JPH06118087A - メトミオグロビンの還元剤 - Google Patents
メトミオグロビンの還元剤Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 正常人の筋肉組織中のメトミオグロビンレダ
クターゼ量を容易に検出することができる低分子量のメ
トミオグロビンの還元剤を提供する。 【構成】 非陰イオン性で、分子量が１０００乃至３０
００の範囲にあり、還元至適ｐＨが約６であることを特
徴とするメトミオグロビンの還元剤。
クターゼ量を容易に検出することができる低分子量のメ
トミオグロビンの還元剤を提供する。 【構成】 非陰イオン性で、分子量が１０００乃至３０
００の範囲にあり、還元至適ｐＨが約６であることを特
徴とするメトミオグロビンの還元剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はメトミオグロビンの還元
剤に係り、特に低分子量であるメトミオグロビン還元剤
に関する。
剤に係り、特に低分子量であるメトミオグロビン還元剤
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミオグロビンは、ヘモグロビンと同様に
酸素を可逆的に結合するが、自酸化あるいは薬物酸化に
よって２価鉄状態から３価鉄状態のメトミオグロビンに
されると、生理的な酸素貯蔵体として機能を失う。そし
て、生成したメトミオグロビンを還元する還元剤とし
て、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンヌクレオチドの
還元型）−メトミオグロビンレダクターゼおよびＮＡＤ
ＰＨ（ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸の還
元型）−メトミオグロビンレダクターゼとよばれる酵素
が存在する。このようなＮＡＤＨ−メトミオグロビンレ
ダクターゼおよびＮＡＤＰＨ−メトミオグロビンレダク
ターゼは、分子量が３０，０００〜５０，０００程度で
あり、還元至適ｐＨが４〜５である。
酸素を可逆的に結合するが、自酸化あるいは薬物酸化に
よって２価鉄状態から３価鉄状態のメトミオグロビンに
されると、生理的な酸素貯蔵体として機能を失う。そし
て、生成したメトミオグロビンを還元する還元剤とし
て、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンヌクレオチドの
還元型）−メトミオグロビンレダクターゼおよびＮＡＤ
ＰＨ（ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸の還
元型）−メトミオグロビンレダクターゼとよばれる酵素
が存在する。このようなＮＡＤＨ−メトミオグロビンレ
ダクターゼおよびＮＡＤＰＨ−メトミオグロビンレダク
ターゼは、分子量が３０，０００〜５０，０００程度で
あり、還元至適ｐＨが４〜５である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ようにＮＡＤＨ−メトミオグロビンレダクターゼおよび
ＮＡＤＰＨ−メトミオグロビンレダクターゼは、分子量
が大きいため、筋肉組織が崩壊、壊死を起こさない限
り、血中に容易に放出されないとものと考えられる。し
たがって、長時間の運動負荷等によりメトミオグロビン
の生成量が増大し、これにともなって、筋肉組織中のメ
トミオグロビンレダクターゼ量が増大したことを容易に
検出することができないという問題があった。
ようにＮＡＤＨ−メトミオグロビンレダクターゼおよび
ＮＡＤＰＨ−メトミオグロビンレダクターゼは、分子量
が大きいため、筋肉組織が崩壊、壊死を起こさない限
り、血中に容易に放出されないとものと考えられる。し
たがって、長時間の運動負荷等によりメトミオグロビン
の生成量が増大し、これにともなって、筋肉組織中のメ
トミオグロビンレダクターゼ量が増大したことを容易に
検出することができないという問題があった。
【０００４】本発明は、このような事情に鑑みてなされ
たものであり、正常人の筋肉組織中のメトミオグロビン
レダクターゼ量を容易に検出することができる低分子量
のメトミオグロビンの還元剤を提供することを目的とす
る。
たものであり、正常人の筋肉組織中のメトミオグロビン
レダクターゼ量を容易に検出することができる低分子量
のメトミオグロビンの還元剤を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明のメトミオグロビ
ンの還元剤は、非陰イオン性で、分子量が１０００乃至
３０００の範囲にあり、還元至適ｐＨが約６であること
を特徴とする。
ンの還元剤は、非陰イオン性で、分子量が１０００乃至
３０００の範囲にあり、還元至適ｐＨが約６であること
を特徴とする。
【０００６】このようなメトミオグロビンの還元剤は、
例えば動物の心筋から得ることができる。これを、図１
を参照して説明する。先ず、動物の心筋を所定の抽出用
液に浸漬して得た浸出液から固形分を除去し、その後、
遠心分離を行って得た上清を多孔フィルタを用いて濾過
する。この濾過液から、限外濾過により分子量１０，０
００以下の画分を分離し、この画分から分子量３，００
０以下の画分を分離し、さらに、この画分から分子量
１，０００以上の画分を分離する。そして、蒸留水によ
り洗浄した後、再度、限外濾過により分子量３，０００
以下の画分を分離し、凍結乾燥する。その後、陰イオン
高性能液体クロマトグラフィを用いて分離し、第３番目
のフラクション（約２．９分で現れるピーク）を分離し
て還元剤が得られる。
例えば動物の心筋から得ることができる。これを、図１
を参照して説明する。先ず、動物の心筋を所定の抽出用
液に浸漬して得た浸出液から固形分を除去し、その後、
遠心分離を行って得た上清を多孔フィルタを用いて濾過
する。この濾過液から、限外濾過により分子量１０，０
００以下の画分を分離し、この画分から分子量３，００
０以下の画分を分離し、さらに、この画分から分子量
１，０００以上の画分を分離する。そして、蒸留水によ
り洗浄した後、再度、限外濾過により分子量３，０００
以下の画分を分離し、凍結乾燥する。その後、陰イオン
高性能液体クロマトグラフィを用いて分離し、第３番目
のフラクション（約２．９分で現れるピーク）を分離し
て還元剤が得られる。
【０００７】このようにして得られるメトミオグロビン
の還元剤は、限外濾過の操作手順から明らかなように、
分子量は１０００乃至３０００の範囲にある。さらに、
陰イオン高性能液体クロマトグラフィによる分離におい
て、非吸着画分に含まれることより、非陰イオン性であ
ると言える。また、メトミオグロビンを還元する際の至
適ｐＨは、従来知られているメトミオグロビンレダクタ
ーゼの還元至適ｐＨが４〜５であるのに対して、約６と
高い数値を示す。
の還元剤は、限外濾過の操作手順から明らかなように、
分子量は１０００乃至３０００の範囲にある。さらに、
陰イオン高性能液体クロマトグラフィによる分離におい
て、非吸着画分に含まれることより、非陰イオン性であ
ると言える。また、メトミオグロビンを還元する際の至
適ｐＨは、従来知られているメトミオグロビンレダクタ
ーゼの還元至適ｐＨが４〜５であるのに対して、約６と
高い数値を示す。
【０００８】このため、従来から知られているＮＡＤＨ
−メトミオグロビンレダクターゼおよびＮＡＤＰＨ−メ
トミオグロビンレダクターゼが、分子量が大きいため、
筋肉組織が崩壊、壊死を起こさない限り、血中に容易に
放出されないのに対し、本発明のメトミオグロビンの還
元剤は、筋肉組織中のメトミオグロビンレダクターゼ量
が増大するに従い血中に放出される。したがって、本発
明のメトミオグロビンの還元剤の血中あるいは尿中の濃
度を測定することにより、長時間の運動負荷状態、アル
コール中毒状態、一酸化炭素中毒状態等の診断を行うこ
とができる。
−メトミオグロビンレダクターゼおよびＮＡＤＰＨ−メ
トミオグロビンレダクターゼが、分子量が大きいため、
筋肉組織が崩壊、壊死を起こさない限り、血中に容易に
放出されないのに対し、本発明のメトミオグロビンの還
元剤は、筋肉組織中のメトミオグロビンレダクターゼ量
が増大するに従い血中に放出される。したがって、本発
明のメトミオグロビンの還元剤の血中あるいは尿中の濃
度を測定することにより、長時間の運動負荷状態、アル
コール中毒状態、一酸化炭素中毒状態等の診断を行うこ
とができる。
【０００９】
【実施例】図１に示される操作手順に従って、牛の心筋
（約１ｋｇ）を、０．１モルのＫＣｌにtris−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）を３０ミリモル含有する溶液（１．５
ｌ、４℃）に一晩浸漬し、浸出液をガーゼ、濾紙に通し
て固形分を除去した。次に、この浸出液を下記の条件で
遠心分離し、上清を回収した。
（約１ｋｇ）を、０．１モルのＫＣｌにtris−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）を３０ミリモル含有する溶液（１．５
ｌ、４℃）に一晩浸漬し、浸出液をガーゼ、濾紙に通し
て固形分を除去した。次に、この浸出液を下記の条件で
遠心分離し、上清を回収した。
【００１０】・遠心力 ： １４０００×重力 ・分離時間 ： ３０分間 ・液温度 ： ４℃ その後、遠心分離により得られた上清を、１．２μｍ，
０．６５μｍ，０．４５μｍ，０．２μｍの各細孔を有
する多孔フィルタを用いて順次濾過した。さらに、得た
濾過液に対して限外濾過を繰り返し、先ず分子量１０，
０００以下の画分を分離し、この画分から分子量３，０
００以下の画分を分離し、さらに、この画分から分子量
１，０００以上の画分を分離した。次に、蒸留水により
洗浄した後、再度、限外濾過により分子量３，０００以
下の画分を分離し、凍結乾燥した。
０．６５μｍ，０．４５μｍ，０．２μｍの各細孔を有
する多孔フィルタを用いて順次濾過した。さらに、得た
濾過液に対して限外濾過を繰り返し、先ず分子量１０，
０００以下の画分を分離し、この画分から分子量３，０
００以下の画分を分離し、さらに、この画分から分子量
１，０００以上の画分を分離した。次に、蒸留水により
洗浄した後、再度、限外濾過により分子量３，０００以
下の画分を分離し、凍結乾燥した。
【００１１】その後、この分子量１０００〜３０００の
画分を下記の条件で陰イオン高性能液体クロマトグラフ
ィを用いて分離し、第３番目のフラクション（図２に示
されるチャートのＡのピーク（約２．９分で現れるピー
ク））を分離して回収して本発明のメトミオグロビンの
還元剤を得た。
画分を下記の条件で陰イオン高性能液体クロマトグラフ
ィを用いて分離し、第３番目のフラクション（図２に示
されるチャートのＡのピーク（約２．９分で現れるピー
ク））を分離して回収して本発明のメトミオグロビンの
還元剤を得た。
【００１２】・陰イオン交換体 ： トーソー（株）
製 ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−２５
Ｗ） ・カラム ： ＩＤ． ４．６ mm ×２５cm ・溶離液 ： ０．０５モル クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ６） ・溶離液の流速 ： １．５ml／min. ・検出波長 ： ２６０nm 上述のようにして得られたメトミオグロビンの還元剤に
ついて、下記の条件で吸光度を測定し、結果を図３に示
した。
製 ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−２５
Ｗ） ・カラム ： ＩＤ． ４．６ mm ×２５cm ・溶離液 ： ０．０５モル クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ６） ・溶離液の流速 ： １．５ml／min. ・検出波長 ： ２６０nm 上述のようにして得られたメトミオグロビンの還元剤に
ついて、下記の条件で吸光度を測定し、結果を図３に示
した。
【００１３】・測定装置 ： 分光光度計 ・走査速度 ： ２００nm／min. 図３に示されるように、得られたメトミオグロビンの還
元剤は２６０nmに吸収を有する。
元剤は２６０nmに吸収を有する。
【００１４】また、得られたメトミオグロビンの還元剤
について、以下のようにして活性を測定した。 （１）先ず、以下のようにジアホラーゼ活性を測定し
た。メトミオグロビンの還元剤を含む緩衝液８９０μｌ
に５００μモル2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ルを１００μｌ加え、波長６００nmで安定するまで吸光
度を測定し、その後、１０ｍモルＮＡＤＰＨまたはＮＡ
ＤＨを１０μｌ加えて、反応開始から１０分間測定し
た。
について、以下のようにして活性を測定した。 （１）先ず、以下のようにジアホラーゼ活性を測定し
た。メトミオグロビンの還元剤を含む緩衝液８９０μｌ
に５００μモル2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ルを１００μｌ加え、波長６００nmで安定するまで吸光
度を測定し、その後、１０ｍモルＮＡＤＰＨまたはＮＡ
ＤＨを１０μｌ加えて、反応開始から１０分間測定し
た。
【００１５】図４に示されるグラフは、メトミオグロビ
ンの還元剤＋ＮＡＤＰＨにおける１０分間の吸光度の低
下度合いを示すものであり、図５に示されるグラフは、
ＮＡＤＰＨ単独の場合の１０分間の吸光度の低下度合い
を示すものである。この場合、ジアホラーゼ活性は吸光
度の低下量が大きい程高いと言えるが、図４および図５
から明らかのように、本発明のメトミオグロビンの還元
剤は高いジアホラーゼ活性（還元力）を具備している。 （２）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにメトミオグロビン（met Ｍｂ）を使用
し、測定波長を５８０nmとした他は、上記（１）と同様
にして吸光度を測定した。この場合、吸光度が上昇する
程、還元力は高いと言える。 （３）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにメトヘモグロビン（met Ｈｂ）を使用
し、測定波長を５７５nmとした他は、上記（１）と同様
にして吸光度を測定した。この場合も、吸光度が上昇す
る程、還元力は高いと言える。 （４）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにチトクロームＣを使用し、測定波長を４
５０nmとした他は、上記（１）と同様にして吸光度を測
定した。この場合も、吸光度が上昇する程、還元力は高
いと言える。
ンの還元剤＋ＮＡＤＰＨにおける１０分間の吸光度の低
下度合いを示すものであり、図５に示されるグラフは、
ＮＡＤＰＨ単独の場合の１０分間の吸光度の低下度合い
を示すものである。この場合、ジアホラーゼ活性は吸光
度の低下量が大きい程高いと言えるが、図４および図５
から明らかのように、本発明のメトミオグロビンの還元
剤は高いジアホラーゼ活性（還元力）を具備している。 （２）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにメトミオグロビン（met Ｍｂ）を使用
し、測定波長を５８０nmとした他は、上記（１）と同様
にして吸光度を測定した。この場合、吸光度が上昇する
程、還元力は高いと言える。 （３）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにメトヘモグロビン（met Ｈｂ）を使用
し、測定波長を５７５nmとした他は、上記（１）と同様
にして吸光度を測定した。この場合も、吸光度が上昇す
る程、還元力は高いと言える。 （４）色素（2.6-ジクロロフェノールインドフェノー
ル）の代わりにチトクロームＣを使用し、測定波長を４
５０nmとした他は、上記（１）と同様にして吸光度を測
定した。この場合も、吸光度が上昇する程、還元力は高
いと言える。
【００１６】（１）〜（４）において測定した結果か
ら、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨとの組み合わせによる本
発明のメトミオグロビンの還元剤の還元力を評価して下
記の表１に示した。
ら、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨとの組み合わせによる本
発明のメトミオグロビンの還元剤の還元力を評価して下
記の表１に示した。
【００１７】
【表１】 表１に示されるように、本発明のメトミオグロビンの還
元剤は、特にＮＡＤＰＨとの組み合わせにより、良好な
還元性を示す。
元剤は、特にＮＡＤＰＨとの組み合わせにより、良好な
還元性を示す。
【００１８】尚、上記のジアホラーゼ活性の測定におい
て使用する緩衝液を変えてｐＨを４〜７まで変化させた
ところ、ｐＨ６においてジアホラーゼ活性が最も高いも
のとなった。したがって、本発明のメトミオグロビンの
還元剤は、還元至適ｐＨが約６であり、従来知られてい
るメトミオグロビンレダクターゼの還元至適ｐＨ４〜５
に対して高い数値を示した。
て使用する緩衝液を変えてｐＨを４〜７まで変化させた
ところ、ｐＨ６においてジアホラーゼ活性が最も高いも
のとなった。したがって、本発明のメトミオグロビンの
還元剤は、還元至適ｐＨが約６であり、従来知られてい
るメトミオグロビンレダクターゼの還元至適ｐＨ４〜５
に対して高い数値を示した。
【００１９】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明のメトミオ
グロビンの還元剤は低分子量であり、筋肉組織が崩壊、
壊死を起こさない場合であっても、筋肉組織中のメトミ
オグロビンレダクターゼ量が増大するに従い血中に放出
される。したがって、本発明のメトミオグロビンの還元
剤の血中あるいは尿中の濃度を測定することにより、筋
肉組織中のメトミオグロビンレダクターゼ量を容易に検
出することができ、長時間の運動負荷状態、アルコール
中毒状態、一酸化炭素中毒状態等の診断を行うことがで
きる。
グロビンの還元剤は低分子量であり、筋肉組織が崩壊、
壊死を起こさない場合であっても、筋肉組織中のメトミ
オグロビンレダクターゼ量が増大するに従い血中に放出
される。したがって、本発明のメトミオグロビンの還元
剤の血中あるいは尿中の濃度を測定することにより、筋
肉組織中のメトミオグロビンレダクターゼ量を容易に検
出することができ、長時間の運動負荷状態、アルコール
中毒状態、一酸化炭素中毒状態等の診断を行うことがで
きる。
【図１】本発明のメトミオグロビンの還元剤を得るため
の操作手順を示す図である。
の操作手順を示す図である。
【図２】高性能液体クロマトグラフィにおけるチャート
を示す図である。
を示す図である。
【図３】本発明のメトミオグロビンの還元剤の２６０nm
における吸光度を示す図である。
における吸光度を示す図である。
【図４】本発明のメトミオグロビン還元剤とＮＡＤＰＨ
の組み合わせによる色素還元における波長６００nmでの
吸光度の低下を示す図である。
の組み合わせによる色素還元における波長６００nmでの
吸光度の低下を示す図である。
【図５】ＮＡＤＰＨのみによる色素還元における波長６
００nmでの吸光度の低下を示す図である。
００nmでの吸光度の低下を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
Claims (1)
- 【請求項１】 非陰イオン性で、分子量が１０００乃至
３０００の範囲にあり、還元至適ｐＨが約６であること
を特徴とするメトミオグロビンの還元剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26725192A JPH06118087A (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | メトミオグロビンの還元剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26725192A JPH06118087A (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | メトミオグロビンの還元剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06118087A true JPH06118087A (ja) | 1994-04-28 |
Family
ID=17442238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26725192A Pending JPH06118087A (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | メトミオグロビンの還元剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06118087A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3738304A1 (de) * | 1986-11-11 | 1988-05-26 | Laurel Bank Machine Co | Vorrichtung zum pruefen von banknoten |
| US4828243A (en) * | 1986-10-28 | 1989-05-09 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Accumulated bills delivering apparatus for bill receiving and dispensing machine |
| US4840368A (en) * | 1986-10-31 | 1989-06-20 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill containing box apparatus of bill receiving and dispensing machine |
| US4854452A (en) * | 1986-10-27 | 1989-08-08 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill receiving, discriminating, and dispensing machine |
| US4863038A (en) * | 1986-10-30 | 1989-09-05 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill receiving and dispensing machine |
-
1992
- 1992-10-06 JP JP26725192A patent/JPH06118087A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4854452A (en) * | 1986-10-27 | 1989-08-08 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill receiving, discriminating, and dispensing machine |
| US4828243A (en) * | 1986-10-28 | 1989-05-09 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Accumulated bills delivering apparatus for bill receiving and dispensing machine |
| US4863038A (en) * | 1986-10-30 | 1989-09-05 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill receiving and dispensing machine |
| US4840368A (en) * | 1986-10-31 | 1989-06-20 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill containing box apparatus of bill receiving and dispensing machine |
| DE3738304A1 (de) * | 1986-11-11 | 1988-05-26 | Laurel Bank Machine Co | Vorrichtung zum pruefen von banknoten |
| US4823393A (en) * | 1986-11-11 | 1989-04-18 | Laurel Bank Machines Co., Ltd. | Bill discriminating device |
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