JPH06109739A - Ｈｄｌコレステロール定量測定法及びそれに用いるｈｄｌリポタンパク分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡便、迅速で、かつ良好な再現性が得られる
ＨＤＬコレステロール定量測定法の提供と、この測定及
びその他の用途にも用いることができるＨＤＬリポタン
パク分離法の提供。 【構成】 血清にポリアニオン沈殿試薬を加えてＬＤＬ
リポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミクロン
の沈殿物を生成させてＨＤＬリポタンパクを分画し、生
成した沈殿物を孔径が０．５μｍ以下のフィルターによ
って除去し、ＨＤＬリポタンパクのみを分離する。ＨＤ
Ｌコレステロールを定量測定するには、フィルターで分
離したＨＤＬリポタンパクを対象に比色法によって行わ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液中のＨＤＬコレス
テロールの定量測定法及びその測定に用いるＨＤＬリポ
タンパク分離法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のＨＤＬコレステロールは、冠状
動脈硬化症の危険予防因子であることから、多くの施設
で成人病予防検査の一環としてその測定が行われてい
る。ＨＤＬコレステロールについては、ＨＤＬリポタン
パクを他のリポタンパクから分画後、上清（上澄液）中
のＨＤＬコレステロールを酵素法によって測定してい
る。ＨＤＬリポタンパクを他のリポタンパクから分画す
る方法としては、超遠心力を用いる方法、２価の金属イ
オンとポリアニオンにより他のリポタンパクを沈殿させ
て除去する方法がある。

【０００３】超遠心法は超遠心機を使用するので、操作
が煩雑でかつ多大な時間を必要とすることから、現在の
測定に用いられる分画法の主流は後者の沈殿法となって
いる。２価の金属イオンとポリアニオンを組合せたポリ
アニオン沈殿剤としては、ヘパリン−Ｃａ²⁺，ヘパリン
−Ｍｎ²⁺，リンタングステン酸−Ｍｇ²⁺，デキストラン
硫酸−Ｍｇ²⁺が用いられる。これらのポリアニオン沈殿
剤を用いる方法はほぼ共通しており、次のとおりであ
る。すなわち、血清に上記沈殿剤を加えて５〜２０分間
（使用沈殿剤により異なる）放置して沈殿を十分生成さ
せた後、３０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離を行
う。遠心分離後、上清（ＨＬＤ画分）をとり、３７℃で
コレステロール発色反応又は酵素電極法により定量す
る。

【０００４】以上述べたように、沈殿剤を用いるＨＤＬ
コレステロールの測定方法は、沈殿生成以外に遠心分離
操作が必要なため、超遠心法ほどではないにせよ操作が
煩雑でかつ時間がかかるという欠点が指摘されている。
すなわち、遠心分離の正味所要時間は１０分間として
も、検体の移しかえ、分離管の準備、遠心分離のバラン
スとり、回転速度の上昇と減速等に必要な時間を加える
と少なくとも２０分間を要してしまう。また検体の取違
えが発生する恐れもある。

【０００５】上記沈殿法と原理は全く異なるが、すでに
実用化されている方法として電気泳動法がある。この方
法は、電気泳動によってリポタンパクがＨＤＬ，ＬＤ
Ｌ，ＶＬＤＬにそれぞれ分画されるため、ＨＤＬ画分の
コレステロールを染色してデンシトメトリーにより定量
する方法であるが、泳動と染色とに時間を要し、高速化
したとしても沈殿法と大差ない測定速度にしかならな
い。デキストラン硫酸−Ｍｇ法では、分子量５００００
程度のデキストランを用いれば、必ずしも本発明のよう
な微小孔径フィルターを用いる必要はなく、ろ紙等でも
分離が可能となるが、信頼性に欠けるため実用化されて
いない。

【０００６】この他に、コレステロールをドライケミス
トリーにより測定する方法に沈殿剤を加味した新たな方
法が開発されている。この方法では、コレステロール測
定フィルムの展開層部分に沈殿剤が含まれており、血清
は沈殿剤と反応してＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポ
タンパク等が沈殿として除去され、沈殿剤と反応しなか
ったＨＤＬリポタンパクが下層の発色層まで到達して、
反射吸光光度法により定量される。この方法は簡便で短
時間での測定が可能なため、現在の迅速化の要求に応え
うる方法ではあるが、再現精度に問題があり、しかも測
定コストも高いという欠点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な従来のＨＤＬコレステロール測定法が有する欠点を除
去した、簡便かつ迅速な新規測定法を提供することを目
的としている。本発明はまた、前記測定及びその他の用
途にも用いることができるＨＤＬリポタンパクの分離法
にも関する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によるＨＤＬリポ
タンパクの分離法は、血清のポリアニオン沈殿試薬を加
えてＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイ
ロミクロンの沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を孔径
が０．５μｍ以下のフィルターによって除去することを
特徴としている。また、この分離法を用いるＨＤＬコレ
ステロールの定量測定法は、上記分離法によって分離さ
れたＨＤＬリポタンパクを対象に比色法又は酵素電極法
により行われることを特徴とし、好ましい実施態様にお
いては、ＨＤＬコレステロールの定量はドライケミスト
リーを用いて行われる。

【０００９】上記のように本発明では、沈殿剤によって
沈殿を生成するＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポタン
パク、カイロミクロンから、沈殿を生成しないＨＤＬリ
ポタンパクを分画した後、従来の遠心分離法の代わりに
フィルターろ過法によって生成した沈殿物を除去するこ
とによって血清中のＨＤＬリポタンパクを分離する。フ
ィルターとしてはメンブランフィルターが好ましく、孔
径が０．１μｍ，０．２μｍ，０．４５μｍのものが用
いられる。メンブランフィルターろ過法を採用すること
により、従来の遠心分離法における煩雑な操作、長い所
要時間を簡略化、短縮化することが可能となった。

【００１０】本発明によるＨＤＬコレステロールの測定
法では、血清中のＨＤＬリポタンパクをＬＤＬリポタン
パク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミクロンから分画
するのにポリアニオン沈殿試験を用い、生成した沈殿物
を０．１〜０．４５μｍの親水性メンブレンフィルター
でろ過し、得られたＨＤＬリポタンパク画分について比
色法又は酵素電極法により定量測定することを基本とし
ている。

【００１１】ポリアニオン沈殿剤としては、ヘパリン−
Ｃａ沈殿剤、リンタングステン−Ｍｇ沈殿剤、デキスト
ラン硫酸Ｍｇ−リンタングステンＭｇ沈殿剤、等電点分
画−リンタングステン沈殿剤の４種類が、ＨＤＬコレス
テロール測定の精度、正確さのいずれも優れているため
広く用いられており、本発明においてもこれら４種類の
いずれの沈殿剤も使用可能である。しかしながらヘパリ
ン−Ｃａ沈殿剤を用いた場合、沈殿生成に要する時間が
２０〜３０分と長いため、本発明の目的である迅速性の
面からは好ましくない。またデキストラン硫酸−Ｍｇ、
ポリエチレングリコール６０００、ヘパリン−Ｍｎの３
種類の沈殿剤も原理的に可能であるが、正確さ、精度の
点で劣るため、これらは市販されていない。

【００１２】次に、生成した沈殿物をフィルターで除去
する段階は本発明の大きな特徴であるが、これに用いら
れるフィルターとしてはメンブランフィルターが好まし
く、親水性、強靱、均一孔径という三条件の他に、さら
にタンパク吸着がないという条件も満たしたメンブラン
フィルターがもっとも好ましい。これらの条件を満たす
メンブランフィルターとしては、酢酸セルロース、硝酸
セルロース、ポリビニデンジフルオライド、オムニポ
ア、変性ポリスルフォン等の各メンブランがある。ただ
し酢酸セルロース、硝酸セルロースは強度的に０．１μ
ｍのメンブランには使用できず、また硝酸セルロースは
タンパク吸着が比較的大とされているので好ましくな
い。

【００１３】メンブランフィルターろ過にはある程度圧
力を加える必要があり、そのためには空気で加圧する
か、吸引するかの方法が用いられる。前者は注射シリン
ジの先端に加圧ろ過フィルターを装着し、シリンジを押
しながら沈殿物をろ過する。後者は減圧吸引によりろ過
を行うもので、多試料処理に適している。限度を超える
加圧又は減圧は孔径以上の沈殿物を通過させるので、加
圧、減圧とも限度以内の圧力とする必要がある。

【００１４】メンブランの材質にもよるが、ポリビニリ
デンジフルオライド及びオムニポアのメンブランは、酢
酸セルロースメンブランよりも圧力を高くする必要があ
る。また孔径が小さいほど、ろ過に必要な圧力を高くし
なければならないことは当然である。これらをすべて合
せて考慮すると、孔径の小さなフィルターよりも０．４
５μｍ孔径の酢酸セルロースメンブランがもっとも適し
ていることがわかる。

【００１５】生成沈殿物を確実にろ過するのに必要なメ
ンブランの孔径を明確な数字として表わすことは困難で
ある。その理由の一つは、例えば孔径が０．４５μｍと
表示されたメンブランであっても、すべての孔径が均一
に０．４５μｍではなくてばらつきがあり、孔径が０．
４μｍや０．５μｍのものも混在していることであり、
他の理由は、市販されているメンブランの孔径が、０．
１μｍ，０．２μｍ，０．２２μｍ，０．４５μｍ，
０．８μｍとなっており、特に０．４５μｍから０．８
μｍに飛んで、その間の孔径のものが市販されていない
ことである。

【００１６】発明者の実験によれば、孔径０．４５μｍ
のメンブランでは沈殿物を除去することができたが、孔
径０．８μｍのメンブランでは除去できなかった。した
がって、少なくとも０．８μｍ以上の孔径のメンブラン
を用いることができないのは明らかである。また、孔径
０．８μｍではかなりの沈殿物が通過したため、孔径
０．６μｍでもある程度の通過の恐れが予測された。以
上のことから、孔径０．５μｍ以下であれば、沈殿物は
ほぼ完全に除去されるとの大まかな判断基準を得ること
ができた。

【００１７】 表１は、フィルターの孔径によりＨＤＬコレステロール
の測定がどのように変化するかを調べたテスト結果であ
る。この表から、孔径０．８μｍのフィルターでは明ら
かに正誤差が得られていることがわかる。一方、孔径
０．１〜０．４５μｍのフィルターでは、ほぼ一致した
値となっているが、傾向的には孔径０．１μｍフィルタ
ーでの値は低い値を示している。これについては、生成
した沈殿中には微細なものが存在し、それが孔径０．２
μｍ以上では通過するが、孔径０．１μｍフィルターで
は通過しないためと考えられる。

【００１８】予備実験における遠心分離法と０．１μｍ
フィルターろ過法とを比較すると、遠心分離法の方が、
ＨＤＬコレステロール測定値がやや高い値となる傾向を
示した。これは３０００ｒｐｍの遠心分離では、上記の
微細沈殿物を除去できないためと考えられる。このこと
から、真のＨＤＬコレステロールという観点からすれ
ば、０．１μｍフィルターろ過法がより正確な方法であ
ると云える。

【００１９】同様の観点から、孔径０．２μｍと０．４
５μｍとの比較では、０．２μｍの方がより正しい値が
得られるということになる。特に試料検体によっては微
細沈殿物が比較的多く生成することが考えられるので、
ＨＤＬコレステロール測定値の正確さの点からは孔径
０．２μｍフィルターの方が好ましい。今後さらに数多
くの検体を用いて解析を行い、そのような異常検体の特
定を行う必要があると思われる。

【００２０】ところで、このような孔径０．５μｍ以下
のメンブランフィルターによる沈殿物のろ過除去方法に
ついては、過去の文献に報告された例が見当らない。そ
の理由は、このろ過法が新鮮血清以外には適用できない
ことにあると思われる。すなわち新鮮血清の入手が困難
なため、新方法の開発実験では必ず冷凍保存血清か、凍
結乾燥血清が試料として使用されるが、タンパク変性が
多少なりとも生じたこのような血清による実験では、大
きな誤差が生じることが本発明による方法の開発過程で
判明した。これを表２に示す。

【００２１】 このような現象が生じる理由としては、タンパク変性に
よる生成物が沈殿剤と反応して微細な沈殿物を生じる場
合があり、このような沈殿物がメンブランフィルターを
通過して正誤差となる、また逆に、タンパク変性が進行
すると、沈殿剤と反応してＨＤＬリポタンパクを取込ん
だ沈殿物を生成して負誤差となる、あるいは、一定の径
をもった沈殿物生成に長時間を要して再現性が得られな
い、の三つ理由が考えられる。これらのことからメンブ
ランフィルターろ過法の有用性が容易に気づかれず、一
方、遠心分離法がその間に普及したため、メンブランフ
ィルターろ過法が顧られなくなったと思われる。

【００２２】ところで本発明によるＨＤＬコレステロー
ルの測定法は、前にも記したようにメンブランフィルタ
ーろ過法で分離された血清中のＨＤＬリポタンパク画分
について、比色法又は酵素電極法により定量測定するこ
とを基本としている。比色法とは、コレステロールエス
テラーゼ、コレステロールオキシダーゼにより生成した
過酸化水素とペルオキシダーゼの反応に発色試薬（種々
のものがある）を組合せ、５００〜５５０ｎｍでの吸光
度（又は吸光度変化）を分光光度計を用いて測定するも
のである。

【００２３】この比色法は、分光光度計を必要とするた
め装置がやや大がかりになるが、酵素電極法を定量に用
いれば小型化が可能となる。これはコレステロールオキ
シダーゼをコラーゲンに固定化したもので、生成した過
酸化水素をアンペロメトリーにより測定する。また、酸
化還元メディエーターを用いる電極も報告されている。
さらに近年、コレステロールエステラーゼを固体化する
方法も報告されている。ただし現状では精度がかなり劣
るため、広く用いられるにはいたっていない。比色法で
は、過剰な沈殿剤が共存しても過酸化水素生成反応が生
じているので、酵素電極法も沈殿剤の共存下に作用する
はずである。またＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺等は影響を生じないの
で、原理的には沈殿法と、沈殿をろ過後の酵素電極によ
る検出は可能である。

【００２４】より簡便かつ迅速な測定法として、例えば
ドライケミストリーと組合せることが可能である。公知
のコダック(Kodak) 社のドライケミでは展開層に沈殿試
薬が含まれており、沈殿分画と展開が同時に行われるが
再現性が悪い。これは沈殿を生成しつつ展開を行うこと
となり、沈殿生成が速度論的に扱われた例であり、再現
性が劣ることは当然と云える。

【００２５】しかしながら本発明の方法によれば、生成
した沈殿物をフィルターろ過し、その後に展開層で展開
し、比色定量されるため再現性の向上が予測された。予
備実験の結果、ＨＤＬコレステロール測定値のばらつき
は主として発色過程に原因があり、フィルターろ過によ
るばらつきはきわめて小さいことが判明した。ＨＤＬコ
レステロール測定値は再現値を要求されるものである
が、フィルターろ過（ポリアニオン沈殿試薬による沈殿
物生成を含むことはもちろんである）とドライケミスト
リーを組合せることにより、簡便、迅速、良好な再現性
の三条件が揃い、はじめて十分な実用性を満足させるこ
とができた。

【００２６】上記の方法を実施するための操作を図１の
略図によって説明する。直径約５ｍｍの円形メンブラン
フィルター１と、圧力によってこのメンブランが破損し
ないようにする網目状支持層２をその下側に備えたフィ
ルター部を有するメンブラン板４が、多層分析フィルム
の最上層である展開層５上に接着されている。加圧注入
シリンジ８を注入口９にはめて沈殿物含有試料液を注入
すると、ＨＤＬリポタンパク画分のみがメンブランフィ
ルター１を通過し、展開層５に達して展開される。試料
液は展開されながら反射層６を通過して、発色試薬を含
有する発色層７に達し、試薬と反応して吸光度に変化を
生じる。ここに下から光を当てると、発色層７を透過し
た光が反射層６で反射されるので、これを測光すること
によってＨＤＬコレステロールを定量測定できる。

【００２７】

【実施例】実施例１ 新鮮血清を試料とし、測定には国際試薬社製のＨＤＬコ
レステロール測定キットを用いた。このキットの原理
は、等電点分画−リンタングステン酸沈殿法によってい
る。血清としては、健常人から採取した血液を暫時放置
して血餅を除いた血清を、２日間４℃の冷蔵庫で保存し
たものを用いた。測定は、キット記載の方法に従って行
った。メンブランフィルターろ過には、アドヴァンテッ
ク(ADVANTEC)社製の加圧ろ過カートリッジ（酢酸セルロ
ース）を用いた。本発明のメンブランフィルターろ過法
によるＨＤＬコレステロール測定値と従来の遠心分離法
による測定値の比較を表３に示す。

【００２８】 実施例２ 実施例１と同一の血清を試料とし、協和メデックス社製
のＨＤＬ分画試薬デタミナーＨＤＬを用いて、本発明の
比色法（用手法）による測定方法の有用性を調べた。デ
タミナーＨＤＬは、デキストラン硫酸Ｍｇ−リンタング
ステンＭｇ沈殿試薬であるが、発色試薬が付属していな
いので、実施例１の国際試薬社製のＨＤＬコレステロー
ル測定キットの発色試薬を用いた。実施例１と同様に測
定値の比較を表４に示す。

【００２９】 実施例３ 実施例１とは異なる新鮮血清を試料として、実施例２と
同様にして（ただしメンブランフィルターは孔径０．２
μｍのみ）ＨＤＬコレステロールを測定した。実施例
１，２と同様に測定値の比較を表５に示す。

【００３０】 実施例４ ドライケミストリーによる測定を応用した。市販による
コレステロール測定用フィルムの上層に図１のメンブラ
ン板を密着させ、リンタングステン−Ｍｇ沈殿剤を加え
て血清試料を注入して測定した。ただし、空気がフィル
ム上に圧入されると測定にばらつきが生じたので、テル
モ社の注射器で、メンブランと試料の間に空気が入らな
いように試料をメンブラン上に注入後、ピペッターを装
着して加圧ろ過させた。

【００３１】原理的にはフィルムとメンブラン板とを密
着させる必要はないので、メンブラン板の下方に空気が
外部に放出される間隙を設けるようにすれば、メンブラ
ンと試料の間に空気が入っても支障はない。４回の繰返
し測定結果は、 ５２．４， ５４．８， ５０．９， ５３．６ ｍｇ
／ｄｌ であった。この結果によれば、ばらつきが比色法に比べ
てやや大きくなった。その大きな原因は、加圧時の圧力
のかけ方にあることが判明した。圧力がフィルムに直接
かからないように、横に支えを設けることによってばら
つきが解消するものと思われる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によるＨＤＬコレステロール定量
測定法は、ポリアニオン沈殿試薬によって血清中のＬＤ
Ｌリポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミクロ
ンの沈殿物を生成させて、沈殿を生成しないＨＤＬリポ
タンパクを分画し、この生成した沈殿物を孔径が０．５
μｍ以下のフィルターによって除去したＨＤＬリポタン
パク画分を検体として測定することにより、簡便、迅速
で、良好な再現性が得られるという顕著な効果が得られ
た。

【００３３】またこの測定法の前段は、ＨＤＬリポタン
パクを分離する方法であり、本発明による分離法によれ
ば、連続的でかつ簡便にＨＤＬリポタンパクを分離する
ことができ、遠心分離法のようなバッチ式方法とは異な
り、大量の分離処理が可能となる。そのためＨＤＬコレ
ステロール測定に用いられる以外にも工業上の利用分野
も広く、例えばメンブランフィルターろ過液を透析又は
限界ろ過、ゲルクロマトグラフィー等の手段によって、
連続的かつ大量に純粋ＨＤＬリポタンパクが得られる効
果は大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ドライケミストリーと組合せた本発明によるＨ
ＤＬコレステロール定量測定の操作を説明する略図。

【符号の説明】

１ メンブランフィルター ２ メンブランフィルター１の支持層（網目状） ３ フィルター部 ４ メンブラン板 ５ 展開層 ６ 反射層 ７ 発色層 ８ 加圧注入シリンジ ９ 注入口

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年８月２０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の詳細な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液中のＨＤＬコレス
テロールの定量測定法及びその測定に用いるＨＤＬリポ
タンパク分離法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のＨＤＬコレステロールは、冠状
動脈硬化症の危険予防因子であることから、多くの施設
で成人病予防検査の一環としてその測定が行われてい
る。ＨＤＬコレステロールについては、ＨＤＬリポタン
パクを他のリポタンパクから分画後、上清（上澄液）中
のＨＤＬコレステロールを酵素法によって測定してい
る。ＨＤＬリポタンパクを他のリポタンパクから分画す
る方法としては、超遠心力を用いる方法、２価の金属イ
オンとポリアニオンにより他のリポタンパクを沈殿させ
て除去する方法がある。

【０００３】超遠心法は超遠心機を使用するので、操作
が煩雑でかつ多大な時間を必要とすることから、現在の
測定に用いられる分画法の主流は後者の沈殿法となって
いる。２価の金属イオンとポリアニオンを組合せたポリ
アニオン沈殿剤としては、ヘパリン−Ｃａ²⁺，ヘパリン
−Ｍｎ²⁺，リンタングステン酸−Ｍｇ²⁺，デキストラン
硫酸−Ｍｇ²⁺が用いられる。これらのポリアニオン沈殿
剤を用いる方法はほぼ共通しており、次のとおりであ
る。すなわち、血清に上記沈殿剤を加えて５〜２０分間
（使用沈殿剤により異なる）放置して沈殿を十分生成さ
せた後、３０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離を行
う。遠心分離後、上清（ＨＬＤ画分）をとり、３７℃で
コレステロール発色反応又は酵素電極法により定量す
る。

【０００４】以上述べたように、沈殿剤を用いるＨＤＬ
コレステロールの測定方法は、沈殿生成以外に遠心分離
操作が必要なため、超遠心法ほどではないにせよ操作が
煩雑でかつ時間がかかるという欠点が指摘されている。
すなわち、遠心分離の正味所要時間は１０分間として
も、検体の移しかえ、分離管の準備、遠心分離のバラン
スとり、回転速度の上昇と減速等に必要な時間を加える
と少なくとも２０分間を要してしまう。また検体の取違
えが発生する恐れもある。

【０００５】上記沈殿法と原理は全く異なるが、すでに
実用化されている方法として電気泳動法がある。この方
法は、電気泳動によってリポタンパクがＨＤＬ，ＬＤ
Ｌ，ＶＬＤＬにそれぞれ分画されるため、ＨＤＬ画分の
コレステロールを染色してデンシトメトリーにより定量
する方法であるが、泳動と染色とに時間を要し、高速化
したとしても沈殿法と大差ない測定速度にしかならな
い。デキストラン硫酸−Ｍｇ法では、分子量５００００
程度のデキストランを用いれば、必ずしも本発明のよう
な微小孔径フィルターを用いる必要はなく、ろ紙等でも
分離が可能となるが、信頼性に欠けるため実用化されて
いない。

【０００６】この他に、コレステロールをドライケミス
トリーにより測定する方法に沈殿剤を加味した新たな方
法が開発されている。この方法では、コレステロール測
定フィルムの展開層部分に沈殿剤が含まれており、血清
は沈殿剤と反応してＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポ
タンパク等が沈殿として除去され、沈殿剤と反応しなか
ったＨＤＬリポタンパクが下層の発色層まで到達して、
反射吸光光度法により定量される。この方法は簡便で短
時間での測定が可能なため、現在の迅速化の要求に応え
うる方法ではあるが、再現精度に問題があり、しかも測
定コストも高いという欠点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な従来のＨＤＬコレステロール測定法が有する欠点を除
去した、簡便かつ迅速な新規測定法を提供することを目
的としている。本発明はまた、前記測定及びその他の用
途にも用いることができるＨＤＬリポタンパクの分離法
にも関する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によるＨＤＬリポ
タンパクの分離法は、血清のポリアニオン沈殿試薬を加
えてＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイ
ロミクロンの沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を孔径
が０．５μｍ以下のフィルターによって除去することを
特徴としている。また、この分離法を用いるＨＤＬコレ
ステロールの定量測定法は、上記分離法によって分離さ
れたＨＤＬリポタンパクを対象に比色法又は酵素電極法
により行われることを特徴とし、好ましい実施態様にお
いては、ＨＤＬコレステロールの定量はドライケミスト
リーを用いて行われる。

【０００９】上記のように本発明では、沈殿剤によって
沈殿を生成するＬＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポタン
パク、カイロミクロンから、沈殿を生成しないＨＤＬリ
ポタンパクを分画した後、従来の遠心分離法の代わりに
フィルターろ過法によって生成した沈殿物を除去するこ
とによって血清中のＨＤＬリポタンパクを分離する。フ
ィルターとしてはメンブランフィルターが好ましく、孔
径が０．１μｍ，０．２μｍ，０．４５μｍのものが用
いられる。メンブランフィルターろ過法を採用すること
により、従来の遠心分離法における煩雑な操作、長い所
要時間を簡略化、短縮化することが可能となった。

【００１０】本発明によるＨＤＬコレステロールの測定
法では、血清中のＨＤＬリポタンパクをＬＤＬリポタン
パク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミクロンから分画
するのにポリアニオン沈殿試験を用い、生成した沈殿物
を０．１〜０．４５μｍの親水性メンブレンフィルター
でろ過し、得られたＨＤＬリポタンパク画分について比
色法又は酵素電極法により定量測定することを基本とし
ている。

【００１１】ポリアニオン沈殿剤としては、ヘパリン−
Ｃａ沈殿剤、リンタングステン−Ｍｇ沈殿剤、デキスト
ラン硫酸Ｍｇ−リンタングステンＭｇ沈殿剤、等電点分
画−リンタングステン沈殿剤の４種類が、ＨＤＬコレス
テロール測定の精度、正確さのいずれも優れているため
広く用いられている。しかしながらヘパリン−Ｃａ沈殿
剤については、日本商事社製のヘパリン沈殿法によるＨ
ＤＬ−コレステロールキット（ネスコートＨＤＬ−Ｃキ
ットＮ）を用いて、遠心分離法及び０．２μｍフィルタ
ーろ過法で、測定したところ、次の結果が得られた。 検 体 遠心分離法 ろ 過 法 （mg/dl) （mg/dl) 新鮮血清Ａ ４９．３ ６５．３ 冷凍新鮮血清Ｂ ５３．８ ７２．７ Ｂ′ ５８．４ ９１．３ 冷凍保存血清Ｃ ５８．７ ７０．０ Ｃ′ ５９．８ ６７．９ この結果から、ヘパリン−Ｃａ沈殿剤を用いた場合、ろ
過法は遠心分離と比べて明らかに高い値を示すことがわ
かった。したがってヘパリン−Ｃａ沈殿法によるろ過法
を本発明に適用することはできないので、他の３種類の
沈殿剤を用いるのが適当である。 またデキストラン硫酸
−Ｍｇ、ポリエチレングリコール６０００、ヘパリン−
Ｍｎの３種類の沈殿剤も原理的に可能であるが、正確
さ、精度の点で劣るため、これら単独の沈殿剤キットは
市販されていない。

【００１２】次に、生成した沈殿物をフィルターで除去
する段階は本発明の大きな特徴であるが、これに用いら
れるフィルターとしてはメンブランフィルターが好まし
く、親水性、強靱、均一孔径という三条件の他に、さら
にタンパク吸着がないという条件も満たしたメンブラン
フィルターがもっとも好ましい。これらの条件を満たす
メンブランフィルターとしては、酢酸セルロース、硝酸
セルロース、ポリビニデンジフルオライド、オムニポ
ア、変性ポリスルフォン等の各メンブランがある。ただ
し酢酸セルロース、硝酸セルロースは強度的に０．１μ
ｍのメンブランには使用できず、また硝酸セルロースは
タンパク吸着が比較的大とされているので好ましくな
い。

【００１３】メンブランフィルターろ過にはある程度圧
力を加える必要があり、そのためには空気で加圧する
か、吸引するかの方法が用いられる。前者は注射シリン
ジの先端に加圧ろ過フィルターを装着し、シリンジを押
しながら沈殿物をろ過する。後者は減圧吸引によりろ過
を行うもので、多試料処理に適している。限度を超える
加圧又は減圧は孔径以上の沈殿物を通過させるので、加
圧、減圧とも限度以内の圧力とする必要がある。

【００１４】メンブランの材質にもよるが、ポリビニリ
デンジフルオライド及びオムニポアのメンブランは、酢
酸セルロースメンブランよりも圧力を高くする必要があ
る。また孔径が小さいほど、ろ過に必要な圧力を高くし
なければならないことは当然である。これらをすべて合
せて考慮すると、孔径の小さなフィルターよりも０．４
５μｍ孔径の酢酸セルロースメンブランがもっとも適し
ていることがわかる。

【００１５】生成沈殿物を確実にろ過するのに必要なメ
ンブランの孔径を明確な数字として表わすことは困難で
ある。その理由の一つは、例えば孔径が０．４５μｍと
表示されたメンブランであっても、すべての孔径が均一
に０．４５μｍではなくてばらつきがあり、孔径が０．
４μｍや０．５μｍのものも混在していることであり、
他の理由は、市販されているメンブランの孔径が、０．
１μｍ，０．２μｍ，０．２２μｍ，０．４５μｍ，
０．８μｍとなっており、特に０．４５μｍから０．８
μｍに飛んで、その間の孔径のものが市販されていない
ことである。

【００１６】発明者の実験によれば、孔径０．４５μｍ
のメンブランでは沈殿物を除去することができたが、孔
径０．８μｍのメンブランでは除去できなかった。した
がって、少なくとも０．８μｍ以上の孔径のメンブラン
を用いることができないのは明らかである。また、孔径
０．８μｍではかなりの沈殿物が通過したため、孔径
０．６μｍでもある程度の通過の恐れが予測された。以
上のことから、孔径０．５μｍ以下であれば、沈殿物は
ほぼ完全に除去されるとの大まかな判断基準を得ること
ができた。

【００１７】 表１は、フィルターの孔径によりＨＤＬコレステロール
の測定がどのように変化するかを調べたテスト結果であ
る。この表から、孔径０．８μｍのフィルターでは明ら
かに正誤差が得られていることがわかる。一方、孔径
０．１〜０．４５μｍのフィルターでは、ほぼ一致した
値となっているが、傾向的には孔径０．１μｍフィルタ
ーでの値は低い値を示している。これについては、生成
した沈殿中には微細なものが存在し、それが孔径０．２
μｍ以上では通過するが、孔径０．１μｍフィルターで
は通過しないためと考えられる。

【００１８】予備実験における遠心分離法と０．１μｍ
フィルターろ過法とを比較すると、遠心分離法の方が、
ＨＤＬコレステロール測定値がやや高い値となる傾向を
示した。これは３０００ｒｐｍの遠心分離では、上記の
微細沈殿物を除去できないためと考えられる。このこと
から、真のＨＤＬコレステロールという観点からすれ
ば、０．１μｍフィルターろ過法がより正確な方法であ
ると云える。

【００１９】同様の観点から、孔径０．２μｍと０．４
５μｍとの比較では、０．２μｍの方がより正しい値が
得られるということになる。特に試料検体によっては微
細沈殿物が比較的多く生成することが考えられるので、
ＨＤＬコレステロール測定値の正確さの点からは孔径
０．２μｍフィルターの方が好ましい。今後さらに数多
くの検体を用いて解析を行い、そのような異常検体の特
定を行う必要があると思われる。

【００２０】ところで、このような孔径０．５μｍ以下
のメンブランフィルターによる沈殿物のろ過除去方法に
ついては、過去の文献に報告された例が見当らない。そ
の理由は、このろ過法が新鮮血清以外には適用できない
ことにあると思われる。すなわち新鮮血清の入手が困難
なため、新方法の開発実験では必ず冷凍保存血清か、凍
結乾燥血清が試料として使用されるが、タンパク変性が
多少なりとも生じたこのような血清による実験では、大
きな誤差が生じることが本発明による方法の開発過程で
判明した。これを表２に示す。

【００２１】 このような現象が生じる理由としては、タンパク変性に
よる生成物が沈殿剤と反応して微細な沈殿物を生じる場
合があり、このような沈殿物がメンブランフィルターを
通過して正誤差となる、また逆に、タンパク変性が進行
すると、沈殿剤と反応してＨＤＬリポタンパクを取込ん
だ沈殿物を生成して負誤差となる、あるいは、一定の径
をもった沈殿物生成に長時間を要して再現性が得られな
い、の三つ理由が考えられる。これらのことからメンブ
ランフィルターろ過法の有用性が容易に気づかれず、一
方、遠心分離法がその間に普及したため、メンブランフ
ィルターろ過法が顧られなくなったと思われる。

【００２２】ところで本発明によるＨＤＬコレステロー
ルの測定法は、前にも記したようにメンブランフィルタ
ーろ過法で分離された血清中のＨＤＬリポタンパク画分
について、比色法又は酵素電極法により定量測定するこ
とを基本としている。比色法とは、コレステロールエス
テラーゼ、コレステロールオキシダーゼにより生成した
過酸化水素とペルオキシダーゼの反応に発色試薬（種々
のものがある）を組合せ、５００〜５５０ｎｍでの吸光
度（又は吸光度変化）を分光光度計を用いて測定するも
のである。

【００２３】この比色法は、分光光度計を必要とするた
め装置がやや大がかりになるが、酵素電極法を定量に用
いれば小型化が可能となる。これはその表面にメンブラ
ンフィルターをつけることにより、浸透によってＨＤＬ
のみが電極面に移動するため、圧力をかけてろ過を行う
操作が不要となるからである。酵素電極としては、コレ
ステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ
をコラーゲン（アナリティカル・レターズ，１２（Ｂ１
４）巻，１４７７〜１４８８頁，１９７９年及び１２
巻，５８１頁，１９７９年）に固定化した例、アルキル
アミン・ガラス（クリニカル・ケミストリー，２３巻，
６７１頁，１９７７年）に固定化した例、ポリアクリル
アミド（アナリティカル・レターズ，１３（Ｂ１０）
巻，８２５頁，１９８０年）に固定化した例、ヒドロキ
シエチルメタアクリレート・ゲル（バイオエレクトロケ
ミストリー・バイオエナジェティックス，１１巻，３０
７頁，１９８３年）に固定化した例等が報告されてい
る。

【００２４】より簡便かつ迅速な測定法として、例えば
ドライケミストリーと組合せることが可能である。公知
のコダック(Kodak) 社のドライケミでは展開層に沈殿試
薬が含まれており、沈殿分画と展開が同時に行われるが
再現性が悪い。これは沈殿を生成しつつ展開を行うこと
となり、沈殿生成が速度論的に扱われた例であり、再現
性が劣ることは当然と云える。

【００２５】しかしながら本発明の方法によれば、生成
した沈殿物をフィルターろ過し、その後に展開層で展開
し、比色定量されるため再現性の向上が予測された。予
備実験の結果、ＨＤＬコレステロール測定値のばらつき
は主として発色過程に原因があり、フィルターろ過によ
るばらつきはきわめて小さいことが判明した。ＨＤＬコ
レステロール測定値は再現値を要求されるものである
が、フィルターろ過（ポリアニオン沈殿試薬による沈殿
物生成を含むことはもちろんである）とドライケミスト
リーを組合せることにより、簡便、迅速、良好な再現性
の三条件が揃い、はじめて十分な実用性を満足させるこ
とができた。

【００２６】上記の方法を実施するための操作を図１の
略図によって説明する。直径約５ｍｍの円形メンブラン
フィルター１と、圧力によってこのメンブランが破損し
ないようにする網目状支持層２をその下側に備えたフィ
ルター部を有するメンブラン板４が、多層分析フィルム
の最上層である展開層５上に接着されている。加圧注入
シリンジ８を注入口９にはめて沈殿物含有試料液を注入
すると、ＨＤＬリポタンパク画分のみがメンブランフィ
ルター１を通過し、展開層５に達して展開される。試料
液は展開されながら反射層６を通過して、発色試薬を含
有する発色層７に達し、試薬と反応して吸光度に変化を
生じる。ここに下から光を当てると、発色層７を透過し
た光が反射層６で反射されるので、これを測光すること
によってＨＤＬコレステロールを定量測定できる。

【００２７】

【実施例】実施例１ 新鮮血清を試料とし、測定には国際試薬社製のＨＤＬコ
レステロール測定キットを用いた。このキットの原理
は、等電点分画−リンタングステン酸沈殿法によってい
る。血清としては、健常人から採取した血液を暫時放置
して血餅を除いた血清を、２日間４℃の冷蔵庫で保存し
たものを用いた。測定は、キット記載の方法に従って行
った。メンブランフィルターろ過には、アドヴァンテッ
ク(ADVANTEC)社製の加圧ろ過カートリッジ（酢酸セルロ
ース）を用いた。本発明のメンブランフィルターろ過法
によるＨＤＬコレステロール測定値と従来の遠心分離法
による測定値の比較を表３に示す。

【００２８】 実施例２ 実施例１と同一の血清を試料とし、協和メデックス社製
のＨＤＬ分画試薬デタミナーＨＤＬを用いて、本発明の
比色法（用手法）による測定方法の有用性を調べた。デ
タミナーＨＤＬは、デキストラン硫酸Ｍｇ−リンタング
ステンＭｇ沈殿試薬であるが、発色試薬が付属していな
いので、実施例１の国際試薬社製のＨＤＬコレステロー
ル測定キットの発色試薬を用いた。実施例１と同様に測
定値の比較を表４に示す。

【００２９】 実施例３ 実施例１とは異なる新鮮血清を試料として、実施例２と
同様にして（ただしメンブランフィルターは孔径０．２
μｍのみ）ＨＤＬコレステロールを測定した。実施例
１，２と同様に測定値の比較を表５に示す。

【００３０】 実施例４ ドライケミストリーによる測定を応用した。市販による
コレステロール測定用フィルムの上層に図１のメンブラ
ン板を密着させ、リンタングステン−Ｍｇ沈殿剤を加え
て血清試料を注入して測定した。ただし、空気がフィル
ム上に圧入されると測定にばらつきが生じたので、テル
モ社の注射器で、メンブランと試料の間に空気が入らな
いように試料をメンブラン上に注入後、ピペッターを装
着して加圧ろ過させた。

【００３１】原理的にはフィルムとメンブラン板とを密
着させる必要はないので、メンブラン板の下方に空気が
外部に放出される間隙を設けるようにすれば、メンブラ
ンと試料の間に空気が入っても支障はない。４回の繰返
し測定結果は、 ５２．４， ５４．８， ５０．９， ５３．６ ｍｇ
／ｄｌ であった。この結果によれば、ばらつきが比色法に比べ
てやや大きくなった。その大きな原因は、加圧時の圧力
のかけ方にあることが判明した。圧力がフィルムに直接
かからないように、横に支えを設けることによってばら
つきが解消するものと思われる。

【００３２】実施例５ ラジオメータ社製の血液ガス分析装置ＡＢＬ−５００の
酸素電極（内部液：ＫＣｌ）のテフロン透過膜をはず
し、その代りに酢酸セルロース膜、コレステロール酵素
ゲル、絹メンブラン、孔径０．２μｍメンブランフィル
ターをこの順に取りつけてＯリングでとめた。コレステ
ロール酵素膜は、粒径９０〜１８０μｍのヒドロキシア
ルキルメタアクリレート・ゲル（M.Kuehn 他、J.Prakt.
Chem.、３２４巻、１９８２年、１１７頁の方法により
調製）を０．１Ｍリン酸緩衝液に一晩浸漬し、吸引によ
って水分を除去したのち１％グルタルアルデヒド溶液に
分散させて３時間かきまぜ、ガラス・フィルター上でリ
ン酸緩衝液により十分洗浄した。このゲル２５０ｍｇを
採取し、２ｍｌのリン酸緩衝液にベーリンガー社製のコ
レステロールエステラーゼ及び同社製のコレステロール
エステラーゼ（ＥＣ３，１，１，１３，Candida cylind
racea 由来）及びコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ
１，１，３，６，Nocardia erythropolis)を溶解した液
にこのゲルを加え、４℃で１８時間かきまぜながら固定
化を行った。酵素量は、ゲル１ｇ当りオキシダーゼ４単
位、エステラーゼ８単位とした。

【００３３】リンタングステン−Ｍｇ沈殿試薬に血清を
加えて、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬを沈殿させ
た溶液２０ｍｌに上述の電極を浸漬し、０．６Ｖ（対Ａ
ｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加してＨＤＬ−コレステロー
ルを測定した。リノール酸コレステロール，オレイン酸
コレステロールのコール酸ナトリウム標準液を調製し、
その標準液５０μｌをリン酸緩衝液２０ｍｌに加え、上
記のコレステロール電極で測定して検量線を作成したと
ころ、総コレステロールとして３００ｍｇ／ｄｌまで直
線性があった。

【００３４】予備実験として、和光純薬工業社製のβ−
リポタンパク（ＶＬＤＬ，ＬＤＬに相当）を上記沈殿試
薬に加えて測定したところ、信号は検出されなかった
が、次にリノール酸コレステロールのコール酸ナトリウ
ム溶液を測定したところ信号が検出された。これによ
り、本電極がリポタンパクを分離でき、かつエステル型
コレステロールを検出できることが確認された。次に国
際試薬社製のＨＤＬ−コレステロール測定キットで測定
した５３ｍｇ／ｄｌの血清を、本発明の方法によって測
定した結果４８〜５２ｍｇ／ｄｌが得られ、ほぼ満足で
きる値であった。

【００３５】実施例６ 次に異なる被検者の異なる状態の血清を、異なるロット
の試薬、異なるロットのメンブランを用いてフィルター
ろ過法により測定した結果を、従来の遠心分離法による
ものと比較して示す。 （１） 実施例１と同様に、国際試薬社製のＨＤＬコレ
ステロール測定キット（等電点分画法による）を用い
た。 検 体 遠心分離法 ０．２μｍフィルター （mg/dl) ろ過法（mg/dl) 新鮮血清Ａ ４４．０ ４２．９ 冷凍保存血清Ｄ ４３．４ ４３．７ （２） リンタングステン−Ｍｇ沈殿剤として、栄研化
学社製の“ＨＤＬ−Ｃ５５５”栄研を用いた。 検 体 遠心分離法 ０．２μｍフィルター （mg/dl) ろ過法（mg/dl) 新鮮血清Ａ′ ３５．１ ３５．３ 新鮮血清Ａ′ ３３．０ ３６．３ 冷凍新鮮血清Ｂ ５１．５ ５０．７ （３） 実施例２と同様に、協和メデックス社のデタミ
ナーＨＤＬ（デキストラン硫酸−リンタングステンＭ
ｇ）を用いた。 検 体 遠心分離法 ０．２μｍフィルター ０．１μｍフィルター （mg/dl) ろ過法（mg/dl) ろ過法（mg/dl) 新鮮血清Ａ ４６．３ ５１．４ ４７．６ 冷凍保存血清Ｄ ５０．５ ５４．５ ４９．８ ０．２μｍフィルターで濾過した場合、遠心分離法と比
べてやや高い値を示したが、他の沈殿法との差も５mg/d
l 程度はあることから、許容できる誤差範囲と言うこと
ができる。一方、０．１μｍフィルターの場合は遠心分
離法による値とよく一致した。

【００３６】

【発明の効果】本発明によるＨＤＬコレステロール定量
測定法は、ポリアニオン沈殿試薬によって血清中のＬＤ
Ｌリポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミクロ
ンの沈殿物を生成させて、沈殿を生成しないＨＤＬリポ
タンパクを分画し、この生成した沈殿物を孔径が０．５
μｍ以下のフィルターによって除去したＨＤＬリポタン
パク画分を検体として測定することにより、簡便、迅速
で、良好な再現性が得られるという顕著な効果が得られ
た。

【００３７】 またこの測定法の前段は、ＨＤＬリポタン
パクを分離する方法であり、本発明による分離法によれ
ば、連続的でかつ簡便にＨＤＬリポタンパクを分離する
ことができ、遠心分離法のようなバッチ式方法とは異な
り、大量の分離処理が可能となる。そのためＨＤＬコレ
ステロール測定に用いられる以外にも工業上の利用分野
も広く、例えばメンブランフィルターろ過液を透析又は
限界ろ過、ゲルクロマトグラフィー等の手段によって、
連続的かつ大量に純粋ＨＤＬリポタンパクが得られる効
果は大である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血清にポリアニオン沈殿試薬を加えてＬ
   ＤＬリポタンパク、ＶＬＤＬリポタンパク、カイロミク
   ロンの沈殿物を生成させてＨＤＬリポタンパクを分画
   し、生成した沈殿物を孔径が０．５μｍ以下のフィルタ
   ーによって除去するＨＤＬリポタンパク分離法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法によって得られたＨ
   ＤＬリポタンパクを対象に比色法又は酵素電極法を用い
   て行われるＨＤＬコレステロール定量測定法。
3. 【請求項３】 ドライケミストリーを用いて行われる請
   求項２記載のＨＤＬコレステロール定量測定法。