリセリン、0.5m
M EDTA,0.5mM還元形グルタチオン、0.1mM酸化形グルタ
チオン溶液に対して３回、40時間かけて透析を行った。
透析物を30000Xgで15分間遠心分離して澄ませた後、直
ぐにDEAEセファセルに詰め、10mM トリス−HCl,0.5mM
EDTA pH8.0溶液中にKClが０から0.5Mまで直線的な濃度
勾配となるように含まれた溶液を用いて展開を行った。
フロントページの続き (72)発明者 アンガル，サロジヤニイ イギリス国，アールジー２ ７イーキユー バークシヤー，リーデイング，ウツドレ ー，リンデン ロード 30 (72)発明者 シヤーメイカー，ジヨイス アン イギリス国，ダブリユー４ １イーエヌ ロンドン チジツク，フエアフアクス ロ ード 16 (56)参考文献 特表 昭59−500996（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】キモシン先駆物質を除くタンパク質のコー
ドとなる遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主生物
により、キモシン先駆物質を除く不溶性の形態のタンパ
ク質を産生させ、 この不溶性のタンパク質を、該タンパク質の配座を保持
するのに関与している１つ又は２つ以上のグループのタ
ンパク質の解離を促進させるように選ばれたpHのアルカ
リ性水溶液中で変性させ、 続いてこのタンパク質を、該タンパク質の変性された状
態を維持するのに必要なpH以下に上記溶液のpHを下げる
ことにより、可溶性で自然のタンパク質に再変性させる
ことを特徴とするタンパク質の生産方法。 - 【請求項２】上記アルカリ性水溶液のpHは９から11.5で
ある請求の範囲第１項記載の生産方法。 - 【請求項３】上記不溶性の形態のタンパク質は、アルカ
リ性水溶液に不溶性である、宿主生物に由来する断片と
結合して存在しており、変性させたタンパク質の抽出を
１回以上行う請求の範囲第１項又は第２項記載の生産方
法。 - 【請求項４】キモシン先駆物質を除くタンパク質のコー
ドとなる遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主生物
により、キモシン先駆物質を除く不溶性の形態のタンパ
ク質を産生させる可溶性で自然のタンパク質の生産方法
であって、 先ず上記不溶性の形態のタンパク質をグアニジンハイド
ロクロライド又は尿素の水溶液中で変性させ、 続いて生成した溶液を、上記タンパク質の配座を保持す
るのに関与している１つ又は２つ以上のグループのタン
パク質の解離を促進させるように選ばれたpHのアルカリ
性水溶液中で希釈し、 上記タンパク質を変性された状態に維持するのに必要な
pH以下に上記溶液のpHを下げることにより、上記タンパ
ク質を可溶性で自然な形態のものに再変性させることを
特徴とするタンパク質の生産方法。 - 【請求項５】上記アルカリ性水溶液のpHは９から11.5で
ある請求の範囲第４項記載の生産方法。 - 【請求項６】上記希釈の率は、10倍から50倍である請求
の範囲第４項又は第５項記載の生産方法。 - 【請求項７】上記不溶性のタンパク質は、少なくとも7M
の濃度の尿素を含む水溶液中で変性させるようにした請
求の範囲第４項ないし第６項のいずれか１項に記載の生
産方法。 - 【請求項８】上記不溶性のタンパク質は、少なくとも6M
のグアニジンハイドロクロライドを含む水溶液中で変性
させるようにした請求の範囲第４項ないし第６項のいず
れか１項に記載の生産方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8308234 | 1983-03-25 | ||
| GB838308234A GB8308234D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Recovery of products produced by host organisms |
| GB83/00152 | 1983-06-07 | ||
| PCT/GB1983/000152 WO1983004418A1 (en) | 1982-06-07 | 1983-06-07 | A process for the preparation of chymosin |
| GB8327345 | 1983-10-12 | ||
| GB838327345A GB8327345D0 (en) | 1983-06-07 | 1983-10-12 | Production of protein |
| PCT/GB1984/000093 WO1984003711A1 (en) | 1983-03-25 | 1984-03-23 | A process for the production of a protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60500893A JPS60500893A (ja) | 1985-06-20 |
| JPH06102034B2 true JPH06102034B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=27261901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50161184A Expired - Lifetime JPH06102034B2 (ja) | 1983-03-25 | 1984-03-23 | タンパク質の生産方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0122080B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06102034B2 (ja) |
| AT (1) | ATE107356T1 (ja) |
| DE (1) | DE122080T1 (ja) |
| GB (1) | GB2138004B (ja) |
| WO (1) | WO1984003711A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| BG49718A3 (bg) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Метод за получаване на полипептид със супероксиддисмутазна активност |
| US4721673A (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-26 | Genex Corporation | Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| US5871956A (en) * | 1984-12-06 | 1999-02-16 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US6132990A (en) * | 1984-12-06 | 2000-10-17 | Amgen Boulder Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US5900400A (en) * | 1984-12-06 | 1999-05-04 | Amgen Inc. | Serine protease inhibitor analogs |
| HU204563B (en) * | 1984-12-06 | 1992-01-28 | Synergen Biolog Inc | Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them |
| WO1986004608A1 (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Synergen Biologicals, Inc. | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using same and recombinant-dna method for the manufacture of same |
| ES8800957A1 (es) * | 1985-02-22 | 1987-12-01 | Monsanto Co | Un metodo para la solubilizacion y renaturalizacion de proteina somatotropina |
| GB8508340D0 (en) * | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| US4873312A (en) * | 1985-04-25 | 1989-10-10 | Amgen | Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby |
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| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| DE3611817A1 (de) * | 1986-04-08 | 1987-10-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur renaturierung von proteinen |
| US4705848A (en) * | 1986-06-02 | 1987-11-10 | International Minerals & Chemical Corp. | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone |
| JPH01222780A (ja) * | 1988-03-02 | 1989-09-06 | Tosoh Corp | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法 |
| US5006472A (en) * | 1988-06-03 | 1991-04-09 | Miles Inc. | Enzymatic purification process |
| US5637566A (en) * | 1988-08-24 | 1997-06-10 | Southern Cross Biotech Pty. Ltd. | Method of improving carcass quality by administering growth hormone |
| US5064943A (en) * | 1988-12-16 | 1991-11-12 | American Cyanamid Company | Method for solubilization and naturation of somatotropin |
| DE4039415A1 (de) | 1990-02-03 | 1991-08-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine ohne n-terminalen methioninrest |
| DE69229202T2 (de) * | 1991-02-26 | 2000-01-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur reinigung von menschlichem bcdf |
| US6869925B1 (en) * | 1992-09-09 | 2005-03-22 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| NZ261571A (en) * | 1993-02-04 | 1997-03-24 | Denzyme Aps | Producing correctly folded proteins using multiple denaturation and renaturation cycles |
| US6017880A (en) * | 1994-03-09 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| EP1149160B1 (en) | 1999-01-25 | 2006-04-19 | Novozymes A/S | Recovery of a protein at high ph |
| SG176963A1 (en) | 2009-06-22 | 2012-02-28 | Amgen Inc | Refolding proteins using a chemically controlled redox state |
| LT3660032T (lt) | 2009-06-25 | 2026-02-25 | Amgen Inc. | Ne žinduolių sistemoje ekspresuotų baltymų surišamojo gryninimo būdai |
| BR112012022518A2 (pt) | 2010-03-17 | 2020-10-13 | Biogenerix Gmbh | método para obtenção de g- csf recombinante humano biologicamente ativo |
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1984-03-23 DE DE198484301995T patent/DE122080T1/de active Pending
- 1984-03-23 EP EP84301995A patent/EP0122080B1/en not_active Expired
- 1984-03-23 WO PCT/GB1984/000093 patent/WO1984003711A1/en not_active Ceased
- 1984-03-23 GB GB08407570A patent/GB2138004B/en not_active Expired
- 1984-03-23 AT AT87110601T patent/ATE107356T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-03-23 JP JP50161184A patent/JPH06102034B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
| JPS58501900A (ja) * | 1981-11-13 | 1983-11-10 | ブル− サ−クル インダストリ−ズ ピ−エルシ− | 静電集塵方法および装置 |
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| GB2138004B (en) | 1987-05-13 |
| GB2138004A (en) | 1984-10-17 |
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| WO1984003711A1 (en) | 1984-09-27 |
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