JPH0611483A - 非対称電場逆転による一本鎖ｄｎａの電気泳動分解の改良 - Google Patents
非対称電場逆転による一本鎖ｄｎａの電気泳動分解の改良Info
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- JPH0611483A JPH0611483A JP4321633A JP32163392A JPH0611483A JP H0611483 A JPH0611483 A JP H0611483A JP 4321633 A JP4321633 A JP 4321633A JP 32163392 A JP32163392 A JP 32163392A JP H0611483 A JPH0611483 A JP H0611483A
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- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 一本鎖ＤＮＡの分子の分解を改良するための
方法に関する。 【構成】 電気泳動分離支持体において予備選択された
移動方向にそって長さ３００又はそれ以上の塩基の一本
鎖ＤＮＡ分子の混合物を電気泳動分離するための方法に
関する。
方法に関する。 【構成】 電気泳動分離支持体において予備選択された
移動方向にそって長さ３００又はそれ以上の塩基の一本
鎖ＤＮＡ分子の混合物を電気泳動分離するための方法に
関する。
Description
【０００１】本発明は、一本鎖ＤＮＡの電気泳動分離の
電場に関し、そして特に、一本鎖ＤＮＡ分子の分解を改
良するための方法に関する。
電場に関し、そして特に、一本鎖ＤＮＡ分子の分解を改
良するための方法に関する。
【０００２】発明の背景 ＤＮＡの実験操作において急速に増大する使用の技法
は、パルスされたフィールド電気泳動の技法である。前
記技法は、ザイズに基づいてＤＮＡフラグメントを分解
するために開発された。個々のその多くの変法におい
て、この技法は、ＤＮＡ鎖の定期的な再配向を引き起こ
すために、方向が異なる複数の場間での電場の前後への
スイッチングを包含する。個々のパルス内で生じる再配
向の程度は、個々の鎖の長さにより変化し、そして移動
の全体の方向にかけるいづれか特定の鎖の移動の正味速
度は、その鎖の長さにより変化し、それによって、鎖の
長さに従って分解を可能にする。
は、パルスされたフィールド電気泳動の技法である。前
記技法は、ザイズに基づいてＤＮＡフラグメントを分解
するために開発された。個々のその多くの変法におい
て、この技法は、ＤＮＡ鎖の定期的な再配向を引き起こ
すために、方向が異なる複数の場間での電場の前後への
スイッチングを包含する。個々のパルス内で生じる再配
向の程度は、個々の鎖の長さにより変化し、そして移動
の全体の方向にかけるいづれか特定の鎖の移動の正味速
度は、その鎖の長さにより変化し、それによって、鎖の
長さに従って分解を可能にする。
【０００３】この技法の初期研究は、Ｃａｎｔｏｒ，な
ど．，アメリカ特許第４，４７３，４５２号（１９８４
年９月２５日）の参照特許及び文献、Schwarts, D.C.,
など．，" New Techniques For Purifying Large DNAs
and Studying Their Properties and Packaging." Cold
Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology4
7：１８９〜１９５（１９８３）に包含される。Ｃａｎ
ｔｏｒ及びＳｃｈｗａｒｔｚにより開示されるスイッチ
ング手段は、スラブゲルの面においてお互い横断する
（一般的に直交する）方向において２種の電場間に存在
し、そして強度及び持続期間は２種の電場間で異なる。
前記２種の電場間の角度は、ＤＮＡがゲルにそって進行
するにつれて変化するが、しかしその結果は、その２種
の電場方向間の角度を２等分する線を一般的に従がえる
全体の移動方向である。その技法の変法は、場の均一性
に対して制御を達成するために、９０°以外の角度、た
とえば１２０°の使用、及び種々の改良及び調整を包含
する。この技法の追加の変法においては、２種の電場方
向がゲルの面に対して及びお互いに対して横断し、そし
てここで前記ゲルの面はそれらの間の角度を２等分す
る。この変法は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．，など．，So
matic Cell and Molecular Genetics 12(6): １８５〜
１９５（１９８６）及びＧａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．，な
ど．，Nature 331：３７１〜２（１９８８年１月２８
日）により記載され、そして " fransverse alternatin
g fild electrophoresis "（ＴＡＦＥ）として言及され
る。ここで、２種の場は、同じ強さのものであり、そし
てスイッチングは、等しい時間で行なわれ、そしてさら
に、電場間の角度は、ＤＮＡがゲルにそって移動するに
つれて変化する。
ど．，アメリカ特許第４，４７３，４５２号（１９８４
年９月２５日）の参照特許及び文献、Schwarts, D.C.,
など．，" New Techniques For Purifying Large DNAs
and Studying Their Properties and Packaging." Cold
Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology4
7：１８９〜１９５（１９８３）に包含される。Ｃａｎ
ｔｏｒ及びＳｃｈｗａｒｔｚにより開示されるスイッチ
ング手段は、スラブゲルの面においてお互い横断する
（一般的に直交する）方向において２種の電場間に存在
し、そして強度及び持続期間は２種の電場間で異なる。
前記２種の電場間の角度は、ＤＮＡがゲルにそって進行
するにつれて変化するが、しかしその結果は、その２種
の電場方向間の角度を２等分する線を一般的に従がえる
全体の移動方向である。その技法の変法は、場の均一性
に対して制御を達成するために、９０°以外の角度、た
とえば１２０°の使用、及び種々の改良及び調整を包含
する。この技法の追加の変法においては、２種の電場方
向がゲルの面に対して及びお互いに対して横断し、そし
てここで前記ゲルの面はそれらの間の角度を２等分す
る。この変法は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．，など．，So
matic Cell and Molecular Genetics 12(6): １８５〜
１９５（１９８６）及びＧａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．，な
ど．，Nature 331：３７１〜２（１９８８年１月２８
日）により記載され、そして " fransverse alternatin
g fild electrophoresis "（ＴＡＦＥ）として言及され
る。ここで、２種の場は、同じ強さのものであり、そし
てスイッチングは、等しい時間で行なわれ、そしてさら
に、電場間の角度は、ＤＮＡがゲルにそって移動するに
つれて変化する。
【０００４】第２グループのパルスされた電場技法は、
直交して配向された場よりもむしろ、電場反転又は一次
元パルスを包含する。 " fild inversion gel electrop
horesis " （ＦＩＧＥ）として知られるこのグループに
おいては、交番は、９０°、１２０°又はいづれか他の
横角度よりもむしろ、お互いに対して１８０°回転され
た２種の電場間に存在する。この技法の説明は、Ｃａｒ
ｌｅ，Ｇ．Ｆ．，など．，アメリカ特許第４，７３７，
２５１号（１９８８年４月１２日）により提供される。
Ｃａｒｌｅ、などの方法によれば、１つの方向における
正味移動は、不平等な期間のパルス（ここで前方パルス
は逆パルスよりも長い）又は同じ期間のパルス（但し、
不平等な電位傾度を有し、そして前方向への傾度は逆方
向への傾度よりも大きい）のいづれかを用いて、非対称
電場逆転プロフィールにより達成される。
直交して配向された場よりもむしろ、電場反転又は一次
元パルスを包含する。 " fild inversion gel electrop
horesis " （ＦＩＧＥ）として知られるこのグループに
おいては、交番は、９０°、１２０°又はいづれか他の
横角度よりもむしろ、お互いに対して１８０°回転され
た２種の電場間に存在する。この技法の説明は、Ｃａｒ
ｌｅ，Ｇ．Ｆ．，など．，アメリカ特許第４，７３７，
２５１号（１９８８年４月１２日）により提供される。
Ｃａｒｌｅ、などの方法によれば、１つの方向における
正味移動は、不平等な期間のパルス（ここで前方パルス
は逆パルスよりも長い）又は同じ期間のパルス（但し、
不平等な電位傾度を有し、そして前方向への傾度は逆方
向への傾度よりも大きい）のいづれかを用いて、非対称
電場逆転プロフィールにより達成される。
【０００５】ＦＩＧＥ技法に関する問題は、バンド逆転
であり、ここで中間サイズの分子がそれよりも小さな及
び大きな分子よりもゆっくり移動し、サイズ対移動度曲
線がそれ自体に対して後方に向きを変え、両者の同じ移
動度を与えることによって大きな分子上に小さな分子が
重なる。この問題を克服するための１つの試みは、"Zer
o integratecl field electrophoresis "（ＺＩＦＥ）
として知られる技法であり、そしてＴｕｒｍｅｌ，
Ｃ．，など．，" High-Resolution Zero Integrated fi
eld Electrophoresis of DNA," Electrophoresis of La
rge DNA Molecules：Theory and Applications, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, １０１〜１３１ペー
ジ（１９９０）により記載されている。ここで、時間平
均された電位傾度ＥAVは、次の等式により定義される。
であり、ここで中間サイズの分子がそれよりも小さな及
び大きな分子よりもゆっくり移動し、サイズ対移動度曲
線がそれ自体に対して後方に向きを変え、両者の同じ移
動度を与えることによって大きな分子上に小さな分子が
重なる。この問題を克服するための１つの試みは、"Zer
o integratecl field electrophoresis "（ＺＩＦＥ）
として知られる技法であり、そしてＴｕｒｍｅｌ，
Ｃ．，など．，" High-Resolution Zero Integrated fi
eld Electrophoresis of DNA," Electrophoresis of La
rge DNA Molecules：Theory and Applications, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, １０１〜１３１ペー
ジ（１９９０）により記載されている。ここで、時間平
均された電位傾度ＥAVは、次の等式により定義される。
【数１】 ここでＥは電位傾度（Ｖ／cm）を示し、そしてｔは持続
期間（秒）を示し、そして下側に記した１は前方方向を
示し、そして２は逆方向を示す。この著者による与えら
れるこの技法によれば、Ｅ1 ≠Ｅ2 の場合、ＥAVはゼロ
に等しいが、好ましくは、ＥAVは０．３３のオーダーに
基づいて“ゼロよりもわずかに大きい”。これは、サイ
ズ２３kbp よりも大きな分子についてのバンド逆転を排
除すると言われている。
期間（秒）を示し、そして下側に記した１は前方方向を
示し、そして２は逆方向を示す。この著者による与えら
れるこの技法によれば、Ｅ1 ≠Ｅ2 の場合、ＥAVはゼロ
に等しいが、好ましくは、ＥAVは０．３３のオーダーに
基づいて“ゼロよりもわずかに大きい”。これは、サイ
ズ２３kbp よりも大きな分子についてのバンド逆転を排
除すると言われている。
【０００６】これらの技法は、二本鎖ＤＮＡの分離のた
めに開発され、そしてそれにこれまでほとんど使用され
て来た。一本鎖ＤＮＡに関しては、それらの使用は限定
された好結果をもたらして来た。大きな二本鎖ＤＮＡの
分解を改良するそれらの技法の能力にもかかわらず、そ
れらは大きな一本鎖ＤＮＡのためには、ほとんど改良点
を付与するようには思われず、ここで分解は、完全に欠
けていなければ、長さ４００塩基以上のフラグメントに
関して特に難かしい。最っとも広く使用される一本鎖Ｄ
ＮＡのための電場逆転技法は、前方及び逆方向に等しい
電位傾度を包含し、そして前方への持続期間は逆方向へ
の持続期間よりも卓越する。これは、大きな一本鎖ＤＮ
Ａの分離において少々の改良をもたらす。しかしなが
ら、それはまた、二本鎖ＤＮＡ分離におけるように、分
離を不明瞭にするバンド逆転をもたらす。さらに、柔軟
な高電位スイッチング力供給の欠乏が、一本鎖ＤＮＡの
分離に基づくパルスされた場技法の効果の調査を制限し
た。結果として、パルスされた電場電気泳動は、一本鎖
ＤＮＡを包含するＤＮＡ配列決定又は他の分離のための
効果的技法ではなかった。
めに開発され、そしてそれにこれまでほとんど使用され
て来た。一本鎖ＤＮＡに関しては、それらの使用は限定
された好結果をもたらして来た。大きな二本鎖ＤＮＡの
分解を改良するそれらの技法の能力にもかかわらず、そ
れらは大きな一本鎖ＤＮＡのためには、ほとんど改良点
を付与するようには思われず、ここで分解は、完全に欠
けていなければ、長さ４００塩基以上のフラグメントに
関して特に難かしい。最っとも広く使用される一本鎖Ｄ
ＮＡのための電場逆転技法は、前方及び逆方向に等しい
電位傾度を包含し、そして前方への持続期間は逆方向へ
の持続期間よりも卓越する。これは、大きな一本鎖ＤＮ
Ａの分離において少々の改良をもたらす。しかしなが
ら、それはまた、二本鎖ＤＮＡ分離におけるように、分
離を不明瞭にするバンド逆転をもたらす。さらに、柔軟
な高電位スイッチング力供給の欠乏が、一本鎖ＤＮＡの
分離に基づくパルスされた場技法の効果の調査を制限し
た。結果として、パルスされた電場電気泳動は、一本鎖
ＤＮＡを包含するＤＮＡ配列決定又は他の分離のための
効果的技法ではなかった。
【０００７】長さ約２５０個までの塩基のフラグメント
は、従来の装置及び技法により分離され得るが、種々の
複雑且つやっかいな方法がより長い配列のために使用さ
れて来た。これらは、従来の市販されている配列決定ゲ
ルよりも長いゲル（長さ４０cm〜８０cm）の使用、ゲル
の長さにそってバンドの空間を変えるための電位、緩衝
液及び塩傾度の使用（これらの方法のいづれも、分解に
おいて真の改良点を付与しない）、35Ｓ同位体の使用、
個々の実験の期間を変えるために種々の時間で負荷され
る複数レーン組の使用、ビオチン、ストレプトアビジン
又は他の大きな分子の結合（Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ，
Ｌ．，など．，" DNA trapping electrophoresis," Nat
ure 343 ：１９０〜１９２，１９９０年１月１１日によ
り報告されているような）、及び分離されたバンドが、
固定された検出器、たとえば自動螢光検出器を越えて連
続的に移動される方法を包含する。
は、従来の装置及び技法により分離され得るが、種々の
複雑且つやっかいな方法がより長い配列のために使用さ
れて来た。これらは、従来の市販されている配列決定ゲ
ルよりも長いゲル（長さ４０cm〜８０cm）の使用、ゲル
の長さにそってバンドの空間を変えるための電位、緩衝
液及び塩傾度の使用（これらの方法のいづれも、分解に
おいて真の改良点を付与しない）、35Ｓ同位体の使用、
個々の実験の期間を変えるために種々の時間で負荷され
る複数レーン組の使用、ビオチン、ストレプトアビジン
又は他の大きな分子の結合（Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ，
Ｌ．，など．，" DNA trapping electrophoresis," Nat
ure 343 ：１９０〜１９２，１９９０年１月１１日によ
り報告されているような）、及び分離されたバンドが、
固定された検出器、たとえば自動螢光検出器を越えて連
続的に移動される方法を包含する。
【０００８】広範囲の鎖長に対して効果的である、一本
鎖ＤＮＡを分離するための単純且つ効果的な方法が必要
とされる。本発明は、そのような方法を提供し、そして
予期しない好結果を示す態様で従来技術の多くの問題を
克服する。
鎖ＤＮＡを分離するための単純且つ効果的な方法が必要
とされる。本発明は、そのような方法を提供し、そして
予期しない好結果を示す態様で従来技術の多くの問題を
克服する。
【０００９】発明の要約 これまで分解するには困難であったサイズ範囲の一本鎖
ＤＮＡの分解が、非対称電場逆転技法の使用により著し
く改良されることが発見され、ここで前記技法において
は、逆パルスの電位は、前方パルスの電位よりも高く、
前方パルスの持続期間は、逆パルスの持続期間よりも高
く、そして前方パルスのための電位及び持続期間の生成
物は、逆パルスのその生成物よりも高い。数学的に表わ
される場合、それらの関係は次の通りである：
ＤＮＡの分解が、非対称電場逆転技法の使用により著し
く改良されることが発見され、ここで前記技法において
は、逆パルスの電位は、前方パルスの電位よりも高く、
前方パルスの持続期間は、逆パルスの持続期間よりも高
く、そして前方パルスのための電位及び持続期間の生成
物は、逆パルスのその生成物よりも高い。数学的に表わ
される場合、それらの関係は次の通りである：
【数２】 ここで、Ｅｆ及びｔf はそれぞれ前方パルスの電位傾度
及び持続期間であり、そしてＥｒ及びｔr はそれぞれ逆
パルスの電位傾度及び持続期間である。本明細書におけ
る電位傾度は、Ｖ／cmとして表わされ、そして支持体の
長さにより割り算された分離支持体を横切っての全電位
の低下を示す。本明細書に使用される場合、用語“前
方”とは、従来通りに構成されたゲルにおいて、ウェル
からゲルの底に生じる、ＤＮＡの正味移動の方向を言及
する。
及び持続期間であり、そしてＥｒ及びｔr はそれぞれ逆
パルスの電位傾度及び持続期間である。本明細書におけ
る電位傾度は、Ｖ／cmとして表わされ、そして支持体の
長さにより割り算された分離支持体を横切っての全電位
の低下を示す。本明細書に使用される場合、用語“前
方”とは、従来通りに構成されたゲルにおいて、ウェル
からゲルの底に生じる、ＤＮＡの正味移動の方向を言及
する。
【００１０】特定の分離のための最適電位傾度及び電位
傾度比は、分離されるべき一本鎖ＤＮＡのサイズに依存
して変化するであろう。一般的に、最適電位傾度及び電
位傾度比は、平均配列長さが長くなるにつれて上昇する
であろう。しかしながら、すべての電位傾度は、このタ
イプの分離は相当に長い時間を必要とする傾向があるの
で、適切な時間内での分離の完結を可能にするために高
いであろう。
傾度比は、分離されるべき一本鎖ＤＮＡのサイズに依存
して変化するであろう。一般的に、最適電位傾度及び電
位傾度比は、平均配列長さが長くなるにつれて上昇する
であろう。しかしながら、すべての電位傾度は、このタ
イプの分離は相当に長い時間を必要とする傾向があるの
で、適切な時間内での分離の完結を可能にするために高
いであろう。
【００１１】本発明及び好ましい態様の特定の記載 本発明は、一本鎖ＤＮＡの分離のために従来のＤＮＡ配
列決定セル及び他の電気泳動分離システムの使用を可能
にする。ＤＮＡ配列決定のためのセルにおける分離支持
体は一般的に、長さ約３０cm〜約１００cmの範囲内のゲ
ルであり、そして最っとも通常には約４０cm〜約８０cm
である。分離は一般的に、個々のパルスの前方及び逆部
分の両者において、約１０Ｖ／cm又はそれ以上の電位傾
度で行なわれるであろう。好ましい電位傾度は、約１０
Ｖ／cm〜約１００Ｖ／cmであり、最っとも好ましくは、
約３０Ｖ／cm〜約１００Ｖ／cmである。本発明は、電位
傾度及び持続期間が１つのパルスから次のパルスにおい
て一定であるシステム、及び電位傾度、持続期間又は両
者が１つのパルスから次のパルスにおいて変化するシス
テムを拡張する。特に好ましい手段は、パルス持続期間
が勾配し、すなわち連続的に高まる手段である。
列決定セル及び他の電気泳動分離システムの使用を可能
にする。ＤＮＡ配列決定のためのセルにおける分離支持
体は一般的に、長さ約３０cm〜約１００cmの範囲内のゲ
ルであり、そして最っとも通常には約４０cm〜約８０cm
である。分離は一般的に、個々のパルスの前方及び逆部
分の両者において、約１０Ｖ／cm又はそれ以上の電位傾
度で行なわれるであろう。好ましい電位傾度は、約１０
Ｖ／cm〜約１００Ｖ／cmであり、最っとも好ましくは、
約３０Ｖ／cm〜約１００Ｖ／cmである。本発明は、電位
傾度及び持続期間が１つのパルスから次のパルスにおい
て一定であるシステム、及び電位傾度、持続期間又は両
者が１つのパルスから次のパルスにおいて変化するシス
テムを拡張する。特に好ましい手段は、パルス持続期間
が勾配し、すなわち連続的に高まる手段である。
【００１２】本発明の改良点は、それらのパラメーター
に基づく限界の組合せにより観察されるが、好ましい範
囲はそれらの限界のいくつかに適合する。たとえば、電
位傾度比Ｅｒ／Ｅｆの好ましい範囲は、約２．０〜約１
０、及びより好ましくは約２．２５〜約５である。パル
スの前方及び逆方向部分の持続期間の比、すなわちｔ f
／ｔr についての好ましい範囲は、約２〜約２０及び好
ましくは約２．５〜約５である。個々の部分の持続期間
は相当に変化し、そして電位傾度のように、最適条件
は、分離されるサイズ範囲により変化するであろう。ほ
とんどの適用において、最良の結果は、約０．０１秒よ
りもそれぞれ大きいか又は等しく、好ましくは約０．０
３秒〜約３秒、及びより好ましくは約０．１秒〜約１秒
の前方及び逆方向への持続期間により得られるであろ
う。他の選択は、通常の実験により決定され得る。
に基づく限界の組合せにより観察されるが、好ましい範
囲はそれらの限界のいくつかに適合する。たとえば、電
位傾度比Ｅｒ／Ｅｆの好ましい範囲は、約２．０〜約１
０、及びより好ましくは約２．２５〜約５である。パル
スの前方及び逆方向部分の持続期間の比、すなわちｔ f
／ｔr についての好ましい範囲は、約２〜約２０及び好
ましくは約２．５〜約５である。個々の部分の持続期間
は相当に変化し、そして電位傾度のように、最適条件
は、分離されるサイズ範囲により変化するであろう。ほ
とんどの適用において、最良の結果は、約０．０１秒よ
りもそれぞれ大きいか又は等しく、好ましくは約０．０
３秒〜約３秒、及びより好ましくは約０．１秒〜約１秒
の前方及び逆方向への持続期間により得られるであろ
う。他の選択は、通常の実験により決定され得る。
【００１３】本発明の方法は、いづれか特定の形態又は
組成の電気泳動分離支持体に制限されない。ゲル及び粘
性溶液、たとえば線状ポリアクリルアミドの溶液の両者
が使用され得る。２種の電場は、共通軸にそって存在す
るので、本発明は、スラブ形状化支持体及び細管保持支
持体の両者において使用され得る。しかしながら、ほと
んどの適用において、上記論議に従っての長さのスラブ
ゲルが使用されるであろう。
組成の電気泳動分離支持体に制限されない。ゲル及び粘
性溶液、たとえば線状ポリアクリルアミドの溶液の両者
が使用され得る。２種の電場は、共通軸にそって存在す
るので、本発明は、スラブ形状化支持体及び細管保持支
持体の両者において使用され得る。しかしながら、ほと
んどの適用において、上記論議に従っての長さのスラブ
ゲルが使用されるであろう。
【００１４】電場による分離媒体の過剰加熱は、従来の
冷却方法により防がれ、そして多くの場合、前記方法は
媒体のための支持体に又は電気泳動セルの構成の他の成
分に構築される。本発明の実施において有用である典型
的なＤＮＡ配列決定システムは、４０cm〜８０cmの範囲
の長さを有する垂直スラブゲルを用いる、Bio-Rad Labo
ratories, Inc.,Hercules, California の Sequi-Gen
(R) Nucleic Acid Sequencing Systemである。
冷却方法により防がれ、そして多くの場合、前記方法は
媒体のための支持体に又は電気泳動セルの構成の他の成
分に構築される。本発明の実施において有用である典型
的なＤＮＡ配列決定システムは、４０cm〜８０cmの範囲
の長さを有する垂直スラブゲルを用いる、Bio-Rad Labo
ratories, Inc.,Hercules, California の Sequi-Gen
(R) Nucleic Acid Sequencing Systemである。
【００１５】電極は、パルスされた電場電気泳動のため
に企画された電力源及び電場スイッチングユニットによ
り駆動されるであろう。種々の市販のユニットの中に
は、Model 3000xi Electrophoresis Power Supply 及び
３０００Ｖをスイッチできる改良されたPulsewave 760
Electrophoretic Field Switcherが存在し、そしてこれ
らはBio-Rad Laboratories, Inc.,Hercules, Californi
a から入手できる。他方、電極は、スイッチング電力供
給、たとえばTRAK, Inc.,Tampa, Florida から入手でき
るユニットにより駆動され得る。
に企画された電力源及び電場スイッチングユニットによ
り駆動されるであろう。種々の市販のユニットの中に
は、Model 3000xi Electrophoresis Power Supply 及び
３０００Ｖをスイッチできる改良されたPulsewave 760
Electrophoretic Field Switcherが存在し、そしてこれ
らはBio-Rad Laboratories, Inc.,Hercules, Californi
a から入手できる。他方、電極は、スイッチング電力供
給、たとえばTRAK, Inc.,Tampa, Florida から入手でき
るユニットにより駆動され得る。
【００１６】ゲル及び緩衝液は、両者とも、電気泳動分
離において有用であることが知られているいづれかの従
来の組成物からのものであり得る。ゲルの例は、アガロ
ース、ポリアクリルアミド及びスターチゲルである。ゲ
ルの濃度はまた、多様であり、そして当業者に知られて
いる考慮に基づいての従来の実施に従って選択されるで
あろう。
離において有用であることが知られているいづれかの従
来の組成物からのものであり得る。ゲルの例は、アガロ
ース、ポリアクリルアミド及びスターチゲルである。ゲ
ルの濃度はまた、多様であり、そして当業者に知られて
いる考慮に基づいての従来の実施に従って選択されるで
あろう。
【００１７】本発明の方法から有益である一本鎖ＤＮＡ
は、長さ約２００又はそれ以上の塩基のそれらの分子で
あろう。その有益性は、長さ約３００又はそれ以上の塩
基の分子間で特に断定され、そして１０００個以上の塩
基の分子に拡張する。
は、長さ約２００又はそれ以上の塩基のそれらの分子で
あろう。その有益性は、長さ約３００又はそれ以上の塩
基の分子間で特に断定され、そして１０００個以上の塩
基の分子に拡張する。
【００１８】本発明を用いてのＤＮＡ分子の分離のため
に必要とされる時間の長さは臨界ではなく、そしてシス
テムにおける他の変数に依存して広く変化する。ほとん
どの場合、分離は、約８〜約１６時間内で完結するであ
ろう。
に必要とされる時間の長さは臨界ではなく、そしてシス
テムにおける他の変数に依存して広く変化する。ほとん
どの場合、分離は、約８〜約１６時間内で完結するであ
ろう。
【００１９】分離が完結された後すぐに、バンドは従来
の方法により検出され、同定され、そして定量化され得
る。適切な検出技法の例は、放射能、螢光及び化学発光
である。その方法は、検出の手動又は自動化された手段
の両者に適合される。次の例は、例示の目的であって、
本発明を限定するものではない。
の方法により検出され、同定され、そして定量化され得
る。適切な検出技法の例は、放射能、螢光及び化学発光
である。その方法は、検出の手動又は自動化された手段
の両者に適合される。次の例は、例示の目的であって、
本発明を限定するものではない。
【００２０】
【実施例】例 一連の電気泳動分離は、種々の鎖長の一本鎖ＤＮＡの同
じ混合物をそれぞれ用いて、及び同じゲルをそれぞれ用
いて実施され、そしてその分離は、電位傾度及び電場ス
イッチング手段で異なる。その混合物は１５〜１００個
の塩基の大きさの範囲であり、そして分離媒体は、ＤＮ
Ａ配列決定電気泳動セルに固定された８０cm（長さ）×
２１cm（幅）×０．０４cm（厚さ）の５％ポリアクリル
アミドスラブゲルであった。すべてのスイッチングは、
長方形の波形パルスにより行なわれた。
じ混合物をそれぞれ用いて、及び同じゲルをそれぞれ用
いて実施され、そしてその分離は、電位傾度及び電場ス
イッチング手段で異なる。その混合物は１５〜１００個
の塩基の大きさの範囲であり、そして分離媒体は、ＤＮ
Ａ配列決定電気泳動セルに固定された８０cm（長さ）×
２１cm（幅）×０．０４cm（厚さ）の５％ポリアクリル
アミドスラブゲルであった。すべてのスイッチングは、
長方形の波形パルスにより行なわれた。
【００２１】この比較に使用される分離は、次のものを
包含する：２８００Ｖの一定の非間接的電場により行な
われる１回の実施（パルスを伴わない）…実施“０”、
Ｔｕｒｍｅｌ，Ｃ．，など．，" High-Resolution Zero
Integrated field Electrophoresis of DNA," Electro
phoresis of Large DNA Molecules ：Theory and Appli
cations, Cold Spring Harbor Laboratory Press, １０
１〜１３１ページ（１９９０）により記載される手段に
従って行なわれる１回の実施、すなわちＥｒ／Ｅｆ＜
１，ｔf ／ｔr ＜１及びＥｆｔf ／Ｅｒｔr ≧１…実施
“ｉ”、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．Ｗ．，など．，" The basi
s of high resolution separation of small DNA by as
ymmetric-voltage field invension electrophoresis a
nd its application to DNA sequencing gels," Nuclei
c Acids Research 18 (6) ：１４８１〜１４８７（１９
９０）により記載される手段に類似する手段に従って行
なわれる１回の実施−実施“ii”、Ｃａｒｌｅ，Ｇ．
Ｆ．，など．，アメリカ特許第４，７３７，２５１号、
" Field Inversion Gel Electrophoresis," （１９８８
年４月１２日に公開された）により記載される手段に従
って行なわれる２回の実施、すなわちＥｒ／Ｅｆ＝１，
ｔf ／ｔr ＞１…実施“iii ”及び“iv”、本発明外の
他の手段に従って行なわれる４回の実施−実施“ｖ”〜
“viii”、本発明に従って行なわれる２回の実施、すな
わちＥｒ／Ｅｆ≧２．０、ｔf ／ｔr ≧１．２５及び
１．１≦Ｅｆｔf ／Ｅｒｔr ≦２．０…実施“Ａ”及び
“Ｂ”。
包含する：２８００Ｖの一定の非間接的電場により行な
われる１回の実施（パルスを伴わない）…実施“０”、
Ｔｕｒｍｅｌ，Ｃ．，など．，" High-Resolution Zero
Integrated field Electrophoresis of DNA," Electro
phoresis of Large DNA Molecules ：Theory and Appli
cations, Cold Spring Harbor Laboratory Press, １０
１〜１３１ページ（１９９０）により記載される手段に
従って行なわれる１回の実施、すなわちＥｒ／Ｅｆ＜
１，ｔf ／ｔr ＜１及びＥｆｔf ／Ｅｒｔr ≧１…実施
“ｉ”、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．Ｗ．，など．，" The basi
s of high resolution separation of small DNA by as
ymmetric-voltage field invension electrophoresis a
nd its application to DNA sequencing gels," Nuclei
c Acids Research 18 (6) ：１４８１〜１４８７（１９
９０）により記載される手段に類似する手段に従って行
なわれる１回の実施−実施“ii”、Ｃａｒｌｅ，Ｇ．
Ｆ．，など．，アメリカ特許第４，７３７，２５１号、
" Field Inversion Gel Electrophoresis," （１９８８
年４月１２日に公開された）により記載される手段に従
って行なわれる２回の実施、すなわちＥｒ／Ｅｆ＝１，
ｔf ／ｔr ＞１…実施“iii ”及び“iv”、本発明外の
他の手段に従って行なわれる４回の実施−実施“ｖ”〜
“viii”、本発明に従って行なわれる２回の実施、すな
わちＥｒ／Ｅｆ≧２．０、ｔf ／ｔr ≧１．２５及び
１．１≦Ｅｆｔf ／Ｅｒｔr ≦２．０…実施“Ａ”及び
“Ｂ”。
【００２２】これらの分離からの結果は、下記表に示さ
れ、そして実施Ａ及び０からの結果は、また図に示され
る。この表においては、移動度は、相対関係で示され、
すべては長さ１５０個の塩基（１５０ｂ）のＤＮＡ分子
の移動度に標準化されている。種々の実施間での３００
個の塩基と７００個の塩基のＤＮＡ分子間の移動度の広
がりを比較することによれば、パルスを伴わないで得ら
れるその広がりは、まったく改良されず、又は本発明外
のいづれかの手段に従ってパルスすることによって単に
適度に改良されるが、しかし有意な改良は、本発明に従
ってパルスすることによって達成されることが見出され
得る。図において、横座標は５０個の塩基の分子の移動
度に対しての分子の移動度を示し、そして縦座標は塩基
での分子の大きさを示す。実施Ａを示す曲線は、実施Ｏ
に対しての改良性を示し、そして本発明は分化を可能に
するのに十分な程度に５０個の塩基ほどでサイズ的に異
なる分子を分離することを示す。
れ、そして実施Ａ及び０からの結果は、また図に示され
る。この表においては、移動度は、相対関係で示され、
すべては長さ１５０個の塩基（１５０ｂ）のＤＮＡ分子
の移動度に標準化されている。種々の実施間での３００
個の塩基と７００個の塩基のＤＮＡ分子間の移動度の広
がりを比較することによれば、パルスを伴わないで得ら
れるその広がりは、まったく改良されず、又は本発明外
のいづれかの手段に従ってパルスすることによって単に
適度に改良されるが、しかし有意な改良は、本発明に従
ってパルスすることによって達成されることが見出され
得る。図において、横座標は５０個の塩基の分子の移動
度に対しての分子の移動度を示し、そして縦座標は塩基
での分子の大きさを示す。実施Ａを示す曲線は、実施Ｏ
に対しての改良性を示し、そして本発明は分化を可能に
するのに十分な程度に５０個の塩基ほどでサイズ的に異
なる分子を分離することを示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】前述のことは、主に例示目的のために提供
される。本明細書に開示される材料及び方法を越えての
それらの一定の変法、修飾及び置換は、当業者に明らか
であり、そのような変更は本発明の範囲内で行なわれ得
る。
される。本明細書に開示される材料及び方法を越えての
それらの一定の変法、修飾及び置換は、当業者に明らか
であり、そのような変更は本発明の範囲内で行なわれ得
る。
【図１】これは、電気泳動に基づく一本鎖のための相対
的移動度に対する鎖長のプロットであり、そして電場逆
転なしに得られたその対応する結果と共に、本発明に従
って電場逆転技法を用いて得られた結果を示す。
的移動度に対する鎖長のプロットであり、そして電場逆
転なしに得られたその対応する結果と共に、本発明に従
って電場逆転技法を用いて得られた結果を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 電気泳動分離支持体において予備選択さ
れた移動方向にそって長さ２００又はそれ以上の塩基の
一本鎖ＤＮＡ分子の混合物を電気泳動分離するための方
法であって、前方電場とその方向が前記前方電場に対し
て１８０°回転される逆電場との間で前記支持体電場を
横切って交番せしめることを含んで成り、前記前方電場
が前記移動方向にそって存在し、前記前方電場及び逆電
場が次のように電位傾度及び期間を有し：Ｅｆ及びＥｒ
はそれぞれ約１０Ｖ／cmよりも大きいか又は等しく；Ｅ
ｒ／Ｅｆは約２．０よりも大きいか又は等しく；ｔf 及
びｔr はそれぞれ少なくとも約０．０１秒よりも大きい
か又は等しく；ｔf ／ｔr は約１．２５よりも大きいか
又は等しく；そしてＥｆｔf ／Ｅｒｔr は約１．１〜約
２．０であり；ここでＥｆ及びｔf は前記前方電場の電
位傾度及び期間であり、そしてＥｒ及びｔr は前記逆電
場の電位傾度及び期間であることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記Ｅｆ及びＥｒがそれぞれ、約１０Ｖ
／cm〜約１００Ｖ／cmである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記Ｅｒ／Ｅｆが約２．０〜約１０であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記Ｅｆ及びＥｒがそれぞれ約３０Ｖ／
cm〜約１００Ｖ／cmであり、そして前記Ｅｒ／Ｅｆが約
２．２５〜約５である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記ｔf 及びｔr がそれぞれ約０．０３
秒〜約３秒である請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記ｔf ／ｔr が約２〜約２０である請
求項１記載の方法。 - 【請求項７】 前記ｔf 及びｔr がそれぞれ約０．１秒
〜約１秒であり、そして前記ｔf ／ｔr が約２．５〜約
５である請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記Ｅｆ及びＥｒがそれぞれ約１０Ｖ／
cm〜約１００Ｖ／cmであり、Ｅｒ／Ｅｆが約２．０〜約
１０であり、そしてｔf ／ｔr が約２〜約２０である請
求項１記載の方法。 - 【請求項９】 前記Ｅｆ及びＥｒがそれぞれ約３０Ｖ／
cm〜約１００Ｖ／cmであり、Ｅｒ／Ｅｆが約２．２５〜
約５であり、そしてｔf ／ｔr が約１．５〜約５である
請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 ゲルにおいて予備選択された移動方向
にそって長さ３００又はそれ以上の塩基の一本鎖ＤＮＡ
分子の混合物を電気泳動分離するための方法であって、
前方電場とその方向が前記前方電場に対して１８０°回
転される逆電場との間で前記ゲル電場を横切って交番せ
しめることを含んで成り、前記前方電場が前記移動方向
にそって存在し、前記前方電場及び逆電場が次のように
電位傾度及び期間を有し：Ｅｆ及びＥｒはそれぞれ約１
０Ｖ／cm〜１００Ｖ／cmであり；Ｅｒ／Ｅｆは約２．０
〜約１０であり；ｔf ／ｔr は約２〜約２０であり；そ
してＥｆｔf ／Ｅｒｔr は約１．１〜約２．０であり；
ここでＥｆ及びｔf は前記前方電場の電位傾度及び期間
であり、そしてＥｒ及びｔr は前記逆電場の電位傾度及
び期間であることを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 ゲルにおいて予備選択された移動方向
にそって長さ３００又はそれ以上の塩基の一本鎖ＤＮＡ
分子の混合物を電気泳動分離するための方法であって、
前方電場とその方向が前記前方電場に対して１８０°回
転される逆電場との間で前記ゲル電場を横切って交番せ
しめることを含んで成り、前記前方電場が前記移動方向
にそって存在し、前記前方電場及び逆電場が次のように
電位傾度及び期間を有し：Ｅｆ及びＥｒはそれぞれ約３
０Ｖ／cm〜約１００Ｖ／cmであり；Ｅｒ／Ｅｆは約２．
２５〜約５であり；ｔf ／ｔr は約２．５〜約５であ
り；そしてＥｆｔf ／Ｅｒｔr は約１．１〜約２．０で
あり；ここでＥｆ及びｔf は前記前方電場の電位傾度及
び期間であり、そしてＥｒ及びｔr は前記逆電場の電位
傾度及び期間であることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US803316 | 1991-12-04 | ||
| US07/803,316 US5178737A (en) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | Electrophoretic resolution of single strand DNA by asymmetric field inversion |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0611483A true JPH0611483A (ja) | 1994-01-21 |
| JPH0816671B2 JPH0816671B2 (ja) | 1996-02-21 |
Family
ID=25186209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4321633A Expired - Lifetime JPH0816671B2 (ja) | 1991-12-04 | 1992-12-01 | 非対称電場逆転による一本鎖ｄｎａの電気泳動分離の改良 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5178737A (ja) |
| EP (1) | EP0545689A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0816671B2 (ja) |
| CA (1) | CA2082906C (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5964997A (en) * | 1997-03-21 | 1999-10-12 | Sarnoff Corporation | Balanced asymmetric electronic pulse patterns for operating electrode-based pumps |
| US6146511A (en) * | 1998-01-30 | 2000-11-14 | The Perkin-Elmer Corporation | Electrophoretic nucleic acid purification method |
| CA2430312C (en) * | 2000-11-29 | 2008-01-29 | Japan Science And Technology Corporation | Nucleic acid analyzing method |
| WO2002050095A1 (en) * | 2000-12-18 | 2002-06-27 | Trustees Of Princeton University | Fractionation of macro-molecules using asymmetric pulsed field electrophoresis |
| US7014747B2 (en) * | 2001-06-20 | 2006-03-21 | Sandia Corporation | Dielectrophoretic systems without embedded electrodes |
| US7597791B2 (en) * | 2001-10-19 | 2009-10-06 | The Trustees Of Princeton University | Method and apparatus for generating electric fields and flow distributions for rapidly separating molecules |
| US20070227891A1 (en) * | 2004-10-06 | 2007-10-04 | Agency For Science, Technology And Research | Differential alternating field electrophoresis method and an electrophoresis system therefor |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4737251A (en) * | 1985-09-27 | 1988-04-12 | Washington University | Field-inversion gel electrophoresis |
| US4740283A (en) * | 1986-02-27 | 1988-04-26 | University Patents, Inc. | Pulsed-field gradient gel electrophoretic apparatus |
| US4971671A (en) * | 1987-03-02 | 1990-11-20 | Xerox Corporation | Processes for separation of DNA fragments |
| DE3855429T2 (de) * | 1987-12-18 | 1996-11-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | Verfahren zur Elektrophorese |
| US4830726A (en) * | 1988-02-03 | 1989-05-16 | The Wistar Institute | Separation of large DNA molecules in alternating asymmetric electric fields |
| US5084157A (en) * | 1988-03-21 | 1992-01-28 | California Institute Of Technology | Gel electrophoresis using time dependent contour controlled electric fields |
| CA2012379C (en) * | 1989-04-24 | 2000-01-25 | Gary W. Slater | Processes for the preparation and separation of macromolecules |
| US5122248A (en) * | 1990-05-18 | 1992-06-16 | Northeastern University | Pulsed field capillary electrophoresis |
-
1991
- 1991-12-04 US US07/803,316 patent/US5178737A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-11-13 CA CA002082906A patent/CA2082906C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-01 JP JP4321633A patent/JPH0816671B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 EP EP92311005A patent/EP0545689A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2082906C (en) | 1999-02-02 |
| EP0545689A1 (en) | 1993-06-09 |
| JPH0816671B2 (ja) | 1996-02-21 |
| CA2082906A1 (en) | 1993-06-05 |
| US5178737A (en) | 1993-01-12 |
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