JPH06107694A - 平滑筋細胞由来遊走因子 - Google Patents
平滑筋細胞由来遊走因子Info
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- JPH06107694A JPH06107694A JP25705192A JP25705192A JPH06107694A JP H06107694 A JPH06107694 A JP H06107694A JP 25705192 A JP25705192 A JP 25705192A JP 25705192 A JP25705192 A JP 25705192A JP H06107694 A JPH06107694 A JP H06107694A
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- muscle cell
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Abstract
(57)【要約】
【構成】哺乳動物の大動脈平滑筋細胞の無血清培養上清
から精製して得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量が非還元条件下で５０,０００〜６
０,０００、還元条件下で５０,０００〜６０,０００で
あり、平滑筋細胞に遊走活性を示す一本鎖構造蛋白質で
ある平滑筋細胞由来遊走因子。 【効果】抗体など用いてその尿中、血中の濃度を測定す
ることにより、動脈硬化症の病巣形成の初期からの診
断、定量が可能となる。
から精製して得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量が非還元条件下で５０,０００〜６
０,０００、還元条件下で５０,０００〜６０,０００で
あり、平滑筋細胞に遊走活性を示す一本鎖構造蛋白質で
ある平滑筋細胞由来遊走因子。 【効果】抗体など用いてその尿中、血中の濃度を測定す
ることにより、動脈硬化症の病巣形成の初期からの診
断、定量が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物の大動脈平滑
筋細胞が産する平滑筋細胞由来遊走因子に関する。
筋細胞が産する平滑筋細胞由来遊走因子に関する。
【０００２】
【従来の技術】動脈硬化症は、血管に生じる異常であ
り、血管閉塞等の症状を起こす。現在行われている動脈
硬化症の診断は、血清脂質、血糖値を測定する生化学的
な試験方法と、Ｘ線やＭＲＩを用いた直接病巣部を検査
する方法がある。しかし、これらの方法は病巣形成がか
なり進行した場合には効果があるが、初期症状における
効果に問題がある。しかも、取り扱いに特殊な技術を要
し、熟練者でないと良好な解析が行えない。そこで、動
脈硬化症の早期に簡便な診断方法の確立が望まれてい
る。
り、血管閉塞等の症状を起こす。現在行われている動脈
硬化症の診断は、血清脂質、血糖値を測定する生化学的
な試験方法と、Ｘ線やＭＲＩを用いた直接病巣部を検査
する方法がある。しかし、これらの方法は病巣形成がか
なり進行した場合には効果があるが、初期症状における
効果に問題がある。しかも、取り扱いに特殊な技術を要
し、熟練者でないと良好な解析が行えない。そこで、動
脈硬化症の早期に簡便な診断方法の確立が望まれてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症にみられる
血管閉塞は、平滑筋細胞の内膜への遊走とそれに続く増
殖により引き起こされる。平滑筋細胞による病巣形成、
とりわけ平滑筋細胞の遊走の状態を把握することは動脈
硬化症の新しい診断方法として有望視されている。平滑
筋細胞由来遊走因子は平滑筋細胞の内膜への遊走をつか
さどり、病巣形成に係わる重要な因子である（森崎信尋
ら、実験医学８，ｐ３９−４５，１９９０）。
血管閉塞は、平滑筋細胞の内膜への遊走とそれに続く増
殖により引き起こされる。平滑筋細胞による病巣形成、
とりわけ平滑筋細胞の遊走の状態を把握することは動脈
硬化症の新しい診断方法として有望視されている。平滑
筋細胞由来遊走因子は平滑筋細胞の内膜への遊走をつか
さどり、病巣形成に係わる重要な因子である（森崎信尋
ら、実験医学８，ｐ３９−４５，１９９０）。
【０００４】本発明は、その因子の尿中、血中の濃度を
測定することにより、動脈硬化症の病巣形成の初期から
の診断、定量が可能となる平滑筋細胞由来遊走因子およ
びその精製方法を提供することにある。
測定することにより、動脈硬化症の病巣形成の初期から
の診断、定量が可能となる平滑筋細胞由来遊走因子およ
びその精製方法を提供することにある。
【０００５】また本発明により、平滑筋細胞由来遊走因
子を純化させることにより、当該因子を抗原として抗体
作製し、この抗体を用いて定量測定キット等または定量
測定方法を提供できる。
子を純化させることにより、当該因子を抗原として抗体
作製し、この抗体を用いて定量測定キット等または定量
測定方法を提供できる。
【０００６】
【問題を解決するための手段】上記目的を解決する本発
明は、哺乳動物の大動脈平滑筋細胞の無血清培養上清か
ら精製して得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量が非還元条件下で５０,０００〜６０,
０００、還元条件下で５０,０００〜６０,０００であ
り、平滑筋細胞に遊走活性を示し、血管内皮細胞に遊走
活性を示さない一本鎖構造蛋白質であることを特徴とす
る平滑筋細胞由来遊走因子である。
明は、哺乳動物の大動脈平滑筋細胞の無血清培養上清か
ら精製して得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量が非還元条件下で５０,０００〜６０,
０００、還元条件下で５０,０００〜６０,０００であ
り、平滑筋細胞に遊走活性を示し、血管内皮細胞に遊走
活性を示さない一本鎖構造蛋白質であることを特徴とす
る平滑筋細胞由来遊走因子である。
【０００７】更に本発明は、哺乳動物の大動脈平滑筋細
胞の無血清培養上清を、（１）ジェラチンセファロース
カラムクロマトグラフィー、（２）ヘパリンセファロー
スカラムクロマトグラフィー、（３）レッドセファロー
スカラムクロマトグラフィー、（４）ヘパリンカラム高
速液体クロマトグラフィー、（５）ゲル濾過高速液体ク
ロマトグラフィーの順に精製して得られ、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量が非還元条件下
で５０,０００〜６０,０００、還元条件下で５０,００
０〜６０,０００であり、平滑筋細胞に遊走活性を示
し、血管内皮細胞に遊走活性を示さない一本鎖構造蛋白
質であることを特徴とする平滑筋細胞由来遊走因子及び
その方法である。
胞の無血清培養上清を、（１）ジェラチンセファロース
カラムクロマトグラフィー、（２）ヘパリンセファロー
スカラムクロマトグラフィー、（３）レッドセファロー
スカラムクロマトグラフィー、（４）ヘパリンカラム高
速液体クロマトグラフィー、（５）ゲル濾過高速液体ク
ロマトグラフィーの順に精製して得られ、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量が非還元条件下
で５０,０００〜６０,０００、還元条件下で５０,００
０〜６０,０００であり、平滑筋細胞に遊走活性を示
し、血管内皮細胞に遊走活性を示さない一本鎖構造蛋白
質であることを特徴とする平滑筋細胞由来遊走因子及び
その方法である。
【０００８】本発明において、平滑筋細胞の培養方法と
よび条件などに関しては、特に限定するものはなく、一
般的な培養方法を用いればよい。特に、精製が容易に行
える点で、最初は牛胎児血清を含む培地を用いて培養
し、その後無血清培地を用いて培養し、培養上清から平
滑筋細胞由来遊走因子を得る方法が好ましい。
よび条件などに関しては、特に限定するものはなく、一
般的な培養方法を用いればよい。特に、精製が容易に行
える点で、最初は牛胎児血清を含む培地を用いて培養
し、その後無血清培地を用いて培養し、培養上清から平
滑筋細胞由来遊走因子を得る方法が好ましい。
【０００９】また、本発明の平滑筋細胞由来遊走因子は
ビーズの浮遊培養法を用いることで効率よく大量に平滑
筋細胞由来遊走因子を得ることができる。本発明に用い
るビーズの浮遊培養法とは、担体としてビーズの細胞を
付着させ、この状態にてビーズを培地中に浮遊させる方
法であり、用いるビーズは特に限定しないがゼラチンマ
イクロキャリアビーズ、コラーゲンマイクロキャリアビ
ーズ等が良く、特にゼラチンマイクロキャリアビーズが
好ましい。
ビーズの浮遊培養法を用いることで効率よく大量に平滑
筋細胞由来遊走因子を得ることができる。本発明に用い
るビーズの浮遊培養法とは、担体としてビーズの細胞を
付着させ、この状態にてビーズを培地中に浮遊させる方
法であり、用いるビーズは特に限定しないがゼラチンマ
イクロキャリアビーズ、コラーゲンマイクロキャリアビ
ーズ等が良く、特にゼラチンマイクロキャリアビーズが
好ましい。
【００１０】培養上清からの平滑筋細胞由来遊走因子の
回収と精製は、例えば、当該培養上清に、ジェラチンカ
ラムクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースカラム
クロマトグラフィー、レッドセファロースカラムクロマ
トグラフィー、ヘパリンカラム高速液体クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過高速液体カラムクロマトグラフィー等を
適宣に組み合わせることによって行うことができる。よ
り具体的には下記のような５段階よりなる方法によって
得ることができる。
回収と精製は、例えば、当該培養上清に、ジェラチンカ
ラムクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースカラム
クロマトグラフィー、レッドセファロースカラムクロマ
トグラフィー、ヘパリンカラム高速液体クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過高速液体カラムクロマトグラフィー等を
適宣に組み合わせることによって行うことができる。よ
り具体的には下記のような５段階よりなる方法によって
得ることができる。
【００１１】ジェラチンセファロースカラムクロマト
グラフィー 培養上清をジェラチンセファロースカラムを通過させる
ことによって、未吸着画分を回収する。
グラフィー 培養上清をジェラチンセファロースカラムを通過させる
ことによって、未吸着画分を回収する。
【００１２】ヘパリンセファロースカラムクロマトグ
ラフィー 上記ジェラチンセファロースカラムを通過させた活性画
分をヘパリンセルロースアンフィニティーカラムを通過
させることによって、活性物質をカラムに吸着させ、そ
れに吸着された活性物質を、０Ｍ ＮａＣｌ，０.８５Ｍ
ＮａＣｌをそれぞれ含むリン酸緩衝生理食塩水とのリ
ニアグラジエトで溶出する。
ラフィー 上記ジェラチンセファロースカラムを通過させた活性画
分をヘパリンセルロースアンフィニティーカラムを通過
させることによって、活性物質をカラムに吸着させ、そ
れに吸着された活性物質を、０Ｍ ＮａＣｌ，０.８５Ｍ
ＮａＣｌをそれぞれ含むリン酸緩衝生理食塩水とのリ
ニアグラジエトで溶出する。
【００１３】レッドセルロースクロマトグラフィー 上記溶出された活性画分をレッドセルロースカラムを通
過させることによって吸着させ、活性物質を０％ソディ
ウム ドデシル サルフェイト（[Sodium dodecyl sult
ate] 以下、ＳＤＳと称す）、０.０５％ＳＤＳとのリ
ニアグラジエトで溶出する。
過させることによって吸着させ、活性物質を０％ソディ
ウム ドデシル サルフェイト（[Sodium dodecyl sult
ate] 以下、ＳＤＳと称す）、０.０５％ＳＤＳとのリ
ニアグラジエトで溶出する。
【００１４】ヘパリンカラム高速液体クロマトグラフ
ィー 上記溶出された活性画分を、ＴＳＫ・ヘパリンセルロー
スカラムに通過させることにより、活性物質を０Ｍ Ｎ
ａＣｌ，０.８５Ｍ ＮａＣｌをそれぞれ含むリン酸緩衝
生理食塩水（以下、ＰＢＳと称す）とのリニアグラジエ
トで溶出する。
ィー 上記溶出された活性画分を、ＴＳＫ・ヘパリンセルロー
スカラムに通過させることにより、活性物質を０Ｍ Ｎ
ａＣｌ，０.８５Ｍ ＮａＣｌをそれぞれ含むリン酸緩衝
生理食塩水（以下、ＰＢＳと称す）とのリニアグラジエ
トで溶出する。
【００１５】ゲル濾過高速液体カラムクロマトグラフ
ィー 上記溶出された活性画分を、ゲル濾過担体のカラムに通
過させて展開させ、その活性画分を溶出により回収す
る。ゲル濾過担体としては、スーパーロース６（Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６）カラムが望ましい。
ィー 上記溶出された活性画分を、ゲル濾過担体のカラムに通
過させて展開させ、その活性画分を溶出により回収す
る。ゲル濾過担体としては、スーパーロース６（Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６）カラムが望ましい。
【００１６】なお、上記の５段階よりなる精製方法は１
例を示したものであり、この限りではない。
例を示したものであり、この限りではない。
【００１７】本発明の純化された平滑筋細胞由来遊走因
子はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が非還元条件下で５０,０００〜６０,０００、還元条
件下で５０,０００〜６０,０００であった。
子はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が非還元条件下で５０,０００〜６０,０００、還元条
件下で５０,０００〜６０,０００であった。
【００１８】また、平滑筋細胞の遊走活性の測定は、フ
ィルターを介して上下２室からなるチャンバーの上室に
平滑筋細胞懸濁液を、下室に平滑筋細胞由来遊走因子
（以下、ＳＤＭＦと称す）溶液を加え、因子が遊走活性
を持つ場合、上室の平滑筋細胞はフィルターの孔（直径
５.０μm）を通ってフィルター下室側に生着するので、
この平滑筋細胞の数を顕微鏡下で計測し遊走活性の指標
とする公知のボイデンチャンバー法によって行った（小
山ら、アテロスクローシス［N.koyama et al. Atherosc
lerosis],(1991),86,219-227）。
ィルターを介して上下２室からなるチャンバーの上室に
平滑筋細胞懸濁液を、下室に平滑筋細胞由来遊走因子
（以下、ＳＤＭＦと称す）溶液を加え、因子が遊走活性
を持つ場合、上室の平滑筋細胞はフィルターの孔（直径
５.０μm）を通ってフィルター下室側に生着するので、
この平滑筋細胞の数を顕微鏡下で計測し遊走活性の指標
とする公知のボイデンチャンバー法によって行った（小
山ら、アテロスクローシス［N.koyama et al. Atherosc
lerosis],(1991),86,219-227）。
【００１９】以下実施例を示し、本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
【００２０】
（実施例１）平滑筋細胞（以下、ＳＭＣと称す）は６週
命雄性ＷｉｓｔａｒＲａｔ（体重約２００ｇ）の胸部大
動脈よりエックスプラント（ｅｘｐｌａｎｔ）法にて採
取し、牛胎児血清１０％添加ダルベッコ変法イーグル培
地（以下、ＤＭＥと称す）にて培養した。実験には継代
数５から１０代までのものを用いた。このＳＭＣををト
リプトファンで回収し、乾燥重量２５ｇ相当のゼラチン
コートポリスチレンビーズ（ベンターゲルII［Ｖｅｎｔ
ｅｒｇｅｌ.II］，ベントレックス ラボラトリー社
［Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｒａｂ.］製，比重１.０３ｇ/ｍ
Ｌ）と共に、１.０Ｌの１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥ中に懸
濁し、カルチャーベセルに入れ、３７℃，５分間，ＣＯ
2インキュベーションした後、６０r.p.m，２min回転培
養し、３０min回転を止めて放置した。これを一晩繰り
返し、その翌日からは３７℃，５％ＣＯ２存在下で６０
r.p.mの定速で回転させながら培養した。培地交換は３
日に１度行った。この際、スターラーの回転を止めビー
ズが沈んでから上清をアスピレーターで除き、新しい培
地を加えた。かくして、平滑筋細胞由来遊走因子を含ん
だ上清画分を得た。
命雄性ＷｉｓｔａｒＲａｔ（体重約２００ｇ）の胸部大
動脈よりエックスプラント（ｅｘｐｌａｎｔ）法にて採
取し、牛胎児血清１０％添加ダルベッコ変法イーグル培
地（以下、ＤＭＥと称す）にて培養した。実験には継代
数５から１０代までのものを用いた。このＳＭＣををト
リプトファンで回収し、乾燥重量２５ｇ相当のゼラチン
コートポリスチレンビーズ（ベンターゲルII［Ｖｅｎｔ
ｅｒｇｅｌ.II］，ベントレックス ラボラトリー社
［Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｒａｂ.］製，比重１.０３ｇ/ｍ
Ｌ）と共に、１.０Ｌの１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥ中に懸
濁し、カルチャーベセルに入れ、３７℃，５分間，ＣＯ
2インキュベーションした後、６０r.p.m，２min回転培
養し、３０min回転を止めて放置した。これを一晩繰り
返し、その翌日からは３７℃，５％ＣＯ２存在下で６０
r.p.mの定速で回転させながら培養した。培地交換は３
日に１度行った。この際、スターラーの回転を止めビー
ズが沈んでから上清をアスピレーターで除き、新しい培
地を加えた。かくして、平滑筋細胞由来遊走因子を含ん
だ上清画分を得た。
【００２１】上記によって得た平滑筋細胞由来遊走因子
の遊走活性の測定を、４８ウェルミクロケモタクシス
チャンバー（４８ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａ
ｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒ、ノイロポローベ社製［米
国］）を用いたボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎｃｈ
ａｍｂｅｒ）法によって行った。
の遊走活性の測定を、４８ウェルミクロケモタクシス
チャンバー（４８ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａ
ｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒ、ノイロポローベ社製［米
国］）を用いたボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎｃｈ
ａｍｂｅｒ）法によって行った。
【００２２】採取した培養上清（以下、ＣＭと称す）
は、混入したＳＭＣや細胞の分解産物を除くため、３０
００r.p.mで１０分間遠心分離を行い、その上清のみを
回収し４℃で保存した。ビーズ径として９０−１５０μ
ｍのものを用いた場合について、それぞれ４回ＣＭを採
取する間の遊走活性の変動を調べた結果を下記表１に示
す。それぞれ２つのロットの細胞について検討した。１
回目が０から２日目、２回目が２から４日目、３回目が
４から６日目、４回目が６から８日目に相当する。
は、混入したＳＭＣや細胞の分解産物を除くため、３０
００r.p.mで１０分間遠心分離を行い、その上清のみを
回収し４℃で保存した。ビーズ径として９０−１５０μ
ｍのものを用いた場合について、それぞれ４回ＣＭを採
取する間の遊走活性の変動を調べた結果を下記表１に示
す。それぞれ２つのロットの細胞について検討した。１
回目が０から２日目、２回目が２から４日目、３回目が
４から６日目、４回目が６から８日目に相当する。
【００２３】
【表１】
【００２４】ＣＭを採取する回数は３から４回目で著し
い活性低下が認められるので、これ以上ＣＭを採取する
のは困難であるため、１から２回目のＣＭを次の精製に
用いた。
い活性低下が認められるので、これ以上ＣＭを採取する
のは困難であるため、１から２回目のＣＭを次の精製に
用いた。
【００２５】（実施例２）図１に示すようにジェラチン
セファロースカラム（ファルマシア社製）とヘパリンセ
ファロースカラム（ファルマシア社製）を直列につな
ぎ、コールドルーム（室温約６℃）にてＣＭをロータリ
ーポンプを用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平
衡化した両カラムへ流した。この時のカラム条件は次の
通りである。
セファロースカラム（ファルマシア社製）とヘパリンセ
ファロースカラム（ファルマシア社製）を直列につな
ぎ、コールドルーム（室温約６℃）にてＣＭをロータリ
ーポンプを用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平
衡化した両カラムへ流した。この時のカラム条件は次の
通りである。
【００２６】 カラム：２０ｍＬ（ジェラチンセファロースカラム） １０ｍＬ（ヘパリンセファロースカラム） 流 速：２００ｍＬ/ｈ
【００２７】２０ＬのＣＭの処理に約１００時間を要す
るが、この間にカラムの目詰まりやポンプ流速の低下は
認められなかった。ヘパリンセファロースカラムに未処
理のＣＭを流した場合、１−２ＬのＣＭでカラムが目詰
まりを起こし、これ以上の大量精製は困難であったこと
から、ジェラチンセファロースカラムよる処理はヘパリ
ンセファロースカラムによるＳＤＭＦ精製に非常に有効
な手段であるといえる。
るが、この間にカラムの目詰まりやポンプ流速の低下は
認められなかった。ヘパリンセファロースカラムに未処
理のＣＭを流した場合、１−２ＬのＣＭでカラムが目詰
まりを起こし、これ以上の大量精製は困難であったこと
から、ジェラチンセファロースカラムよる処理はヘパリ
ンセファロースカラムによるＳＤＭＦ精製に非常に有効
な手段であるといえる。
【００２８】上記の方法により処理したＣＭのジェラチ
ンセファロースカラム通過後とヘパリンセファロースカ
ラム通過後の遊走活性と蛋白質濃度を測定し、未処理の
ＣＭと比較した。蛋白質はジェラチンセファロースカラ
ムに８.４％が、ヘパリンセファロースカラムに１２.３
％が吸着していた。一方活性は、ジェラチンセファロー
スカラムへの吸着は認められず、９０％以上がヘパリン
セファロースカラムへ吸着した（図２）。このヘパリン
セファロースカラムへの吸着性は、大量のＣＭ（１６
Ｌ）を処理した後でも低下していなかった。
ンセファロースカラム通過後とヘパリンセファロースカ
ラム通過後の遊走活性と蛋白質濃度を測定し、未処理の
ＣＭと比較した。蛋白質はジェラチンセファロースカラ
ムに８.４％が、ヘパリンセファロースカラムに１２.３
％が吸着していた。一方活性は、ジェラチンセファロー
スカラムへの吸着は認められず、９０％以上がヘパリン
セファロースカラムへ吸着した（図２）。このヘパリン
セファロースカラムへの吸着性は、大量のＣＭ（１６
Ｌ）を処理した後でも低下していなかった。
【００２９】（実施例３）ヘパリンセファロースカラム
をＰＢＳで十分に洗浄後、吸着したＳＤＭＦを、ＮａＣ
ｌの濃度勾配を用い、２０ｍＬ／ｈの流速で溶出させた
（図３）。蛋白質はＮａＣｌ濃度０.３５Ｍにピークを
とりブロードに溶出したが、遊走活性はＮａＣｌ濃度
０.４５Ｍ−０.６０Ｍに溶出した。この方法での溶出画
分への蛋白質と活性の回収率はそれぞれ１.４％，６.２
％であった。図３中、活性の中心であるフラクション
（Fraction）Ｎｏ，１８−３０のサンプルを次の精製に
進めた。
をＰＢＳで十分に洗浄後、吸着したＳＤＭＦを、ＮａＣ
ｌの濃度勾配を用い、２０ｍＬ／ｈの流速で溶出させた
（図３）。蛋白質はＮａＣｌ濃度０.３５Ｍにピークを
とりブロードに溶出したが、遊走活性はＮａＣｌ濃度
０.４５Ｍ−０.６０Ｍに溶出した。この方法での溶出画
分への蛋白質と活性の回収率はそれぞれ１.４％，６.２
％であった。図３中、活性の中心であるフラクション
（Fraction）Ｎｏ，１８−３０のサンプルを次の精製に
進めた。
【００３０】（実施例４）ヘパリンセファロースカラム
から回収したＳＤＭＦ分画（体積１００ｍＬ，総蛋白質
量１４ｍｇ）にＮａＣｌを加え最終ＮａＣｌ濃度を２Ｍ
にした後、ＰＢＳで平衡化したレッドセルロースカラム
（ファルマシア社製）へロータリーポンプを用いて流し
た。この時のレッドセルロースカラム容積２０ｍＬ，流
速５０ｍＬ/ｈである。この操作で活性の６４％，総蛋
白質の５３％がレッドセルロースカラムに結合した。
から回収したＳＤＭＦ分画（体積１００ｍＬ，総蛋白質
量１４ｍｇ）にＮａＣｌを加え最終ＮａＣｌ濃度を２Ｍ
にした後、ＰＢＳで平衡化したレッドセルロースカラム
（ファルマシア社製）へロータリーポンプを用いて流し
た。この時のレッドセルロースカラム容積２０ｍＬ，流
速５０ｍＬ/ｈである。この操作で活性の６４％，総蛋
白質の５３％がレッドセルロースカラムに結合した。
【００３１】レッドセルロースカラムへのＳＤＭＦの結
合は非常に強く、２ＭのＮａＣｌ，０.２％ 3-((3-クロ
ラミドプロピル)ディメチルアムモニオ)-1-プロパンス
ルフォネート（3-((3-cholamidopropyl)dimethylammoni
o)-1-propanen sulfonate）（以下、ＣＨＡＰＳと称
す）を用いても溶出されないが、０.０３％程度のＳＤ
Ｓで溶出されることを見いだしている。ＰＢＳで十分に
洗浄後、レッドセルロースカラムのＳＤＭＦをＳＤＳの
濃度勾配を用いて、１２ｍＬ/ｈの流速で溶出させた。
結果を図４に示す。
合は非常に強く、２ＭのＮａＣｌ，０.２％ 3-((3-クロ
ラミドプロピル)ディメチルアムモニオ)-1-プロパンス
ルフォネート（3-((3-cholamidopropyl)dimethylammoni
o)-1-propanen sulfonate）（以下、ＣＨＡＰＳと称
す）を用いても溶出されないが、０.０３％程度のＳＤ
Ｓで溶出されることを見いだしている。ＰＢＳで十分に
洗浄後、レッドセルロースカラムのＳＤＭＦをＳＤＳの
濃度勾配を用いて、１２ｍＬ/ｈの流速で溶出させた。
結果を図４に示す。
【００３２】なお、低温（４℃）ではＳＤＳが析出しカ
ラム操作が困難になるため、レッドセルロースカラムに
よる精製は室温（約２５℃）で行った。蛋白質の溶出は
０.０２％付近と０.０３％付近にピークが認められた
が、活性は０.０３％にシャープなピークとなって溶出
した。この操作での蛋白質と活性の回収率はそれぞれ５
０.１％，４７.３％であった。活性の中心である図４中
のフラクション（Fraction）Ｎｏ，３１−３５のサンプ
ルを次の精製に進めた。
ラム操作が困難になるため、レッドセルロースカラムに
よる精製は室温（約２５℃）で行った。蛋白質の溶出は
０.０２％付近と０.０３％付近にピークが認められた
が、活性は０.０３％にシャープなピークとなって溶出
した。この操作での蛋白質と活性の回収率はそれぞれ５
０.１％，４７.３％であった。活性の中心である図４中
のフラクション（Fraction）Ｎｏ，３１−３５のサンプ
ルを次の精製に進めた。
【００３３】（実施例５）ＳＤＭＦのヘパリン結合能を
利用してさらに精製を進めるために、ＨＰＬＣのヘパリ
ンカラムであるＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラム（東
ソ社製）を用いて精製を進めた。レッドセルロースカラ
ムからの溶出に用いたＳＤＳは、ＳＤＭＦとヘパリンと
の結合を阻害するが、ＳＤＳの濃度０.０１以下ではこ
の影響は認められないという基礎検討の結果から、レッ
ドセルロースのＳＤＭＦ画分（総蛋白質量110mg）を蒸
留水で希釈してＳＤＳ濃度を０.０１％以下にしてから
ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラムに１.０ｍＬ/minの
流速で流し吸着させた。
利用してさらに精製を進めるために、ＨＰＬＣのヘパリ
ンカラムであるＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラム（東
ソ社製）を用いて精製を進めた。レッドセルロースカラ
ムからの溶出に用いたＳＤＳは、ＳＤＭＦとヘパリンと
の結合を阻害するが、ＳＤＳの濃度０.０１以下ではこ
の影響は認められないという基礎検討の結果から、レッ
ドセルロースのＳＤＭＦ画分（総蛋白質量110mg）を蒸
留水で希釈してＳＤＳ濃度を０.０１％以下にしてから
ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラムに１.０ｍＬ/minの
流速で流し吸着させた。
【００３４】ＰＢＳでカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度
勾配を用いて０.５ｍＬ/minの流速でＳＤＭＦを溶出さ
せた。その結果を図５に示す。蛋白質の溶出は０.５Ｍ
付近にブロードなピークとなったが、活性はシャープな
ピークとして溶出された。活性の中心である図５中のフ
ラクション（Fraction）Ｎｏ，２２−２６のサンプルを
次の精製に進めた。
勾配を用いて０.５ｍＬ/minの流速でＳＤＭＦを溶出さ
せた。その結果を図５に示す。蛋白質の溶出は０.５Ｍ
付近にブロードなピークとなったが、活性はシャープな
ピークとして溶出された。活性の中心である図５中のフ
ラクション（Fraction）Ｎｏ，２２−２６のサンプルを
次の精製に進めた。
【００３５】（実施例６）精製の最終ステップとして、
ゲル濾過のカラムであるスーパーロース ６を用いてＳ
ＤＭＦの精製を進めた。ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカ
ラムのＳＤＭＦ画分を凍結乾燥により０.５ｍＬに濃縮
後、０.０１％ＳＤＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４２）で平
衡化したカラムに流し、同じ緩衝液で溶出させた。その
結果を図６に示す。分子量マーカーとして、ブルーデキ
ストラン(blue dextran)[void]，フェリチン(ferritin)
[400kDa],カタロース(catalase)[232kDa],ボビンセーラ
ムアルブミン(bovine serum albumin)[67kDa],ラクトア
ルブミン(lactoalbumin)[14kDa]を用いた。６０ｋＤａ
付近に遊走活性が溶出したが、４００ｋＤａ付近にも遊
走活性が認められた。
ゲル濾過のカラムであるスーパーロース ６を用いてＳ
ＤＭＦの精製を進めた。ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカ
ラムのＳＤＭＦ画分を凍結乾燥により０.５ｍＬに濃縮
後、０.０１％ＳＤＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４２）で平
衡化したカラムに流し、同じ緩衝液で溶出させた。その
結果を図６に示す。分子量マーカーとして、ブルーデキ
ストラン(blue dextran)[void]，フェリチン(ferritin)
[400kDa],カタロース(catalase)[232kDa],ボビンセーラ
ムアルブミン(bovine serum albumin)[67kDa],ラクトア
ルブミン(lactoalbumin)[14kDa]を用いた。６０ｋＤａ
付近に遊走活性が溶出したが、４００ｋＤａ付近にも遊
走活性が認められた。
【００３６】（実施例７）実施例６にて精製されたスー
パーロース ６ カラムの活性ピークである図６中のフ
ラクション（Fraction）Ｎｏ，４０のサンプルをポリア
クリルアミド濃度１０／２０％グラジエントゲル（ＡＣ
Ｉ社製）を用いて電気泳動を行った。その結果を図７に
示す。図に示すように、ＳＤＭＦは、非還元下で５８ｋ
Ｄａ，５％メルカプトエタノール還元下で５３ｋＤａの
物質と認められた。
パーロース ６ カラムの活性ピークである図６中のフ
ラクション（Fraction）Ｎｏ，４０のサンプルをポリア
クリルアミド濃度１０／２０％グラジエントゲル（ＡＣ
Ｉ社製）を用いて電気泳動を行った。その結果を図７に
示す。図に示すように、ＳＤＭＦは、非還元下で５８ｋ
Ｄａ，５％メルカプトエタノール還元下で５３ｋＤａの
物質と認められた。
【００３７】
【発明の効果】本発明の平滑筋細胞由来遊走因子は、動
脈硬化症病巣形成に係わる主要因子であり、当該因子の
抗体を用いれば動脈硬化症の早期・定量的診断が可能と
なる。また、当該因子は、創傷、火傷の活性促進因子と
しても有用である。さらに、本発明の平滑筋細胞由来遊
走因子精製方法によると、当該因子が純度よく得られ、
それを抗原として抗体作製し、この抗体を用いて定量測
定キット等または定量測定方法を提供できる。
脈硬化症病巣形成に係わる主要因子であり、当該因子の
抗体を用いれば動脈硬化症の早期・定量的診断が可能と
なる。また、当該因子は、創傷、火傷の活性促進因子と
しても有用である。さらに、本発明の平滑筋細胞由来遊
走因子精製方法によると、当該因子が純度よく得られ、
それを抗原として抗体作製し、この抗体を用いて定量測
定キット等または定量測定方法を提供できる。
図１は、本実施例に用いたカラムとポンプの配置を図示
したものである。図２は、実施例２にて処理したＣＭを
ジェラチンセファロースカラム通過後とヘパリンセファ
ロースカラム通過させたものと、未処理のＣＭとの遊走
活性と蛋白質濃度を測定した結果を示す。図３は、実施
例３においてヘパリンセファロースカラムをＰＢＳで十
分に洗浄後、吸着したＳＤＭＦを、ＮａＣｌの濃度勾配
を用い、２０ｍＬ／ｈの流速で溶出させた結果を示す。
図４は、実施例４において、レッドセルロースカラムの
ＳＤＭＦをＳＤＳの濃度勾配を用いて、１２ｍＬ/ｈの
流速で溶出させた結果を示す。図５は、実施例５におい
て、ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラムに吸着したＳＤ
ＭＦをＰＢＳでカラム洗浄後、ＮａＣｌの濃度勾配を用
いて０.５ｍＬ/minの流速で溶出させた結果を示す。図
６は、実施例６において、ＴＳＫ−ヘパリンセルロース
カラムのＳＤＭＦ画分を凍結乾燥により０.５ｍＬに濃
縮後、０.０１％ＳＤＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４２）で
平衡化したカラムに流し、同じ緩衝液で溶出させた結果
を示す。図７は、実施例７において、サンプルをポリア
クリルアミド濃度１０／２０％グラジエントゲル（ＡＣ
Ｉ社製）を用いて電気泳動を行った結果を示す。(−)
は、β−メルカプトエタノール（以下、β−ｍｅと称
す）非還元下の泳動像で、(＋)はβ−ｍｅ還元下の泳動
像を示す。
したものである。図２は、実施例２にて処理したＣＭを
ジェラチンセファロースカラム通過後とヘパリンセファ
ロースカラム通過させたものと、未処理のＣＭとの遊走
活性と蛋白質濃度を測定した結果を示す。図３は、実施
例３においてヘパリンセファロースカラムをＰＢＳで十
分に洗浄後、吸着したＳＤＭＦを、ＮａＣｌの濃度勾配
を用い、２０ｍＬ／ｈの流速で溶出させた結果を示す。
図４は、実施例４において、レッドセルロースカラムの
ＳＤＭＦをＳＤＳの濃度勾配を用いて、１２ｍＬ/ｈの
流速で溶出させた結果を示す。図５は、実施例５におい
て、ＴＳＫ−ヘパリンセルロースカラムに吸着したＳＤ
ＭＦをＰＢＳでカラム洗浄後、ＮａＣｌの濃度勾配を用
いて０.５ｍＬ/minの流速で溶出させた結果を示す。図
６は、実施例６において、ＴＳＫ−ヘパリンセルロース
カラムのＳＤＭＦ画分を凍結乾燥により０.５ｍＬに濃
縮後、０.０１％ＳＤＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４２）で
平衡化したカラムに流し、同じ緩衝液で溶出させた結果
を示す。図７は、実施例７において、サンプルをポリア
クリルアミド濃度１０／２０％グラジエントゲル（ＡＣ
Ｉ社製）を用いて電気泳動を行った結果を示す。(−)
は、β−メルカプトエタノール（以下、β−ｍｅと称
す）非還元下の泳動像で、(＋)はβ−ｍｅ還元下の泳動
像を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】哺乳動物の大動脈平滑筋細胞の無血清培養
上清から精製して得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量が非還元条件下で５０,０００
〜６０,０００、還元条件下で５０,０００〜６０,００
０であり、平滑筋細胞に遊走活性を有する一本鎖構造蛋
白質であることを特徴とする平滑筋細胞由来遊走因子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25705192A JPH06107694A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 平滑筋細胞由来遊走因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25705192A JPH06107694A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 平滑筋細胞由来遊走因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06107694A true JPH06107694A (ja) | 1994-04-19 |
Family
ID=17301060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25705192A Pending JPH06107694A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 平滑筋細胞由来遊走因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06107694A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5916758A (en) * | 1995-09-08 | 1999-06-29 | Hurle; Mark Robert | Smooth muscle cell-derived migration factor |
| WO2010067904A1 (ja) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | 国立大学法人東京大学 | 細胞の３次元階層的共培養法 |
-
1992
- 1992-09-28 JP JP25705192A patent/JPH06107694A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5916758A (en) * | 1995-09-08 | 1999-06-29 | Hurle; Mark Robert | Smooth muscle cell-derived migration factor |
| WO2010067904A1 (ja) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | 国立大学法人東京大学 | 細胞の３次元階層的共培養法 |
| JPWO2010067904A1 (ja) * | 2008-12-12 | 2012-05-24 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞の３次元階層的共培養法 |
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