JPH06107689A - 魚類の生殖腺刺激ホルモン - Google Patents
魚類の生殖腺刺激ホルモンInfo
- Publication number
- JPH06107689A JPH06107689A JP3354152A JP35415291A JPH06107689A JP H06107689 A JPH06107689 A JP H06107689A JP 3354152 A JP3354152 A JP 3354152A JP 35415291 A JP35415291 A JP 35415291A JP H06107689 A JPH06107689 A JP H06107689A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gth
- sequence listing
- fish
- gene
- gonadotropin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 魚類の生殖腺刺激ホルモンを提供する。
【構成】 ニシン目サケ科魚類の脳下垂体由来の生殖腺
刺激ホルモンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を得、
次にこの遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作成し、
該組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ると
共にその形質転換体を利用して魚類の脳下垂体由来の生
殖腺刺激ホルモンを得る。こうして得られた魚類の生殖
腺刺激ホルモンは、魚類をはじめとする動物の成熟促進
・産卵促進するのに有用である。
刺激ホルモンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を得、
次にこの遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作成し、
該組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ると
共にその形質転換体を利用して魚類の脳下垂体由来の生
殖腺刺激ホルモンを得る。こうして得られた魚類の生殖
腺刺激ホルモンは、魚類をはじめとする動物の成熟促進
・産卵促進するのに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は魚類の新規な生殖腺刺激
ホルモン、より詳細にはニシン目サケ科魚類の脳下垂体
由来の生殖腺刺激ホルモン、そのアミノ酸配列をコード
する遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該
組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転
換体を利用して産生された新規な魚類の脳下垂体由来の
生殖腺刺激ホルモンおよびその製造法に関する。本発明
はまた上記新規な生殖腺刺激ホルモンを用いた魚類をは
じめとする動物の成熟促進、産卵促進方法に関する。
ホルモン、より詳細にはニシン目サケ科魚類の脳下垂体
由来の生殖腺刺激ホルモン、そのアミノ酸配列をコード
する遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該
組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転
換体を利用して産生された新規な魚類の脳下垂体由来の
生殖腺刺激ホルモンおよびその製造法に関する。本発明
はまた上記新規な生殖腺刺激ホルモンを用いた魚類をは
じめとする動物の成熟促進、産卵促進方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
まで魚類から哺乳類に到るまで数種の生殖腺刺激ホルモ
ン（以下ＧＴＨ）が単離され、その多くは遺伝子の構造
まで明らかになっている。哺乳類においてＧＴＨは黄体
形成ホルモン（ＬＨ）および細胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）として知られ腺下垂体のゴナドトロフ細胞で産生分
泌される事が明らかにされている。動物一般にＧＴＨは
糖を含むタンパク質でαとβのサブユニットが１個ずつ
非共有的に結合する形になっている。生殖腺刺激ホルモ
ンは成熟促進効果を有するので魚類の養殖業および畜産
業にあっては魚類、家畜の採卵、成熟促進、排卵誘発剤
などへの応用が期待されている。
まで魚類から哺乳類に到るまで数種の生殖腺刺激ホルモ
ン（以下ＧＴＨ）が単離され、その多くは遺伝子の構造
まで明らかになっている。哺乳類においてＧＴＨは黄体
形成ホルモン（ＬＨ）および細胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）として知られ腺下垂体のゴナドトロフ細胞で産生分
泌される事が明らかにされている。動物一般にＧＴＨは
糖を含むタンパク質でαとβのサブユニットが１個ずつ
非共有的に結合する形になっている。生殖腺刺激ホルモ
ンは成熟促進効果を有するので魚類の養殖業および畜産
業にあっては魚類、家畜の採卵、成熟促進、排卵誘発剤
などへの応用が期待されている。
【０００３】そこで本発明者らは魚類養殖等の分野への
ＧＴＨの応用を考えサケ科魚類の１種であるサクラマス
ＧＴＨについて研究を重ねサクラマスＧＴＨのαおよび
β鎖のｃＤＮＡをそれぞれ２種類ずつ単離し、それらの
塩基配列およびそこにコードされるアミノ酸配列を決定
した。さらに本発明者らはこれらのｃＤＮＡを用いるこ
とにより遺伝子工学的にαおよびβ鎖を有するＧＴＨを
発現させることに成功し、容易かつ大量に高純度の目的
ＧＴＨを製造する方法を開発したのである。
ＧＴＨの応用を考えサケ科魚類の１種であるサクラマス
ＧＴＨについて研究を重ねサクラマスＧＴＨのαおよび
β鎖のｃＤＮＡをそれぞれ２種類ずつ単離し、それらの
塩基配列およびそこにコードされるアミノ酸配列を決定
した。さらに本発明者らはこれらのｃＤＮＡを用いるこ
とにより遺伝子工学的にαおよびβ鎖を有するＧＴＨを
発現させることに成功し、容易かつ大量に高純度の目的
ＧＴＨを製造する方法を開発したのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はニシン目サケ科
魚類の、特にサクラマスＧＴＨのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術
を用いてクローニングし、その遺伝子を発現させること
に成功し、容易且つ大量に高純度の目的ＧＴＨを製造す
ることを可能にしたのである。本発明は更に上記のよう
にして得られたＧＴＨおよび上記のようにして遺伝子組
換え技術を利用して得られたＧＴＨが共に良好な動物、
特に魚類の生殖腺刺激作用を示すことを確認してなされ
たものである。
魚類の、特にサクラマスＧＴＨのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術
を用いてクローニングし、その遺伝子を発現させること
に成功し、容易且つ大量に高純度の目的ＧＴＨを製造す
ることを可能にしたのである。本発明は更に上記のよう
にして得られたＧＴＨおよび上記のようにして遺伝子組
換え技術を利用して得られたＧＴＨが共に良好な動物、
特に魚類の生殖腺刺激作用を示すことを確認してなされ
たものである。
【０００５】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は以下に示す各種の方法により製造することが
できる。
る遺伝子は以下に示す各種の方法により製造することが
できる。
【０００６】該方法としては、例えば上記ＧＴＨの産生
細胞であるニシン目サケ科魚類であるヒラメの脳下垂体
からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｃＤ
ＮＡを合成し、次に適当なプライマーを用いてｃＤＮＡ
を鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によりＧＴＨの翻訳領域を増幅せしめ、ＧＴＨの
翻訳領域をコードするＤＮＡを得る。その他の方法とし
ては合成したｃＤＮＡを適当なベクターに接続して宿主
細胞内で増殖させ、適当なＤＮＡブローブを合成し、そ
のブローブを用いて遺伝子ライブラリーを検索し、目的
のＧＴＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含有す
るクローンを選別し、該クローンの有するベクターより
単離する方法などがある。以下に上記サクラマスの脳下
垂体から該遺伝子を調整する方法について詳述する。
細胞であるニシン目サケ科魚類であるヒラメの脳下垂体
からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｃＤ
ＮＡを合成し、次に適当なプライマーを用いてｃＤＮＡ
を鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によりＧＴＨの翻訳領域を増幅せしめ、ＧＴＨの
翻訳領域をコードするＤＮＡを得る。その他の方法とし
ては合成したｃＤＮＡを適当なベクターに接続して宿主
細胞内で増殖させ、適当なＤＮＡブローブを合成し、そ
のブローブを用いて遺伝子ライブラリーを検索し、目的
のＧＴＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含有す
るクローンを選別し、該クローンの有するベクターより
単離する方法などがある。以下に上記サクラマスの脳下
垂体から該遺伝子を調整する方法について詳述する。
【０００７】本発明の遺伝子を入手するためにはサクラ
マスの脳下垂体からＲＮＡを抽出する必要があるが、そ
のサクラマスとしては養殖のものでも天然のものでもい
ずれのものでも好適に使用することができる。サクラマ
スから脳下垂体を摘出するにあたっては常法に従って行
うことができ、こうして摘出された脳下垂体は直ちに液
体窒素、ドライアイス等を用いて直ちに凍結させた後必
要に応じて約−８０℃程度で使用時まで保存することが
できる。上記のようにして得られた脳下垂体からＲＮＡ
を抽出するにあたっては通常の方法によって行うことが
できるが、この様な方法としてはポリソームの分離、シ
ョ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげ
られる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法として
は、グアニジン・チオシアネート処理後ＣａＣｌ密度勾
配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウ
ム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，１８５２９４（１９７９））、パナジウ
ム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤で処理した後フェノール処理を行う方法
（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グアニジン・チ
オシアネート−ホットフェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシア
ネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チ
オシアネートで処理した後塩化リチウムで処理してＲＮ
Ａを沈澱させる方法などをあげることができる。上記脳
下垂体からのＲＮＡの抽出方法をより詳しく説明する
と、先ず凍結脳下垂体をＴｕｒｋｅｙ等の方法に従いグ
アニジン塩酸−酢酸ナトリウム溶液中で機械的に破砕し
て可溶化し必要に応じて遠心し沈澱を除去し、上清に２
分の１容のエタノールを加え生成した沈澱を遠心して回
収し全ＲＮＡを得る。このようにして得られたＲＮＡか
らさらにはポリＡ鎖を有するＲＮＡを通常の方法に従っ
て精製する。このような方法としてはオリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー法が
有利に使用できる。次にこのようにして得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素を用いて
２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成に用いられる。このｃ
ＤＮＡの合成方法としては通常の方法に従って行うこと
ができ、まずオリゴｄＴあるいはベクタープライマーを
プライマーとして、例えばＡＭＶ，ＭＭＬＶ，あるいは
ＲＳＶ等に由来する逆転写酵素を用いて第１鎖のＤＮＡ
を合成し、つぎにクレノウフラグメントで処理して２本
鎖ＤＮＡとした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓｌ
ヌクレアーゼで処理するかあるいはＳｌヌクレアーゼで
処理した後ターミナルトランスフェラーゼで処理するか
あるいは上記逆転写酵素を用いて得られた第１鎖のＤＮ
Ａ含有物にＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨ
を作用させる等の方法によって行うことができる。この
ような方法としてはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．
ｂｙ Ｓｈｅｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）
に記載された方法があげられるが実用上はこのｃＤＮＡ
の合成はアマシャム・ジャパン社、ストラタジーン社等
から市販されているｃＤＮＡ合成キットを利用すること
ができる。
マスの脳下垂体からＲＮＡを抽出する必要があるが、そ
のサクラマスとしては養殖のものでも天然のものでもい
ずれのものでも好適に使用することができる。サクラマ
スから脳下垂体を摘出するにあたっては常法に従って行
うことができ、こうして摘出された脳下垂体は直ちに液
体窒素、ドライアイス等を用いて直ちに凍結させた後必
要に応じて約−８０℃程度で使用時まで保存することが
できる。上記のようにして得られた脳下垂体からＲＮＡ
を抽出するにあたっては通常の方法によって行うことが
できるが、この様な方法としてはポリソームの分離、シ
ョ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげ
られる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法として
は、グアニジン・チオシアネート処理後ＣａＣｌ密度勾
配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウ
ム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，１８５２９４（１９７９））、パナジウ
ム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤で処理した後フェノール処理を行う方法
（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グアニジン・チ
オシアネート−ホットフェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシア
ネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チ
オシアネートで処理した後塩化リチウムで処理してＲＮ
Ａを沈澱させる方法などをあげることができる。上記脳
下垂体からのＲＮＡの抽出方法をより詳しく説明する
と、先ず凍結脳下垂体をＴｕｒｋｅｙ等の方法に従いグ
アニジン塩酸−酢酸ナトリウム溶液中で機械的に破砕し
て可溶化し必要に応じて遠心し沈澱を除去し、上清に２
分の１容のエタノールを加え生成した沈澱を遠心して回
収し全ＲＮＡを得る。このようにして得られたＲＮＡか
らさらにはポリＡ鎖を有するＲＮＡを通常の方法に従っ
て精製する。このような方法としてはオリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー法が
有利に使用できる。次にこのようにして得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素を用いて
２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成に用いられる。このｃ
ＤＮＡの合成方法としては通常の方法に従って行うこと
ができ、まずオリゴｄＴあるいはベクタープライマーを
プライマーとして、例えばＡＭＶ，ＭＭＬＶ，あるいは
ＲＳＶ等に由来する逆転写酵素を用いて第１鎖のＤＮＡ
を合成し、つぎにクレノウフラグメントで処理して２本
鎖ＤＮＡとした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓｌ
ヌクレアーゼで処理するかあるいはＳｌヌクレアーゼで
処理した後ターミナルトランスフェラーゼで処理するか
あるいは上記逆転写酵素を用いて得られた第１鎖のＤＮ
Ａ含有物にＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨ
を作用させる等の方法によって行うことができる。この
ような方法としてはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．
ｂｙ Ｓｈｅｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）
に記載された方法があげられるが実用上はこのｃＤＮＡ
の合成はアマシャム・ジャパン社、ストラタジーン社等
から市販されているｃＤＮＡ合成キットを利用すること
ができる。
【０００８】次に上記のようにして得られたｃＤＮＡは
これをポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）により目的とする配列を増幅せしめ、増幅したＤＮ
Ａは電気泳動により分離精製するなどの適当な方法によ
り精製し、適当なベクターに挿入し、次にこのようにし
て得られたベクターを適当な宿主に導入してクローニン
グする事によりさらに増幅させることができ、このベク
ターを元にして塩基配列の決定、発現ベクターの作成等
に用いることができる。
これをポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）により目的とする配列を増幅せしめ、増幅したＤＮ
Ａは電気泳動により分離精製するなどの適当な方法によ
り精製し、適当なベクターに挿入し、次にこのようにし
て得られたベクターを適当な宿主に導入してクローニン
グする事によりさらに増幅させることができ、このベク
ターを元にして塩基配列の決定、発現ベクターの作成等
に用いることができる。
【０００９】以上のようにして得られた組換え体から得
られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサム
・ギルバード法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌク
レオチド・チェインターミネション法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６，５６
０−５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
３０９（１９８１）等によって決定することができる。
られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサム
・ギルバード法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌク
レオチド・チェインターミネション法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６，５６
０−５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
３０９（１９８１）等によって決定することができる。
【００１０】かくして決定された本発明のＧＴＨ、とく
にサクラマス由来のＧＴＨの遺伝子を含むＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列は配列表１、配列表２、配列表３及び
配列表４に示されるとおりである。その配列はサクラマ
ス由来のＧＴＨの前駆体のＤＮＡ配列およびアミノ酸を
包含している。これらの配列のシグナルペプチドと成熟
タンパク質および糖鎖付加位置は表に示す位置にある。
またこのＤＮＡ配列は過去に発見されているＧＴＨ等と
有意の相同性を持つことが認められた。
にサクラマス由来のＧＴＨの遺伝子を含むＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列は配列表１、配列表２、配列表３及び
配列表４に示されるとおりである。その配列はサクラマ
ス由来のＧＴＨの前駆体のＤＮＡ配列およびアミノ酸を
包含している。これらの配列のシグナルペプチドと成熟
タンパク質および糖鎖付加位置は表に示す位置にある。
またこのＤＮＡ配列は過去に発見されているＧＴＨ等と
有意の相同性を持つことが認められた。
【００１１】また遺伝子組換え技術によればＤＮＡ鎖の
切断、削除、付加および結合さらにはＤＮＡ鎖中の塩基
の置換は通常の方法によって行うことができるので、本
発明の遺伝子は配列表１、配列表２、配列表３及び配列
表４に示された塩基配列に関するのみでなく、本発明の
目的を逸脱しない範囲において上記したような改変修飾
を加えたものにも関する。
切断、削除、付加および結合さらにはＤＮＡ鎖中の塩基
の置換は通常の方法によって行うことができるので、本
発明の遺伝子は配列表１、配列表２、配列表３及び配列
表４に示された塩基配列に関するのみでなく、本発明の
目的を逸脱しない範囲において上記したような改変修飾
を加えたものにも関する。
【００１２】このような手法の代表的なものとしては、
オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈおよび
Ｓ．Ｇｉｌｌａｍｒ”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ”（Ｊ．Ｋ．ＳｔｅｌｏｗおよびＡ．Ｈｏｌｌ
ａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．３，ｐ．１（１９
８１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のもの等があげられ
る。
オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈおよび
Ｓ．Ｇｉｌｌａｍｒ”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ”（Ｊ．Ｋ．ＳｔｅｌｏｗおよびＡ．Ｈｏｌｌ
ａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．３，ｐ．１（１９
８１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のもの等があげられ
る。
【００１３】本発明の遺伝子に含まれ、配列表１、配列
表２、配列表３及び配列表４に示された塩基配列を有す
る遺伝子の改変・修飾として特に好ましい目的とする糖
タンパク質の安定性、生物学的活性を高めるようなもの
があげられる。
表２、配列表３及び配列表４に示された塩基配列を有す
る遺伝子の改変・修飾として特に好ましい目的とする糖
タンパク質の安定性、生物学的活性を高めるようなもの
があげられる。
【００１４】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は上記組換えベクターより制限酵素を用いて通
常の方法によって処理することにより大量に得ることが
でき、こうして得られた遺伝子は遺伝子組換え技術によ
って利用されて高純度でかつ大量のＧＴＨのアミノ酸配
列および糖鎖を有する糖タンパク質を製造することがで
きる。
る遺伝子は上記組換えベクターより制限酵素を用いて通
常の方法によって処理することにより大量に得ることが
でき、こうして得られた遺伝子は遺伝子組換え技術によ
って利用されて高純度でかつ大量のＧＴＨのアミノ酸配
列および糖鎖を有する糖タンパク質を製造することがで
きる。
【００１５】このように本発明の遺伝子を利用するにあ
たっては通常の遺伝子組換え技術において用いられてい
る各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝子
は適当な発現ベクターに組換えられ、次に適当な発現用
宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し得られ
た組換え体を培養し、適当な発現誘導することにより目
的のタンパク質を取得することができる。本発明の遺伝
子を用いて目的のタンパク質を宿主に産生させるにあた
っては成熟タンパク質としてすなわちシグナルペプチド
を取り去った形で生産されることもできるし上記シグナ
ルペプチドをそのまま利用したりあるいは適当な宿主細
胞等に適合したシグナルペプチドを付加して宿主細胞等
から分泌生産させることもできる。
たっては通常の遺伝子組換え技術において用いられてい
る各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝子
は適当な発現ベクターに組換えられ、次に適当な発現用
宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し得られ
た組換え体を培養し、適当な発現誘導することにより目
的のタンパク質を取得することができる。本発明の遺伝
子を用いて目的のタンパク質を宿主に産生させるにあた
っては成熟タンパク質としてすなわちシグナルペプチド
を取り去った形で生産されることもできるし上記シグナ
ルペプチドをそのまま利用したりあるいは適当な宿主細
胞等に適合したシグナルペプチドを付加して宿主細胞等
から分泌生産させることもできる。
【００１６】このような場合において、それに用いる遺
伝子のＤＮＡ配列中には開始コドンおよび終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては分泌タンパク質前駆
体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ、
リン酸結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、バチ
ルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌およびグ
ラム陽性細菌に関連したものがあげられる。
伝子のＤＮＡ配列中には開始コドンおよび終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては分泌タンパク質前駆
体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ、
リン酸結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、バチ
ルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌およびグ
ラム陽性細菌に関連したものがあげられる。
【００１７】さらにまた、例えばインターフェロン、イ
ンターロイキン２、プロインスリン、各種ホルモン等と
一緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもでき
る。また、本発明のＧＴＨは融合蛋白質としても発現さ
せて得ることができる。本発明の遺伝子を発現ベクター
に組換えるにあたっては、公知の遺伝子組換え技術で用
いられる通常の方法に従って行うことができ、例えば各
種制限酵素による切断およびリガーゼによるライゲーシ
ョン処理等があげられる。
ンターロイキン２、プロインスリン、各種ホルモン等と
一緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもでき
る。また、本発明のＧＴＨは融合蛋白質としても発現さ
せて得ることができる。本発明の遺伝子を発現ベクター
に組換えるにあたっては、公知の遺伝子組換え技術で用
いられる通常の方法に従って行うことができ、例えば各
種制限酵素による切断およびリガーゼによるライゲーシ
ョン処理等があげられる。
【００１８】ここで利用される発現ベクターとしては、
宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使用
できるが、そのベクターの中に複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナル等を有するものが好ましく使用できる。ま
たこれらのベクターとしては各種バクテリア由来のも
の、動物ウイルス由来のもの、バクテリオファージ由来
のもの等があげられ、各種ウイルスベクター、各種プラ
スミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター
等があげられる。
宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使用
できるが、そのベクターの中に複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナル等を有するものが好ましく使用できる。ま
たこれらのベクターとしては各種バクテリア由来のも
の、動物ウイルス由来のもの、バクテリオファージ由来
のもの等があげられ、各種ウイルスベクター、各種プラ
スミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター
等があげられる。
【００１９】またこれらのベクターとしては大腸菌とく
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクタ
ー、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等が
あげられる。上記ベクターで利用できるプロモーターと
しては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラク
タース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラク
トース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に
よく知られたものがあげられる。
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクタ
ー、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等が
あげられる。上記ベクターで利用できるプロモーターと
しては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラク
タース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラク
トース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に
よく知られたものがあげられる。
【００２０】これらの遺伝子制御配列は、適宜それらを
組み合わせたり修飾したりして適当なベクターに組み込
んで、本発明の遺伝子発現用のベクターを構築すること
ができる。本発明の遺伝子発現用ベクターにはさらに複
数個の本発明の遺伝子を組み込んでその発現を行うこと
もできる。
組み合わせたり修飾したりして適当なベクターに組み込
んで、本発明の遺伝子発現用のベクターを構築すること
ができる。本発明の遺伝子発現用ベクターにはさらに複
数個の本発明の遺伝子を組み込んでその発現を行うこと
もできる。
【００２１】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子発現ベクターはこれを適当な宿主、特に宿主細
胞に通常知られた方法に従って導入して、その宿主細胞
を形質転換させ、次にそのようにして形質転換された宿
主細胞を培養等の方法により大量に増殖させること等に
より大量に形質転換体と呼ばれる該ＧＴＨのアミノ酸配
列を有する細胞を得ることができる。
る遺伝子発現ベクターはこれを適当な宿主、特に宿主細
胞に通常知られた方法に従って導入して、その宿主細胞
を形質転換させ、次にそのようにして形質転換された宿
主細胞を培養等の方法により大量に増殖させること等に
より大量に形質転換体と呼ばれる該ＧＴＨのアミノ酸配
列を有する細胞を得ることができる。
【００２２】ここで使用される宿主、特に宿主細胞とし
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよい。
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよい。
【００２３】上記宿主への本発明の遺伝子発現ベクター
およびこれによる形質転換方法としては通常遺伝子組換
え技術の分野で使用せられている方法を用いることがで
き、例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合し
たり、細胞をプロトプラスト化した後上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
およびこれによる形質転換方法としては通常遺伝子組換
え技術の分野で使用せられている方法を用いることがで
き、例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合し
たり、細胞をプロトプラスト化した後上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
【００２４】このようにして得られた形質転換体は、そ
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖した後、該遺
伝子の発現を誘導することもできる。
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖した後、該遺
伝子の発現を誘導することもできる。
【００２５】この形質転換体の増殖あるいは培養は、通
常の各種細胞培養用培地を用いて行うことができ、その
ようなものとしては例えば炭素源、窒素源、ビタミン、
アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、適宜肉汁、
ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレ
イショ、麦芽汁、牛乳、血液、血清、ホルモン、抗生物
質等を加えたものがあげられるが、好適な培地は一般に
広く市販されているものを使用してそれをそのままある
いは適当に改変して用いることができる。
常の各種細胞培養用培地を用いて行うことができ、その
ようなものとしては例えば炭素源、窒素源、ビタミン、
アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、適宜肉汁、
ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレ
イショ、麦芽汁、牛乳、血液、血清、ホルモン、抗生物
質等を加えたものがあげられるが、好適な培地は一般に
広く市販されているものを使用してそれをそのままある
いは適当に改変して用いることができる。
【００２６】上記形質転換体の増殖又は培養に当たって
は該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、撹
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖または培養す
る事により、あるいは該遺伝子の発現を誘導する事によ
り産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質は
通常の操作により分離採取することができる。
は該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、撹
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖または培養す
る事により、あるいは該遺伝子の発現を誘導する事によ
り産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質は
通常の操作により分離採取することができる。
【００２７】この分離採取方法としては、例えば細胞の
超音波破砕、機械的破砕、凍結および融解による方法、
浸透圧ショック等による方法のほか、培養上清から例え
ばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離す
る方法等があげられる。上記の分離方法に加えてさらに
目的とするタンパク質は、その物理化学的性質を利用し
て、一般に広く採用されている各種分離精製法を適用し
て精製をする事ができる。
超音波破砕、機械的破砕、凍結および融解による方法、
浸透圧ショック等による方法のほか、培養上清から例え
ばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離す
る方法等があげられる。上記の分離方法に加えてさらに
目的とするタンパク質は、その物理化学的性質を利用し
て、一般に広く採用されている各種分離精製法を適用し
て精製をする事ができる。
【００２８】この様な分離精製法としては、硫安等のタ
ンパク質沈澱剤を用いる沈澱処理の他、限外ろ過処理、
ゲルろ過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等あるいは
それらの組み合わせを用いることができる。さらにま
た、上記したような形質転換体から採取されたタンパク
質は、適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶
液で処理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で
その活性なものとすることができる。
ンパク質沈澱剤を用いる沈澱処理の他、限外ろ過処理、
ゲルろ過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等あるいは
それらの組み合わせを用いることができる。さらにま
た、上記したような形質転換体から採取されたタンパク
質は、適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶
液で処理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で
その活性なものとすることができる。
【００２９】本発明のＧＴＨ、特にニシン目サケ科魚類
の脳下垂体由来のＧＴＨはその生物活性を次に示す様な
方法で容易に確認することができる。つまり、ニジマス
等の生殖腺をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、その培養液に
得られたＧＴＨを添加し、性ステロイドホルモンの培養
液への分泌量の増加をモニターすることにより行うこと
ができる。
の脳下垂体由来のＧＴＨはその生物活性を次に示す様な
方法で容易に確認することができる。つまり、ニジマス
等の生殖腺をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、その培養液に
得られたＧＴＨを添加し、性ステロイドホルモンの培養
液への分泌量の増加をモニターすることにより行うこと
ができる。
【００３０】
【実施例】以下に実施例を記載し、本発明を詳細に説明
する。 実施例１ サクラマス下垂体の採取および保存 産卵後の雌サクラマスより脳下垂体を摘出し直ちにドラ
イアイスにて凍結した。採取した下垂体はＲＮＡ抽出ま
で−８０℃で保存した。
する。 実施例１ サクラマス下垂体の採取および保存 産卵後の雌サクラマスより脳下垂体を摘出し直ちにドラ
イアイスにて凍結した。採取した下垂体はＲＮＡ抽出ま
で−８０℃で保存した。
【００３１】実施例２ サクラマス脳下垂体のメッセンジャーＲＮＡの精製およ
びｃＤＮＡの合成 サクラマス脳下垂体０．５ｇを８Ｍ塩酸グアニジン（キ
シダ化学、特級）−１０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純
薬、特級）、ｐＨ４．２、５ｍｌ中でホモジナイズし日
立製作所製遠心分離機ＳＣＲ２０Ｂで４，０００ｇ、４
℃で１０分間遠心を行い上清を採取した。次にこれに
２．５ｍｌのエタノールを加え、生成した沈澱を上記遠
心分離機で１０，０００ｇ、１０分間遠心し、沈澱させ
た後沈澱を採取し上記ホモゲナイズに用いた溶液に溶解
した。この溶液に２．５ｍｌのエタノールを加え１０，
０００ｇ、１０分間遠心した後沈澱を回収し、全ＲＮＡ
を得た。
びｃＤＮＡの合成 サクラマス脳下垂体０．５ｇを８Ｍ塩酸グアニジン（キ
シダ化学、特級）−１０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純
薬、特級）、ｐＨ４．２、５ｍｌ中でホモジナイズし日
立製作所製遠心分離機ＳＣＲ２０Ｂで４，０００ｇ、４
℃で１０分間遠心を行い上清を採取した。次にこれに
２．５ｍｌのエタノールを加え、生成した沈澱を上記遠
心分離機で１０，０００ｇ、１０分間遠心し、沈澱させ
た後沈澱を採取し上記ホモゲナイズに用いた溶液に溶解
した。この溶液に２．５ｍｌのエタノールを加え１０，
０００ｇ、１０分間遠心した後沈澱を回収し、全ＲＮＡ
を得た。
【００３２】次にこれをバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｌｍＭ ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ７．５）に溶解しオリゴｄＴセル
ロースカラムに通すことによりポリ（Ａ）ＲＮＡを精製
した。カラムに吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡは滅菌した蒸
留水により回収した。次に精製したポリ（Ａ）ＲＮＡを
用いてｃＤＮＡ合成を行った。合成反応はＳｔｒａｎｔ
ａｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮ
Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ キットを用いてプロトコール
に従い２本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
ｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｌｍＭ ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ７．５）に溶解しオリゴｄＴセル
ロースカラムに通すことによりポリ（Ａ）ＲＮＡを精製
した。カラムに吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡは滅菌した蒸
留水により回収した。次に精製したポリ（Ａ）ＲＮＡを
用いてｃＤＮＡ合成を行った。合成反応はＳｔｒａｎｔ
ａｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮ
Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ キットを用いてプロトコール
に従い２本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００３３】実施例３ ＰＣＲ法によるＧＴＨ遺伝子の増幅 次にＰＣＲ法により目的遺伝子を増幅するため、以下に
示す配列を持つプライマーをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を
用いて合成した。 α鎖 Ａ：ＣＣＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ Ｂ：ＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧ βＩ鎖 Ａ：ＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡ
ＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣ Ｂ：ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＧＧ βＩＩ鎖 Ａ：ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴ
ＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣ Ｂ：ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＡ
示す配列を持つプライマーをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を
用いて合成した。 α鎖 Ａ：ＣＣＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ Ｂ：ＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧ βＩ鎖 Ａ：ＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡ
ＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣ Ｂ：ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＧＧ βＩＩ鎖 Ａ：ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴ
ＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣ Ｂ：ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＡ
【００３４】上記プライマーα鎖ＡおよびＢ、βＩ鎖Ａ
およびＢ、βＩＩ鎖ＡおよびＢという３種類の組み合わ
せをプライマーとしてＰＣＲを行った。二本鎖に合成し
たｃＤＮＡ２００ｎｇずつを用いて宝酒造社製ＤＮＡポ
リメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置はＭＪ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ社のＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＴＣ−１００を使用
し、ＰＣＲを行った。反応条件は変性 ９４℃ １分、
アニーリング ４５℃ ２分、反応 ７４℃ ８分と
し、これを１サイクルとして、合計３０サイクル反応を
繰り返した後、７４℃でさらに１０分間反応を行い増幅
を完了した。
およびＢ、βＩＩ鎖ＡおよびＢという３種類の組み合わ
せをプライマーとしてＰＣＲを行った。二本鎖に合成し
たｃＤＮＡ２００ｎｇずつを用いて宝酒造社製ＤＮＡポ
リメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置はＭＪ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ社のＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＴＣ−１００を使用
し、ＰＣＲを行った。反応条件は変性 ９４℃ １分、
アニーリング ４５℃ ２分、反応 ７４℃ ８分と
し、これを１サイクルとして、合計３０サイクル反応を
繰り返した後、７４℃でさらに１０分間反応を行い増幅
を完了した。
【００３５】実施例４ 増幅したＧＴＨ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の
決定 次に増幅したα鎖、β鎖のｃＤＮＡは１％アガロースゲ
ル電気泳動により分離し、増幅されたＤＮＡ部分のゲル
を切り出したのち、宝酒造社製ＤＮＡ回収用途遠心チュ
ーブＳＵＲＥＣ−０２を用いてプロトコールに従い回収
した。回収した増幅ＤＮＡは宝酒造製制限酵素ＳｍａＩ
で分解したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製プラスミドベクタ
ーＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋に、宝酒造社製Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ キットにより連結した。連結
したベクターを大腸菌ＸＬｌ Ｂｌｕｅに形質転換し、
α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを持つ形質転換体を得た。つぎ
にこれらのＤＮＡは東洋紡績株式会社製Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、３２−Ｐ標識ｄ−ＣＴＰの
取り込みによるサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏ，Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３−５４６７（１９７７））により塩基
配列の決定を行った。分析は尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、得られた泳動パターンから塩
基配列を解読した結果、α鎖をコードする２種類のｃＤ
ＮＡαＩおよびαＩＩ（ｃαＩ，ｃαＩＩ）およびβ鎖
をコードする２種類のクローンβＩおよびβＩＩ（ｃβ
Ｉ，ｃβＩＩ）を得た。ＤＮＡ断片ｃαＩ，ｃαＩＩ，
ｃβＩおよびｃβＩＩを保持する大腸菌ＸＬＩＢｌｕｅ
（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｓα
Ｉ，ｓαＩＩ，ｓβＩおよびｓβＩＩと命名）が、保存
のためのものとされている。
決定 次に増幅したα鎖、β鎖のｃＤＮＡは１％アガロースゲ
ル電気泳動により分離し、増幅されたＤＮＡ部分のゲル
を切り出したのち、宝酒造社製ＤＮＡ回収用途遠心チュ
ーブＳＵＲＥＣ−０２を用いてプロトコールに従い回収
した。回収した増幅ＤＮＡは宝酒造製制限酵素ＳｍａＩ
で分解したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製プラスミドベクタ
ーＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋に、宝酒造社製Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ キットにより連結した。連結
したベクターを大腸菌ＸＬｌ Ｂｌｕｅに形質転換し、
α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを持つ形質転換体を得た。つぎ
にこれらのＤＮＡは東洋紡績株式会社製Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、３２−Ｐ標識ｄ−ＣＴＰの
取り込みによるサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏ，Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３−５４６７（１９７７））により塩基
配列の決定を行った。分析は尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、得られた泳動パターンから塩
基配列を解読した結果、α鎖をコードする２種類のｃＤ
ＮＡαＩおよびαＩＩ（ｃαＩ，ｃαＩＩ）およびβ鎖
をコードする２種類のクローンβＩおよびβＩＩ（ｃβ
Ｉ，ｃβＩＩ）を得た。ＤＮＡ断片ｃαＩ，ｃαＩＩ，
ｃβＩおよびｃβＩＩを保持する大腸菌ＸＬＩＢｌｕｅ
（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｓα
Ｉ，ｓαＩＩ，ｓβＩおよびｓβＩＩと命名）が、保存
のためのものとされている。
【００３６】塩基配列の決定は制限酵素による消化でｄ
ｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを作製して行い、適当な
制限酵素部位がない場合はプライマーを合成して行っ
た。決定したサクラマスＧＴＨの塩基配列を配列表１、
配列表２、配列表３及び配列表４に示す。このｃＤＮＡ
の塩基配列は過去に発見されたＧＴＨなどと有意な相同
性を持つことが認められた。
ｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを作製して行い、適当な
制限酵素部位がない場合はプライマーを合成して行っ
た。決定したサクラマスＧＴＨの塩基配列を配列表１、
配列表２、配列表３及び配列表４に示す。このｃＤＮＡ
の塩基配列は過去に発見されたＧＴＨなどと有意な相同
性を持つことが認められた。
【００３７】実施例５ サクラマスＧＴＨ生産菌の作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨｃＤＮＡをも
とにＰＣＲ法により原核細胞用発現ＤＮＡを作製した。
すなわち制限酵素サイトおよび開始コドン（ＡＴＧ）を
含むタンパク質Ｎ末端側プライマー、終始コドンおよび
制限酵素サイトを含むタンパク質Ｃ末端側プライマーを
作製し、ＧＴＨｃＤＮＡをもとに成熟ＧＴＨの原核細胞
発現用断片を作製した。
とにＰＣＲ法により原核細胞用発現ＤＮＡを作製した。
すなわち制限酵素サイトおよび開始コドン（ＡＴＧ）を
含むタンパク質Ｎ末端側プライマー、終始コドンおよび
制限酵素サイトを含むタンパク質Ｃ末端側プライマーを
作製し、ＧＴＨｃＤＮＡをもとに成熟ＧＴＨの原核細胞
発現用断片を作製した。
【００３８】ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列は αＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡ
ＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＣ末端側：３′ＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＴ
ＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ αＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣ
ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＩＣ末端側：３′ＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧ３′ βＩＣ末端側：３′ＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴ
ＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣ
ＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣ３′ βＩＩＣ末端側：３′ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′
ＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＣ末端側：３′ＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＴ
ＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ αＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣ
ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＩＣ末端側：３′ＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧ３′ βＩＣ末端側：３′ＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴ
ＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣ
ＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣ３′ βＩＩＣ末端側：３′ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′
【００３９】これらのプライマーはそれぞれＡＢＩ社製
ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。合成したプライ
マーを用いてｃαＩ，ｃαＩＩ，ｃβＩおよびｃβＩＩ
２００ｎｇからＰＣＲ法により発現用ＤＮＡを増幅し
た。ＰＣＲには酵素として宝酒造社製ＤＮＡポリメラー
ゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置としてＭＪ Ｒｅｓｅ
ａｃｈ社製Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ
ＣｏｎｔｒｏｉｌｅｒＰＴＣ−１００を用いた。反応条
件は変性９４℃ １分、アニーリング４５℃２分、反応
７４℃ ３分としこれを１サイクルとして、合計３０
サイクル反応を繰り返した後、７４℃でさらに１０分反
応を行い増幅を完了した。増幅したＧＴＨ発現用遺伝子
は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、増幅され
たＤＮＡ部分のゲルを切り出した後宝酒造社製ＤＮＡ回
収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いてプロトコ
ールに従い回収した。回収したＤＮＡは宝酒造社製制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した。
ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。合成したプライ
マーを用いてｃαＩ，ｃαＩＩ，ｃβＩおよびｃβＩＩ
２００ｎｇからＰＣＲ法により発現用ＤＮＡを増幅し
た。ＰＣＲには酵素として宝酒造社製ＤＮＡポリメラー
ゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置としてＭＪ Ｒｅｓｅ
ａｃｈ社製Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ
ＣｏｎｔｒｏｉｌｅｒＰＴＣ−１００を用いた。反応条
件は変性９４℃ １分、アニーリング４５℃２分、反応
７４℃ ３分としこれを１サイクルとして、合計３０
サイクル反応を繰り返した後、７４℃でさらに１０分反
応を行い増幅を完了した。増幅したＧＴＨ発現用遺伝子
は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、増幅され
たＤＮＡ部分のゲルを切り出した後宝酒造社製ＤＮＡ回
収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いてプロトコ
ールに従い回収した。回収したＤＮＡは宝酒造社製制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した。
【００４０】次に大腸菌発現用ベクターｐＫＰ１５００
（ＭｉＫｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，１，３２７−３３２（１９８７））を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したものを用意し、これに上
記ＰＣＲにより増幅した発現用ＤＮＡを宝酒造社製ライ
ゲーションキットを用いて連結し、αＩ，αＩＩ，βＩ
およびβＩＩを持つ原核生物発現用ベクターｐＫＰα
Ｉ，ｐＫＰαＩＩ，ｐＫＰβＩおよびｐＫＰβＩＩを得
た（図１）。連結したそれぞれのベクターは大腸菌ＫＰ
３９９８に導入しＧＴＨの発現用ベクターを持つ形質転
換体を得た。
（ＭｉＫｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，１，３２７−３３２（１９８７））を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したものを用意し、これに上
記ＰＣＲにより増幅した発現用ＤＮＡを宝酒造社製ライ
ゲーションキットを用いて連結し、αＩ，αＩＩ，βＩ
およびβＩＩを持つ原核生物発現用ベクターｐＫＰα
Ｉ，ｐＫＰαＩＩ，ｐＫＰβＩおよびｐＫＰβＩＩを得
た（図１）。連結したそれぞれのベクターは大腸菌ＫＰ
３９９８に導入しＧＴＨの発現用ベクターを持つ形質転
換体を得た。
【００４１】実施例６ 大腸菌によるＧＴＨの製造 実施例５において作製されたＧＴＨ生産菌をＬＢ培地
（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエクス
トラクト、０．５％；ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５００ｍ
ｌにそれぞれ接種し、３７℃で１６時間培養した。得ら
れた培養液を１％グルコース、０．５％イーストエクス
トラクト、１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、
４５ｐｐｍアンピシリン、ｐＨ７．０に接種し、３７℃
で１６時間培養後集菌した。得られた菌体は３倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸
濁し、超音波破砕により破砕した。次にこの懸濁液を日
立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃｓｃｒ２０Ｂで１７，
０００ｇ２０分４℃で遠心し、沈澱物を得た。この沈澱
物は２０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭＥＤＴＡ，
０．０２％リゾチームに懸濁し室温で１時間撹拌した。
つぎにこの溶液に１０％デオキシコール酸を加えさらに
室温で１時間撹拌した。つぎにこの溶液は１７，０００
ｇ、２３℃、２０分遠心し沈澱物を蒸留水で洗浄した後
再び上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は６Ｍ
塩酸グアニジン、５０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．０に溶解
し、２４時間撹拌した。この溶液を１７，０００ｇ ２
０分間遠心し、上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 Ｐｅｌ
ｌｉｃｏｎ ＣａｓｓｅｔｔｅＳｙｓｔｅｍによる限外
ろ過で濃縮脱塩を行った。つぎに濃縮液は塩酸グアニジ
ン ４Ｍ，Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ溶液に溶解し、０．０５
Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０溶液に対して４８時間
室温で透析を行った。透析物は１７，０００ｇ、２０分
間遠心し、上清を凍結乾燥した。この凍結乾燥物はさら
に逆相ＨＰＬＣにより精製し、再生組換えＧＴＨサブユ
ニットを得た。得られたそれぞれのサブユニットについ
て会合を行い、αＩ鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴ
ＨＩ，αＩＩ鎖およびβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ
Ｉを得た。
（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエクス
トラクト、０．５％；ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５００ｍ
ｌにそれぞれ接種し、３７℃で１６時間培養した。得ら
れた培養液を１％グルコース、０．５％イーストエクス
トラクト、１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、
４５ｐｐｍアンピシリン、ｐＨ７．０に接種し、３７℃
で１６時間培養後集菌した。得られた菌体は３倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸
濁し、超音波破砕により破砕した。次にこの懸濁液を日
立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃｓｃｒ２０Ｂで１７，
０００ｇ２０分４℃で遠心し、沈澱物を得た。この沈澱
物は２０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭＥＤＴＡ，
０．０２％リゾチームに懸濁し室温で１時間撹拌した。
つぎにこの溶液に１０％デオキシコール酸を加えさらに
室温で１時間撹拌した。つぎにこの溶液は１７，０００
ｇ、２３℃、２０分遠心し沈澱物を蒸留水で洗浄した後
再び上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は６Ｍ
塩酸グアニジン、５０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．０に溶解
し、２４時間撹拌した。この溶液を１７，０００ｇ ２
０分間遠心し、上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 Ｐｅｌ
ｌｉｃｏｎ ＣａｓｓｅｔｔｅＳｙｓｔｅｍによる限外
ろ過で濃縮脱塩を行った。つぎに濃縮液は塩酸グアニジ
ン ４Ｍ，Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ溶液に溶解し、０．０５
Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０溶液に対して４８時間
室温で透析を行った。透析物は１７，０００ｇ、２０分
間遠心し、上清を凍結乾燥した。この凍結乾燥物はさら
に逆相ＨＰＬＣにより精製し、再生組換えＧＴＨサブユ
ニットを得た。得られたそれぞれのサブユニットについ
て会合を行い、αＩ鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴ
ＨＩ，αＩＩ鎖およびβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ
Ｉを得た。
【００４２】実施例７ サクラマスＧＴＨをコードする真核細胞発現用組換え体
プラスミドの作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐｓαＩ，ｐｓαＩＩ，ｐｓβ
ＩおよびｐｓβＩＩ５μｇを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００
μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｈバッファ
ーという）２０μｌに溶解し、制限酵素ＥＣＯＲＩ，Ｓ
ｍａＩ（宝酒造社製）をそれぞれ３０単位加え、３７
℃、２時間反応を行った。反応液をフェノール抽出後、
アガロースゲル電気泳動によりサクラマスＧＴＨのアミ
ノ酸配列をコードする部分を切り出し、宝酒造社製ＤＮ
Ａ回収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いて回収
し、サクラマスＧＴＨ翻訳領域を含む断片をそれぞれ回
収した。回収したＤＮＡはそれぞれ宝酒造社製ＤＮＡプ
ランティングキットにより平滑化しエタノール沈澱によ
り精製した。
プラスミドの作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐｓαＩ，ｐｓαＩＩ，ｐｓβ
ＩおよびｐｓβＩＩ５μｇを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００
μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｈバッファ
ーという）２０μｌに溶解し、制限酵素ＥＣＯＲＩ，Ｓ
ｍａＩ（宝酒造社製）をそれぞれ３０単位加え、３７
℃、２時間反応を行った。反応液をフェノール抽出後、
アガロースゲル電気泳動によりサクラマスＧＴＨのアミ
ノ酸配列をコードする部分を切り出し、宝酒造社製ＤＮ
Ａ回収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いて回収
し、サクラマスＧＴＨ翻訳領域を含む断片をそれぞれ回
収した。回収したＤＮＡはそれぞれ宝酒造社製ＤＮＡプ
ランティングキットにより平滑化しエタノール沈澱によ
り精製した。
【００４３】別に真核細胞発現用ベクターｐＳＶＬ（フ
ァルマシア社製）３μｇを３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔ
ａｔｅ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔ
ｅ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，６６ｎＭＫ−ａｃｔａｔｅ，
１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｔバ
ッファー）５０μｌに溶解し、宝酒造社製制限酵素Ｓｍ
ａＩ ５０Ｕで３７℃２時間消化し、フェノール抽出後
エタノール沈澱により精製した。次に平滑末端化された
サクラマスＧＴＨをコードする断片とＳｍａＩ消化され
たｐＳＶＬを宝酒造社製ライゲーションキットによりラ
イゲーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢプレート上でよく生育する
コロニーを選びＧＴＨのアミノ酸配列をコードするプラ
スミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよびｐ
ＳＶβＩＩを得た（図２）。これらの大腸菌を培養し、
常法に従い上記プラスミドを調整した。
ァルマシア社製）３μｇを３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔ
ａｔｅ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔ
ｅ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，６６ｎＭＫ−ａｃｔａｔｅ，
１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｔバ
ッファー）５０μｌに溶解し、宝酒造社製制限酵素Ｓｍ
ａＩ ５０Ｕで３７℃２時間消化し、フェノール抽出後
エタノール沈澱により精製した。次に平滑末端化された
サクラマスＧＴＨをコードする断片とＳｍａＩ消化され
たｐＳＶＬを宝酒造社製ライゲーションキットによりラ
イゲーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢプレート上でよく生育する
コロニーを選びＧＴＨのアミノ酸配列をコードするプラ
スミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよびｐ
ＳＶβＩＩを得た（図２）。これらの大腸菌を培養し、
常法に従い上記プラスミドを調整した。
【００４４】実施例８ 真核細胞による組換えサクラマスＧＴＨの生産 実施例７で得られたＧＴＨのアミノ酸配列をコードする
プラスミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよ
びｐＳＶβＩＩをアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−
１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ，２３，１７５
−１８２，１９８１）にＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌ
ｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１（１
９８３））により導入した。形質転換されたＣＯＳ−１
細胞は１０％牛胎盤血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社
製）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＧＩＢＵＣ
Ｏ社製）中で５日間、３７℃において培養し、培養液上
清を採取した。これらの培養液上清を限外ろ過により脱
塩した後、ＭｏｎｏＱカラムによりＧＴＨサブユニット
を精製し、それぞれのサブユニットの会合を行い、αＩ
鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ、αＩＩ鎖およ
びβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩＩを得た。
プラスミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよ
びｐＳＶβＩＩをアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−
１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ，２３，１７５
−１８２，１９８１）にＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌ
ｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１（１
９８３））により導入した。形質転換されたＣＯＳ−１
細胞は１０％牛胎盤血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社
製）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＧＩＢＵＣ
Ｏ社製）中で５日間、３７℃において培養し、培養液上
清を採取した。これらの培養液上清を限外ろ過により脱
塩した後、ＭｏｎｏＱカラムによりＧＴＨサブユニット
を精製し、それぞれのサブユニットの会合を行い、αＩ
鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ、αＩＩ鎖およ
びβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩＩを得た。
【００４５】実験．９ 生理活性の測定 ２年齢の雄ニジマスから取りだした精巣を用い、上記組
換えＧＴＨの性ステロイドの産生効果を調べた。実施例
６，８で得られた組換えＧＴＨはそれぞれ良好なステロ
イド産生効果を示したことからこれらのＧＴＨは魚類の
性腺刺激効果を持つことが判明した。配列表１は、サク
ラマスＧＴＨαＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示
す。配列表２は、サクラマスＧＴＨαＩＩ鎖のアミノ酸
配列および塩基配列を示す。配列表３は、サクラマスＧ
ＴＨβＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列
表４は、サクラマスＧＴＨβＩＩ鎖のアミノ酸配列およ
び塩基配列を示す。
換えＧＴＨの性ステロイドの産生効果を調べた。実施例
６，８で得られた組換えＧＴＨはそれぞれ良好なステロ
イド産生効果を示したことからこれらのＧＴＨは魚類の
性腺刺激効果を持つことが判明した。配列表１は、サク
ラマスＧＴＨαＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示
す。配列表２は、サクラマスＧＴＨαＩＩ鎖のアミノ酸
配列および塩基配列を示す。配列表３は、サクラマスＧ
ＴＨβＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列
表４は、サクラマスＧＴＨβＩＩ鎖のアミノ酸配列およ
び塩基配列を示す。
【図１】ｐＫＰαＩ，ｐＫＰαＩＩ，ｐＫＰβＩおよび
ｐＫＰβＩＩの作製過程を示す。
ｐＫＰβＩＩの作製過程を示す。
【図２】ｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよび
ｐＳＶβＩＩの作製過程を示す。
ｐＳＶβＩＩの作製過程を示す。
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は魚類の新規な生殖腺刺激
ホルモン、より詳細にはニシン目サケ科魚類の脳下垂体
由来の生殖腺刺激ホルモン、そのアミノ酸配列をコード
する遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該
組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転
換体を利用して産生された新規な魚類の脳下垂体由来の
生殖腺刺激ホルモンおよびその製造法に関する。本発明
はまた上記新規な生殖腺刺激ホルモンを用いた魚類をは
じめとする動物の成熟促進、産卵促進方法に関する。
ホルモン、より詳細にはニシン目サケ科魚類の脳下垂体
由来の生殖腺刺激ホルモン、そのアミノ酸配列をコード
する遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該
組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転
換体を利用して産生された新規な魚類の脳下垂体由来の
生殖腺刺激ホルモンおよびその製造法に関する。本発明
はまた上記新規な生殖腺刺激ホルモンを用いた魚類をは
じめとする動物の成熟促進、産卵促進方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
まで魚類から哺乳類に到るまで数種の生殖腺刺激ホルモ
ン（以下ＧＴＨ）が単離され、その多くは遺伝子の構造
まで明らかになっている。哺乳類においてＧＴＨは黄体
形成ホルモン（ＬＨ）および細胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）として知られ腺下垂体のゴナドトロフ細胞で産生分
泌される事が明らかにされている。動物一般にＧＴＨは
糖を含むタンパク質でαとβのサブユニットが１個ずつ
非共有的に結合する形になっている。生殖腺刺激ホルモ
ンは成熟促進効果を有するので魚類の養殖業および畜産
業にあっては魚類、家畜の採卵、成熟促進、排卵誘発剤
などへの応用が期待されている。
まで魚類から哺乳類に到るまで数種の生殖腺刺激ホルモ
ン（以下ＧＴＨ）が単離され、その多くは遺伝子の構造
まで明らかになっている。哺乳類においてＧＴＨは黄体
形成ホルモン（ＬＨ）および細胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）として知られ腺下垂体のゴナドトロフ細胞で産生分
泌される事が明らかにされている。動物一般にＧＴＨは
糖を含むタンパク質でαとβのサブユニットが１個ずつ
非共有的に結合する形になっている。生殖腺刺激ホルモ
ンは成熟促進効果を有するので魚類の養殖業および畜産
業にあっては魚類、家畜の採卵、成熟促進、排卵誘発剤
などへの応用が期待されている。
【０００３】そこで本発明者らは魚類養殖等の分野への
ＧＴＨの応用を考えサケ科魚類の１種であるサクラマス
ＧＴＨについて研究を重ねサクラマスＧＴＨのαおよび
β鎖のｃＤＮＡをそれぞれ２種類ずつ単離し、それらの
塩基配列およびそこにコードされるアミノ酸配列を決定
した。さらに本発明者らはこれらのｃＤＮＡを用いるこ
とにより遺伝子工学的にαおよびβ鎖を有するＧＴＨを
発現させることに成功し、容易かつ大量に高純度の目的
ＧＴＨを製造する方法を開発したのである。
ＧＴＨの応用を考えサケ科魚類の１種であるサクラマス
ＧＴＨについて研究を重ねサクラマスＧＴＨのαおよび
β鎖のｃＤＮＡをそれぞれ２種類ずつ単離し、それらの
塩基配列およびそこにコードされるアミノ酸配列を決定
した。さらに本発明者らはこれらのｃＤＮＡを用いるこ
とにより遺伝子工学的にαおよびβ鎖を有するＧＴＨを
発現させることに成功し、容易かつ大量に高純度の目的
ＧＴＨを製造する方法を開発したのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はニシン目サケ科
魚類の、特にサクラマスＧＴＨのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術
を用いてクローニングし、その遺伝子を発現させること
に成功し、容易且つ大量に高純度の目的ＧＴＨを製造す
ることを可能にしたのである。本発明は更に上記のよう
にして得られたＧＴＨおよび上記のようにして遺伝子組
換え技術を利用して得られたＧＴＨが共に良好な動物、
特に魚類の生殖腺刺激作用を示すことを確認してなされ
たものである。
魚類の、特にサクラマスＧＴＨのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術
を用いてクローニングし、その遺伝子を発現させること
に成功し、容易且つ大量に高純度の目的ＧＴＨを製造す
ることを可能にしたのである。本発明は更に上記のよう
にして得られたＧＴＨおよび上記のようにして遺伝子組
換え技術を利用して得られたＧＴＨが共に良好な動物、
特に魚類の生殖腺刺激作用を示すことを確認してなされ
たものである。
【０００５】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は以下に示す各種の方法により製造することが
できる。
る遺伝子は以下に示す各種の方法により製造することが
できる。
【０００６】該方法としては、例えば上記ＧＴＨの産生
細胞であるニシン目サケ科魚類であるヒラメの脳下垂体
からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｃＤ
ＮＡを合成し、次に適当なプライマーを用いてｃＤＮＡ
を鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によりＧＴＨの翻訳領域を増幅せしめ、ＧＴＨの
翻訳領域をコードするＤＮＡを得る。その他の方法とし
ては合成したｃＤＮＡを適当なベクターに接続して宿主
細胞内で増殖させ、適当なＤＮＡブローブを合成し、そ
のブローブを用いて遺伝子ライブラリーを検索し、目的
のＧＴＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含有す
るクローンを選別し、該クローンの有するベクターより
単離する方法などがある。以下に上記サクラマスの脳下
垂体から該遺伝子を調整する方法について詳述する。
細胞であるニシン目サケ科魚類であるヒラメの脳下垂体
からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｃＤ
ＮＡを合成し、次に適当なプライマーを用いてｃＤＮＡ
を鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によりＧＴＨの翻訳領域を増幅せしめ、ＧＴＨの
翻訳領域をコードするＤＮＡを得る。その他の方法とし
ては合成したｃＤＮＡを適当なベクターに接続して宿主
細胞内で増殖させ、適当なＤＮＡブローブを合成し、そ
のブローブを用いて遺伝子ライブラリーを検索し、目的
のＧＴＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含有す
るクローンを選別し、該クローンの有するベクターより
単離する方法などがある。以下に上記サクラマスの脳下
垂体から該遺伝子を調整する方法について詳述する。
【０００７】本発明の遺伝子を入手するためにはサクラ
マスの脳下垂体からＲＮＡを抽出する必要があるが、そ
のサクラマスとしては養殖のものでも天然のものでもい
ずれのものでも好適に使用することができる。サクラマ
スから脳下垂体を摘出するにあたっては常法に従って行
うことができ、こうして摘出された脳下垂体は直ちに液
体窒素、ドライアイス等を用いて直ちに凍結させた後必
要に応じて約−８０℃程度で使用時まで保存することが
できる。上記のようにして得られた脳下垂体からＲＮＡ
を抽出するにあたっては通常の方法によって行うことが
できるが、この様な方法としてはポリソームの分離、シ
ョ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげ
られる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法として
は、グアニジン・チオシアネート処理後ＣａＣｌ密度勾
配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウ
ム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，１８５２９４（１９７９））、パナジウ
ム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤で処理した後フェノール処理を行う方法
（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グアニジン・チ
オシアネート−ホットフェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシア
ネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チ
オシアネートで処理した後塩化リチウムで処理してＲＮ
Ａを沈澱させる方法などをあげることができる。上記脳
下垂体からのＲＮＡの抽出方法をより詳しく説明する
と、先ず凍結脳下垂体をＴｕｒｋｅｙ等の方法に従いグ
アニジン塩酸−酢酸ナトリウム溶液中で機械的に破砕し
て可溶化し必要に応じて遠心し沈澱を除去し、上清に２
分の１容のエタノールを加え生成した沈澱を遠心して回
収し全ＲＮＡを得る。このようにして得られたＲＮＡか
らさらにはポリＡ鎖を有するＲＮＡを通常の方法に従っ
て精製する。このような方法としてはオリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー法が
有利に使用できる。次にこのようにして得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素を用いて
２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成に用いられる。このｃ
ＤＮＡの合成方法としては通常の方法に従って行うこと
ができ、まずオリゴｄＴあるいはベクタープライマーを
プライマーとして、例えばＡＭＶ，ＭＭＬＶ，あるいは
ＲＳＶ等に由来する逆転写酵素を用いて第１鎖のＤＮＡ
を合成し、つぎにクレノウフラグメントで処理して２本
鎖ＤＮＡとした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓｌ
ヌクレアーゼで処理するかあるいはＳｌヌクレアーゼで
処理した後ターミナルトランスフェラーゼで処理するか
あるいは上記逆転写酵素を用いて得られた第１鎖のＤＮ
Ａ含有物にＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨ
を作用させる等の方法によって行うことができる。この
ような方法としてはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．
ｂｙ Ｓｈｅｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）
に記載された方法があげられるが実用上はこのｃＤＮＡ
の合成はアマシャム・ジャパン社、ストラタジーン社等
から市販されているｃＤＮＡ合成キットを利用すること
ができる。
マスの脳下垂体からＲＮＡを抽出する必要があるが、そ
のサクラマスとしては養殖のものでも天然のものでもい
ずれのものでも好適に使用することができる。サクラマ
スから脳下垂体を摘出するにあたっては常法に従って行
うことができ、こうして摘出された脳下垂体は直ちに液
体窒素、ドライアイス等を用いて直ちに凍結させた後必
要に応じて約−８０℃程度で使用時まで保存することが
できる。上記のようにして得られた脳下垂体からＲＮＡ
を抽出するにあたっては通常の方法によって行うことが
できるが、この様な方法としてはポリソームの分離、シ
ョ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげ
られる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法として
は、グアニジン・チオシアネート処理後ＣａＣｌ密度勾
配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウ
ム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，１８５２９４（１９７９））、パナジウ
ム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤で処理した後フェノール処理を行う方法
（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グアニジン・チ
オシアネート−ホットフェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシア
ネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チ
オシアネートで処理した後塩化リチウムで処理してＲＮ
Ａを沈澱させる方法などをあげることができる。上記脳
下垂体からのＲＮＡの抽出方法をより詳しく説明する
と、先ず凍結脳下垂体をＴｕｒｋｅｙ等の方法に従いグ
アニジン塩酸−酢酸ナトリウム溶液中で機械的に破砕し
て可溶化し必要に応じて遠心し沈澱を除去し、上清に２
分の１容のエタノールを加え生成した沈澱を遠心して回
収し全ＲＮＡを得る。このようにして得られたＲＮＡか
らさらにはポリＡ鎖を有するＲＮＡを通常の方法に従っ
て精製する。このような方法としてはオリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー法が
有利に使用できる。次にこのようにして得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素を用いて
２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成に用いられる。このｃ
ＤＮＡの合成方法としては通常の方法に従って行うこと
ができ、まずオリゴｄＴあるいはベクタープライマーを
プライマーとして、例えばＡＭＶ，ＭＭＬＶ，あるいは
ＲＳＶ等に由来する逆転写酵素を用いて第１鎖のＤＮＡ
を合成し、つぎにクレノウフラグメントで処理して２本
鎖ＤＮＡとした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓｌ
ヌクレアーゼで処理するかあるいはＳｌヌクレアーゼで
処理した後ターミナルトランスフェラーゼで処理するか
あるいは上記逆転写酵素を用いて得られた第１鎖のＤＮ
Ａ含有物にＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨ
を作用させる等の方法によって行うことができる。この
ような方法としてはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．
ｂｙ Ｓｈｅｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）
に記載された方法があげられるが実用上はこのｃＤＮＡ
の合成はアマシャム・ジャパン社、ストラタジーン社等
から市販されているｃＤＮＡ合成キットを利用すること
ができる。
【０００８】次に上記のようにして得られたｃＤＮＡは
これをポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）により目的とする配列を増幅せしめ、増幅したＤＮ
Ａは電気泳動により分離精製するなどの適当な方法によ
り精製し、適当なベクターに挿入し、次にこのようにし
て得られたベクターを適当な宿主に導入してクローニン
グする事によりさらに増幅させることができ、このベク
ターを元にして塩基配列の決定、発現ベクターの作成等
に用いることができる。
これをポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）により目的とする配列を増幅せしめ、増幅したＤＮ
Ａは電気泳動により分離精製するなどの適当な方法によ
り精製し、適当なベクターに挿入し、次にこのようにし
て得られたベクターを適当な宿主に導入してクローニン
グする事によりさらに増幅させることができ、このベク
ターを元にして塩基配列の決定、発現ベクターの作成等
に用いることができる。
【０００９】以上のようにして得られた組換え体から得
られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサム
・ギルバード法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌク
レオチド・チェインターミネション法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６，５６
０−５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
３０９（１９８１）等によって決定することができる。
られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサム
・ギルバード法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌク
レオチド・チェインターミネション法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６，５６
０−５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
３０９（１９８１）等によって決定することができる。
【００１０】かくして決定された本発明のＧＴＨ、とく
にサクラマス由来のＧＴＨの遺伝子を含むＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列は配列表１、配列表２、配列表３及び
配列表４に示されるとおりである。その配列はサクラマ
ス由来のＧＴＨの前駆体のＤＮＡ配列およびアミノ酸を
包含している。これらの配列のシグナルペプチドと成熟
タンパク質および糖鎖付加位置は表に示す位置にある。
またこのＤＮＡ配列は過去に発見されているＧＴＨ等と
有意の相同性を持つことが認められた。
にサクラマス由来のＧＴＨの遺伝子を含むＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列は配列表１、配列表２、配列表３及び
配列表４に示されるとおりである。その配列はサクラマ
ス由来のＧＴＨの前駆体のＤＮＡ配列およびアミノ酸を
包含している。これらの配列のシグナルペプチドと成熟
タンパク質および糖鎖付加位置は表に示す位置にある。
またこのＤＮＡ配列は過去に発見されているＧＴＨ等と
有意の相同性を持つことが認められた。
【００１１】また遺伝子組換え技術によればＤＮＡ鎖の
切断、削除、付加および結合さらにはＤＮＡ鎖中の塩基
の置換は通常の方法によって行うことができるので、本
発明の遺伝子は配列表１、配列表２、配列表３及び配列
表４に示された塩基配列に関するのみでなく、本発明の
目的を逸脱しない範囲において上記したような改変修飾
を加えたものにも関する。
切断、削除、付加および結合さらにはＤＮＡ鎖中の塩基
の置換は通常の方法によって行うことができるので、本
発明の遺伝子は配列表１、配列表２、配列表３及び配列
表４に示された塩基配列に関するのみでなく、本発明の
目的を逸脱しない範囲において上記したような改変修飾
を加えたものにも関する。
【００１２】このような手法の代表的なものとしては、
オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈおよび
Ｓ．Ｇｉｌｌａｍｒ”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ”（Ｊ．Ｋ．ＳｔｅｌｏｗおよびＡ．Ｈｏｌｌ
ａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．３，ｐ．１（１９
８１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のもの等があげられ
る。
オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈおよび
Ｓ．Ｇｉｌｌａｍｒ”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ”（Ｊ．Ｋ．ＳｔｅｌｏｗおよびＡ．Ｈｏｌｌ
ａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．３，ｐ．１（１９
８１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のもの等があげられ
る。
【００１３】本発明の遺伝子に含まれ、配列表１、配列
表２、配列表３及び配列表４に示された塩基配列を有す
る遺伝子の改変・修飾として特に好ましい目的とする糖
タンパク質の安定性、生物学的活性を高めるようなもの
があげられる。
表２、配列表３及び配列表４に示された塩基配列を有す
る遺伝子の改変・修飾として特に好ましい目的とする糖
タンパク質の安定性、生物学的活性を高めるようなもの
があげられる。
【００１４】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は上記組換えベクターより制限酵素を用いて通
常の方法によって処理することにより大量に得ることが
でき、こうして得られた遺伝子は遺伝子組換え技術によ
って利用されて高純度でかつ大量のＧＴＨのアミノ酸配
列および糖鎖を有する糖タンパク質を製造することがで
きる。
る遺伝子は上記組換えベクターより制限酵素を用いて通
常の方法によって処理することにより大量に得ることが
でき、こうして得られた遺伝子は遺伝子組換え技術によ
って利用されて高純度でかつ大量のＧＴＨのアミノ酸配
列および糖鎖を有する糖タンパク質を製造することがで
きる。
【００１５】このように本発明の遺伝子を利用するにあ
たっては通常の遺伝子組換え技術において用いられてい
る各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝子
は適当な発現ベクターに組換えられ、次に適当な発現用
宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し得られ
た組換え体を培養し、適当な発現誘導することにより目
的のタンパク質を取得することができる。本発明の遺伝
子を用いて目的のタンパク質を宿主に産生させるにあた
っては成熟タンパク質としてすなわちシグナルペプチド
を取り去った形で生産されることもできるし上記シグナ
ルペプチドをそのまま利用したりあるいは適当な宿主細
胞等に適合したシグナルペプチドを付加して宿主細胞等
から分泌生産させることもできる。
たっては通常の遺伝子組換え技術において用いられてい
る各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝子
は適当な発現ベクターに組換えられ、次に適当な発現用
宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し得られ
た組換え体を培養し、適当な発現誘導することにより目
的のタンパク質を取得することができる。本発明の遺伝
子を用いて目的のタンパク質を宿主に産生させるにあた
っては成熟タンパク質としてすなわちシグナルペプチド
を取り去った形で生産されることもできるし上記シグナ
ルペプチドをそのまま利用したりあるいは適当な宿主細
胞等に適合したシグナルペプチドを付加して宿主細胞等
から分泌生産させることもできる。
【００１６】このような場合において、それに用いる遣
伝子のＤＮＡ配列中には開始コドンおよび終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては分泌タンパク質前駆
体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ、
リン酸結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、バチ
ルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌およびグ
ラム陽姓細菌に関連したものがあげられる。
伝子のＤＮＡ配列中には開始コドンおよび終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては分泌タンパク質前駆
体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ、
リン酸結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、バチ
ルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌およびグ
ラム陽姓細菌に関連したものがあげられる。
【００１７】さらにまた、例えばインターフェロン、イ
ンターロイキン２、プロインスリン、各種ホルモン等と
一緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもでき
る。また、本発明のＧＴＨは融合蛋白質としても発現さ
せて得ることができる。本発明の遺伝子を発現ベクター
に組換えるにあたっては、公知の遺伝子組換え技術で用
いられる通常の方法に従って行うことができ、例えば各
種制限酵素による切断およびリガーゼによるライゲーシ
ョン処理等があげられる。
ンターロイキン２、プロインスリン、各種ホルモン等と
一緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもでき
る。また、本発明のＧＴＨは融合蛋白質としても発現さ
せて得ることができる。本発明の遺伝子を発現ベクター
に組換えるにあたっては、公知の遺伝子組換え技術で用
いられる通常の方法に従って行うことができ、例えば各
種制限酵素による切断およびリガーゼによるライゲーシ
ョン処理等があげられる。
【００１８】ここで利用される発現ベクターとしては、
宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使用
できるが、そのベクターの中に複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナル等を有するものが好ましく使用できる。ま
たこれらのベクターとしては各種バクテリア由来のも
の、動物ウイルス由来のもの、バクテリオファージ由来
のもの等があげられ、各種ウイルスベクター、各種プラ
スミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター
等があげられる。
宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使用
できるが、そのベクターの中に複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナル等を有するものが好ましく使用できる。ま
たこれらのベクターとしては各種バクテリア由来のも
の、動物ウイルス由来のもの、バクテリオファージ由来
のもの等があげられ、各種ウイルスベクター、各種プラ
スミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター
等があげられる。
【００１９】またこれらのベクターとしては大腸菌とく
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクタ
ー、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等が
あげられる。上記ベクターで利用できるプロモーターと
しては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラク
タース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラク
トース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に
よく知られたものがあげられる。
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクタ
ー、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等が
あげられる。上記ベクターで利用できるプロモーターと
しては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラク
タース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラク
トース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に
よく知られたものがあげられる。
【００２０】これらの遺伝子制御配列は、適宜それらを
組み合わせたり修飾したりして適当なベクターに組み込
んで、本発明の遺伝子発現用のベクターを構築すること
ができる。本発明の遺伝子発現用ベクターにはさらに複
数個の本発明の遺伝子を組み込んでその発現を行うこと
もできる。
組み合わせたり修飾したりして適当なベクターに組み込
んで、本発明の遺伝子発現用のベクターを構築すること
ができる。本発明の遺伝子発現用ベクターにはさらに複
数個の本発明の遺伝子を組み込んでその発現を行うこと
もできる。
【００２１】本発明のＧＴＨのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子発現ベクターはこれを適当な宿主、特に宿主細
胞に通常知られた方法に従って導入して、その宿主細胞
を形質転換させ、次にそのようにして形質転換された宿
主細胞を培養等の方法により大量に増殖させること等に
より大量に形質転換体と呼ばれる該ＧＴＨのアミノ酸配
列を有する細胞を得ることができる。
る遺伝子発現ベクターはこれを適当な宿主、特に宿主細
胞に通常知られた方法に従って導入して、その宿主細胞
を形質転換させ、次にそのようにして形質転換された宿
主細胞を培養等の方法により大量に増殖させること等に
より大量に形質転換体と呼ばれる該ＧＴＨのアミノ酸配
列を有する細胞を得ることができる。
【００２２】ここで使用される宿主、特に宿主細胞とし
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよい。
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよい。
【００２３】上記宿主への本発明の遺伝子発現ベクター
およびこれによる形質転換方法としては通常遺伝子組換
え技術の分野で使用せられている方法を用いることがで
き、例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合し
たり、細胞をプロトプラスト化した後上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
およびこれによる形質転換方法としては通常遺伝子組換
え技術の分野で使用せられている方法を用いることがで
き、例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合し
たり、細胞をプロトプラスト化した後上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
【００２４】このようにして得られた形質転換体は、そ
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖した後、該遺
伝子の発現を誘導することもできる。
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖した後、該遺
伝子の発現を誘導することもできる。
【００２５】この形質転換体の増殖あるいは培養は、通
常の各種細胞培養用培地を用いて行うことができ、その
ようなものとしては例えば炭素源、窒素源、ビタミン、
アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、適宜肉汁、
ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレ
イショ、麦芽汁、牛乳、血液、血清、ホルモン、抗生物
質等を加えたものがあげられるが、好適な培地は一般に
広く市販されているものを使用してそれをそのままある
いは適当に改変して用いることができる。
常の各種細胞培養用培地を用いて行うことができ、その
ようなものとしては例えば炭素源、窒素源、ビタミン、
アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、適宜肉汁、
ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレ
イショ、麦芽汁、牛乳、血液、血清、ホルモン、抗生物
質等を加えたものがあげられるが、好適な培地は一般に
広く市販されているものを使用してそれをそのままある
いは適当に改変して用いることができる。
【００２６】上記形質転換体の増殖又は培養に当たって
は該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、撹
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖または培養す
る事により、あるいは該遺伝子の発現を誘導する事によ
り産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質は
通常の操作により分離採取することができる。
は該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、撹
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖または培養す
る事により、あるいは該遺伝子の発現を誘導する事によ
り産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質は
通常の操作により分離採取することができる。
【００２７】この分離採取方法としては、例えば細胞の
超音波破砕、機械的破砕、凍結および融解による方法、
浸透圧ショック等による方法のほか、培養上清から例え
ばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離す
る方法等があげられる。上記の分離方法に加えてさらに
目的とするタンパク質は、その物理化学的性質を利用し
て、一般に広く採用されている各種分離精製法を適用し
て精製をする事ができる。
超音波破砕、機械的破砕、凍結および融解による方法、
浸透圧ショック等による方法のほか、培養上清から例え
ばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離す
る方法等があげられる。上記の分離方法に加えてさらに
目的とするタンパク質は、その物理化学的性質を利用し
て、一般に広く採用されている各種分離精製法を適用し
て精製をする事ができる。
【００２８】この様な分離精製法としては、硫安等のタ
ンパク質沈澱剤を用いる沈澱処理の他、限外ろ過処理、
ゲルろ過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等あるいは
それらの組み合わせを用いることができる。さらにま
た、上記したような形質転換体から採取されたタンパク
質は、適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶
液で処理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で
その活性なものとすることができる。
ンパク質沈澱剤を用いる沈澱処理の他、限外ろ過処理、
ゲルろ過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等あるいは
それらの組み合わせを用いることができる。さらにま
た、上記したような形質転換体から採取されたタンパク
質は、適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶
液で処理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で
その活性なものとすることができる。
【００２９】本発明のＧＴＨ、特にニシン目サケ科魚類
の脳下垂体由来のＧＴＨはその生物活性を次に示す様な
方法で容易に確認することができる。つまり、ニジマス
等の生殖腺をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、その培養液に
得られたＧＴＨを添加し、性ステロイドホルモンの培養
液への分泌量の増加をモニターすることにより行うこと
ができる。
の脳下垂体由来のＧＴＨはその生物活性を次に示す様な
方法で容易に確認することができる。つまり、ニジマス
等の生殖腺をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、その培養液に
得られたＧＴＨを添加し、性ステロイドホルモンの培養
液への分泌量の増加をモニターすることにより行うこと
ができる。
【００３０】
【実施例】以下に実施例を記載し、本発明を詳細に説明
する。 実施例１ サクラマス下垂体の採取および保存 産卵後の雌サクラマスより脳下垂体を摘出し直ちにドラ
イアイスにて凍結した。採取した下垂体はＲＮＡ抽出ま
で−８０℃で保存した。
する。 実施例１ サクラマス下垂体の採取および保存 産卵後の雌サクラマスより脳下垂体を摘出し直ちにドラ
イアイスにて凍結した。採取した下垂体はＲＮＡ抽出ま
で−８０℃で保存した。
【００３１】実施例２ サクラマス脳下垂体のメッセンジャーＲＮＡの精製およ
びｃＤＮＡの合成 サクラマス脳下垂体０．５ｇを８Ｍ塩酸グアニジン（キ
シダ化学、特級）−１０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純
薬、特級）、ｐＨ４．２、５ｍｌ中でホモジナイズし日
立製作所製遠心分離機ＳＣＲ２０Ｂで４，０００ｇ、４
℃で１０分間遠心を行い上清を採取した。次にこれに
２．５ｍｌのエタノールを加え、生成した沈澱を上記遠
心分離機で１０，０００ｇ、１０分間遠心し、沈澱させ
た後沈澱を採取し上記ホモゲナイズに用いた溶液に溶解
した。この溶液に２．５ｍｌのエタノールを加え１０，
０００ｇ、１０分間遠心した後沈澱を回収し、全ＲＮＡ
を得た。
びｃＤＮＡの合成 サクラマス脳下垂体０．５ｇを８Ｍ塩酸グアニジン（キ
シダ化学、特級）−１０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純
薬、特級）、ｐＨ４．２、５ｍｌ中でホモジナイズし日
立製作所製遠心分離機ＳＣＲ２０Ｂで４，０００ｇ、４
℃で１０分間遠心を行い上清を採取した。次にこれに
２．５ｍｌのエタノールを加え、生成した沈澱を上記遠
心分離機で１０，０００ｇ、１０分間遠心し、沈澱させ
た後沈澱を採取し上記ホモゲナイズに用いた溶液に溶解
した。この溶液に２．５ｍｌのエタノールを加え１０，
０００ｇ、１０分間遠心した後沈澱を回収し、全ＲＮＡ
を得た。
【００３２】次にこれをバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ７．５）に溶解しオリゴｄＴセル
ロースカラムに通すことによりポリ（Ａ）ＲＮＡを精製
した。カラムに吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡは滅菌した蒸
留水により回収した。次に精製したポリ（Ａ）ＲＮＡを
用いてｃＤＮＡ合成を行った。合成反応はＳｔｒａｎｔ
ａｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮ
Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ キットを用いてプロトコール
に従い２本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
ｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ７．５）に溶解しオリゴｄＴセル
ロースカラムに通すことによりポリ（Ａ）ＲＮＡを精製
した。カラムに吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡは滅菌した蒸
留水により回収した。次に精製したポリ（Ａ）ＲＮＡを
用いてｃＤＮＡ合成を行った。合成反応はＳｔｒａｎｔ
ａｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮ
Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ キットを用いてプロトコール
に従い２本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００３３】実施例３ ＰＣＲ法によるＧＴＨ遺伝子の増幅 次にＰＣＲ法により目的遺伝子を増幅するため、以下に
示す配列を持つプライマーをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を
用いて合成した。 α鎖 Ａ：ＣＣＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ Ｂ：ＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧ βＩ鎖 Ａ：ＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡ
ＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣ Ｂ：ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＧＧ βＩＩ鎖 Ａ：ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴ
ＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣ Ｂ：ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＡ
示す配列を持つプライマーをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を
用いて合成した。 α鎖 Ａ：ＣＣＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ Ｂ：ＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧ βＩ鎖 Ａ：ＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡ
ＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣ Ｂ：ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＧＧ βＩＩ鎖 Ａ：ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴ
ＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣ Ｂ：ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＡ
【００３４】上記プライマーα鎖ＡおよびＢ、βＩ鎖Ａ
およびＢ、βＩＩ鎖ＡおよびＢという３種類の組み合わ
せをプライマーとしてＰＣＲを行った。二本鎖に合成し
たｃＤＮＡ２００ｎｇずつを用いて宝酒造社製ＤＮＡポ
リメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置はＭＪ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ社のＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＴＣ−１００を使用
し、ＰＣＲを行った。反応条件は変性 ９４℃ １分、
アニーリング ４５℃ ２分、反応 ７４℃ ８分と
し、これを１サイクルとして、合計３０サイクル反応を
繰り返した後、７４℃でさらに１０分間反応を行い増幅
を完了した。
およびＢ、βＩＩ鎖ＡおよびＢという３種類の組み合わ
せをプライマーとしてＰＣＲを行った。二本鎖に合成し
たｃＤＮＡ２００ｎｇずつを用いて宝酒造社製ＤＮＡポ
リメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置はＭＪ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ社のＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＴＣ−１００を使用
し、ＰＣＲを行った。反応条件は変性 ９４℃ １分、
アニーリング ４５℃ ２分、反応 ７４℃ ８分と
し、これを１サイクルとして、合計３０サイクル反応を
繰り返した後、７４℃でさらに１０分間反応を行い増幅
を完了した。
【００３５】実施例４ 増幅したＧＴＨ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の
決定 次に増幅したα鎖、β鎖のｃＤＮＡは１％アガロースゲ
ル電気泳動により分離し、増幅されたＤＮＡ部分のゲル
を切り出したのち、宝酒造社製ＤＮＡ回収用途遠心チュ
ーブＳＵＲＥＣ−０２を用いてプロトコールに従い回収
した。回収した増幅ＤＮＡは宝酒造製制限酵素ＳｍａＩ
で分解したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製プラスミドベクタ
ーＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋に、宝酒造社製Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ キットにより連結した。連結
したベクターを大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅに形質転換し、
α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを持つ形質転換体を得た。つぎ
にこれらのＤＮＡは東洋紡績株式会社製Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、３２−Ｐ標識ｄ−ＣＴＰの
取り込みによるサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏ，Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３−５４６７（１９７７））により塩基
配列の決定を行った。分析は尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、得られた泳動パターンから塩
基配列を解読した結果、α鎖をコードする２種類のｃＤ
ＮＡαＩおよびαＩＩ（ｃαＩ，ｃαＩＩ）およびβ鎖
をコードする２種類のクローンβＩおよびβＩＩ（ｃβ
Ｉ，ｃβＩＩ）を得た。ＤＮＡ断片ｃαＩ，ｃαＩＩ，
ｃβＩおよびｃβＩＩを保持する大腸菌ＸＬＩＢｌｕｅ
（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｓα
Ｉ，ｓαＩＩ，ｓβＩおよびｓβＩＩと命名）が、保存
のためのものとされている。
決定 次に増幅したα鎖、β鎖のｃＤＮＡは１％アガロースゲ
ル電気泳動により分離し、増幅されたＤＮＡ部分のゲル
を切り出したのち、宝酒造社製ＤＮＡ回収用途遠心チュ
ーブＳＵＲＥＣ−０２を用いてプロトコールに従い回収
した。回収した増幅ＤＮＡは宝酒造製制限酵素ＳｍａＩ
で分解したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製プラスミドベクタ
ーＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋に、宝酒造社製Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ キットにより連結した。連結
したベクターを大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅに形質転換し、
α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを持つ形質転換体を得た。つぎ
にこれらのＤＮＡは東洋紡績株式会社製Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、３２−Ｐ標識ｄ−ＣＴＰの
取り込みによるサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏ，Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３−５４６７（１９７７））により塩基
配列の決定を行った。分析は尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、得られた泳動パターンから塩
基配列を解読した結果、α鎖をコードする２種類のｃＤ
ＮＡαＩおよびαＩＩ（ｃαＩ，ｃαＩＩ）およびβ鎖
をコードする２種類のクローンβＩおよびβＩＩ（ｃβ
Ｉ，ｃβＩＩ）を得た。ＤＮＡ断片ｃαＩ，ｃαＩＩ，
ｃβＩおよびｃβＩＩを保持する大腸菌ＸＬＩＢｌｕｅ
（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｓα
Ｉ，ｓαＩＩ，ｓβＩおよびｓβＩＩと命名）が、保存
のためのものとされている。
【００３６】塩基配列の決定は制限酵素による消化でｄ
ｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを作製して行い、適当な
制限酵素部位がない場合はプライマーを合成して行っ
た。決定したサクラマスＧＴＨの塩基配列を配列表１、
配列表２、配列表３及び配列表４に示す。このｃＤＮＡ
の塩基配列は過去に発見されたＧＴＨなどと有意な相同
性を持つことが認められた。
ｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを作製して行い、適当な
制限酵素部位がない場合はプライマーを合成して行っ
た。決定したサクラマスＧＴＨの塩基配列を配列表１、
配列表２、配列表３及び配列表４に示す。このｃＤＮＡ
の塩基配列は過去に発見されたＧＴＨなどと有意な相同
性を持つことが認められた。
【００３７】実施例５ サクラマスＧＴＨ生産菌の作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨｃＤＮＡをも
とにＰＣＲ法により原核細胞用発現ＤＮＡを作製した。
すなわち制限酵素サイトおよび開始コドン（ＡＴＧ）を
含むタンパク質Ｎ末端側プライマー、終始コドンおよび
制限酵素サイトを含むタンパク質Ｃ末端側プライマーを
作製し、ＧＴＨｃＤＮＡをもとに成熟ＧＴＨの原核細胞
発現用断片を作製した。
とにＰＣＲ法により原核細胞用発現ＤＮＡを作製した。
すなわち制限酵素サイトおよび開始コドン（ＡＴＧ）を
含むタンパク質Ｎ末端側プライマー、終始コドンおよび
制限酵素サイトを含むタンパク質Ｃ末端側プライマーを
作製し、ＧＴＨｃＤＮＡをもとに成熟ＧＴＨの原核細胞
発現用断片を作製した。
【００３８】ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列は αＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡ
ＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＣ末端側：３′ＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＴ
ＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ αＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣ
ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＩＣ末端側：３′ＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧ３′ βＩＣ末端側：３′ＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴ
ＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣ
ＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣ３′ βＩＩＣ末端側：３′ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′
ＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＣ末端側：３′ＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＴ
ＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ αＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣ
ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡ３′ αＩＩＣ末端側：３′ＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧ３′ βＩＣ末端側：３′ＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴ
ＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′ βＩＩＮ末端側：５′ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣ
ＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣ３′ βＩＩＣ末端側：３′ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣ５′
【００３９】これらのプライマーはそれぞれＡＢＩ社製
ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。合成したプライ
マーを用いてｃαＩ，ｃαＩＩ，ｃβＩおよびｃβＩＩ
２００ｎｇからＰＣＲ法により発現用ＤＮＡを増幅し
た。ＰＣＲには酵素として宝酒造社製ＤＮＡポリメラー
ゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置としてＭＪ Ｒｅｓｅ
ａｃｈ社製Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａ１
ＣｏｎｔｒｏｉｌｅｒＰＴＣ−１００を用いた。反応条
件は変性９４℃ １分、アニーリング４５℃２分、反応
７４℃ ３分としこれを１サイクルとして、合計３０
サイクル反応を繰り返した後、７４℃でさらに１０分反
応を行い増幅を完了した。増幅したＧＴＨ発現用遺伝子
は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、増幅され
たＤＮＡ部分のゲルを切り出した後宝酒造社製ＤＮＡ回
収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いてプロトコ
ールに従い回収した。回収したＤＮＡは宝酒造社製制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した。
ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。合成したプライ
マーを用いてｃαＩ，ｃαＩＩ，ｃβＩおよびｃβＩＩ
２００ｎｇからＰＣＲ法により発現用ＤＮＡを増幅し
た。ＰＣＲには酵素として宝酒造社製ＤＮＡポリメラー
ゼＡｍｐｌｉＴａｑを用い、装置としてＭＪ Ｒｅｓｅ
ａｃｈ社製Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａ１
ＣｏｎｔｒｏｉｌｅｒＰＴＣ−１００を用いた。反応条
件は変性９４℃ １分、アニーリング４５℃２分、反応
７４℃ ３分としこれを１サイクルとして、合計３０
サイクル反応を繰り返した後、７４℃でさらに１０分反
応を行い増幅を完了した。増幅したＧＴＨ発現用遺伝子
は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、増幅され
たＤＮＡ部分のゲルを切り出した後宝酒造社製ＤＮＡ回
収用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いてプロトコ
ールに従い回収した。回収したＤＮＡは宝酒造社製制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した。
【００４０】次に大腸菌発現用ベクターｐＫＰ１５００
（ＭｉＫｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，１，３２７−３３２（１９８７））を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したものを用意し、これに上
記ＰＣＲにより増幅した発現用ＤＮＡを宝酒造社製ライ
ゲーションキットを用いて連結し、αＩ，αＩＩ，βＩ
およびβＩＩを持つ原核生物発現用ベクターｐＫＰα
Ｉ，ｐＫＰαＩＩ，ｐＫＰβＩおよびｐＫＰβＩＩを得
た（図１）。連結したそれぞれのベクターは大腸菌ＫＰ
３９９８に導入しＧＴＨの発現用ベクターを持つ形質転
換体を得た。
（ＭｉＫｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，１，３２７−３３２（１９８７））を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したものを用意し、これに上
記ＰＣＲにより増幅した発現用ＤＮＡを宝酒造社製ライ
ゲーションキットを用いて連結し、αＩ，αＩＩ，βＩ
およびβＩＩを持つ原核生物発現用ベクターｐＫＰα
Ｉ，ｐＫＰαＩＩ，ｐＫＰβＩおよびｐＫＰβＩＩを得
た（図１）。連結したそれぞれのベクターは大腸菌ＫＰ
３９９８に導入しＧＴＨの発現用ベクターを持つ形質転
換体を得た。
【００４１】実施例６ 大腸菌によるＧＴＨの製造 実施例５において作製されたＧＴＨ生産菌をＬＢ培地
（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエクス
トラクト、０．５％；ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５００ｍ
ｌにそれぞれ接種し、３７℃で１６時間培養した。得ら
れた培養液を１％グルコース、０．５％イーストエクス
トラクト、１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、
４５ｐｐｍアンピシリン、ｐＨ７．０に接種し、３７℃
で１６時間培養後集菌した。得られた菌体は３倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸
濁し、超音波破砕により破砕した。次にこの懸濁液を日
立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃｓｃｒ２０Ｂで１７，
０００ｇ２０分４℃で遠心し、沈澱物を得た。この沈澱
物は２０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭＥＤＴＡ，
０．０２％リゾチームに懸濁し室温で１時間撹拌した。
つぎにこの溶液に１０％デオキシコール酸を加えさらに
室温で１時間撹拌した。つぎにこの溶液は１７，０００
ｇ、２３℃、２０分遠心し沈澱物を蒸留水で洗浄した後
再び上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は６Ｍ
塩酸グアニジン、５０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．０に溶解
し、２４時間撹拌した。この溶液を１７，０００ｇ ２
０分間遠心し、上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 Ｐｅｌ
ｌｉｃｏｎ ＣａｓｓｅｔｔｅＳｙｓｔｅｍによる限外
ろ過で濃縮脱塩を行った。つぎに濃縮液は塩酸グアニジ
ン ４Ｍ，ＴｒｉＳ ５０ｍＭ溶液に溶解し、０．０５
Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０溶液に対して４８時間
室温で透析を行った。透析物は１７，０００ｇ、２０分
間遠心し、上清を凍結乾燥した。この凍結乾燥物はさら
に逆相ＨＰＬＣにより精製し、再生組換えＧＴＨサブユ
ニットを得た。得られたそれぞれのサブユニットについ
て会合を行い、αＩ鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴ
ＨＩ，αＩＩ鎖およひβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ
Ｉを得た。
（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエクス
トラクト、０．５％；ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５００ｍ
ｌにそれぞれ接種し、３７℃で１６時間培養した。得ら
れた培養液を１％グルコース、０．５％イーストエクス
トラクト、１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、
４５ｐｐｍアンピシリン、ｐＨ７．０に接種し、３７℃
で１６時間培養後集菌した。得られた菌体は３倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸
濁し、超音波破砕により破砕した。次にこの懸濁液を日
立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃｓｃｒ２０Ｂで１７，
０００ｇ２０分４℃で遠心し、沈澱物を得た。この沈澱
物は２０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭＥＤＴＡ，
０．０２％リゾチームに懸濁し室温で１時間撹拌した。
つぎにこの溶液に１０％デオキシコール酸を加えさらに
室温で１時間撹拌した。つぎにこの溶液は１７，０００
ｇ、２３℃、２０分遠心し沈澱物を蒸留水で洗浄した後
再び上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は６Ｍ
塩酸グアニジン、５０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．０に溶解
し、２４時間撹拌した。この溶液を１７，０００ｇ ２
０分間遠心し、上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 Ｐｅｌ
ｌｉｃｏｎ ＣａｓｓｅｔｔｅＳｙｓｔｅｍによる限外
ろ過で濃縮脱塩を行った。つぎに濃縮液は塩酸グアニジ
ン ４Ｍ，ＴｒｉＳ ５０ｍＭ溶液に溶解し、０．０５
Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０溶液に対して４８時間
室温で透析を行った。透析物は１７，０００ｇ、２０分
間遠心し、上清を凍結乾燥した。この凍結乾燥物はさら
に逆相ＨＰＬＣにより精製し、再生組換えＧＴＨサブユ
ニットを得た。得られたそれぞれのサブユニットについ
て会合を行い、αＩ鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴ
ＨＩ，αＩＩ鎖およひβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ
Ｉを得た。
【００４２】実施例７ サクラマスＧＴＨをコードする真核細胞発現用組換え体
プラスミドの作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐｓαＩ，ｐｓαＩＩ，ｐｓβ
ＩおよびｐｓβＩＩ５μｇを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｇ
／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｈバッファーと
いう）２０μｌに溶解し、制限酵素ＥＣＯＲＩ，Ｓｍａ
Ｉ（宝酒造社製）をそれぞれ３０単位加え、３７℃、２
時間反応を行った。反応液をフェノール抽出後、アガロ
ースゲル電気泳動によりサクラマスＧＴＨのアミノ酸配
列をコードする部分を切り出し、宝酒造社製ＤＮＡ回収
用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いて回収し、サ
クラマスＧＴＨ翻訳領域を含む断片をそれぞれ回収し
た。回収したＤＮＡはそれぞれ宝酒造社製ＤＮＡプラン
ティングキットにより平滑化しエタノール沈澱により精
製した。
プラスミドの作製 次に実施例４で得られたサクラマスＧＴＨをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐｓαＩ，ｐｓαＩＩ，ｐｓβ
ＩおよびｐｓβＩＩ５μｇを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｇ
／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｈバッファーと
いう）２０μｌに溶解し、制限酵素ＥＣＯＲＩ，Ｓｍａ
Ｉ（宝酒造社製）をそれぞれ３０単位加え、３７℃、２
時間反応を行った。反応液をフェノール抽出後、アガロ
ースゲル電気泳動によりサクラマスＧＴＨのアミノ酸配
列をコードする部分を切り出し、宝酒造社製ＤＮＡ回収
用遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０２を用いて回収し、サ
クラマスＧＴＨ翻訳領域を含む断片をそれぞれ回収し
た。回収したＤＮＡはそれぞれ宝酒造社製ＤＮＡプラン
ティングキットにより平滑化しエタノール沈澱により精
製した。
【００４３】別に真核細胞発現用ベクターｐＳＶＬ（フ
ァルマシア社製）３μｇを３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔ
ａｔｅ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔ
ｅ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，６６ｎＭＫ−ａｃｔａｔｅ，
１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｔバ
ッファー）５０μｌに溶解し、宝酒造社製制限酵素Ｓｍ
ａＩ ５０Ｕで３７℃２時間消化し、フェノール抽出後
エタノール沈澱により精製した。次に平滑末端化された
サクラマスＧＴＨをコードする断片とＳｍａＩ消化され
たｐＳＶＬを宝酒造社製ライゲーションキットによりラ
イゲーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢプレート上でよく生育する
コロニーを選びＧＴＨのアミノ酸配列をコードするプラ
スミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよびｐ
ＳＶβＩＩを得た（図２）。これらの大腸菌を培養し、
常法に従い上記プラスミドを調整した。
ァルマシア社製）３μｇを３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔ
ａｔｅ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔ
ｅ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，６６ｎＭＫ−ａｃｔａｔｅ，
１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンの反応液（以下Ｔバ
ッファー）５０μｌに溶解し、宝酒造社製制限酵素Ｓｍ
ａＩ ５０Ｕで３７℃２時間消化し、フェノール抽出後
エタノール沈澱により精製した。次に平滑末端化された
サクラマスＧＴＨをコードする断片とＳｍａＩ消化され
たｐＳＶＬを宝酒造社製ライゲーションキットによりラ
イゲーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢプレート上でよく生育する
コロニーを選びＧＴＨのアミノ酸配列をコードするプラ
スミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ｐＳＶβＩおよびｐ
ＳＶβＩＩを得た（図２）。これらの大腸菌を培養し、
常法に従い上記プラスミドを調整した。
【００４４】実施例８ 真核細胞による組換えサクラマスＧＴＨの生産 実施例７で得られたＧＴＨのアミノ酸配列をコードする
プラスミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ＰＳＶβＩおよ
びｐＳＶβＩＩをアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−
１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ，２３，１７５
−１８２，１９８１）にＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌ
ｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１（１
９８３））により導入した。形質転換されたＣＯＳ−１
細胞は１０％牛胎盤血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社
製）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＧＩＢＵＣ
Ｏ社製）中で５日間、３７℃において培養し、培養液上
清を採取した。これらの培養液上清を限外ろ過により脱
塩した後、ＭｏｎｏＱカラムによりＧＴＨサブユニット
を精製し、それぞれのサブユニットの会合を行い、αＩ
鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ，αＩＩ鎖およ
びβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩＩを得た。
プラスミドｐＳＶαＩ，ｐＳＶαＩＩ，ＰＳＶβＩおよ
びｐＳＶβＩＩをアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−
１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ，２３，１７５
−１８２，１９８１）にＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌ
ｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１（１
９８３））により導入した。形質転換されたＣＯＳ−１
細胞は１０％牛胎盤血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社
製）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＧＩＢＵＣ
Ｏ社製）中で５日間、３７℃において培養し、培養液上
清を採取した。これらの培養液上清を限外ろ過により脱
塩した後、ＭｏｎｏＱカラムによりＧＴＨサブユニット
を精製し、それぞれのサブユニットの会合を行い、αＩ
鎖およびβＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩ，αＩＩ鎖およ
びβＩＩ鎖からなる活性型ＧＴＨＩＩを得た。
【００４５】実験．９ 生理活性の測定 ２年齢の雄ニジマスから取りだした精巣を用い、上記組
換えＧＴＨの性ステロイドの産生効果を調べた。実施例
６，８で得られた組換えＧＴＨはそれぞれ良好なステロ
イド産生効果を示したことからこれらのＧＴＨは魚類の
性腺刺激効果を持つことが判明した。配列表１は、サク
ラマスＧＴＨαＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示
す。配列表２は、サクラマスＧＴＨαＩＩ鎖のアミノ酸
配列および塩基配列を示す。配列表３は、サクラマスＧ
ＴＨβＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列
表４は、サクラマスＧＴＨβＩＩ鎖のアミノ酸配列およ
び塩基配列を示す。
換えＧＴＨの性ステロイドの産生効果を調べた。実施例
６，８で得られた組換えＧＴＨはそれぞれ良好なステロ
イド産生効果を示したことからこれらのＧＴＨは魚類の
性腺刺激効果を持つことが判明した。配列表１は、サク
ラマスＧＴＨαＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示
す。配列表２は、サクラマスＧＴＨαＩＩ鎖のアミノ酸
配列および塩基配列を示す。配列表３は、サクラマスＧ
ＴＨβＩ鎖のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列
表４は、サクラマスＧＴＨβＩＩ鎖のアミノ酸配列およ
び塩基配列を示す。
【配列表】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】サクラマスＧＴＨのαＩ，αＩＩ，βＩおよび
βＩＩの遺伝子発現用ｐＫＰベクターの構築法を模擬的
に示す。
βＩＩの遺伝子発現用ｐＫＰベクターの構築法を模擬的
に示す。
【図２】サクラマスＧＴＨのαＩ，αＩＩ，βＩおよび
βＩＩの遺伝子発現用ｐＳＶベクターの構築法を模擬的
に示す。
βＩＩの遺伝子発現用ｐＳＶベクターの構築法を模擬的
に示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/38 ＡＥＸ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】 配列表１、配列表２、配列表３および配
列表４に示したアミノ酸配列からなる群から選ばれるア
ミノ酸配列を有する魚類の生殖腺刺激ホルモン。 - 【請求項２】 魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチド
をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 魚類の生殖腺刺激ホルモンが配列表１、
配列表２、配列表３および配列表４に示したアミノ酸配
列を有する特許請求の範囲第２項のＤＮＡ。 - 【請求項４】 魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチド
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 魚類の生殖腺刺激ホルモンが配列表１、
配列表２、配列表３および配列表４に示したアミノ酸配
列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを
特徴とする特許請求の範囲第４項の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項６】 魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチド
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物。 - 【請求項７】 魚類の生殖腺刺激ホルモンが配列表１、
配列表２、配列表３および配列表４に示したアミノ酸配
列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを
特徴とする特許請求の範囲第４項の組換え体ＤＮＡを組
み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物。 - 【請求項８】 魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチド
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
真核細胞。 - 【請求項９】 魚類の生殖腺刺激ホルモンが配列表１、
配列表２、配列表３および配列表４に示したアミノ酸配
列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを
特徴とする特許請求の範囲第４項の組換え体ＤＮＡを組
み込んだ組換え体ＤＮＡを含む真核細胞。 - 【請求項１０】 魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含
む微生物または真核細胞を栄養培地に培養し、該培養物
中に魚類の生殖腺刺激ホルモンを蓄積せしめ、該培養物
から該ポリペプチドを採取することを特徴とする魚類の
生殖腺刺激ホルモンポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3354152A JPH06107689A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 魚類の生殖腺刺激ホルモン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3354152A JPH06107689A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 魚類の生殖腺刺激ホルモン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06107689A true JPH06107689A (ja) | 1994-04-19 |
Family
ID=18435636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3354152A Pending JPH06107689A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 魚類の生殖腺刺激ホルモン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06107689A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008528027A (ja) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | ユニヴェルシテイト レイデン | 移植細胞により産生されるホルモンを用いた魚の卵及び／又は魚の精子の発生及び成熟を改善するための手段及び方法 |
| KR100872327B1 (ko) * | 2006-09-01 | 2008-12-05 | 전남대학교산학협력단 | 전어(Ｋｏｎｏｓｉｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ)의 성성숙시기 제어를 통한 조기산란 유도 및 이를 이용한종묘생산방법 |
-
1991
- 1991-11-20 JP JP3354152A patent/JPH06107689A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008528027A (ja) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | ユニヴェルシテイト レイデン | 移植細胞により産生されるホルモンを用いた魚の卵及び／又は魚の精子の発生及び成熟を改善するための手段及び方法 |
| KR100872327B1 (ko) * | 2006-09-01 | 2008-12-05 | 전남대학교산학협력단 | 전어(Ｋｏｎｏｓｉｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ)의 성성숙시기 제어를 통한 조기산란 유도 및 이를 이용한종묘생산방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU202921B (en) | Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| JPH06296491A (ja) | シグナル配列をコードしているｄｎａと機能的に結合しているヒト成長ホルモンをコードしているｄｎａ | |
| CA2100690C (en) | Megakaryocyte differentiation factor | |
| KR20110106286A (ko) | 친화성 태그가 결합된 융합 콜라게나제 및 그의 제조방법 | |
| WO2020187271A1 (zh) | 利用双质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸 | |
| JP2637393B2 (ja) | プロインシュリンおよびプレプロインシュリン産生暗号を有するヒト遺伝子 | |
| CN111647607A (zh) | 一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法 | |
| CN111850020B (zh) | 利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸 | |
| CN111378027B (zh) | 一种索玛鲁肽前体的制备方法 | |
| US5552302A (en) | Methods and compositions for production of human recombinant placental ribonuclease inhibitor | |
| JP2513909B2 (ja) | ネコインタ―フェロンおよびその製造法 | |
| Cho et al. | Molecular cloning, sequencing, and expression of a fibrinolytic serine-protease gene from the earthworm Lumbricus rubellus | |
| JPH06107689A (ja) | 魚類の生殖腺刺激ホルモン | |
| Chang et al. | cDNA sequence analysis and expression of cardiotoxins from Taiwan cobra | |
| AU643194B2 (en) | Recombinant fish hormone proteins | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| EP0508672A2 (en) | Fish prolactin | |
| JP2002523100A (ja) | 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法 | |
| CN106479987A (zh) | 一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用 | |
| EP0443790A1 (en) | Growth hormone-like glycoproteins | |
| CN102558356A (zh) | 一种人胰岛素原融合蛋白及人胰岛素的制备方法 | |
| CN107653244B (zh) | 一种止血蛋白及其制备方法和应用 | |
| JPS62226998A (ja) | ヒトカルシトニン前駆体ペプチド及びその製造方法 |