JPH06116169A

JPH06116169A - 温度応答性生理活性物質−オリゴマー複合体及びその製造法

Info

Publication number: JPH06116169A
Application number: JP5052251A
Authority: JP
Inventors: Naoya Ogata; 直哉緒方; Yasuhisa Sakurai; 靖久桜井; Mitsuo Okano; 光夫岡野; Yoshiyuki Takei; 良之武井; Takashi Aoki; 隆史青木
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 1993-03-12
Publication date: 1994-04-26
Anticipated expiration: 2017-02-04
Also published as: JP3253730B2

Abstract

(57)【要約】【構成】生理活性物質と末端に官能基を有するＮ−イ
ソプロピルアクリルアミドホモオリゴマーとの複合体、
及び生理活性物質と末端に官能基を有するＮ−イソプロ
ピルアクリルアミドと親水性モノマー又は疎水性モノマ
ーとのコオリゴマーとの複合体、並びにこれらの製造
法。【効果】本発明の複合体は、温度応答性を有し、ＬＣ
ＳＴ以下の温度で均一系反応が可能であり、またＬＣＳ
Ｔ以上で不溶化するので、容易に反応生成物と分離する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、温度応答性を有するＮ
−イソプロピルアクリルアミドオリゴマーと生理活性物
質との複合体及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは分子
内に疎水性のイソプロピル基と親水性のアミド基を有
し、そのホモポリマーは水系において下限臨界共溶温度
を有する(M. Henskins, J. Macromol. Sci. Chem., A2,
8, 1441(1968)) 。そのため、32℃を境に低温側では水
溶性を示し、高温側ではほとんど水に溶けないという温
度応答性を示す。

【０００３】一方、酵素や抗体等の生理活性物質は、反
応物との分離を行うため、従来は不溶性担体に固定化さ
れて利用されている。しかし、担体への固定化により、
生理活性物質の活性は、生理的条件下における単独使用
に比べてその２割程度しか発現されていない。また、こ
のような不均一系では、システム全体としての反応効率
も必ずしも充分とはいえない。

【０００４】Ｎ−イソプロピルアクリルアミドオリゴマ
ーと生理活性物質との複合体としては、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドとＮ−アクリロイルオキシスクシンイ
ミドとのランダムコポリマーと蛋白質との複合体が知ら
れている(J. P. Chen, et al., Biomaterials, 11, 625
-634(1990))。しかしながら、この複合体は、１本の高
分子鎖中に多くの結合点を持つため、不必要な架橋をし
て凝集を起こしやすく、また結合させた生理活性物質の
活性を低下させやすいという欠点を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前述した従
来のＮ−イソプロピルアクリルアミドオリゴマーと生理
活性物質との複合体の欠点を解消した、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドオリゴマーと生理活性物質との複合体
及びその製造法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、生理活性物質
と分子量 1,000〜80,000の末端に官能基を有するＮ−イ
ソプロピルアクリルアミドホモオリゴマーとの複合体、
及び生理活性物質と、分子量 1,000〜80,000の末端に官
能基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミドと親水性
モノマー又は疎水性モノマーとのコオリゴマーとの複合
体、並びにこれらの複合体の製造法である。

【０００７】本発明の対象となる生理活性物質として
は、例えば酵素、抗体、ホルモン、その他各種蛋白質、
糖蛋白質、核酸、糖脂質が挙げられる。本発明に用いる
オリゴマーにおける官能基としては、前記生理活性物質
と共有結合を形成し得るものであれば特に制限はなく、
例えばカルボキシル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、
ハロゲン原子、オキソ基、ホルミル基、活性エステル、
イソシアナート基、酸クロリド等が挙げられる。

【０００８】末端に官能基を有するＮ−イソプロピルア
クリルアミドホモオリゴマーとしては、例えば、次式
（Ｉ）：

【０００９】

【化７】

【００１０】で示される繰り返し単位からなる分子量
1,000〜80,000のオリゴマーであって、末端の一方が水
素原子で、他方が次式（II）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるものが挙げられる。該ホモオリゴマ
ーの代表的なものとしては、次式 (III)：

【００１１】

【化８】

【００１２】（式中、ｎは10〜700 の整数を表す。）で
示されるものが挙げられる。前述した生理活性物質とＮ
−イソプロピルアクリルアミドホモオリゴマーとの複合
体は、32〜34℃の下限臨界共溶温度（以下「ＬＣＳＴ」
という。）を有するものであるが、用いるオリゴマーを
親水性モノマーとのコオリゴマーとし、該親水性モノマ
ーの比率を高めることによりＬＣＳＴを高温側にシフト
させることができ、また用いるオリゴマーを疎水性モノ
マーとのコオリゴマーとし、該疎水性モノマーの比率を
高めることによりＬＣＳＴを低温側にシフトさせること
ができる。ここで用いる親水性モノマーとしては、例え
ばＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリル酸、メタ
クリル酸、アクリルアミド、モノメチルアクリルアミ
ド、エチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ビ
ニルアルコール等が挙げられ、疎水性モノマーとして
は、例えば、次式：

【００１３】

【化９】

【００１４】（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表
し、ｎは１〜20、好ましくは２〜18の整数を表す。）で
示されるアクリル酸アルキル又はメタクリル酸アルキ
ル、例えばメタクリル酸ブチル等が挙げられる。前記Ｎ
−イソプロピルアクリルアミドと親水性モノマー又は疎
水性モノマーとのコオリゴマーにおけるＮ−イソプロピ
ルアクリルアミドと親水性モノマーとのモル比は、好ま
しくは 100〜80：０〜20であり、Ｎ−イソプロピルアク
リルアミドと疎水性モノマーとのモル比は、好ましくは
100〜90：０〜10である。

【００１５】末端に官能基を有するＮ−イソプロピルア
クリルアミドと親水性モノマーとのコオリゴマーとして
は、例えば、次式（Ｉ）：

【００１６】

【化１０】

【００１７】で示される構造単位と、次式（IV）：

【００１８】

【化１１】

【００１９】で示される構造単位が 100〜80：０〜20の
モル比で線状に不規則に配列した分子量 1,000〜80,000
のオリゴマーであって、末端の一方が水素原子で、他方
が次式（II）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるものが挙げられる。

【００２０】また、末端に官能基を有するＮ−イソプロ
ピルアクリルアミドと疎水性モノマーとのコオリゴマー
としては、例えば、次式（Ｉ）：

【００２１】

【化１２】

【００２２】で示される構造単位と、次式（Ｖ）：

【００２３】

【化１３】

【００２４】で示される構造単位が 100〜90：０〜10の
モル比で線状に不規則に配列した分子量 1,000〜80,000
のオリゴマーであって、末端の一方が水素原子で、他方
が次式（II）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるものが挙げられる。

【００２５】本発明に用いるオリゴマーは、例えば、Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド（以下「ＩＰＡＡｍ」と
いう。）、及び必要に応じて親水性モノマー又は疎水性
モノマーと、３−メルカプトプロピオン酸（以下「ＭＰ
Ａ」という。）をラジカル重合開始剤の存在下に反応さ
せることにより製造することができる。ここで用いるラ
ジカル重合開始剤としては、例えばα，α'-アゾビスイ
ソブチロニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という。）、α，
α'-アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、α，α'-
アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等、一連
のアゾ化合物系のラジカル重合開始剤が挙げられる。

【００２６】反応溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（以下「ＤＭＦ」という。）、ジメチル
スルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサンが挙げ
られる。反応温度は、通常60〜70℃、好ましくは68〜70
℃であり、反応時間は、通常２〜５時間、好ましくは４
〜５時間である。

【００２７】分子量（重合度）は、モノマーとＭＰＡの
比を変えることにより任意のものを得ることができる。
即ち、得られるオリゴマーの数平均分子量の逆数は「モ
ノマーのモル数／ＭＰＡのモル数」に比例する。本発明
に用いるオリゴマーの分子量は、 1,000〜80,000である
が、生理活性物質−オリゴマー複合体が温度変化により
沈殿しやすくなるためには分子量が大きい方が好まし
く、一方、末端官能基の反応性は分子量の増大により低
下し、また分子量の増大による立体障害により生理活性
物質の活性が低下するため、特に分子量 3,000〜30,000
のオリゴマーを用いることが好ましい。

【００２８】以上のようにして得られるオリゴマーを蛋
白質、酵素等のアミノ基を有する生理活性物質と結合さ
せるに際しては、オリゴマーを、必要に応じて、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミドの存在
下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させる等によ
り活性化オリゴマーとした後、該アミノ基を有する生理
活性物質と反応させればよい。

【００２９】Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによる活性
化反応において、反応溶媒としては、例えば、酢酸エチ
ル等のエステル系溶媒、テトラヒドロフラン等のエーテ
ル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン
化炭化水素系溶媒が挙げられ、反応温度は、通常４〜10
℃であり、反応時間は、通常４〜16時間、好ましくは12
〜16時間である。

【００３０】また、活性化オリゴマーと生理活性物質と
の反応において、活性化オリゴマーと生理活性物質のモ
ル比は、好ましくは５〜50：１〜５であり、反応溶媒と
しては、例えば、水、ＤＭＦ、ジオキサンが挙げられ、
反応温度は、通常４〜10℃であり、反応時間は、通常４
〜16時間、好ましくは12〜16時間である。一方、水溶性
カルボジイミドを用いて水溶液又は緩衝液中で反応させ
る場合は、オリゴマーを活性化させることなく、直接生
理活性物質と反応させることができる。以上のようにし
て得られる本発明の生理活性物質−オリゴマー複合体
は、温度応答性を有し、ＬＣＳＴ以下の温度で均一系反
応が可能であり、またＬＣＳＴ以上で不溶化するので、
容易に反応生成物と分離することができる。更に、薬理
効果を有する生理活性物質とオリゴマーとの複合体を生
体に投与し、作用させたい部位のみを加温して当該部位
に生理活性物質を集積させる新しいターゲッティングシ
ステムが可能となる。

【００３１】

【実施例】以下、合成例及び実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定され
るものではない。（合成例１）ＩＰＡＡｍホモオリゴマーの合成 (1) 試薬ＡＩＢＮ、ＤＭＦは常法により精製した。ＩＰＡＡｍは
トルエンに溶解後、20倍量の石油エーテル中にあけ、再
結晶したものを使用した。ＭＰＡは減圧蒸留により83℃
/5mmHg留分を使用した。その他の試薬は市販品をそのま
ま使用した。 (2) 片末端にカルボキシル基を有するＩＰＡＡｍホモオ
リゴマーの合成重合管に表１に示す量のＩＰＡＡｍとＭＰＡを採取し、
ラジカル重合開始剤ＡＩＢＮ3.3g(0.4mol/l)を加え、Ｄ
ＭＦ50mlで希釈した。凍結脱気後、真空下で封管し、恒
温槽中で70±１℃に保って５時間振り混ぜながらテロメ
リゼーションを行った。次に、冷却して反応を停止さ
せ、得られた反応混合物を40℃の水浴上で溶媒を減圧留
去した後、ジエチルエーテル中にあけてオリゴマーを沈
殿させ、濾別後、真空乾燥した。なお、ＤＭＦ中のＩＰ
ＡＡｍオリゴマー濃度は理論値で1.0mol/lである。本実
施例で得られたＩＰＡＡｍホモオリゴマーは、前記式(I
II)で示されるものである。

【００３２】ＩＰＡＡｍとＭＰＡの使用量、収量及び収
率を表１に示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】(3) オリゴマーの分析 (a)分子量の測定ＩＰＡＡｍオリゴマー0.02g をテトラヒドロフラン５ml
に溶解し、40℃でのゲル濾過クロマトグラフィー（島津
C-R4AX, Shodex KF-80M×2)により重量平均分子量（Ｍ
w ）及び数平均分子量（Ｍn ）を求めた。

【００３５】(b)末端カルボキシル基の定量ＩＰＡＡｍオリゴマー0.2gを超純水20mlに溶解した後、
20℃の恒温槽中に30分間放置し、フェノールフタレイン
を指示薬として、 0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液により
中和滴定を行った。 (c)曇点変化の測定ＩＰＡＡｍオリゴマー0.1gを超純水10mlに溶解し、サン
プル管に入れ恒温槽中で各温度において５分間保温し、
紫外分光光度計（島津 UV-240)によりＩＰＡＡｍオリゴ
マー水溶液の500nm の透過率を測定した。別途に分子量
の異なる２種類のオリゴマー(Ic-50, Ic-100) 水溶液を
37℃で10分間静置した後、30秒間激しく攪拌し、再び37
℃で５分間静置したサンプルの上澄の透過率を測定し
た。また、同様の操作を行った後のサンプルを37℃で５
分間遠心分離にかけ、その上澄の透過率を測定した。 (4) 結果 (a)分子量等テロメリゼーションにおけるＩＰＡＡｍモノマーのモル
濃度に対するＭＰＡのモル濃度の比（以下 S / M とい
う。）、及び分子量等の分析結果を表２に示す。

【００３６】

【表２】＊：３回の平均表２から、カルボキシル基１個に相当する分子量と、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーによる数平均分子量（Ｍn ）
が良く一致していることがわかる。このことから、以下
の式に示すようなテロメリゼーションにより反応が進行
し、片末端にカルボキシル基を有するオリゴマーが生成
したものと考えられた。

【００３７】

【化１４】（式中、Ｉは重合開始剤を、R^*は重合開始剤由来のラ
ジカルを、＊はラジカルを、M はＩＰＡＡｍモノマーを
表す。）表２に示した結果からわかるように、分子鎖長
はモノマーに対するＭＰＡ濃度を変化させることにより
制御することができる。また、分子鎖長の小さいオリゴ
マーはＤＭＦ溶媒中でＭＰＡを多量に用いることにより
得ることができた。このテロメリゼーションにおいてＭ
ＰＡのＩＰＡＡｍに対する連鎖移動定数(Cs)は3.73×10
^-3であり、ＭＰＡがメタクリル酸メチル（0.38×10^-4)
及びスチレン(9.4×10^-4)("Polymer Handbook", J. Bra
udrup and E. H. Immergut Ed., John Wiley & Sons,
N. Y., 1975, pp.92-95) に対して示す値に比して非常
に大きな値を示した。

【００３８】(b)水溶液中におけるオリゴマーの感温性得られたＩＰＡＡｍオリゴマー水溶液の温度による透過
率の変化を図１に示す。図１から明らかなように、鎖長
の異なるいずれのオリゴマーにおいても31〜32℃付近で
大きく透過率が変化した。これは、ＩＰＡＡｍのホモポ
リマーが有する下限臨界共溶温度と一致することから、
オリゴマーもホモポリマーと同様の感温性を有している
ことがわかった。

【００３９】また、得られたＩＰＡＡｍオリゴマーIc-5
0 及びIc-100の水溶液濃度による透過率の変化を図２
に、ＩＰＡＡｍオリゴマーIc-50 希薄水溶液の遠心によ
る透過率の変化を図３に示す。１重量％以上の濃度では
ほぼ90％以上のオリゴマーが析出しかつ沈降していると
考えられるが、１重量％以下の濃度ではオリゴマーの分
子量の小さいものは沈降が進んでいなかった。これは、
希薄溶液中では脱水和したオリゴマーの衝突回数が減
り、オリゴマー自身が沈降するに必要な凝集力を充分に
得ることができないためと考えられた。しかし、水溶液
中で拡散した状態のものでも 0.5重量％程度の濃度であ
れば10000gの遠心力をかけることにより沈降することが
わかった。

【００４０】（実施例１）コラーゲン−ＩＰＡＡｍホ
モオリゴマー複合体の製造合成例１で得た分子量6,100 のＩＰＡＡｍホモオリゴマ
ー(Ic-50) １ｇをＮ−ヒドロキシスクシンイミド 0.5ｇ
及びジシクロヘキシルカルボジイミド 0.5ｇと共に酢酸
エチル50mlに溶解し、４℃で16時間反応させた。反応液
を濾過後、ジエチルエーテル中にあけ、活性化オリゴマ
ーを得た。スクシニミジル基の導入の確認はＩＲ及びＵ
Ｖにより行った。

【００４１】分子量約30万のアテロコラーゲン500mg を
冷精製水90mlでふやかした。これに0.1Ｍ塩酸0.5ml を
加えて溶解させた後、pH3.0 の冷精製水で30倍に希釈し
た（約0.3 重量％）。活性化オリゴマー140mg を乾燥Ｄ
ＭＦ４mlに溶解し、30分おきに５回、前記コラーゲン水
溶液に加え、攪拌下４℃で16時間反応させた。ここで加
えた活性化オリゴマーの総量は700mg である。

【００４２】反応終了後、セルロース製透析膜を用いて
透析した。外液は精製水（塩酸酸性pH3.0）を用いた。
その後、凍結乾燥してコラーゲン−Ic-50 複合体を得
た。コラーゲン−Ic-50 複合体の 0.3重量％水溶液をサ
ンプル管に入れ恒温槽中で各温度において５分間保温
し、紫外分光光度計（島津 UV-240)により500nm の透過
率を測定した。結果を図４に示す。

【００４３】コラーゲン−Ic-50 複合体は、塩環境に関
係なく水に可溶であり、かつアルコール類やＤＭＦ等の
極性溶媒に可溶である。（合成例２）ＩＰＡＡｍコオリゴマーの合成 (1) ＩＰＡＡｍ−疎水性モノマー・コオリゴマーの合
成原料モノマーとして表３に示す量のＩＰＡＡｍ及びメタ
クリル酸ブチル（以下「ＢＭＡ」という。）を用い、各
モノマーとＭＰＡの比を、得られるコオリゴマーの分子
量が6,000 前後となるように設定した（ＩＰＡＡｍ及び
ＢＭＡの全モノマーのモル濃度に対するＭＰＡのモル濃
度の比は、0.022 とした）以外は合成例１と同様にして
ＩＰＡＡｍ−ＢＭＡコオリゴマーを合成した。

【００４４】各モノマーとＭＰＡの使用量、収量及び収
率を表３に示す。

【００４５】

【表３】

【００４６】分子量等の分析結果を表４に示す。

【００４７】

【表４】＊：３回の平均 (2) ＩＰＡＡｍ−親水性モノマー・コオリゴマーの合
成原料モノマーとして表５に示す量のＩＰＡＡｍ及びＮ，
Ｎ−ジメチルアクリルアミド（以下「ＤＭＡＡｍ」とい
う。）を用い、各モノマーとＭＰＡの比を、得られるコ
オリゴマーの分子量が6,000 前後となるように設定した
（ＩＰＡＡｍ及びＤＭＡＡｍの全モノマーのモル濃度に
対するＭＰＡのモル濃度の比は、0.022とした）以外は
合成例１と同様にしてＩＰＡＡｍ−ＤＭＡＡｍコオリゴ
マーを合成した。

【００４８】各モノマーとＭＰＡの使用量、収量及び収
率を表５に示す。

【００４９】

【表５】

【００５０】分子量等の分析結果を表６に示す。

【００５１】

【表６】＊：３回の平均 (3) 水溶液中におけるオリゴマーの感温性 (1) で得られたＩＰＡＡｍ−ＢＭＡコオリゴマー水溶液
の温度による透過率の変化を図５に、(2) で得られたＩ
ＰＡＡｍ−ＤＭＡＡｍコオリゴマー水溶液の温度による
透過率の変化を図６に示す。

【００５２】図５及び６から、用いるオリゴマーをＢＭ
Ａ等の疎水性モノマーとのコオリゴマーとし、該疎水性
モノマーの比率を高めることによりＬＣＳＴを低温側に
シフトさせることができ、また用いるオリゴマーをＤＭ
ＡＡｍ等の親水性モノマーとのコオリゴマーとし、該親
水性モノマーの比率を高めることによりＬＣＳＴを高温
側にシフトさせることができ、これによりＬＣＳＴを制
御することができることがわかる。

【００５３】（実施例２）生理活性物質−ＩＰＡＡｍ
コオリゴマー複合体の製造実施例１と同様にして、合成例２(1) で得たＩＰＡＡｍ
−ＢＭＡコオリゴマーIBc-3（ＬＣＳＴ：28℃）とウシ
フィブリノーゲンとの複合体、及び合成例２(2) で得た
ＩＰＡＡｍ−ＤＭＡＡｍコオリゴマー IDc-5（ＬＣＳ
Ｔ：34℃）とウシアルブミンとの複合体を製造した。ウ
シフィブリノーゲンと IBc-3のモル比は１：80、ウシア
ルブミンと IDc-5のモル比は１：20とした。なお、活性
化オリゴマーと生理活性物質との複合体形成反応の溶媒
としては水を用いた。

【００５４】反応終了後、実施例１と同様にして、透
析、凍結乾燥を行い複合体を得た。得られたウシフィブ
リノーゲン−IBc-3 複合体（Ｆ−(IBc-3))及びウシアル
ブミン−IDc-5 複合体（Ａ−(IDc-5))それぞれ 0.1ｇず
つを超純水10mlに混合・溶解した。この水溶液をサンプ
ル管に入れ恒温槽中で各温度において５分間保温し、紫
外分光光度計（島津 UV-240)により500nm の透過率を測
定した。結果を図７に示す。

【００５５】29℃付近で白濁・沈殿を生じた。これを激
しく振盪した後、30℃で遠心し、上清を分離・濾過し
た。沈殿物は凍結乾燥した。濾液は、再度恒温槽中で保
温したところ、35℃付近で再び白濁した。この沈殿物も
遠心後、濾取して凍結乾燥した。

【００５６】最初の沈殿物はトロンビン・クロッティン
グ法によりフィブリノーゲンであること、また２回目の
沈殿物はブロモクレゾール−グリーン法によりアルブミ
ンであることを確認した。双方の混入は測定上無視でき
るほど少なかった。以上のことから、ＩＰＡＡｍ−疎水
性モノマー・コオリゴマー、ＩＰＡＡｍ−親水性モノマ
ー・コオリゴマーを導入した蛋白質は、温度応答性生理
活性物質−オリゴマー複合体として機能し、混合液中か
らでも、その温度応答性に従って、順に析出・沈殿し、
遠心分離及び濾過により回収が可能であることがわか
る。

【００５７】（実施例３）リパーゼ−ＩＰＡＡｍコオ
リゴマー複合体の製造 (1) リパーゼ修飾 0.1Mリン酸緩衝化食塩水(pH 7.4)20mlにブタ膵臓由来の
リパーゼ（和光純薬）50mgを溶解後、合成例２(2) で得
たＩＰＡＡｍ−ＤＭＡＡｍコオリゴマーIDc-10（ＬＣＳ
Ｔ：37℃）をリパーゼの重量比で10倍量又は20倍量溶解
し、４℃で攪拌しながら水溶性カルボジイミド水溶液を
滴下し、同温で４時間反応させた。得られた反応液を精
製水に対して透析（４℃、24時間）後、限外濾過（４
℃）により精製した後、凍結乾燥してリパーゼ−IDc-10
複合体（以下、IDc-10をリパーゼの重量比で10倍量用い
て得られた複合体を「Ｌ−(IDc-10)Ａ」、IDc-10をリパ
ーゼの重量比で20倍量用いて得られた複合体を「Ｌ−(I
Dc-10)Ｂ」という。）を得た。なお、水溶性カルボジイ
ミドとしては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩を用い、その水溶液の濃
度はＬ−(IDc-10)Ａでは2.0mg／ml、Ｌ−(IDc-10)Ｂで
は4.0mg／mlであり、使用量はいずれも８mlとした。

【００５８】得られたＬ−(IDc-10)Ａ及びＬ−(IDc-10)
Ｂ、並びに原料のIDc-10及び未修飾リパーゼそれぞれ
0.1ｇずつを超純水10mlに溶解し、透過用セルに入れ恒
温槽中で各温度において５分間保温し、紫外分光光度計
（島津 UV-240)により500nm の透過率を測定した。結果
を図８に示す。図８から、IDc-10で修飾されたリパーゼ
Ｌ−(IDc-10)Ａ及びＬ−(IDc-10)Ｂは37℃で相転移を示
す蛋白質ハイブリッドであることがわかる。

【００５９】(2) 酵素活性の測定 IDc-10で修飾されたリパーゼＬ−(IDc-10)Ａ及びＬ−(I
Dc-10)Ｂ、並びに原料の未修飾リパーゼの酵素活性を以
下のようにして測定した。オリーブ油エマルジョンを基
質として¹⁾、32℃で１時間攪拌後、エタノール５mlで反
応を停止させ、遊離脂肪酸をフェノールフタレインを指
示薬として 0.001Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定し
た。 1)精製水 3.8ml＋酵素溶液 0.2ml＋オリーブ油エマルジ
ョン²⁾2ml＋バルビタール緩衝液³⁾1ml 2)5w/v％アラビアゴム水溶液50ml＋オリーブ油25ml＋2w
/v％安息香酸ナトリウム水溶液 5ml＋精製水20mlを20分
間攪拌した後、用いた。 3)バルビタールナトリウム 1.45g＋精製水20ml＋1mol/l
塩酸2.94mlを精製水で全量を100ml とした。結果を図９に示す。IDc-10で修飾されたリパーゼＬ−(I
Dc-10)Ａ及びＬ−(IDc-10)Ｂ、並びに未修飾リパーゼの
活性は、酵素濃度（Lowry 法により測定）に比例した。

【００６０】また、Ｌ−(IDc-10)Ａ及び未修飾リパーゼ
の酵素濃度をそれぞれ0.4mg・cm^-3になるように調整
し、酵素活性の温度依存性を調べたところ未修飾リパー
ゼは37℃で酵素活性最大を示したのに対して、Ｌ−(IDc
-10)Ａは37℃で不溶化し、活性をほとんど示さなかった
（図10）。以上のことから、本発明による酵素−オリゴ
マー複合体は、反応後に相転移させて、生成物と酵素を
分離するシステムとして利用できることがわかる。

【００６１】

【発明の効果】本発明の生理活性物質−オリゴマー複合
体は、温度応答性を有し、ＬＣＳＴ以下の温度で均一系
反応が可能であり、またＬＣＳＴ以上で不溶化するの
で、容易に反応生成物と分離することができる。更に、
本発明の生理活性物質−オリゴマー複合体は、末端に官
能基を有するオリゴマーを用いているため、従来の１本
の高分子鎖中に多くの結合点を持つランダムコポリマー
を用いたものと異なり、不必要な架橋による凝集、生理
活性物質の活性低下等の欠点を有さず、また生理活性物
質に対して定量的に導入することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＰＡＡｍオリゴマー水溶液の温度による透過
率の変化を示す図である。

【図２】ＩＰＡＡｍオリゴマーの水溶液濃度による透過
率の変化を示す図である。

【図３】ＩＰＡＡｍオリゴマー希薄水溶液の遠心による
透過率の変化を示す図である。

【図４】コラーゲン−Ic-50 複合体水溶液の温度による
透過率の変化を示す図である。

【図５】ＩＰＡＡｍ−ＢＭＡコオリゴマー水溶液の温度
による透過率の変化を示す図である。

【図６】ＩＰＡＡｍ−ＤＭＡＡｍコオリゴマー水溶液の
温度による透過率の変化を示す図である。

【図７】ウシフィブリノーゲン−IBc-3 複合体（Ｆ−(I
Bc-3))及びウシアルブミン−IDc-5 複合体（Ａ−(IDc-
5))混合水溶液の温度による透過率の変化を示す図であ
る。

【図８】Ｌ−(IDc-10)Ａ、Ｌ−(IDc-10)Ｂ、IDc-10及び
未修飾リパーゼのそれぞれの水溶液の温度による透過率
の変化を示す図である。

【図９】Ｌ−(IDc-10)Ａ、Ｌ−(IDc-10)Ｂ及び未修飾リ
パーゼの酵素濃度による活性の変化を示す図である。

【図１０】Ｌ−(IDc-10)Ａ及び未修飾リパーゼの酵素活
性の温度依存性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生理活性物質と分子量 1,000〜80,000の
末端に官能基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド
ホモオリゴマーとの複合体。
【請求項２】末端に官能基を有するＮ−イソプロピル
アクリルアミドホモオリゴマーの官能基がカルボキシル
基である請求項１記載の複合体。
【請求項３】末端に官能基を有するＮ−イソプロピル
アクリルアミドホモオリゴマーが、次式（Ｉ）：【化１】で示される繰り返し単位からなる分子量 1,000〜80,000
のオリゴマーであって、末端の一方が水素原子で、他方
が次式（II）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるオリゴマーである請求項１記載の複
合体。
【請求項４】末端に官能基を有するＮ−イソプロピル
アクリルアミドホモオリゴマーが、次式 (III)：【化２】（式中、ｎは10〜700 の整数を表す。）で示されるオリ
ゴマーである請求項１記載の複合体。
【請求項５】生理活性物質と、分子量 1,000〜80,000
の末端に官能基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドと親水性モノマー又は疎水性モノマーとのコオリゴマ
ーとの複合体。
【請求項６】末端に官能基を有するＮ−イソプロピル
アクリルアミドと親水性モノマーとのコオリゴマーが、
次式（Ｉ）：【化３】で示される構造単位と、次式（IV）：【化４】で示される構造単位が 100〜80：０〜20のモル比で線状
に不規則に配列した分子量 1,000〜80,000のオリゴマー
であって、末端の一方が水素原子で、他方が次式（I
I）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるオリゴマーである請求項５記載の複
合体。
【請求項７】末端に官能基を有するＮ−イソプロピル
アクリルアミドと疎水性モノマーとのコオリゴマーが、
次式（Ｉ）：【化５】で示される構造単位と、次式（Ｖ）：【化６】で示される構造単位が 100〜90：０〜10のモル比で線状
に不規則に配列した分子量 1,000〜80,000のオリゴマー
であって、末端の一方が水素原子で、他方が次式（I
I）： -SCH₂CH₂COOH （II）で示される基であるオリゴマーである請求項５記載の複
合体。
【請求項８】分子量 1,000〜80,000の末端にカルボキ
シル基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミドホモオ
リゴマーを、カルボジイミド類の存在下、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドと反応させて活性化オリゴマーとした
後、アミノ基を有する生理活性物質と反応させることを
特徴とする生理活性物質−オリゴマー複合体の製造法。
【請求項９】分子量 1,000〜80,000の末端にカルボキ
シル基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミドと親水
性モノマー又は疎水性モノマーとのコオリゴマーを、カ
ルボジイミド類の存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドと反応させて活性化オリゴマーとした後、アミノ基を
有する生理活性物質と反応させることを特徴とする生理
活性物質−オリゴマー複合体の製造法。
【請求項10】分子量 1,000〜80,000の末端にカルボキ
シル基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミドと親水
性モノマー又は疎水性モノマーとのコオリゴマーを、水
溶性カルボジイミド類の存在下、アミノ基を有する生理
活性物質と反応させることを特徴とする生理活性物質−
オリゴマー複合体の製造法。