JPH06104061B2 - 細胞培養支持体材料 - Google Patents

細胞培養支持体材料

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JPH06104061B2
JPH06104061B2 JP1031844A JP3184489A JPH06104061B2 JP H06104061 B2 JPH06104061 B2 JP H06104061B2 JP 1031844 A JP1031844 A JP 1031844A JP 3184489 A JP3184489 A JP 3184489A JP H06104061 B2 JPH06104061 B2 JP H06104061B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、生物学、医学および免疫学等における細胞類
の培養用支持体材料に関するものである。
〈従来の技術〉 従来、細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を
行なった合成高分子の表面上にて行なわれていた。例え
ば、ポリスチレンを材料とする表面処理、例えばγ線照
射、シリコンコーティング等を行なった種々の容器が細
胞培養用容器として普及している。従来、このような細
胞培養用容器を用いて培養・増殖した細胞は、トリプシ
ンのような蛋白分解酵素や化学薬品により処理すること
で容器表面から剥離・回収されていた。しかしながら、
上述のような化学薬品処理を施して増殖した細胞を回収
する場合、処理工程が煩雑になり、不純物混入の可能
性が多くなること、増殖した細胞が科学的処理により
変成し細胞本来の機能が損なわれる例があること、等の
欠点が指摘されている。
〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、上記のような問題を解決するためになされた
ものであり、トリプシン、EDTAのような蛋白分解酵素、
化学薬品処理を施さずに環境温度を変化させることで、
培養・増殖させた細胞を支持体表面から剥離・回収が可
能となるような細胞培養に使用する材料を提供すること
を目的とする。
〈課題を解決するための手段〉 本研究者らは以上のような点を鑑み、鋭意研究を重ねた
結果、細胞支持体の表面を水溶性高分子の中でも特に上
限臨界溶解温度かつ／または下限臨界溶解温度（水にあ
る物質を混合する時、ある温度では部分的にしか溶かさ
ないため、２層に分かれているが、温度を上げるかまた
は下げてある一定の温度を過ぎると完全に溶解して１層
になることがある。温度を挙げて完全溶解に達した場合
の温度を上限臨界溶解温度、温度を下げていって完全に
溶解した場合の温度を下限臨界溶解温度と言う。）を示
すようなポリマーにより処理することで、環境温度を変
化させるだけで支持体表面の親水性、疎水性のバランス
を容易にコントロールでき、細胞培養中と培養終了後、
細胞剥離・回収工程で温度を変化させると増殖細胞が剥
離、引き続いて等張液等で洗浄することだけで増殖細胞
を回収可能であることを見出した。
即ち、本発明は水に対する上限臨界溶解温度または下限
臨界溶解温度が80〜０℃の範囲にするポリマーもしくは
コポリマーで表面を被覆した脂肪培養支持体材料を提出
する。
水に対する上限または下限臨界溶解温度は通常水（イオ
ン交換水または蒸留水）との溶解相図を作成して求め
る。水との溶解相図は水と上限または下限臨界溶解温度
を求めるポリマーとの種々の濃度（重量分率、容積分
率、モル分率、モル比等何れの単位を用いても構わな
い。）の溶液を調製し、各々の温度を上下させ、目視
により２相分離を確認する方法の他、臨界タンパク光
の観測による方法、散乱光強度の観測による方法、
透過レーザー光の観測による方法、等一般に知られてい
る方法の何れかを用いて、また、組み合わせて用いて作
成される。
被覆に用いられる物質は水溶液中で上限臨界溶解温度ま
たは下限臨界溶解温度を有する化合物であればすべて用
いることができるが、好ましくは80℃〜０℃、より好ま
しくは50℃〜20℃の上限または下限臨界溶解温度を有す
るものである。上限または下限臨界溶解温度が80℃を越
えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。
また、上限または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一
般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死
滅してしまう為、好ましくない。
本発明に用いるポリマーまたはコポリマーは、以下のモ
ノマーの重合または共重合により得られる。使用し得る
モノマーは、これらの化合物に限定されるものではない
が、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の
（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリルア
ミド（単独重合体の下限臨界溶解温度72℃）、Ｎ−ｎ−
プロピルアクリルアミド（同21℃）、Ｎ−ｎ−プロピル
メタクリルアミド（同27℃）、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド（同32℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミ
ド（同43℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同
45℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（同60
℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約35
℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約45
℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同
約28℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミ
ド（同約35℃）等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリル
アミド誘導体、N,N−ジメチル（メタ）アクリルアミ
ド、N,N−エチルメチルアクリルアミド（単独重合体の
下限臨界溶解温度56℃）、N,N−ジエチルアクリルアミ
ド（同32℃）等のN,N−ジアルキル置換（メタ）アクリ
ルアミド誘導体、更に１−（１−オキソ−２−プロペニ
ル）−ピロリジン（同56℃）、１−（１−オキソ−２−
プロペニル）−ピペリジン（同約６℃）、４−（１−オ
キソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキ
ソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−
（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリ
ジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニ
ル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリル
アミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下
限臨界溶解温度35℃）等のビニルエーテル誘導体、また
増殖細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要が
ある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を
高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水、疎水性
のバランスを調整する等の目的で、上記以外のモノマー
類との共重合、ポリマー同士グラフトまたは共重合、あ
るいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。
また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で、架橋す
ることも可能である。
また、被覆を施される支持体の材質は通常細胞培養に用
いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチ
ルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与
が可能である物質、例えば上記以外の高分子化合物、セ
ラミックス、金属類など全て用いることができる。その
形状は、ペトリディッシュに限定されることは無く、プ
レート、ファイバー、（多孔質）粒子、また、一般に細
胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を付与
されていても構わない。
支持体への被覆方法は、支持体基材と被覆物質を化学
的な反応によって結合させる方法、物理的な相互作用
を利用する方法、を単独でまたは併用して行なうことが
できる。すなわち、化学的な反応によって結合させる
場合、電子線照射（EB）、γ線照射、紫外線照射、プラ
ズマ処理、コロナ処理、さらに支持体と被覆材料が適当
な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオ
ン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を
用いることができる。物理的な相互作用による方法と
しては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマ
トリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノ
マーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料と
のグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、混
練等の物理的吸着を用いる方法等がある。
また、細胞培養支持体上にて培養した細胞を支持体から
剥離させ回収するには、上限臨界溶解温度以上もしくは
下限臨界溶解温度以下にてこれを剥離し、等張液等によ
って洗浄して回収すればよい。
本発明の作用をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
を例にとって説明する。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドは水溶液中で約32℃に下限臨界溶解温度を有す
ることが知られている。例えば、一般に細胞培養用ペト
リディッシュ材料として用いられるポリスチレン上でＮ
−イソプロピルアクリルアミドを電子線照射（EB）によ
り重合を行なうと、下限臨界溶解温度である32℃以上で
はポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの占有体積は
小さくなり、ポリマー中の水分子を排除するため、支持
体表面は疎水性を示し、逆に32℃以下ではポリ−Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドの占有体積は大きくなるので
ポリマー中の水分子の占める体積分率が上昇するため、
支持体表面は親水性を示すようになる。
通常の細胞培養ではトリプシン、EDTA等の蛋白分解酵
素、化学薬品で処理することにより培養・増殖後の細胞
を支持体表面から剥離・回収するが、上述したような物
性を有するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを電
子線照射によって表面コーティングされた支持体では、
温度を制御することにより支持体表面の親水・疎水性が
コントロールでき細胞の細胞培養支持体への接着性が変
化する。そのため、温度を変化させるだけで培養・増殖
後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離
させ、引き続いて等張液等によって培養された細胞を洗
浄すると回収することが可能である。
この方法によれば、トリプシン、EDTAのような蛋白分解
酵素、化学薬品による処理を経ずに細胞培養支持体から
培養した脂肪を剥離・回収することができるので、処
理工程が簡略化される、不純物等の混入の可能性が完
全になくなる、増殖した細胞が化学的処理により細胞
膜が障害される等で細胞本来の機能が損なわれない、等
の顕著な特徴を獲得することが可能である。
〈実施例〉 以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。
実施例１、２、３ 細胞支持体基材としてベクトン・ディキンソン・ラブウ
ェア（Becton Dickinson Labware）社製ファルコン（FA
LCON）3001ペトリディッシュを用い、培養する細胞は牛
の大動脈の血管内皮細胞を採用した。（ポリ）Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド（被覆物質）を表−１に示す濃
度でイソプロピルアルコールに溶解してペトリディッシ
ュに0.5ml添加後、各々表−１に示す照射量の電子線を
照射することによりペトリディッシュ表面にポリ−Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドを被覆した。電子線照射終
了後、イオン交換水によりペトリディッシュを洗浄し、
残存モノマーを取り除きクリーンベンチ内で乾燥して、
細胞支持体を得た。
牛の大動脈の血管内細胞の培養は、得られた細胞支持体
上にて牛胎児血清（FCS）を20％含むダルベッコー改変
イーグル培地（DMEM）を培地として５％二酸化炭素中、
37℃で行なった。十分細胞が増殖したのを確認後、４℃
に冷却し放置して付着培養細胞を剥離させ、増殖細胞剥
離回収率（すなわち、増殖させた細胞総数に対する剥離
して回収された細胞総数）を求めた。結果を表−１に示
す。
実施例４、５ 被覆物質として（ポリ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドの代わりにN,N−ジエチルアクリルアミドを使用した
点以外は実施例１、２、３と同様にして細胞支持体を
得、細胞培養し、これを剥離回収した。増殖細胞剥離回
収率を表−１に示す。
比較例１、２、３ 細胞支持体としてベクトン・ディキンソン・ラブウェア
社製ファルコン3001ペトリディッシュを用い、比較例１
は全く表面処理を行わずに実施例１、２、３、４、５と
同様の実験を行なった。また、比較例２、３は電子照射
のみを行ない、実施例１、２、３、４、５と同様の実験
を行なった。牛の大動脈の血管内皮細胞の培養は実施例
１、２、３、４、５と同様の方法を採用した。続いて、
充分細胞が増殖したのを確認後、４℃に冷却し放置して
付着培養細胞を剥離させ、増殖細胞剥離回収率を求め
た。結果を表−１に示す。
なお、実施例、比較例とも、支持耐の親水・疎水性を調
べるためにフェース（FACE）接触角計（CA−Ｄ型）［協
和界面科学株式会社製］および付属品として三態系測定
装置を用い水中法（underwater method）で接触角を測
定した。結果を表−２に示す。
実施例６ 被覆物質として（ポリ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドの代わりにＮ−イソプロピルメタクリルアミドを使用
した点以外は実施例１、２、３と同様にして細胞支持体
を得、牛の大動脈の血管内皮細胞を45℃で培養し、これ
を30℃で剥離回収した。増殖細胞剥離回収率を表−３に
示す。
実施例７ 被覆物質として（ポリ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドの代わりにＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドを使用し
た点以外は実施例１、２、３と同様にして細胞支持体を
得、牛の大動脈の血管内皮細胞を25℃で培養し、これを
10℃で剥離回収した。増殖細胞剥離回収率を表−３に示
す。
実施例８ 実施例３で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するた
め、これを遠心分離（600G、５分）により回収し、得ら
れた１×105個の細胞をベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン3001ペトリディッシュ上で再び培
養させた。培養はG1、２、３と同様の方法を採用した。
結果を表−４に示す。
比較例４ 比較例１で培養した付着細胞を0.05％トリプシン−0.02
％EDTA処理し、剥離させた細胞の損傷度合を確認するた
め、これを遠心分離（600G、５分）することにより回収
し、得られた１×105個の細胞をベクトン・ディキンソ
ン・ラブウェア社製ファルコン3001ペトリディッシュ上
で再び培養させた。培養は実施例１、２、３と同様の方
法を採用した。結果を表−４に示す。
以上の実施例および比較例の結果より、細胞培養支持体
基材であるポリスチレンの表面をＮ−イソプロピルアク
リルアミドポリマーまたはN,N−ジエチルアクリルアミ
ドで表面処理を行なった実施例１、２、３、４、５では
表−２に示されるように周囲の温度を37℃から４℃に下
げることで接触角が減少しており、これは被覆されたＮ
−イソプロピルアクリルアミドまたはN,N−ジエチルア
クリルアミドにより材料表面が疎水性から親水性へと変
化していることを示している。このような材料を使用し
た実施例１、２、３、４、５の場合、表−１に示される
ように、培養温度を低下させると付着細胞は培養支持体
から良好に剥離し、回収することが可能であった。ま
た、実施例６及び７においても同様の結果が得られた。
一方、表面処理を施さない場合は表−２に示されるよう
に、周りの温度を下げても接触角はほとんど変化せず材
料表面は疎水性のままであった。このような材料を使用
した比較例１、２、３では表−１に示されるように、培
養温度を低下させても付着細胞の剥離現象は観察されな
かった。
さらに、剥離回収細胞の損傷度合については、表−４に
示されるように、実施例８では培養開始時の10倍まで再
増殖させることが可能であるが、比較例４では５倍まで
しか再増殖させることができなかった。このことは、本
発明の剥離回収細胞は従来のそれよりも損傷度が小さい
ことを意味する。
〈発明の効果〉 本発明は、低温処理という簡便な操作で、不純物等を全
く混入させることなく、しかも、従来の方法と比較する
と細胞機能を十分に保持しながら、培養・回収の繰り返
し操作を行なうことができる。
フロントページの続き (72)発明者 桜井 靖久 東京都杉並区永福３―17―６ (72)発明者 網屋 毅之 和歌山県和歌山市舟津町２―11―３ シテ ィーハイツアルム201号 (72)発明者 儘田 明 和歌山県和歌山市西浜1450 花王水軒寮 (56)参考文献 特開 昭62−6682（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／8448（ＷＯ，Ａ)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】水に対する上限臨界溶解温度または下限臨
    界溶解温度が80〜０℃の範囲にあるポリマーもしくはコ
    ポリマーで表面を被覆した細胞培養支持体材料。
JP1031844A 1989-02-10 1989-02-10 細胞培養支持体材料 Expired - Lifetime JPH06104061B2 (ja)

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DE69019009T DE69019009T2 (de) 1989-02-10 1990-02-08 Zellkulturverfahren.
EP90102491A EP0382214B1 (en) 1989-02-10 1990-02-08 Method of cell culture
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