JPH06105691A - フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子領域を含むｄｎａ断片、組換プラスミド、形質転換体およびトリクロロエチレンの分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記制限酵素地図に示されるフェノールハイ
ドロキシラーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片。 【化１】 （地図中、Ｃ２３Ｏはカテコール２，３オキシゲナーゼ
遺伝子の一部、ＰＨはフェノールハイドロキシラーゼ遺
伝子を示す。）このＤＮＡ断片と、薬剤耐性遺伝子と、
グラム陰性細菌内における自律的複製に必要な遺伝子お
よび複製開始部位を含む広宿主域複製領域とを有し、グ
ラム陰性細菌内で複製可能な組換プラスミドを、宿主細
菌に導入し、得られた形質転換体によりトリクロロエチ
レンを分解する。 【効果】 トリクロロエチレンを簡単に効率よく分解で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフェノールハイドロキシ
ラーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片、このＤＮＡ断片を
含む新規な組換プラスミド、この組換プラスミドを保持
する形質転換体およびこの形質転換体を用いたトリクロ
ロエチレンの分解方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トリクロロエチレンは溶剤として広く使
用されているが、有毒であり、自然の微生物によって容
易に分解されないため、各地で土壌、地下水汚染を引起
こしている。

【０００３】トリクロロエチレンの処理方法としては活
性炭等に吸着させて除去する方法があるが、この方法は
ただトリクロロエチレンを回収するだけで、無毒化する
ことはできず、本質的な解決にはなっていない。また嫌
気的な処理によりトリクロロエチレンを分解することも
できるが、毒性の高いジクロロエチレンやビニルクロラ
イド等の中間生成物が生成されるという問題点がある。

【０００４】このような問題点の解決に、トリクロロエ
チレンを分解する酵素または微生物の利用が有効な対策
となり得る。従来、トリクロロエチレンを分解する酵素
としては、メタン資化細菌のもつメタンモノオキシゲナ
ーゼ、トルエン資化細菌のもつトルエンモノオキシゲナ
ーゼ、トルエンジオキシゲナーゼ、硝化細菌のもつアン
モニアモノオキシゲナーゼが知られている。

【０００５】しかし、トリクロロエチレン分解能を有す
る自然菌を用いたトリクロロエチレンの分解には次のよ
うな問題点がある。 １）自然菌はメタン、トルエン、フェノール等の物質に
より誘導されるので、これらの誘導物質の添加が不可欠
である。このため添加したトルエン、フェノール等が環
境中に放出される。 ２）一度誘導されたトリクロロエチレンの分解能は長期
間維持されず、通常半日程度で活性がなくなってしま
う。 ３）リアクターにて使用する場合の分解能が充分でな
い。

【０００６】一方特表平２−５０３８６６号には、シュ
ードモナス メンドシナ ＫＲ−１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ＫＲ−１）由来のトルエ
ンモノオキシゲナーゼ遺伝子（トルエンモノオキシゲナ
ーゼはトリクロロエチレンを分解する）を宿主細菌に導
入し、この形質転換体を用いてトリクロロエチレンを分
解する方法が記載されている。しかし、この方法は、ト
ルエンモノオキシゲナーゼを利用しており、本発明のフ
ェノールハイドロキシラーゼを利用するものとは異な
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、トリ
クロロエチレン分解活性を有するフェノールハイドロキ
シラーゼの遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を提供すること
である。本発明の他の目的は、上記ＤＮＡ断片を組込ん
だ新規な組換プラスミドを提供することである。本発明
の別の目的は、上記組換プラスミドを宿主細菌に導入し
た形質転換体を提供することである。本発明のさら別の
目的は、上記形質転換体を用いたトリクロロエチレンの
分解方法を提案することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は次のフェノール
ハイドロキシラーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片、組換
プラスミド、形質転換体、およびそれを用いたトリクロ
ロエチレンの分解方法である。 （１）下記制限酵素地図〔１〕に示されるフェノールハ
イドロキシラーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片。

【化２】 （地図中、Ｃ２３Ｏはカテコール２，３オキシゲナーゼ
遺伝子の一部、ＰＨはフェノールハイドロキシラーゼ遺
伝子を示す。） （２）シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＷＩ−９）菌株染色
体ＤＮＡ由来のフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子
と、薬剤耐性遺伝子と、グラム陰性細菌内における自律
的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含む広宿主
域複製領域とを有し、グラム陰性細菌内で複製可能な組
換プラスミド。 （３）上記（２）記載の組換プラスミドを宿主細菌に導
入したことを特徴とする形質転換体。 （４）上記（３）記載の形質転換体を用いてトリクロロ
エチレンを分解することを特徴とするトリクロロエチレ
ンの分解方法。

【０００９】本発明のフェノールハイドロキシラーゼ遺
伝子領域を含むＤＮＡ断片は、シュードモナス プチダ
ＫＷＩ−９菌株等の染色体ＤＮＡから分離される。シ
ュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株は、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１３
１０９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１０９）の微生物受託番
号で寄託されており、その菌株的性質および培養方法等
については特願平４−２２８１６９号に記載されてい
る。

【００１０】本発明のＤＮＡ断片は、制限酵素ＳｔｕＩ
ないしＳｍａＩサイトで切断した断片であり、下記制限
酵素に対し、次の切断部位を有する。 制限酵素 切断部位数Ｓａｃ Ｉ １Ｓａｌ Ｉ １Ｈｉｎ ｄIII １Ｅｃｏ ＲＩ １ 上記制限酵素の相対的な切断部位は、複数の制限酵素で
完全消化し、生成したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動で解析することにより求めることができる。

【００１１】本発明のＤＮＡ断片は、シュードモナス
プチダ ＫＷＩ−９菌株の染色体ＤＮＡを制限酵素で切
断して得られる次の２つのＤＮＡ断片を結合した８．５
ｋｂのＤＮＡ断片中に存在する（図３参照）。Ｈｉｎ ｄIIIで切断して得られる１０ｋｂのＤＮＡ断
片（図１参照）：このＤＮＡ断片の２．３ｋｂのＥｃｏ
ＲＩサイトないし４．８ｋｂのＳａｌＩサイトの間にカ
テコール２，３オキシゲナーゼ（Ｃ２３Ｏ）遺伝子が存
在している。このＤＮＡ断片を含む形質転換体はＣ２３
Ｏによりカテコールを黄変させるので、容易に検出でき
る。

【００１２】ＥｃｏＲＩで切断して得られる６．０ｋ
ｂのＤＮＡ断片（図２参照）：このＤＮＡ断片の３．７
ｋｂのＨｉｎｄIIIサイトないし６．０ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉサイト部分は、のＤＮＡ断片の０ｋｂのＨｉｎｄII
Iサイトないし２．３ｋｂのＥｃｏＲＩサイト部分と重
複している。すなわちのＤＮＡ断片の０ｋｂのＥｃｏ
ＲＩサイトないし３．７ｋｂのＨｉｎｄIIIサイトは、
のＤＮＡ断片の上流部分である。のＤＮＡ断片は、
両者の重複部分をプローブとしてサウザンハイブリダイ
ゼイションにより分離できる。

【００１３】本発明のＤＮＡ断片を含む８．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片は、上記のＤＮＡ断片の０ｋｂのＨｉｎｄII
Iサイトないし４．８ｋｂのＳａｌＩサイト断片に、そ
の上流部分としてのＤＮＡ断片の０ｋｂのＥｃｏＲＩ
サイトないし３．７ｋｂのＨｉｎｄIIIサイト断片を結
合させるか、またはのＤＮＡ断片の下流に、のＤＮ
Ａ断片の２．３ｋｂのＥｃｏＲＩサイトないし４．８ｋ
ｂのＳａｌＩサイト断片を連結させることにより得られ
る。本発明のＤＮＡ断片は、上記８．５ｋｂのＤＮＡ断
片をＳｔｕＩおよびＳｍａＩサイトで切断した断片とし
て得られる。

【００１４】本発明の組換プラスミドはシュードモナス
プチダ ＫＷＩ−９菌株染色体ＤＮＡ由来のフェノー
ルハイドロキシラーゼ遺伝子を有している。この遺伝子
から形成されるフェノールハイドロキシラーゼは、トリ
クロロエチレンを分解するので、本発明の組換プラスミ
ドを宿主細菌に導入し、得られた形質転換体を用いてト
リクロロエチレンを分解することができる。

【００１５】本発明の組換プラスミドは、次のＤＮＡ断
片をリガーゼで連結して構築することができる。 広宿主域複製領域を含むＤＮＡ断片 薬剤耐性遺伝子（マーカー） シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株染色体ＤＮ
Ａ由来のフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子

【００１６】広宿主域複製領域は、組換プラスミドがグ
ラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持される
のに必要な遺伝子領域であり、プラスミドＲＳＦ１０１
０由来のもの等を採用することができるが、これに限定
されない。ＲＳＦ１０１０はグラム陰性細菌内における
自律的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含み、
約５．８ｋｂのＤＮＡ領域に集中して存在する。この領
域はＲＳＦ１０１０だけでなく、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭ
Ｂ２２等のプラスミドから制限酵素等の核酸分解酵素を
用いて分離することができる。

【００１７】薬剤耐性遺伝子としては、クロラムフェニ
コール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
でき、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ
９９Ａ、ｐＫＴ２４０等のプラスミドから分離できる。
シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株染色体ＤＮＡ
由来のフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子としては、
前記本発明のＤＮＡ断片が使用できる。

【００１８】本発明の組換プラスミドは、種々の異なる
プロモーター・ターミネーター系を介してフェノールハ
イドロキシラーゼを発現させることができる。このた
め、トリクロロエチレン分解能の向上がプロモーターの
改良により容易に行うことができる。また、ｌａｃＩｑ
等のリプレッサー遺伝子を組込むことにより、イソプロ
ピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質により
制御が可能となる。従って、フェノール、トルエンの添
加は不要である。さらに、リプレッサー遺伝子を欠損さ
せることにより、誘導物質の添加が不要になり、フェノ
ールハイドロキシラーゼを構成酵素として作用させるこ
とも可能であり、このため長時間にわたってトリクロロ
エチレン分解能を維持できる。ｌａｃＩｑ遺伝子・プロ
モーター・オペレーター・ターミネーター系は、ｐＴｒ
ｃ９９Ａ等のプラスミドから制限酵素等の核酸分解酵素
を用いて分離することができる。

【００１９】組換プラスミドの宿主への導入は、エレク
トロポーレーション法、カルシウムおよびルビジウム処
理による方法、ヘルパープラスミドを用いた伝達による
方法等によって、極めて容易に行うことが可能である。
宿主としては、組換プラスミドが安定に維持されるグラ
ム陰性細菌が利用されるが、好ましくはシュードモナス
属細菌、中でもシュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌
株およびその変異株等が望ましい。

【００２０】また本発明によれば、組換プラスミドを導
入した形質転換体を用いてトリクロロエチレンを分解す
ることができる。トリクロロエチレンの分解は、トリク
ロロエチレンを含む培地中で形質転換体を好気的に培養
する等の方法により行うことができ、完全に脱ハロゲン
化できる。

【００２１】組換プラスミドを導入した形質転換体の培
養は、宿主の生育に適した条件で行われるが、炭素源お
よび窒素源としてペプトン、トリプトン、酵母エキス
等、無機塩として塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用
い、培地のｐＨ５〜８．５、好ましくは６〜７、温度１
５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で好気的に培養する
のが望ましい。

【００２２】

【実施例】次に本発明の実施例について説明する。実施
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。 １）ｐＫＫ２２３−３ タンパク質の発現に用いられる発現ベクター。ｌａｃリ
プレッサーにより調節されうる強力なｔａｃプロモータ
ーを有し、ＩＰＴＧ等の誘導物質がｌａｃリプレッサー
を不活性にすると、転写を誘発する。ｔａｃプロモータ
ーのすぐ下流にはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）
および強力なｒｒｎリボソームターミネーターが存在し
ている。このプラスミドはファルマシア社から市販され
ており、製品コード番号は２７−４９３５−０１であ
る。

【００２３】２）ｐＴｒｃ９９Ａ ｐＫＫ２３３−２の誘導体であり、強力なｔｒｃプロモ
ーターのすぐ下流には長いマルチクローニングサイトお
よび強力なターミネーター（ｒｒＢ）が存在している。
またｐＫＫ２３３−２にはないｌａｃＩｑ（ｌａｃリプ
レッサーの強力なもの）遺伝子を含むため、ｌａｃリプ
レッサーが欠損するＥ．ｃｏｌｉを宿主として使用する
ことができる。ｔｒｃプロモーターは、ＩＰＴＧの添加
により誘発される。なおマルチクローニングサイトのＮ
ｃｏＩ制限酵素切断部位には翻訳開始コドンＡＴＧを有
しており、このコドンが欠損している遺伝子を挿入して
も発現可能である。このプラスミドはファルマシア社か
ら市販されており、製品コード番号は２７−５００７−
０１である。

【００２４】３）ｐＡＣＹＣ１８４ 大腸菌のクローニングベクターで、４２４４ｂｐの大き
さを有する。ＥｃｏＲＩサイトの最初のグアニン（Ｇ）
をヌクレオチド配列の１番目とすると、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子を１５８０〜２７７０番目、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）を３８０４〜２１９番目に
有する。

【００２５】４）ｐＫＴ２４０ プラスミドＲＳＦ１０１０由来の広宿主域複製領域を有
し、多くのグラム陰性細菌内で安定して維持可能な１
２．９ｋｂのプラスミドである。アンピシリン耐性遺伝
子とカナマイシン耐性遺伝子とを持っている。ＡＴＣＣ
から市販されている。ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７２５８（Ａ
ＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ ＤＮＡ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２ｎｄ ｅｄｉ
ｔｉｏｎ，１９９１）。

【００２６】５）大腸菌ＤＨ５α 大きなプラスミドにより形質転換されやすい。ベセスダ
・リサーチ社（ＢＲＬ）から市販されている。品番は８
２６２ＳＡ。 ６）シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株 フェノール資化能を有し、トルエン資化能を有さないト
リクロロエチレン分解性菌株であり、前記微生物受託番
号で寄託されている。トリクロロエチレン分解性はフェ
ノールの共存により著しく阻害される。

【００２７】実施例１ シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株の生産するフ
ェノールハイドロキシラーゼがトリクロロエチレンを分
解していると考え、またＣ２３Ｏの遺伝子が一つのオペ
ロン中でフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子と共存
し、かつＣ２３Ｏの遺伝子の上流にフェノールハイドロ
キシラーゼ遺伝子が存在すると考え、Ｃ２３Ｏをマーカ
ーにしてフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子の分離を
試みた。なお、Ｃ２３Ｏはカテコールを２−ヒドロキシ
ムコニックセミアルデヒド（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃ
ｏｎｉｃ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）に酸化し、黄変
させる。

【００２８】大腸菌ＤＨ５αの液体培養にはＬＢ培地を
用い、培養温度は３７℃に設定した。抗生物質はアンピ
シリンとクロラムフェニコールをそれぞれ１００μｇ／
ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。大腸菌ＤＨ５
αへのプラスミドの導入は、Ｈａｎａｈａｎの方法を利
用した。サウザンハイブリダイゼーション法、ライゲー
ション法その他の分子生物学に係わる基本的な手法は、
すべて”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”の第２
版に従った。

【００２９】ＨｉｎｄIIIで切断し、５’末端を脱リン
酸化処理したｐＫＫ２２３−３に、シュードモナス プ
チダ ＫＷＩ−９菌株の染色体を制限酵素ＨｉｎｄIII
で切断したＤＮＡ断片を組込んだ。このプラスミドを大
腸菌ＤＨ５αに導入し、形質転換した。この結果、約１
２０００のコロニーが得られ、そのうち９個のコロニー
がカテコールのスプレーにより黄変した。これらの形質
転換体は、すべて同じ１０ｋｂのＤＮＡ断片を組込んで
いた。このＤＮＡ断片を含むプラスミドの制限酵素地図
を図１に示す。このＤＮＡ断片には、２．３ｋｂのＥｃ
ｏＲＩサイトないしＳａｌＩサイトの間にＣ２３Ｏ遺伝
子が存在した。

【００３０】上記１０ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片
を組込んだｐＫＫ２２３−３を大腸菌ＤＨ５αに導入
し、この大腸菌によるフェノールの分解試験を行った
が、フェノールは全く分解されなかった。そこで下記の
操作により、さらに上流のＤＮＡ断片を取得した。

【００３１】シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株
の染色体をＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲルで電気
泳動にかけ、６．０ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロース
ゲル部分を切出した。この中に含まれるＤＮＡ断片を第
一化学薬品社製のＤＮＡセル（ＤＮＡ ＣＥＬＬ、商
標）により取出した。この６．０ｋｂのＥｃｏＲＩ Ｄ
ＮＡ断片をｐＴｒｃ９９ＡのＥｃｏＲＩサイトに組込
み、約１４０００の形質転換体を得た。その中の３００
をランダムに選び、前記１０ｋｂのＨｉｎｄIIIＤＮＡ
断片の０ｋｂのＨｉｎｄIIIサイトないし２．３ｋｂの
ＥｃｏＲＩサイトまでをプローブとして、サウザンハイ
ブリダイゼーションを行った。その結果、６．０ｋｂの
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片が組込まれたプラスミドを持つ
形質転換体が得られた。このプラスミドの制限酵素地図
を図２に示す。このプラスミドには、前記１０ｋｂのＨ
ｉｎｄIII ＤＮＡ断片の０ｋｂのＨｉｎｄIIIサイトが
３．７ｋｂの位置に存在した。

【００３２】上記二種類のＤＮＡ断片（１０ｋｂのＨｉ
ｎｄIII ＤＮＡ断片、６．０ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮ
Ａ断片）を図３に示すように結合させ、下流部位はＣ２
３Ｏ遺伝子を含むＳａｌＩサイトまでの８．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片をｐＴｒｃ９９Ａに組込んだ。なお、図３の制
限酵素サイトはｐＴｒｃ９９Ａを切断しない制限酵素を
利用して決定したものである。

【００３３】このプラスミドの上流部位の制限酵素サイ
トを段階的に削除し、種々の長さのプラスミドを作成
し、これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入し、コ
ロニーによるフェノールハイドロキシラーゼおよびＣ２
３Ｏの発現試験を行った。Ｃ２３Ｏは０．１Ｍのカテコ
ールを用い、フェノールハイドロキシラーゼの場合は
０．１Ｍのフェノールを用い、これらをコロニー上に滴
下し、これらのコロニーの色の変化を観察した。フェノ
ールハイドロキシラーゼ遺伝子が正しく組込まれている
場合は、下流にＣ２３Ｏ遺伝子が存在するため、フェノ
ールがフェノールハイドロキシラーゼによりカテコール
に酸化された後、続けてＣ２３Ｏにより黄色の物質が生
成されるため、コロニーは黄変する。このため検出は容
易である。

【００３４】なおＳｔｕＩサイトから遺伝子を発現させ
る場合は次のようにして行った。ＳｔｕＩサイトから遺
伝子を発現させると、大腸菌に生育障害が起こりコロニ
ーが形成されなかったが、これはｐＴｒｃ９９ＡのＮｃ
ｏＩサイトにあるＡＴＧより合成されるタンパク質が阻
害の原因であることが判明したので、ｐＴｒｃ９９Ａの
代りに、ｐＴｒｃ９９ＡからＡＴＧ部分を取除いた新し
いプラスミドｐＴｒｃ１００を用いて行った。このプラ
スミドは、ｐＴｒｃ９９ＡをＮｃｏＩで切断し、露出し
たＣＡＴＧをＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで
取除いて作成した。

【００３５】発現結果を図４示す。図４から、ＳｔｕＩ
サイトないし２番目のＳｍａＩサイトの間にフェノール
ハイドロキシラーゼ遺伝子が、２番目のＥｃｏＲＩサイ
トないし２番目のＳａｌＩサイトの間にＣ２３Ｏ遺伝子
が存在することがわかる。なお、フェノールハイドロキ
シラーゼ活性が見られたものは、トリクロロエチレン分
解活性も見られ、フェノールハイドロキシラーゼがトリ
クロロエチレンを分解することが明らかとなった。フェ
ノールハイドロキシラーゼ遺伝子とＣ２３Ｏ遺伝子の存
在位置を図５に示す。

【００３６】実施例２ フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子とＣ２３Ｏ遺伝子
を含むＳｔｕＩないし最後のＳａｌＩサイトまでのＤＮ
Ａ断片（図５参照）を組込んだ組換プラスミドを、シュ
ードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株に導入し、トリク
ロロエチレンの分解試験を次のようにして行った。

【００３７】シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株
の液体培養には下記ＳＯＢ培地を使用した。寒天培地は
ＳＯＢ寒天培地を用いた。抗生物質はアンピシリンとク
ロラムフェニコールをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、５０
μｇ／ｍｌの濃度で使用した。培養温度は３０℃に設定
した。シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９菌株へのプ
ラスミドの導入はバイオ−ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製
のジーンパルサーを利用し、エレクトロポーレーション
法により行った。

【００３８】ＳＯＢ培地： バクト（Ｂａｃｔｏ）トリプトン ２０ｇ バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母エキス ５ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ２５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍｌ 蒸留水 全量で９９０ｍｌとする ｐＨ ７．０ 上記溶液をオートクレーブで殺菌し、室温まで冷却した
後、これとは別のビンでオートクレーブにより殺菌した
２Ｍ Ｍｇ²⁺液（１Ｍ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ＋１Ｍ Ｍ
ｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）を１０ｍｌ加える。

【００３９】まず、シュードモナスに多く利用されてい
るＲＳＦ１０１０レプリコンと、ｐＡＣＹＣ１８４のク
ロラムフェニコール耐性遺伝子と、ｐＴｒｃ１００のｌ
ａｃＩｑないしターミネーターまでの部分とを用い、図
６に示すＩＰＴＧで制御可能なシュードモナス用のプラ
スミドｐＲＣＬ１００を調製した。

【００４０】すなわち、ｐＫＴ２４０からＰｖｕIIとＰ
ｓｔＩで切出される約５．８ｋｂのレプリコン部位（こ
のレプリコンはＲＳＦ１０１０のＰｖｕII（ｂｐ１９４
８）〜ＰｓｔＩ（ｂｐ７７６８）の部分に相当する）
と、ｐＡＣＹＣ１８４のＢｓｔＢＩ（ｂｐ３７１６）〜
ＢｓａＡＩ（ｂｐ３１０）の部分をＴ₄ＤＮＡポリメラ
ーゼで処理した後、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼで連結させ、プ
ラスミドを作成した。次にＲＳＦ１０１０のＸｍｎＩ
（ｂｐ２０３０）サイトを利用し、このプラスミドを切
断し、この部分にＴ₄ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐ
Ｔｒｃ１００のＢｓａＡＩ（ｂｐ２７６９）〜ＢｓｐＨ
Ｉ（ｂｐ７９３）（この部分にはｌａｃＩｑが存在す
る）を組込み、新しいプラスミドｐＲＣＬ１００を作成
した。

【００４１】次に、フェノールハイドロキシラーゼ遺伝
子とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＳｔｕＩ〜ＳａｌＩサイトま
でのＤＮＡ断片（図５参照）内にＢａｍＨＩサイトが存
在しないので、このＤＮＡ断片の両端にＢａｍＨＩリン
カーを結合し、単一酵素ですべてのＤＮＡ断片が切出せ
るように改良した。そして、ｐＲＣＬ１００をＢａｍＨ
Ｉで切断し、その部分にフェノールハイドロキシラーゼ
遺伝子とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組込み、図
７に示す新しいプラスミドｐＮＥＭ１０１を作成した。
このプラスミドは、シュードモナス プチダ ＫＷＩ−
９菌株に導入した場合、安定に維持された。

【００４２】このｐＮＥＭ１０１をシュードモナス プ
チダ ＫＷＩ−９菌株に導入し、次のようにしてトリク
ロロエチレンの分解試験を行った。組換シュードモナス
プチダ ＫＷＩ−９菌株の前培養液１〜２ｍｌを１０
０ｍｌのＳＯＢ培地に接種した後、３０℃で培養し、６
００ｎｍでの吸光度（以下、Ａ₆₀₀という）が０．５〜
０．７に達した時点で、ＩＰＴＧを５ｍＭ添加した後、
２時間培養して誘導した。次に遠心分離により集菌し、
菌体を下記無機培地にＡ₆₀₀が２．０になるように懸濁
した。

【００４３】無機培地： Na₂HPO₄ + KH₂PO₄(1M,pH6.8) 40ml Huntner's vitamin-free mineral base *1 20ml (NH₄)₂SO₄ 1g 蒸留水 840ml *1 Huntner's vitamin-free mineral base; ニトリロ三酢酸 10.0 g MgSO₄ 14.45 g CaCl₂・2H₂O 3.335g (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 9.25 mg FeSO₄・7H₂O 99 mg メタルズ”４４” *2 50 ml 蒸留水 全量で1000mlとする *2 メタルズ”４４”(Metals"44")； エチレンジアミン四酢酸 250.0mg ZnSO₄・7H₂O 1095.0mg(250mg Zn) FeSO₄・7H₂O 500.0mg(100mg Fe) MnSO₄・H₂O 154.0mg( 50mg Mn) CuSO₄・5H₂O 39.2mg( 10mg Cu) Co(NO₃)₂・6H₂O 24.8mg( 5mg Co) Na₂B₄O₇・10H₂O 17.7mg( 2mg B) 数滴の硫酸を加えて沈殿を防止する 蒸留水 100ml

【００４４】この菌溶液１０ｍｌをジーエルサイエンス
社製の１２５ｍｌ容のバイアルビンに入れ、トリクロロ
エチレン１０ｍｇ／ｌ（すべて液に溶解した場合の濃
度）を添加し、テフロンコートブチルゴム栓をした後、
アルミニウムキャップでシールした。このバイアルビン
を３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、定期的に気相
をガスタイトシリンダで１００μｌサンプリングし、ト
リクロロエチレンの分解試験を行った。対照としては、
ＩＰＴＧで誘導しない菌溶液を用いた。

【００４５】結果を図８に示す。図８から、ｐＲＣＬ１
００のプロモーターを活性化させるＩＰＴＧを添加した
場合は、添加しない場合に比べてトリクロロエチレンの
分解が著しく、ｔｒｃプロモーターの下流に挿入された
フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子が有効に作用し、
フェノールハイドロキシラーゼにより活発なトリクロロ
エチレン分解が行われていることが明らかとなった。

【００４６】実施例３ 実施例２において、ｐＮＥＭ１０１の代りに、ｌａｃＩ
ｑを欠損させたプラスミドｐＮＥＭ２０１を用い、ＩＰ
ＴＧを添加しないで、実施例２と同様にしてトリクロロ
エチレン分解試験を行った。

【００４７】ｐＮＥＭ２０１は次のようにして調製し
た。まずｐＫＴ２４０からＰｖｕIIとＰｓｔＩで切出さ
れる約５．８ｋｂのレプリコン部位（このレプリコンは
ＲＳＦ１０１０のＰｖｕII（ｂｐ１９４８）〜ＰｓｔＩ
（ｂｐ７７６８）の部分に相当する）と、ｐＡＣＹＣ１
８４のＢｓｔＢＩ（ｂｐ３７１６）〜ＢｓａＡＩ（ｂｐ
３１０）の部分をＴ₄ＤＮＡポリメラーゼで処理した
後、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼで連結させ、プラスミドを作成
した。次にＲＳＦ１０１０のＸｍｎＩ（ｂｐ２０３０）
サイトを利用し、このプラスミドを切断し、この部分に
Ｔ₄ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＴｒｃ１００のＰ
ｖｕII（ｂｐ４０９６）〜ＢｓｐＨＩ（ｂｐ７９３）
（この部分にｌａｃＩｑは存在しない）を組込み、新し
いプラスミドｐＲＣＴ２００を作成した。

【００４８】次に、フェノールハイドロキシラーゼ遺伝
子とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＳｔｕＩ〜ＳａｌＩまでのＤ
ＮＡ断片（図５参照）内にＢａｍＨＩサイトが存在しな
いので、このＤＮＡ断片の両端にＢａｍＨＩリンカーを
結合し、単一酵素ですべてのＤＮＡ断片が切出せるよう
に改良した。そして、ｐＲＣＬ２００をＢａｍＨＩで切
断し、その部分にフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子
とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組込み、図９に示
す新しいプラスミドｐＮＥＭ２０１を作成した。このプ
ラスミドは、実施例２で使用したｐＮＥＭ１０１からｌ
ａｃＩｑが欠損したものであり、シュードモナス プチ
ダ ＫＷＩ−９菌株に導入した場合、安定に維持され
た。

【００４９】こうして得られた形質転換体を用いて実施
例２と同様にトリクロロエチレンの分解試験を行った。
結果を図１０に示す。図１０から、誘導物質（ＩＰＴ
Ｇ）を添加しなくてもトリクロロエチレンの分解が起こ
り、その能力は５０時間以上の長時間にわたって維持さ
れることがわかる。すなわち、ｌａｃＩｑが存在する場
合には実施例２で示したように誘導物質が必要である
が、このｌａｃＩｑを欠損させると、リプレッサーが生
成しないため、誘導物質を添加しなくてもトリクロロエ
チレンの分解が可能となる。

【００５０】

【発明の効果】以上の通り、本発明によれば、トリクロ
ロエチレンを分解するフェノールハイドロキシラーゼの
遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。また、上記ＤＮＡ
断片を含み、トリクロロエチレンを分解する形質転換体
を調製する際にベクターとして利用でき、しかもトリク
ロロエチレンの分解活性の高い新規な組換プラスミドが
得られる。

【００５１】さらに、上記組換プラスミドを保持し、ト
リクロロエチレンの分解に利用できる形質転換体が得ら
れる。さらにまた、上記形質転換体を利用することによ
り、トリクロロエチレンを簡単に効率よく分解できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で作成したプラスミドの制限酵素地図
である。

【図２】実施例１で作成したプラスミドの制限酵素地図
である。

【図３】本発明のＤＮＡ断片を含むプラスミドの制限酵
素地図である。

【図４】実施例１の試験結果を示す図である。

【図５】本発明のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片の制限酵
素地図である。

【図６】実施例２で作成したプラスミドの制限酵素地図
である。

【図７】実施例２で作成したプラスミドの制限酵素地図
である。

【図８】実施例２の試験結果を示すグラフである。

【図９】実施例３で作成したプラスミドの制限酵素地図
である。

【図１０】実施例３の試験結果を示すグラフである。

【符号の説明】

Ｐ プロモーター ＰＨ フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子 Ｃ２３Ｏ カテコール２，３オキシゲナーゼ遺伝子 Ｃｍ クロラムフェニコール耐性遺伝子 ５ＳＴ１Ｔ２、Ｔ ターミネーター ＩＰＴＧ イソプロピルチオガラクトシド

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年８月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４８】次に、フェノールハイドロキシラーゼ遺伝
子とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＳｔｕＩ〜ＳａｌＩまでのＤ
ＮＡ断片（図５参照）内にＢａｍＨＩサイトが存在しな
いので、このＤＮＡ断片の両端にＢａｍＨＩリンカーを
結合し、単一酵素ですべてのＤＮＡ断片が切出せるよう
に改良した。そして、ｐＲＣＴ２００をＢａｍＨＩで切
断し、その部分にフェノールハイドロキシラーゼ遺伝子
とＣ２３Ｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組込み、図９に示
す新しいプラスミドｐＮＥＭ２０１を作成した。このプ
ラスミドは、実施例２で使用したｐＮＥＭ１０１からｌ
ａｃＩｑが欠損したものであり、シュードモナス プチ
ダ ＫＷＩ−９菌株に導入した場合、安定に維持され
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記制限酵素地図〔１〕に示されるフェ
   ノールハイドロキシラーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断
   片。 【化１】 （地図中、Ｃ２３Ｏはカテコール２，３オキシゲナーゼ
   遺伝子の一部、ＰＨはフェノールハイドロキシラーゼ遺
   伝子を示す。）
2. 【請求項２】 シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９
   （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＷＩ−
   ９）菌株染色体ＤＮＡ由来のフェノールハイドロキシラ
   ーゼ遺伝子と、 薬剤耐性遺伝子と、 グラム陰性細菌内における自律的複製に必要な遺伝子お
   よび複製開始部位を含む広宿主域複製領域とを有し、グ
   ラム陰性細菌内で複製可能な組換プラスミド。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組換プラスミドを宿主細
   菌に導入したことを特徴とする形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を用いてトリ
   クロロエチレンを分解することを特徴とするトリクロロ
   エチレンの分解方法。