JPH0611229B2 - 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌 - Google Patents
抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌Info
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- JPH0611229B2 JPH0611229B2 JP61160772A JP16077286A JPH0611229B2 JP H0611229 B2 JPH0611229 B2 JP H0611229B2 JP 61160772 A JP61160772 A JP 61160772A JP 16077286 A JP16077286 A JP 16077286A JP H0611229 B2 JPH0611229 B2 JP H0611229B2
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- toxin
- bacillus
- spores
- bacillus thuringiensis
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 (イ)発明の目的 「産業上の利用分野」 本発明の枯草菌は農薬として有効な鱗翅目昆虫（ガやチ
ョウの類）の幼虫に対して極めて優れた殺虫効果を示す
結晶毒素を芽胞を形成せずに産生するため農薬製造工業
において非常に有効に利用されるものであり、ひいては
芽胞を形成しないということにより安全な農薬として農
業分野における貢献度も極めて大きいものである。
ョウの類）の幼虫に対して極めて優れた殺虫効果を示す
結晶毒素を芽胞を形成せずに産生するため農薬製造工業
において非常に有効に利用されるものであり、ひいては
芽胞を形成しないということにより安全な農薬として農
業分野における貢献度も極めて大きいものである。
「従来の技術」 バチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ（Bacill
us thuringiensis variety krustaki）の生活環中、胞
子形成期中にこれと同調して形成される細胞内封入体は
結晶毒素と称され、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒
性を示すことから農薬として広く用いられている。結晶
毒素を有効成分とする微生物農薬の製造は、主としてバ
チルス・チューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１株
を培養し、その発酵産物である結晶毒素とこれに混在せ
る生芽胞とを分離することなくそのまま製剤化すること
によりなされている。
us thuringiensis variety krustaki）の生活環中、胞
子形成期中にこれと同調して形成される細胞内封入体は
結晶毒素と称され、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒
性を示すことから農薬として広く用いられている。結晶
毒素を有効成分とする微生物農薬の製造は、主としてバ
チルス・チューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１株
を培養し、その発酵産物である結晶毒素とこれに混在せ
る生芽胞とを分離することなくそのまま製剤化すること
によりなされている。
「発明が解決しようとする問題」 微生物農薬の製造に広く用いられるバチルス・チューリ
ンゲンシス変種クルスタキの産生する結晶毒素は、害虫
のみならず蚕にも強い毒性を示すことから、我国の様な
養蚕国において繁殖能力をもつ生菌や生芽胞を含む製剤
を使用することはきわめて危険なことと考えられる。即
ち、生菌や化学薬品あるいは熱等に対して強い抵抗性を
有する生芽胞を含む製剤を散布した場合、それらが発芽
・増殖して養蚕に大きな被害をもたらすであろうことは
容易に推測される。
ンゲンシス変種クルスタキの産生する結晶毒素は、害虫
のみならず蚕にも強い毒性を示すことから、我国の様な
養蚕国において繁殖能力をもつ生菌や生芽胞を含む製剤
を使用することはきわめて危険なことと考えられる。即
ち、生菌や化学薬品あるいは熱等に対して強い抵抗性を
有する生芽胞を含む製剤を散布した場合、それらが発芽
・増殖して養蚕に大きな被害をもたらすであろうことは
容易に推測される。
さらに、バチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ
は人や家畜に対して病原性を持つことが知られているバ
チルス・セレウス（Bacillus cereus）と病理学的に同
一の病原性を発揮することが明らかとされ（秋山武久他
北里医学１４，２３６−２４７，１９８４，大沢伸孝他
北里医学１４，３２０−３２９，１９８４）、また、バ
チルス・チューリンゲンシス変種クルスタキの産生する
溶血毒は、バチルス・セレウスの産生する毒素と同一の
性状を示すこと、並びに、バチルス・チューリンゲンシ
ス変種クルスタキが何らかの下痢原因毒素を産生する可
能性も示唆されたこと（本田武司他日本細菌学会誌４
０，２４０，１９８５）からも、生菌や生芽胞を含む形
での本菌製剤の散布が人畜に対する高い危険性を含んで
いることが容易に推測できる、事実、生きた芽胞を含ん
だ本菌製剤が散布している農夫の目に入って角膜潰瘍を
もたらしたという報告もある（Samples.J.R.and Buettn
er,H.,Am.J.Opthalmol.,９５，２５８−２６０，１９８
３）。
は人や家畜に対して病原性を持つことが知られているバ
チルス・セレウス（Bacillus cereus）と病理学的に同
一の病原性を発揮することが明らかとされ（秋山武久他
北里医学１４，２３６−２４７，１９８４，大沢伸孝他
北里医学１４，３２０−３２９，１９８４）、また、バ
チルス・チューリンゲンシス変種クルスタキの産生する
溶血毒は、バチルス・セレウスの産生する毒素と同一の
性状を示すこと、並びに、バチルス・チューリンゲンシ
ス変種クルスタキが何らかの下痢原因毒素を産生する可
能性も示唆されたこと（本田武司他日本細菌学会誌４
０，２４０，１９８５）からも、生菌や生芽胞を含む形
での本菌製剤の散布が人畜に対する高い危険性を含んで
いることが容易に推測できる、事実、生きた芽胞を含ん
だ本菌製剤が散布している農夫の目に入って角膜潰瘍を
もたらしたという報告もある（Samples.J.R.and Buettn
er,H.,Am.J.Opthalmol.,９５，２５８−２６０，１９８
３）。
以上のことから判断される様に、バチルス・チューリン
ゲンシス変種クルスタキの産生する結晶毒素に生菌ある
いは生芽胞が混在したまま製剤された農薬を自然界に散
布することは養蚕の上からも公衆衛生の面からみてもき
わめて危険なことといえるものである。
ゲンシス変種クルスタキの産生する結晶毒素に生菌ある
いは生芽胞が混在したまま製剤された農薬を自然界に散
布することは養蚕の上からも公衆衛生の面からみてもき
わめて危険なことといえるものである。
本発明者等は上記結晶毒素を含有する農薬の製造におい
て生菌や生芽胞を含まない製剤の方法について種々検討
してきたが、それが一歩進めて芽胞を生成せずに結晶毒
素を産生させる方法について鋭意検討を行った。
て生菌や生芽胞を含まない製剤の方法について種々検討
してきたが、それが一歩進めて芽胞を生成せずに結晶毒
素を産生させる方法について鋭意検討を行った。
（ロ）発明の構成 「問題点を解決するための手段」 本発明者等は上記問題点の生ずることのない結晶毒素の
産生方法について種々検討し、バチルス・チューリンゲ
ンシス変種クルスタキの結晶毒素遺伝子の導入された枯
草菌が芽胞を形成せずに結晶毒素を産生することを見出
して本発明を完成した。
産生方法について種々検討し、バチルス・チューリンゲ
ンシス変種クルスタキの結晶毒素遺伝子の導入された枯
草菌が芽胞を形成せずに結晶毒素を産生することを見出
して本発明を完成した。
さらに詳細に説明すれば、本発明等がバチルス・チュー
リンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子
を枯草菌ベクター又は大腸菌プラスミドと枯草菌プラス
ミドのシャトルベクターに連結し結晶毒素遺伝子発現プ
ラスミドを作製し、それを枯草菌に導入したところ、安
定にプラスミドを保持する形質転換体が得られた。この
形質転換体を適当な培地に接種し、好気培養条件下で３
０〜３７℃の温度で培養したところ、この培養液は蚕に
対して強い殺虫活性を有しており、農薬原料として非常
に有効であることが判明したのみならず、この培養液中
にはおどろくべきことには芽胞が殆んど含まれず、従来
の問題点を一挙に解決しうるものであることを本発明者
等は見出し本発明を完成したのである。
リンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子
を枯草菌ベクター又は大腸菌プラスミドと枯草菌プラス
ミドのシャトルベクターに連結し結晶毒素遺伝子発現プ
ラスミドを作製し、それを枯草菌に導入したところ、安
定にプラスミドを保持する形質転換体が得られた。この
形質転換体を適当な培地に接種し、好気培養条件下で３
０〜３７℃の温度で培養したところ、この培養液は蚕に
対して強い殺虫活性を有しており、農薬原料として非常
に有効であることが判明したのみならず、この培養液中
にはおどろくべきことには芽胞が殆んど含まれず、従来
の問題点を一挙に解決しうるものであることを本発明者
等は見出し本発明を完成したのである。
すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシス変種
クルスタキの結晶毒素遺伝子の導入された抗昆虫蛋白毒
素産生枯草菌に関するものである。
クルスタキの結晶毒素遺伝子の導入された抗昆虫蛋白毒
素産生枯草菌に関するものである。
枯草菌（Bacillus subtilis） 本発明で結晶毒素遺伝子を導入すべき菌として採用した
枯草菌は人畜や植物に対して寄生、病原性のない極めて
安全なものであると広く知られているが、それは下記に
示す論文等でも裏付けられるものである。
枯草菌は人畜や植物に対して寄生、病原性のない極めて
安全なものであると広く知られているが、それは下記に
示す論文等でも裏付けられるものである。
光岡等（MitsuokaＴ．他GoldschmidtinFormiert２／７
３ ２３，２３−４１，１９７３）によると、種々の動
物の糞中の枯草菌を調べたところ、草食動物に多く雑食
動物には中程度認められるか存在せず、肉食動物には全
く存在しないことが報告されている。また存在が認めら
れる例でも餌料に混入していた枯草菌由来であり、腸内
に定着することはなく、一過性であることが認められて
いる。
３ ２３，２３−４１，１９７３）によると、種々の動
物の糞中の枯草菌を調べたところ、草食動物に多く雑食
動物には中程度認められるか存在せず、肉食動物には全
く存在しないことが報告されている。また存在が認めら
れる例でも餌料に混入していた枯草菌由来であり、腸内
に定着することはなく、一過性であることが認められて
いる。
さらに坂口（遺伝子組換え実用化技術第一集フジテクノ
システム）は、枯草菌と分類学的に同じものと知られて
いる納豆菌を利用して作られる納豆による中毒が報告さ
れておらず、枯草菌が人畜に対して非病原性であるとし
ている。
システム）は、枯草菌と分類学的に同じものと知られて
いる納豆菌を利用して作られる納豆による中毒が報告さ
れておらず、枯草菌が人畜に対して非病原性であるとし
ている。
結晶毒素遺伝子発現プラスミド（pBTK−１）の作製 結晶毒素遺伝子発現プラスミド（pBTK−１）は大腸菌プ
ラスミド（ｐＵＣ９）と枯草菌プラスミド（ｐＵＢ１１
０）のシャトルベクターにバチルス・チューリンゲンシ
ス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子を連結する
ことにより作製することができ、その構造は第１図に示
されるものであった。
ラスミド（ｐＵＣ９）と枯草菌プラスミド（ｐＵＢ１１
０）のシャトルベクターにバチルス・チューリンゲンシ
ス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子を連結する
ことにより作製することができ、その構造は第１図に示
されるものであった。
またプラスミドとしてはpUC9とpUB110に限定されるもの
ではなく、大腸菌プラスミドの場合ｐＢＲ３２２等、枯
草菌プラスミドの場合ｐＣ１９４等の利用も可能であ
り、シャトルベクターを用いる必要もなく、枯草菌ベク
ターを用いてもよい。
ではなく、大腸菌プラスミドの場合ｐＢＲ３２２等、枯
草菌プラスミドの場合ｐＣ１９４等の利用も可能であ
り、シャトルベクターを用いる必要もなく、枯草菌ベク
ターを用いてもよい。
培養 結晶毒素遺伝子を保持する形質転換体は、５〜１０μｇ
／ｍのカナマイシンを含む２×ＳＧ培地（Leighton,
T.J.and Doi,R.H.J.Biol.Chem.２４６ ３１８９−３１
９５，１９７１）等の培地で３０〜３７℃の温度で好気
培養条件下で培養される。
／ｍのカナマイシンを含む２×ＳＧ培地（Leighton,
T.J.and Doi,R.H.J.Biol.Chem.２４６ ３１８９−３１
９５，１９７１）等の培地で３０〜３７℃の温度で好気
培養条件下で培養される。
毒素蛋白の産生 毒素蛋白の産生は、バチルス・チューリンゲンシス・ク
ルスタキＨＤ−１株と異なり、上記培養によって菌の増
殖が定常期に入った細胞中ですでになされていたが、第
２図に示されるように２４〜４８時間後に最大となっ
た。
ルスタキＨＤ−１株と異なり、上記培養によって菌の増
殖が定常期に入った細胞中ですでになされていたが、第
２図に示されるように２４〜４８時間後に最大となっ
た。
「作用」 本発明者らは、バチルス・チューリンゲンシス変種クル
スタキの結晶毒素を枯草菌を用いて産生させることに成
功したがさらに、発酵液中には本来枯草菌により形成さ
れるべき芽胞がほとんど含まれていないことを見出し
た。
スタキの結晶毒素を枯草菌を用いて産生させることに成
功したがさらに、発酵液中には本来枯草菌により形成さ
れるべき芽胞がほとんど含まれていないことを見出し
た。
従って、バチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ
の結晶毒素をコードする結晶毒素遺伝子を導入した枯草
菌は、芽胞を生成させずに結晶毒素を産生させうるとい
う優れた作用を有し、芽胞を含有しないきわめて安全な
微生物農薬を提供できるものである。
の結晶毒素をコードする結晶毒素遺伝子を導入した枯草
菌は、芽胞を生成させずに結晶毒素を産生させうるとい
う優れた作用を有し、芽胞を含有しないきわめて安全な
微生物農薬を提供できるものである。
以下に詳細な実施例を示すが、本発明による方法は実施
例だけに限定するものではない。
例だけに限定するものではない。
１）バチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ結晶
毒素遺伝子発現ベクターの作製 cry−１−１は田村らが作製したプラスミドであり（微
工研菌寄第８４８２号）バチルス・チューリンゲンシス
変種クルスタキ結晶毒素遺伝子を大腸菌ベクターｐＵＣ
９のＥｃｏＲＩ部位へ連結したものである。
毒素遺伝子発現ベクターの作製 cry−１−１は田村らが作製したプラスミドであり（微
工研菌寄第８４８２号）バチルス・チューリンゲンシス
変種クルスタキ結晶毒素遺伝子を大腸菌ベクターｐＵＣ
９のＥｃｏＲＩ部位へ連結したものである。
cry−１−１を制限酵素ＢamHＩで、３７℃、２時間消化
し、次いで、アルカリホスファターゼで３７℃、１時間
処理する。一方、枯草菌プラスミドｐＵＢ１１０（Gryc
zan，Ｔ．Ｊ．他J.Bacteriol.１３４ ３１８−３２
９，１９７８）を制限酵素ＢamHＩで３７℃、２時間消
化する。これらのｃｒｙ−１−１ ＢａｍＨＩ消化物と
ｐＵＢ１１０ ＢａｍＨＩ消化物を、Ｔ４リガーゼで４
℃、１５時間反応させて連結し、環状化した。これを
Ｔ．Maniatisらの定める方法（Molecular Cloning,A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory）に
よって大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体は
４０μｇ／ｍのアンピシリンを含むＬＢ−寒天培地
（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキストラ
クト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１
）で選択した。得られた形質転換体より公知の方法で
あるアルカリ−ＳＤＳ法により、プラスミドＤＮＡを単
離した。これらのプラスミドをＢamHＩで消化し、ｐＵ
Ｂ１１０に相当する4.5kbのＤＮＡ断片とcry−１−１に
相当する9.7kbのＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドp
BTK−１を得た（第１図）。
し、次いで、アルカリホスファターゼで３７℃、１時間
処理する。一方、枯草菌プラスミドｐＵＢ１１０（Gryc
zan，Ｔ．Ｊ．他J.Bacteriol.１３４ ３１８−３２
９，１９７８）を制限酵素ＢamHＩで３７℃、２時間消
化する。これらのｃｒｙ−１−１ ＢａｍＨＩ消化物と
ｐＵＢ１１０ ＢａｍＨＩ消化物を、Ｔ４リガーゼで４
℃、１５時間反応させて連結し、環状化した。これを
Ｔ．Maniatisらの定める方法（Molecular Cloning,A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory）に
よって大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体は
４０μｇ／ｍのアンピシリンを含むＬＢ−寒天培地
（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキストラ
クト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１
）で選択した。得られた形質転換体より公知の方法で
あるアルカリ−ＳＤＳ法により、プラスミドＤＮＡを単
離した。これらのプラスミドをＢamHＩで消化し、ｐＵ
Ｂ１１０に相当する4.5kbのＤＮＡ断片とcry−１−１に
相当する9.7kbのＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドp
BTK−１を得た（第１図）。
２）pBＴＫ−１の枯草菌への導入 大腸菌より単離したpBＴＫ−１を用いてChang,S.and Co
hen,S.N.(Mol.Gen.Genet.１６８，１１１−１１５，１
９７９）の定めるプロトプラスト法によって枯草菌PSL
１（Ostroff,G.R.and Pene,J.J.,J.Bacteriol.１５６，
９３４−９３６，１９８３）を形質転換した。
hen,S.N.(Mol.Gen.Genet.１６８，１１１−１１５，１
９７９）の定めるプロトプラスト法によって枯草菌PSL
１（Ostroff,G.R.and Pene,J.J.,J.Bacteriol.１５６，
９３４−９３６，１９８３）を形質転換した。
得られた形質転換体より１５個のコロニーを選出し大腸
菌の場合と同じアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤ
ＮＡを分離した。次に、これらのプラスミドを常法に従
いアガロースゲル電気泳動にかけ大腸菌より単離したpB
TK 1と同じ泳動距りを示すものを３個取得した。残りの
プラスミドは枯草菌中で欠失を起こしプラスミドを小型
化していた。さらにこの３つのプラスミドをＢamHＩで
消化し、pUＢ１１０に相当する4.5kbのＤＮＡ断片とcry
−１−１に相当する9.7kbのＤＮＡ断片を有することを
確認した。これらのpBTK−１を安定に保持する３株の枯
草菌組換え体のうち１株をＩＡＡ−１（ＡＴＣＣ第６７
１３６号）と命名した。
菌の場合と同じアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤ
ＮＡを分離した。次に、これらのプラスミドを常法に従
いアガロースゲル電気泳動にかけ大腸菌より単離したpB
TK 1と同じ泳動距りを示すものを３個取得した。残りの
プラスミドは枯草菌中で欠失を起こしプラスミドを小型
化していた。さらにこの３つのプラスミドをＢamHＩで
消化し、pUＢ１１０に相当する4.5kbのＤＮＡ断片とcry
−１−１に相当する9.7kbのＤＮＡ断片を有することを
確認した。これらのpBTK−１を安定に保持する３株の枯
草菌組換え体のうち１株をＩＡＡ−１（ＡＴＣＣ第６７
１３６号）と命名した。
３）ＩＡＡ−１によるバチルス・チューリンゲンシス変
種クルスタキ結晶毒素の生産 ＩＡＡ−１を５μｇ／ｍのカナマイシンを含むペナッ
セイ培地（Difco製、アンティバイオティックメジウム
３）に接種し、３７℃で１２〜１５時間振とう培養す
る。この発酵液の内５ｍを５μｇ／ｍのカナマイシ
ンを含む２×ＳＧ培地に接種し、３７℃にて振とう培養
した。
種クルスタキ結晶毒素の生産 ＩＡＡ−１を５μｇ／ｍのカナマイシンを含むペナッ
セイ培地（Difco製、アンティバイオティックメジウム
３）に接種し、３７℃で１２〜１５時間振とう培養す
る。この発酵液の内５ｍを５μｇ／ｍのカナマイシ
ンを含む２×ＳＧ培地に接種し、３７℃にて振とう培養
した。
枯草菌中で結晶毒素遺伝子が発現していることの確認
は、培養菌体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、並びに、顕微鏡観察により確認した。即ち、６，
８，１０，１２，２４，３０，４８時間培養液各１０ｍ
を遠心集菌し、２ｍの３０ｍＭトリス塩酸（pH8.
０）−１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸−５０ｍＭ塩化
ナトリウム液に懸濁し、１０mg／ｍになる様にリゾチ
ームを加え、３７℃で２時間静置した。次に、−８０℃
と室温での凍結融解を４回くり返した後、トミーセイコ
ー社製超音波破さい機モデルＵＲ−２０Ｐにて、３０秒
５回超音波処理した。この超音波処理物を凍結乾燥し、
５００μの0.０１Ｍリン酸緩衝液、１％ＳＤＳ、５％
２−メルカプトエタノールに懸濁し電気泳動試料とし
た。電気泳動は５％ポリアクリルアミドゲルに培養液0.
1ｍに相当する試料をのせ行なった。また、同時にバ
チルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株よ
り単離した結晶毒素蛋白を泳動した。
は、培養菌体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、並びに、顕微鏡観察により確認した。即ち、６，
８，１０，１２，２４，３０，４８時間培養液各１０ｍ
を遠心集菌し、２ｍの３０ｍＭトリス塩酸（pH8.
０）−１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸−５０ｍＭ塩化
ナトリウム液に懸濁し、１０mg／ｍになる様にリゾチ
ームを加え、３７℃で２時間静置した。次に、−８０℃
と室温での凍結融解を４回くり返した後、トミーセイコ
ー社製超音波破さい機モデルＵＲ−２０Ｐにて、３０秒
５回超音波処理した。この超音波処理物を凍結乾燥し、
５００μの0.０１Ｍリン酸緩衝液、１％ＳＤＳ、５％
２−メルカプトエタノールに懸濁し電気泳動試料とし
た。電気泳動は５％ポリアクリルアミドゲルに培養液0.
1ｍに相当する試料をのせ行なった。また、同時にバ
チルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株よ
り単離した結晶毒素蛋白を泳動した。
顕微鏡観察は、２４時間培養液について2000倍の倍率で
行った。
行った。
第２図より明らかな様に、結晶毒素遺伝子を導入した枯
草菌ＩＡＡ−１はバチルス・チューリンゲンシス・クル
スタキ・ＨＤ−１株と同じ約１３0,０００の分子量の蛋
白即ち、結晶毒素蛋白を産生していた。なお、この蛋白
はｐＵＢ１１０のみを保持する枯草菌には認められなか
った。また、結晶毒素蛋白はバチルス・チューリンゲン
シス・クルスタキＨＤ−１株と異なり枯草菌中では菌の
増殖が定常期に入った直後の細胞（ＴＯ）でもすでに産
生されていたが、培養後２４〜４８時間で最大量となっ
た。
草菌ＩＡＡ−１はバチルス・チューリンゲンシス・クル
スタキ・ＨＤ−１株と同じ約１３0,０００の分子量の蛋
白即ち、結晶毒素蛋白を産生していた。なお、この蛋白
はｐＵＢ１１０のみを保持する枯草菌には認められなか
った。また、結晶毒素蛋白はバチルス・チューリンゲン
シス・クルスタキＨＤ−１株と異なり枯草菌中では菌の
増殖が定常期に入った直後の細胞（ＴＯ）でもすでに産
生されていたが、培養後２４〜４８時間で最大量となっ
た。
また、第３図より明らかな様に枯草菌でもバチルス・チ
ューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１と同じ両錐結晶
状蛋白質粒子が形成された。
ューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１と同じ両錐結晶
状蛋白質粒子が形成された。
４）生物試験 上記方法で得たＩＡＡ−１の４８時間培養液の原液並び
に希釈液（蒸留水にて希釈）0.５ｍを協同飼料社製の
人口飼料に混合後、９cmφのシャーレに広げた。一枚の
シャーレにつき４令まで飼育した蚕幼虫１０頭を移し、
３７℃で７２時間静置した後、シャーレ中の死虫数を測
定した。殺虫力の表記はハワード・ダルメージらがＪ．
of Invertebrate Pathology１８，２４０，１９７１に
述べた方法に従った。
に希釈液（蒸留水にて希釈）0.５ｍを協同飼料社製の
人口飼料に混合後、９cmφのシャーレに広げた。一枚の
シャーレにつき４令まで飼育した蚕幼虫１０頭を移し、
３７℃で７２時間静置した後、シャーレ中の死虫数を測
定した。殺虫力の表記はハワード・ダルメージらがＪ．
of Invertebrate Pathology１８，２４０，１９７１に
述べた方法に従った。
ＩＡＡ−１により産生された結晶毒素並びにバチルス・
チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１により産生さ
れた結晶毒素の殺虫活性は表１に示した。
チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１により産生さ
れた結晶毒素の殺虫活性は表１に示した。
５）芽胞数の測定 芽胞数の測定は、芽胞が熱に抵抗性を有することを利用
して行なった。即ち、上記培養液の適当希釈液を８０℃
の温浴中にて３０分間静置する。処理後冷却して栄養寒
天培地で生存細胞数を求める。
して行なった。即ち、上記培養液の適当希釈液を８０℃
の温浴中にて３０分間静置する。処理後冷却して栄養寒
天培地で生存細胞数を求める。
芽胞数測定の結果は表２に示した。
(ハ)発明の効果 本発明によれば、枯草菌を利用して芽胞を含まない結晶
毒素を製造することが可能であり、その結果、人畜に対
してきわめて安全で、かつ、蚕に対する影響の少ない微
生物農薬を提供でき、農薬工業及び一般農家に与える効
果は測り知れないものである。
毒素を製造することが可能であり、その結果、人畜に対
してきわめて安全で、かつ、蚕に対する影響の少ない微
生物農薬を提供でき、農薬工業及び一般農家に与える効
果は測り知れないものである。
第１図は、枯草菌中でバチルス・チューリンゲンシス・
クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素を産生させるためのプ
ラスミドの構築方法を示す。図中の制限酵素作用部位
は、ＢがＢamＨＩ、ＥがＥcoＲＩを表わす。また、細線
はｐＵＣ９、白ぬき太線はｐＵＢ１１０、黒太線はバチ
ルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株由来
の結晶毒素遺伝子を含むＤＮＡ断片を示す。 第２図は、ＩＡＡ−１培養菌体抽出物のＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動像を表わす。図中の番号は、
１〜７までがＩＡＡ−１の各々６時間、８時間、１０時
間、１２時間、２４時間、３０時間及び４８時間培養菌
体抽出物の泳動像、８がバチルス・チューリンゲンシス
・クルスタキＨＤ−１株より単離した結晶毒素蛋白質の
泳動像を表わす。また矢印は分子量１３0,０００に相当
する結晶毒素蛋白質を表わす。 第３図は、ＩＡＡ−１によって産生された結晶毒素の顕
微鏡写真を表わす。図中の矢印は結晶毒素を示す。
クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素を産生させるためのプ
ラスミドの構築方法を示す。図中の制限酵素作用部位
は、ＢがＢamＨＩ、ＥがＥcoＲＩを表わす。また、細線
はｐＵＣ９、白ぬき太線はｐＵＢ１１０、黒太線はバチ
ルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株由来
の結晶毒素遺伝子を含むＤＮＡ断片を示す。 第２図は、ＩＡＡ−１培養菌体抽出物のＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動像を表わす。図中の番号は、
１〜７までがＩＡＡ−１の各々６時間、８時間、１０時
間、１２時間、２４時間、３０時間及び４８時間培養菌
体抽出物の泳動像、８がバチルス・チューリンゲンシス
・クルスタキＨＤ−１株より単離した結晶毒素蛋白質の
泳動像を表わす。また矢印は分子量１３0,０００に相当
する結晶毒素蛋白質を表わす。 第３図は、ＩＡＡ−１によって産生された結晶毒素の顕
微鏡写真を表わす。図中の矢印は結晶毒素を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/32 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (2)
- 【請求項１】バチルス・チューリンゲンシス変種クルス
タキ（Bacillus thuringiensis variety krustaki）の
結晶毒素遺伝子の導入された抗昆虫蛋白毒素産生枯草
菌。 - 【請求項２】枯草菌が枯草菌ＰＳＬ１である特許請求の
範囲第１項記載の抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61160772A JPH0611229B2 (ja) | 1986-07-10 | 1986-07-10 | 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61160772A JPH0611229B2 (ja) | 1986-07-10 | 1986-07-10 | 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6317687A JPS6317687A (ja) | 1988-01-25 |
| JPH0611229B2 true JPH0611229B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=15722119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61160772A Expired - Lifetime JPH0611229B2 (ja) | 1986-07-10 | 1986-07-10 | 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0611229B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1240002A (zh) * | 1996-12-10 | 1999-12-29 | 明治制果株式会社 | 芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质 |
| CN104026153B (zh) * | 2014-06-12 | 2016-01-06 | 河海大学 | 抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂及其制备方法 |
| JP7218090B2 (ja) | 2018-01-12 | 2023-02-06 | 花王株式会社 | タンパク質の製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS605098A (ja) * | 1983-06-17 | 1985-01-11 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 化合物結晶の製造方法 |
-
1986
- 1986-07-10 JP JP61160772A patent/JPH0611229B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6317687A (ja) | 1988-01-25 |
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