JPH06121673A - Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞 - Google Patents
Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞Info
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- JPH06121673A JPH06121673A JP3133482A JP13348291A JPH06121673A JP H06121673 A JPH06121673 A JP H06121673A JP 3133482 A JP3133482 A JP 3133482A JP 13348291 A JP13348291 A JP 13348291A JP H06121673 A JPH06121673 A JP H06121673A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺
伝子を導入した形質転換細胞、該酵素のアミノ酸配列を
コードする塩基配列をもつΔ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡ及び該形質転換細胞を培養
してΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産
する方法。 【効果】Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺
伝子を導入した形質転換細胞を用いることにより、効率
よくΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を量産
することができる。該酵素は、例えばステロイド代謝関
連医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不活
化剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクロー
ナル抗体などの抗体作成用の抗原などとして有用であ
る。
伝子を導入した形質転換細胞、該酵素のアミノ酸配列を
コードする塩基配列をもつΔ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡ及び該形質転換細胞を培養
してΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産
する方法。 【効果】Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺
伝子を導入した形質転換細胞を用いることにより、効率
よくΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を量産
することができる。該酵素は、例えばステロイド代謝関
連医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不活
化剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクロー
ナル抗体などの抗体作成用の抗原などとして有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はΔ4−３−ケトステロイ
ド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞、Δ4
−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する実質
上純粋なＤＮＡ及びΔ4−３−ケトステロイド−５β−
還元酵素の製造方法に関するものである。さらに詳しく
いえば、本発明は、例えばステロイド代謝関連医薬品開
発のための材料、ステロイドホルモンの不活化剤、診断
薬としてのモノクローナル抗体やポリクローナル抗体な
どの抗体作成用の抗原などとして利用可能なΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素を、遺伝子組換え技術
により効率よく生産する形質転換細胞、ラット肝臓由来
のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素のアミノ
酸配列をコードする塩基配列をもつΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡ及び前記形質転換
細胞を用いて、効率よくΔ4−３−ケトステロイド−５
β−還元酵素を製造する方法に関するものである。
ド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞、Δ4
−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する実質
上純粋なＤＮＡ及びΔ4−３−ケトステロイド−５β−
還元酵素の製造方法に関するものである。さらに詳しく
いえば、本発明は、例えばステロイド代謝関連医薬品開
発のための材料、ステロイドホルモンの不活化剤、診断
薬としてのモノクローナル抗体やポリクローナル抗体な
どの抗体作成用の抗原などとして利用可能なΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素を、遺伝子組換え技術
により効率よく生産する形質転換細胞、ラット肝臓由来
のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素のアミノ
酸配列をコードする塩基配列をもつΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡ及び前記形質転換
細胞を用いて、効率よくΔ4−３−ケトステロイド−５
β−還元酵素を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】コレステロールは細胞内において、細胞
膜やオルガネラ膜などの構成成分をなしており、細胞の
生存上不可欠な物質であって、その８０〜９０％が肝臓
において胆汁酸に代謝され、肝汁中に排泄されるととも
に、副腎や性腺においてステロイドホルモンに転換され
様々な生理作用を及ぼしたのち、肝臓などで代謝され、
尿中に排泄されることが知られている。このようなコレ
ステロールからの胆汁酸代謝経路及びステロイドホルモ
ン合成経路においては、種々の酵素が関与しており、そ
の中で、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
は、ステロイド骨格の４位の二重結合をＡ／Ｂｃｉｓに
還元する反応を触媒する重要な酵素であることが知られ
ている［「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」第２４０巻、第
２３９６〜２４０１ページ（１９６５年）］。例えば、
反応式
膜やオルガネラ膜などの構成成分をなしており、細胞の
生存上不可欠な物質であって、その８０〜９０％が肝臓
において胆汁酸に代謝され、肝汁中に排泄されるととも
に、副腎や性腺においてステロイドホルモンに転換され
様々な生理作用を及ぼしたのち、肝臓などで代謝され、
尿中に排泄されることが知られている。このようなコレ
ステロールからの胆汁酸代謝経路及びステロイドホルモ
ン合成経路においては、種々の酵素が関与しており、そ
の中で、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
は、ステロイド骨格の４位の二重結合をＡ／Ｂｃｉｓに
還元する反応を触媒する重要な酵素であることが知られ
ている［「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」第２４０巻、第
２３９６〜２４０１ページ（１９６５年）］。例えば、
反応式
【化１】 （式中のＮＡＤＰＨ2及びＮＡＤＰは、それぞれニコチ
ンアデニンジヌクレオチドリン酸の還元型及び酸化型で
ある）で示されるように、Δ4−３−ケトステロイドと
ＮＡＤＰＨ2とから、３−ケト−５βＨ−ステロイドと
ＮＡＤＰとを生成する反応を触媒する。このΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素が触媒する反応として
は、
ンアデニンジヌクレオチドリン酸の還元型及び酸化型で
ある）で示されるように、Δ4−３−ケトステロイドと
ＮＡＤＰＨ2とから、３−ケト−５βＨ−ステロイドと
ＮＡＤＰとを生成する反応を触媒する。このΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素が触媒する反応として
は、
【化２】
【化３】 に示される種々の反応が例示される。このような性質を
有するΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素は、
例えばステロイド代謝関連医薬品開発のための材料、ス
テロイドホルモンの不活化剤、診断薬としてのモノクロ
ーナル抗体やポリクローナル抗体などの抗体作成用の抗
原などとして有用であることが期待される。診断薬とし
ては、例えばこのΔ4−３−ケトステロイド−５β−還
元酵素に対するモノクローナル抗体を用いて該酵素を測
定することにより、該酵素欠損症の診断が可能である。
このΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素は動物
の肝臓に分布していることが知られており、これまでラ
ット肝臓から抽出精製することが試みられている［「ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」第２５９巻、第７５１９〜７
５２４ページ（１９８４年）、同第２６０巻、第７１３
７〜７１４１ページ（１９８５年）］。しかしながら、
ラット肝臓から抽出する方法においては、生体内の他の
類似のきょう雑物を含有し、かつ得られるΔ4−３−ケ
トステロイド−５β−還元酵素の量が極めて少ないた
め、高純度標品を得ることが困難であり、したがって該
酵素を用いて、新しい医薬品や診断薬を開発する研究を
積極的に進めることができないのが実状である。そのた
め、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を効率
よく生産する微生物や動物細胞の開発が望まれていた。
有するΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素は、
例えばステロイド代謝関連医薬品開発のための材料、ス
テロイドホルモンの不活化剤、診断薬としてのモノクロ
ーナル抗体やポリクローナル抗体などの抗体作成用の抗
原などとして有用であることが期待される。診断薬とし
ては、例えばこのΔ4−３−ケトステロイド−５β−還
元酵素に対するモノクローナル抗体を用いて該酵素を測
定することにより、該酵素欠損症の診断が可能である。
このΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素は動物
の肝臓に分布していることが知られており、これまでラ
ット肝臓から抽出精製することが試みられている［「ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」第２５９巻、第７５１９〜７
５２４ページ（１９８４年）、同第２６０巻、第７１３
７〜７１４１ページ（１９８５年）］。しかしながら、
ラット肝臓から抽出する方法においては、生体内の他の
類似のきょう雑物を含有し、かつ得られるΔ4−３−ケ
トステロイド−５β−還元酵素の量が極めて少ないた
め、高純度標品を得ることが困難であり、したがって該
酵素を用いて、新しい医薬品や診断薬を開発する研究を
積極的に進めることができないのが実状である。そのた
め、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を効率
よく生産する微生物や動物細胞の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、新しい医薬品や診断薬の開発などに有用
なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を効率よ
く生産する微生物や動物細胞を開発し、これらを用いて
該酵素を量産する方法を提供することを目的としてなさ
れたものである。
事情のもとで、新しい医薬品や診断薬の開発などに有用
なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を効率よ
く生産する微生物や動物細胞を開発し、これらを用いて
該酵素を量産する方法を提供することを目的としてなさ
れたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は前記目的を達
成するために鋭意研究を重ねた結果、ラット肝細胞より
調製されたｍＲＮＡを基にして得られたｃＤＮＡライブ
ラリーの中から、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスク
リーニングし、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクター
を構築したのち、適当な細胞（微生物又は動物細胞）に
導入して形質転換細胞を作出し、これを培地で培養する
ことにより、該Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素を効率よく量産しうることを見い出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
成するために鋭意研究を重ねた結果、ラット肝細胞より
調製されたｍＲＮＡを基にして得られたｃＤＮＡライブ
ラリーの中から、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスク
リーニングし、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクター
を構築したのち、適当な細胞（微生物又は動物細胞）に
導入して形質転換細胞を作出し、これを培地で培養する
ことにより、該Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素を効率よく量産しうることを見い出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、Δ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素を発現するＤＮＡを有する組換
えプラスミドによって形質転換された細胞であることを
特徴とするΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
を生産する実質上純粋な細胞、図１で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするΔ
4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する実
質上純粋なＤＮＡ、及び前記の形質転換された細胞であ
るΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産す
る実質上純粋な細胞を培地に培養し、次いでその培養物
からΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を採取
することを特徴とするΔ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素の製造方法を提供するものである。
ロイド−５β−還元酵素を発現するＤＮＡを有する組換
えプラスミドによって形質転換された細胞であることを
特徴とするΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
を生産する実質上純粋な細胞、図１で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするΔ
4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する実
質上純粋なＤＮＡ、及び前記の形質転換された細胞であ
るΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産す
る実質上純粋な細胞を培地に培養し、次いでその培養物
からΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を採取
することを特徴とするΔ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素の製造方法を提供するものである。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を
生産する形質転換細胞を作出するのに用いられるΔ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する遺伝子
ＤＮＡは、肝細胞、例えばラット肝細胞より調製された
ｍＲＮＡを基にして得られるｃＤＮＡライブラリーの中
からスクリーニングすることにより得ることができる。
おいて、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を
生産する形質転換細胞を作出するのに用いられるΔ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する遺伝子
ＤＮＡは、肝細胞、例えばラット肝細胞より調製された
ｍＲＮＡを基にして得られるｃＤＮＡライブラリーの中
からスクリーニングすることにより得ることができる。
【０００７】次に、このΔ4−３−ケトステロイド−５
β−還元酵素を発現する遺伝子ＤＮＡを得る具体的な方
法について例示すると、まず、ラット肝細胞からｍＲＮ
Ａを調製する。このｍＲＮＡを調製する方法としては、
例えば摘出したラット肝組織を破砕したのち、これにグ
アニジウム液などを加えてホモジェナイズ処理を行い、
次いで高分子ＤＮＡを分断し、さらに、適当な処理を施
して全ＲＮＡを回収する。次に、これをオリゴ（ｄＴ)
−セルロースカラムに付して、ｐｏｌｙＡテールをもつ
ＲＮＡのみを溶出させて、ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを調製
する方法を用いることができる。
β−還元酵素を発現する遺伝子ＤＮＡを得る具体的な方
法について例示すると、まず、ラット肝細胞からｍＲＮ
Ａを調製する。このｍＲＮＡを調製する方法としては、
例えば摘出したラット肝組織を破砕したのち、これにグ
アニジウム液などを加えてホモジェナイズ処理を行い、
次いで高分子ＤＮＡを分断し、さらに、適当な処理を施
して全ＲＮＡを回収する。次に、これをオリゴ（ｄＴ)
−セルロースカラムに付して、ｐｏｌｙＡテールをもつ
ＲＮＡのみを溶出させて、ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを調製
する方法を用いることができる。
【０００８】次に、このようにして得られたｐｏｌｙ
（Ａ)+ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成するが、
それにはまず、該ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡに、例えばｄＮ
ＴＰs(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量
混合物）とオリゴ（ｄＴ）と逆転写酵素とを作用させて
第一鎖を合成したのち、ＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメ
ラーゼＩで第二鎖を合成する。次にＥｃｏＲＩメチラー
ゼで遺伝子に内在するＥｃｏＲＩサイトをメチル化した
のち、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とな
し、次いでこの両末端にＥｃｏＲＩリンカーを付着させ
てから、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、これを電気泳動
にかけて、ｃＤＮＡをサイズ分画するとともに、過剰に
加えたリンカーを除去する。
（Ａ)+ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成するが、
それにはまず、該ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡに、例えばｄＮ
ＴＰs(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量
混合物）とオリゴ（ｄＴ）と逆転写酵素とを作用させて
第一鎖を合成したのち、ＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメ
ラーゼＩで第二鎖を合成する。次にＥｃｏＲＩメチラー
ゼで遺伝子に内在するＥｃｏＲＩサイトをメチル化した
のち、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とな
し、次いでこの両末端にＥｃｏＲＩリンカーを付着させ
てから、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、これを電気泳動
にかけて、ｃＤＮＡをサイズ分画するとともに、過剰に
加えたリンカーを除去する。
【０００９】次いでこのようにして得られたｃＤＮＡを
用いて遺伝子ライブラリーを作成し、その中から目的遺
伝子ＤＮＡをスクリーニングするが、その方法について
は特に制限はなく、従来慣用されている方法を用いるこ
とができる。例えばｍＲＮＡを基にして得られた該ｃＤ
ＮＡをクローニング用ベンターに連結させ、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作成する。一方、Δ4−３−ケトステロイ
ド−５β−還元酵素のポリクローナル抗体や、該酵素の
アミノ酸配列におけるある部分の塩基配列に相当する１
５〜２５塩基長のアイソートプや非放射性化合物で標識
されたＤＮＡプローブを作成し、これらを用いて、該ｃ
ＤＮＡライブラリーの中から目的遺伝子をスクリーニン
グすればよい。このｃＤＮＡライブラリーとしては、市
販品のラット肝ｃＤＮＡライブラリーを用いることもで
きる。
用いて遺伝子ライブラリーを作成し、その中から目的遺
伝子ＤＮＡをスクリーニングするが、その方法について
は特に制限はなく、従来慣用されている方法を用いるこ
とができる。例えばｍＲＮＡを基にして得られた該ｃＤ
ＮＡをクローニング用ベンターに連結させ、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作成する。一方、Δ4−３−ケトステロイ
ド−５β−還元酵素のポリクローナル抗体や、該酵素の
アミノ酸配列におけるある部分の塩基配列に相当する１
５〜２５塩基長のアイソートプや非放射性化合物で標識
されたＤＮＡプローブを作成し、これらを用いて、該ｃ
ＤＮＡライブラリーの中から目的遺伝子をスクリーニン
グすればよい。このｃＤＮＡライブラリーとしては、市
販品のラット肝ｃＤＮＡライブラリーを用いることもで
きる。
【００１０】次に本発明の実施例で用いた方法について
説明すると、クローニング用ベクターとしてファージベ
クターλｇｔ１１及びλＺＡＰを用い、前記ｃＤＮＡの
中からできるだけ大きいサイズのフラクションのｃＤＮ
Ａをこれらに連結し、λｇｔ１１ベクターに組み込んだ
ｃＤＮＡライブラリー及びλＺＡＰベクターに組み込ん
だｃＤＮＡライブラリーを作成した。そして、まずλｇ
ｔ１１ライブラリーを、あらかじめ用意していたポリク
ローナル抗体を用いてスクリーニングを行い、約１０
０,０００個のプラークより８個のポジティブプラーク
λ2、λ4、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13を得たの
ち、クローニングを行い、それぞれのクローンについ
て、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素標品の
リジルエンドペプチダーゼ処理により得られたＫ６ペプ
チドに対応する合成ＤＮＡをプローブとしてサザン・ブ
ロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行ったと
ころ、λ4を除くすべてのクローンに対して、１.８kbp
位置にハイブリダイズするバンドが検出されたことか
ら、λ4以外のクローンは該酵素の翻訳領域を少なくと
も一部は含んでいることが確認された。また、この１.
８kbpのｃＤＮＡインサートをプローブとしてラット肝
由来のｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡのノーザン・ブロット（Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行ったところ、該酵
素のｍＲＮＡのサイズは約３.５kbpであることが判明し
た。
説明すると、クローニング用ベクターとしてファージベ
クターλｇｔ１１及びλＺＡＰを用い、前記ｃＤＮＡの
中からできるだけ大きいサイズのフラクションのｃＤＮ
Ａをこれらに連結し、λｇｔ１１ベクターに組み込んだ
ｃＤＮＡライブラリー及びλＺＡＰベクターに組み込ん
だｃＤＮＡライブラリーを作成した。そして、まずλｇ
ｔ１１ライブラリーを、あらかじめ用意していたポリク
ローナル抗体を用いてスクリーニングを行い、約１０
０,０００個のプラークより８個のポジティブプラーク
λ2、λ4、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13を得たの
ち、クローニングを行い、それぞれのクローンについ
て、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素標品の
リジルエンドペプチダーゼ処理により得られたＫ６ペプ
チドに対応する合成ＤＮＡをプローブとしてサザン・ブ
ロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行ったと
ころ、λ4を除くすべてのクローンに対して、１.８kbp
位置にハイブリダイズするバンドが検出されたことか
ら、λ4以外のクローンは該酵素の翻訳領域を少なくと
も一部は含んでいることが確認された。また、この１.
８kbpのｃＤＮＡインサートをプローブとしてラット肝
由来のｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡのノーザン・ブロット（Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析を行ったところ、該酵
素のｍＲＮＡのサイズは約３.５kbpであることが判明し
た。
【００１１】次に、このｍＲＮＡのサイズと比較して、
得られたポジティブクローンのサイズは小さかったた
め、λ11のインサートをプローブとしてλＺＡＰライブ
ラリーのスクリーニングを行い、３'側に約１００bp長
いポジティブクローンＺ８を得た。しかしながら、この
Ｚ８のＤＮＡシーケンスより導かれたタンパクの分子量
は３４,０００となり、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素精製標品の分子量よりかなり小さく、またＣ
ＯＳ細胞にこのｃＤＮＡクローンＺ８をトランスフェク
トしたところ、目的の酵素タンパクの発現はみられなか
った。
得られたポジティブクローンのサイズは小さかったた
め、λ11のインサートをプローブとしてλＺＡＰライブ
ラリーのスクリーニングを行い、３'側に約１００bp長
いポジティブクローンＺ８を得た。しかしながら、この
Ｚ８のＤＮＡシーケンスより導かれたタンパクの分子量
は３４,０００となり、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素精製標品の分子量よりかなり小さく、またＣ
ＯＳ細胞にこのｃＤＮＡクローンＺ８をトランスフェク
トしたところ、目的の酵素タンパクの発現はみられなか
った。
【００１２】これらのことから、該ｃＤＮＡクローンＺ
８は不完全なクローンであると思われるので、次に、プ
ライマー・エクステンデッド（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅ
ｎｄｅｄ）ライブラリー及びランダム・ヘキサプライミ
ング（Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｐｒｉｍｉｎｇ）ライブ
ラリーをλ11インサートをプローブとしてスクリーニン
グを行い、８個のポジティブクローンＨ２３−１、Ｈ２
３−２、Ｈ２３−３、Ｈ２４１、Ｈ２５１、Ｅ２３、Ｅ
２４及びＥ４３を得た。これらの中でＨ２４１が最も長
い該酵素の翻訳領域をもっているので、このｃＤＮＡク
ローンＨ２４１をプラスミドｐＳＶＬに図３に示すよう
に組み込み、プラスミドｐＳＶ５β−２４１（当該プラ
スミドはエシェリヒア・コリＭＶ１１８４ｐＳＶ５β−
２４１として保持せしめた：ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１
９）から成る発現ベクターを構築したのち、ＣＯＳ細胞
に導入して形質転換された細胞ＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２
４１を作出し、培養したところ、得られたタンパク質は
図４の写真で示すように、Δ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素の抗体と反応することが確認され、また
アンドロステンジオンを基質として酵素活性を調べたと
ころ、明らかに酵素活性（比活性：２.５pmol／min／mg
タンパク）を示すことが確認された。
８は不完全なクローンであると思われるので、次に、プ
ライマー・エクステンデッド（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅ
ｎｄｅｄ）ライブラリー及びランダム・ヘキサプライミ
ング（Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｐｒｉｍｉｎｇ）ライブ
ラリーをλ11インサートをプローブとしてスクリーニン
グを行い、８個のポジティブクローンＨ２３−１、Ｈ２
３−２、Ｈ２３−３、Ｈ２４１、Ｈ２５１、Ｅ２３、Ｅ
２４及びＥ４３を得た。これらの中でＨ２４１が最も長
い該酵素の翻訳領域をもっているので、このｃＤＮＡク
ローンＨ２４１をプラスミドｐＳＶＬに図３に示すよう
に組み込み、プラスミドｐＳＶ５β−２４１（当該プラ
スミドはエシェリヒア・コリＭＶ１１８４ｐＳＶ５β−
２４１として保持せしめた：ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１
９）から成る発現ベクターを構築したのち、ＣＯＳ細胞
に導入して形質転換された細胞ＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２
４１を作出し、培養したところ、得られたタンパク質は
図４の写真で示すように、Δ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素の抗体と反応することが確認され、また
アンドロステンジオンを基質として酵素活性を調べたと
ころ、明らかに酵素活性（比活性：２.５pmol／min／mg
タンパク）を示すことが確認された。
【００１３】したがって、該ｃＤＮＡクローンＨ２４１
はΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現す
るＤＮＡであることが判明し、このものは、図１で表さ
れるアミノ酸配列をコードする図２で示される塩基配列
を有しており、この図２において、その５'側上流には
開始コドン、例えばＭｅｔをコードするＡＴＧを有して
いてもよいし、その３'側下流には終止コドン、例えば
ＴＧＡを有していてもよい。また配列表の配列番号１
に、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子
ＤＮＡの全塩基配列を示す。このものは全長３１８９bp
でｐｏｌｙＡテールは欠けており、かつ約２０００bpの
３'非翻訳領域を有している。またこれより導かれた酵
素タンパクは３２７のアミノ酸より構成された分子量３
７３７６のものであり、かつラット肝由来のΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素の精製標品をリジルエ
ンドペプチダーゼ処理して得られた図５で示す６個のペ
プチドフラグメントＫ６、Ｋ１０、Ｋ１５、Ｋ１６、Ｋ
１７、Ｋ１９のアミノ酸配列をすべて含んでいることが
確認された。
はΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現す
るＤＮＡであることが判明し、このものは、図１で表さ
れるアミノ酸配列をコードする図２で示される塩基配列
を有しており、この図２において、その５'側上流には
開始コドン、例えばＭｅｔをコードするＡＴＧを有して
いてもよいし、その３'側下流には終止コドン、例えば
ＴＧＡを有していてもよい。また配列表の配列番号１
に、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子
ＤＮＡの全塩基配列を示す。このものは全長３１８９bp
でｐｏｌｙＡテールは欠けており、かつ約２０００bpの
３'非翻訳領域を有している。またこれより導かれた酵
素タンパクは３２７のアミノ酸より構成された分子量３
７３７６のものであり、かつラット肝由来のΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素の精製標品をリジルエ
ンドペプチダーゼ処理して得られた図５で示す６個のペ
プチドフラグメントＫ６、Ｋ１０、Ｋ１５、Ｋ１６、Ｋ
１７、Ｋ１９のアミノ酸配列をすべて含んでいることが
確認された。
【００１４】本発明においては、ｃＤＮＡライブラリー
からスクリーニングして得られたΔ4−３−ケトステロ
イド−５β−還元酵素を発現するＤＮＡは、実施例で示
すようにプラスミドに直接組み込み発現ベクターを構築
してもよいし、あるいはいったん適当なプラスミドに組
み込み、宿主微生物に導入し、この形質転換された宿主
微生物から、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
らの方法などに従って、Δ4−３−ケトステロイド−５
β−還元酵素遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドを調
製し、この組換えプラスミドと発現用ベクターを適当な
制限酵素を用いて処理し、それぞれΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベ
クター断片を得たのち、それぞれ接着末端をアニーリン
グし、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに
より、発現ベクターを構築してもよい。
からスクリーニングして得られたΔ4−３−ケトステロ
イド−５β−還元酵素を発現するＤＮＡは、実施例で示
すようにプラスミドに直接組み込み発現ベクターを構築
してもよいし、あるいはいったん適当なプラスミドに組
み込み、宿主微生物に導入し、この形質転換された宿主
微生物から、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
らの方法などに従って、Δ4−３−ケトステロイド−５
β−還元酵素遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドを調
製し、この組換えプラスミドと発現用ベクターを適当な
制限酵素を用いて処理し、それぞれΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベ
クター断片を得たのち、それぞれ接着末端をアニーリン
グし、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに
より、発現ベクターを構築してもよい。
【００１５】この発現ベクターの構築に用いられるプラ
スミドの種類については特に制限はなく、使用する宿主
細胞の種類によって適宜選ばれる。例えば宿主細胞とし
て、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）、例えばＥ．ｃｏｌｉＤＨＩ、同ＨＢ１０
１、同ＭＶ１１８４、同ＭＶ１３０４、同Ｗ３１１０、
同Ｃ６００株などを用いる場合にはプラスミドｐＩＮＩ
やｐＩＮIIIなどが、バチルス・ズブチルスを用いる場
合には、例えばプラスミドｐＴＵＢ２１８やｐＴＵＢ２
８５などが、サッカロマイセス・セレビシアなどの酵母
を用いる場合は、例えばプラスミドｐＡＭ８２などが好
ましく使用される。
スミドの種類については特に制限はなく、使用する宿主
細胞の種類によって適宜選ばれる。例えば宿主細胞とし
て、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）、例えばＥ．ｃｏｌｉＤＨＩ、同ＨＢ１０
１、同ＭＶ１１８４、同ＭＶ１３０４、同Ｗ３１１０、
同Ｃ６００株などを用いる場合にはプラスミドｐＩＮＩ
やｐＩＮIIIなどが、バチルス・ズブチルスを用いる場
合には、例えばプラスミドｐＴＵＢ２１８やｐＴＵＢ２
８５などが、サッカロマイセス・セレビシアなどの酵母
を用いる場合は、例えばプラスミドｐＡＭ８２などが好
ましく使用される。
【００１６】一方、宿主細胞として、サル腎（ＣＯＳ）
細胞、チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細
胞、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（葉酸還元酵素欠損）株細胞など
の動物細胞を用いる場合には、ＳＶ４０ウイルスの後期
プロモーターで外来遺伝子を発現させるウイルスベクタ
ー、例えばプラスミドｐＳＶＬやｐＳＶ２−ｄｈｆｒな
どを好ましく使用することができる。
細胞、チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細
胞、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（葉酸還元酵素欠損）株細胞など
の動物細胞を用いる場合には、ＳＶ４０ウイルスの後期
プロモーターで外来遺伝子を発現させるウイルスベクタ
ー、例えばプラスミドｐＳＶＬやｐＳＶ２−ｄｈｆｒな
どを好ましく使用することができる。
【００１７】発現ベクターを前記の宿主に導入する方法
については、例えば宿主細胞がエシェリヒア属に属する
微生物の場合は、例えばカルシウムイオンの存在下に導
入してもよいし、コンピテントセル法を用いて導入して
もよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コ
ンピテントセル法やプロトプラスト法、あるいはマイク
ロインジョン法が用いられる。宿主微生物への発現ベク
ター導入の有無についての選択は、該ベクターの薬剤耐
性マーカーに基づく選択培地で該微生物を培養して生育
する微生物を選択し、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞を得る。
については、例えば宿主細胞がエシェリヒア属に属する
微生物の場合は、例えばカルシウムイオンの存在下に導
入してもよいし、コンピテントセル法を用いて導入して
もよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コ
ンピテントセル法やプロトプラスト法、あるいはマイク
ロインジョン法が用いられる。宿主微生物への発現ベク
ター導入の有無についての選択は、該ベクターの薬剤耐
性マーカーに基づく選択培地で該微生物を培養して生育
する微生物を選択し、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞を得る。
【００１８】一方、宿主細胞がＣＯＳやＣＨＯなどの動
物細胞の場合は、例えばリン酸カルシウム法やエレクト
ロポレーション法などが用いられる。また、発現ベクタ
ーが導入された動物細胞を選択するには薬剤耐性などが
利用される。薬剤耐性遺伝子は発現ベクター内に組み込
んでもよいし、別に薬剤耐性遺伝子発現ベクターを構築
し、両ベクター混合物によるコトランスフェクションを
行い、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生
産する実質上純粋な細胞を得る。
物細胞の場合は、例えばリン酸カルシウム法やエレクト
ロポレーション法などが用いられる。また、発現ベクタ
ーが導入された動物細胞を選択するには薬剤耐性などが
利用される。薬剤耐性遺伝子は発現ベクター内に組み込
んでもよいし、別に薬剤耐性遺伝子発現ベクターを構築
し、両ベクター混合物によるコトランスフェクションを
行い、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生
産する実質上純粋な細胞を得る。
【００１９】このようにして形質転換された細胞の培養
については、該細胞が微生物の場合には、該微生物の生
育に必要な炭素源や窒素源などの栄養源や無機成分など
を含む培地中において行うことができる。該炭素源とし
ては、例えばグルコース、デンプン、ショ糖、モラッ
セ、デキストリンなどが、窒素源としては、例えばペプ
トン、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチープ
リカー、硝酸塩、アンモニウム塩などが、無機成分とし
ては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオ
ンや塩素、硫酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げ
られる。
については、該細胞が微生物の場合には、該微生物の生
育に必要な炭素源や窒素源などの栄養源や無機成分など
を含む培地中において行うことができる。該炭素源とし
ては、例えばグルコース、デンプン、ショ糖、モラッ
セ、デキストリンなどが、窒素源としては、例えばペプ
トン、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチープ
リカー、硝酸塩、アンモニウム塩などが、無機成分とし
ては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオ
ンや塩素、硫酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げ
られる。
【００２０】培養の形態は液体培養が好ましく、工業的
には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培養温度
は、微生物が生育し、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素が生産される範囲で適宜選ばれるが、エシェ
リヒア属に属する微生物の場合は、通常２０〜４０℃の
範囲の温度で選ばれる。培養時間は条件により左右され
るが、該酵素が最高収量に達する時間を見計らって適当
な時期に培養を終了すればよく、通常１２〜２７時間程
度である。
には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培養温度
は、微生物が生育し、Δ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素が生産される範囲で適宜選ばれるが、エシェ
リヒア属に属する微生物の場合は、通常２０〜４０℃の
範囲の温度で選ばれる。培養時間は条件により左右され
るが、該酵素が最高収量に達する時間を見計らって適当
な時期に培養を終了すればよく、通常１２〜２７時間程
度である。
【００２１】このようにして培養したのち、Δ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素は菌体を含む培養液を
そのまま採取して分離、精製すればよく、また、Δ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素が菌体内に存在す
る場合には、得られた培養物をろ過又は遠心分離などの
手段により菌体を回収し、次いでこの菌体をボールミル
や超音波による機械的破砕方法やリゾチームなどの酵素
的破砕方法で破砕し、必要に応じてキレート剤や界面活
性剤を添加してΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素を可溶化して分離採取し、精製すればよい。精製方
法については、例えばΔ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素含有溶液を減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナ
トリウムなどでの塩析処理、メタノールやエタノール、
アセトンなどの親水性有機溶媒での分別沈殿などの手段
を適宜選択し、組み合わせて沈殿を得たのち、さらにこ
のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を含有す
る沈殿物を、必要に応じて、水又は緩衝液に溶解し、透
析膜にて透析して、より低分子量の不純物を除去しても
よく、また、吸着剤やゲルろ過剤などによるイオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ
過法などにより精製してもよい。このようにして得られ
た実質上純粋なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素は必要に応じて凍結乾燥することができる。
ケトステロイド−５β−還元酵素は菌体を含む培養液を
そのまま採取して分離、精製すればよく、また、Δ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素が菌体内に存在す
る場合には、得られた培養物をろ過又は遠心分離などの
手段により菌体を回収し、次いでこの菌体をボールミル
や超音波による機械的破砕方法やリゾチームなどの酵素
的破砕方法で破砕し、必要に応じてキレート剤や界面活
性剤を添加してΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素を可溶化して分離採取し、精製すればよい。精製方
法については、例えばΔ4−３−ケトステロイド−５β
−還元酵素含有溶液を減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナ
トリウムなどでの塩析処理、メタノールやエタノール、
アセトンなどの親水性有機溶媒での分別沈殿などの手段
を適宜選択し、組み合わせて沈殿を得たのち、さらにこ
のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を含有す
る沈殿物を、必要に応じて、水又は緩衝液に溶解し、透
析膜にて透析して、より低分子量の不純物を除去しても
よく、また、吸着剤やゲルろ過剤などによるイオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ
過法などにより精製してもよい。このようにして得られ
た実質上純粋なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素は必要に応じて凍結乾燥することができる。
【００２２】一方、形質転換された細胞がＣＯＳ細胞や
ＣＨＯ細胞などの動物細胞の場合には、従来慣用されて
いる動物細胞の組織培養の手段を用いて培養すればよ
く、例えばダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地と１０重
量％程度のウシ胎児血清を含有する培養器、簡便にはシ
ャーレに、形質転換体を１０4個／cm2程度播種して、通
常３０〜３７℃の温度で２〜６日間程度培養したのち、
公知の酵素の分離、回収手段を用いて、目的のΔ4−３
−ケトステロイド−５β−還元酵素を含む溶液を回収す
ればよい。このようにして得られたΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素含有溶液は、前記の形質転換微
生物の培養の場合と同様にして精製することにより、実
質上純粋なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
が得られる。
ＣＨＯ細胞などの動物細胞の場合には、従来慣用されて
いる動物細胞の組織培養の手段を用いて培養すればよ
く、例えばダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地と１０重
量％程度のウシ胎児血清を含有する培養器、簡便にはシ
ャーレに、形質転換体を１０4個／cm2程度播種して、通
常３０〜３７℃の温度で２〜６日間程度培養したのち、
公知の酵素の分離、回収手段を用いて、目的のΔ4−３
−ケトステロイド−５β−還元酵素を含む溶液を回収す
ればよい。このようにして得られたΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素含有溶液は、前記の形質転換微
生物の培養の場合と同様にして精製することにより、実
質上純粋なΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
が得られる。
【００２３】本発明方法で得られるΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素はＮＡＤＰＨ2の存在下、ステ
ロイド骨格の４位の二重結合をＡ／Ｂｃｉｓに還元する
反応を触媒する性質を有し、例えばステロイド代謝関連
医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不活化
剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクローナ
ル抗体などの抗体作成用の抗原として有用である。特に
Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素に対するモ
ノクローナル抗体は、該酵素欠損症の診断薬として期待
できる。
ロイド−５β−還元酵素はＮＡＤＰＨ2の存在下、ステ
ロイド骨格の４位の二重結合をＡ／Ｂｃｉｓに還元する
反応を触媒する性質を有し、例えばステロイド代謝関連
医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不活化
剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクローナ
ル抗体などの抗体作成用の抗原として有用である。特に
Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素に対するモ
ノクローナル抗体は、該酵素欠損症の診断薬として期待
できる。
【００２４】なお、本発明明細書に記載の塩基配列の記
号及びアミノ酸配列の記号は、当該分野における慣用略
号に基づくもので、それらの例を以下に列記する。ま
た、すべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｌｙ：グリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン
号及びアミノ酸配列の記号は、当該分野における慣用略
号に基づくもので、それらの例を以下に列記する。ま
た、すべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｌｙ：グリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：３１８９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ 起源：ラット肝臓由来のものに基づく合成 配列の名称：Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素遺伝子
素遺伝子
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらの例によってなんら限定される
ものではない。 調製例１ ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡの調製 摘出されたラット肝組織２ｇを液体窒素中で破砕し、４
０mlの６Ｍグアニジンイソチオシアネート中でホモジナ
イズしたのち、１８.５ゲージの太さの注射針を通して
高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げ、次いでホモジネート
を３分の１容の５.７Ｍ塩化セシウムと０.１Ｍ ＥＤＴ
Ａ（pH７.５）を含む溶液上に重層し、３５,０００rp
m、２５℃で１８時間遠心分離処理した。遠心分離後、
沈殿物を水３mlに溶解し、等量のフェノール／クロロホ
ルムで処理し、水層を別の試験管に取り、１０分の１容
の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加
えて遠心分離処理し、沈殿物を集め、減圧乾燥して粗Ｒ
ＮＡ２００mgを得た。この粗ＲＮＡを１.５mlの水に溶
解後、６５℃で５分間保温し、急冷して１.５mlの４０m
Mトリス−塩酸（pH７.６）、１.０Ｍ ＮａＣｌ、２mM
ＥＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ溶液を加えた。次いで、この
溶液全量を２０mMトリス−塩酸（pH７.６）、０.５Ｍ
ＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ及び０.１％ＳＤＳで平衡化し
た７５mgのオリゴ（ｄＴ)−セルロース（ファルマシア
社製）カラムに吸着させたのち、１０mlの同じ溶液で洗
浄後、５mlの２０mMトリス−塩酸（pH７.６）、０.１Ｍ
ＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ及び０.１％ＳＤＳ溶液でｐｏ
ｌｙ（Ａ)+ＲＮＡ以外のＲＮＡを溶出させた。次に１０
mMトリス−塩酸（pH７.５）、１mMＥＤＴＡ、０.０５％
ＳＤＳの溶液でｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを溶出させ、始め
に溶出してくる１mlを分画した。これに１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加
え、−２０℃で一晩放置し、１５,０００rpm、３０分の
遠心分離処理で沈殿を集め、減圧乾燥した。このように
してｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡ２００μｇを得た。
するが、本発明はこれらの例によってなんら限定される
ものではない。 調製例１ ｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡの調製 摘出されたラット肝組織２ｇを液体窒素中で破砕し、４
０mlの６Ｍグアニジンイソチオシアネート中でホモジナ
イズしたのち、１８.５ゲージの太さの注射針を通して
高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げ、次いでホモジネート
を３分の１容の５.７Ｍ塩化セシウムと０.１Ｍ ＥＤＴ
Ａ（pH７.５）を含む溶液上に重層し、３５,０００rp
m、２５℃で１８時間遠心分離処理した。遠心分離後、
沈殿物を水３mlに溶解し、等量のフェノール／クロロホ
ルムで処理し、水層を別の試験管に取り、１０分の１容
の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加
えて遠心分離処理し、沈殿物を集め、減圧乾燥して粗Ｒ
ＮＡ２００mgを得た。この粗ＲＮＡを１.５mlの水に溶
解後、６５℃で５分間保温し、急冷して１.５mlの４０m
Mトリス−塩酸（pH７.６）、１.０Ｍ ＮａＣｌ、２mM
ＥＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ溶液を加えた。次いで、この
溶液全量を２０mMトリス−塩酸（pH７.６）、０.５Ｍ
ＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ及び０.１％ＳＤＳで平衡化し
た７５mgのオリゴ（ｄＴ)−セルロース（ファルマシア
社製）カラムに吸着させたのち、１０mlの同じ溶液で洗
浄後、５mlの２０mMトリス−塩酸（pH７.６）、０.１Ｍ
ＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ及び０.１％ＳＤＳ溶液でｐｏ
ｌｙ（Ａ)+ＲＮＡ以外のＲＮＡを溶出させた。次に１０
mMトリス−塩酸（pH７.５）、１mMＥＤＴＡ、０.０５％
ＳＤＳの溶液でｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを溶出させ、始め
に溶出してくる１mlを分画した。これに１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加
え、−２０℃で一晩放置し、１５,０００rpm、３０分の
遠心分離処理で沈殿を集め、減圧乾燥した。このように
してｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡ２００μｇを得た。
【００３１】調製例２ オリゴ（ｄＴ）プライムλｇｔ
１１ライブラリーの調製 調製例１で得たｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを２μｇ／μｌに
なるように水に溶解し、その２.５μｌをマイクロチュ
ーブに移し、６５℃で５分間加熱し、急冷したのちに、
これに５０mMトリス−塩酸（pH８.３）、１０mMＭｇＣ
ｌ2、１４０mMＫＣｌ、１０mMジチオスレイトール及び
２mMのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰの等量混合物）、５μｇのオリゴ（ｄＴ）（ファ
ルマシア社製）と１.５単位の逆転写酵素（宝酒造社
製）を加え、全量を２０μｌとし、４２℃で１時間反応
させた。その反応液に８０mMトリス−塩酸（pH７.
５）、２００mMＫＣｌ、１０mMＭｇＣｌ2、２５μｇ／m
lＢＳＡ、ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）６０単位及びＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社製）５
単位を加えて総量を１５０μｌにし、１２℃で１時間反
応させたのち、２２℃で１時間反応させた。次いで、２
０μｌの０.２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液と１０μｌの１０％
ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止したのち、等量のフェノ
ール／クロロホルムを加え、１０,０００rpmで５分間遠
心分離処理し、水層を分取した。次に、この水層に、等
量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２倍量のエタノールを加
え、１５,０００rpmで１５分間遠心分離処理し、沈殿物
を集め減圧乾燥したのち、この沈殿物に１００mMトリス
−塩酸（pH８.０）、１０mMＥＤＴＡ、８０μＭＳ−ア
デノシルメチオニン、１００μｇ／mlＢＳＡ及び２単位
のＥｃｏＲＩメチラーゼ（プロメガバイオテック社製）
を加え、１０μｌとし、３７℃で１時間反応させた。反
応後、反応液に４０μｌの水を加え、等量のフェノール
／クロロホルムで処理し、遠心分離処理により分取した
水層に、等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２倍量のエタノ
ールを加え、−７０℃で１５分間放置したのち、１５,
０００rpmで１５分間遠心分離後の沈殿物に６７mMトリ
ス−塩酸（pH８.８）、６.７mMＭｇＣｌ2、１６.６mM硫
酸アンモニウム、１０mM２−メルカプトエタノール、
６.７μＭ ＥＤＴＡ、０.１６７％ＢＳＡ、各７５０μ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４単位加え、全量を
１２μｌとし、３７℃で１時間反応させた。次いで等量
のフェノール／クロロホルム液で処理し、エタノール沈
殿し、遠心分離処理によって沈殿物を回収し、減圧乾燥
した。
１１ライブラリーの調製 調製例１で得たｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを２μｇ／μｌに
なるように水に溶解し、その２.５μｌをマイクロチュ
ーブに移し、６５℃で５分間加熱し、急冷したのちに、
これに５０mMトリス−塩酸（pH８.３）、１０mMＭｇＣ
ｌ2、１４０mMＫＣｌ、１０mMジチオスレイトール及び
２mMのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰの等量混合物）、５μｇのオリゴ（ｄＴ）（ファ
ルマシア社製）と１.５単位の逆転写酵素（宝酒造社
製）を加え、全量を２０μｌとし、４２℃で１時間反応
させた。その反応液に８０mMトリス−塩酸（pH７.
５）、２００mMＫＣｌ、１０mMＭｇＣｌ2、２５μｇ／m
lＢＳＡ、ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）６０単位及びＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社製）５
単位を加えて総量を１５０μｌにし、１２℃で１時間反
応させたのち、２２℃で１時間反応させた。次いで、２
０μｌの０.２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液と１０μｌの１０％
ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止したのち、等量のフェノ
ール／クロロホルムを加え、１０,０００rpmで５分間遠
心分離処理し、水層を分取した。次に、この水層に、等
量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２倍量のエタノールを加
え、１５,０００rpmで１５分間遠心分離処理し、沈殿物
を集め減圧乾燥したのち、この沈殿物に１００mMトリス
−塩酸（pH８.０）、１０mMＥＤＴＡ、８０μＭＳ−ア
デノシルメチオニン、１００μｇ／mlＢＳＡ及び２単位
のＥｃｏＲＩメチラーゼ（プロメガバイオテック社製）
を加え、１０μｌとし、３７℃で１時間反応させた。反
応後、反応液に４０μｌの水を加え、等量のフェノール
／クロロホルムで処理し、遠心分離処理により分取した
水層に、等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２倍量のエタノ
ールを加え、−７０℃で１５分間放置したのち、１５,
０００rpmで１５分間遠心分離後の沈殿物に６７mMトリ
ス−塩酸（pH８.８）、６.７mMＭｇＣｌ2、１６.６mM硫
酸アンモニウム、１０mM２−メルカプトエタノール、
６.７μＭ ＥＤＴＡ、０.１６７％ＢＳＡ、各７５０μ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４単位加え、全量を
１２μｌとし、３７℃で１時間反応させた。次いで等量
のフェノール／クロロホルム液で処理し、エタノール沈
殿し、遠心分離処理によって沈殿物を回収し、減圧乾燥
した。
【００３２】一方、ＥｃｏＲＩリンカー１μｇに、５０
mMトリス−塩酸（pH７.６）、１０mMＭｇＣｌ2、１０mM
ジチオスレイトール、０.１mMスペルミジン、０.１mMＥ
ＤＴＡ、１mMＡＴＰ及び３単位のＴ４ポリヌクレオチド
カイネース（宝酒造社製）を加え、全量を１０μｌと
し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、これをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理後の前記サンプルに全量加え、
さらに６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシア社製）を
加え、１４℃で一晩反応させたのち、この反応液に１０
０mMＮａＣｌ、５０mMトリス−塩酸（pH７.５）、１０m
MＭｇＣｌ2、７mM２−メルカプトエタノール、１００μ
ｇ／mlＢＳＡ及び２５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量
４０μｌにて、３７℃で２時間反応させた。この反応液
を１％低融点アガロースゲルにて分画し、６００〜２０
００ベースのＤＮＡを含むゲルを回収したのち、６５℃
で１０分間保温し、ゲルを融解後、これに等量のフェノ
ールを加え、１０分間氷冷してから、１５,０００rpm、
４℃で１０分間遠心分離処理した。得られた水層に等量
のフェノールを加え、この操作を繰り返したのち、水層
をクロロホルムで２回処理し、１０分の１容の３Ｍ酢酸
ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加え、−７０
℃に放置し、次いで１５,０００rpmで１５分間遠心分離
処理したのち、沈殿を７５％エタノールで２回洗浄し、
減圧乾燥した。次に、この乾燥沈殿に、ラムダファージ
ベクターλｇｔ１１（ストラトジーン社製）アーム１μ
ｇを加え、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
て、２６℃で１０分間反応させたのち、さらにインビト
ロパッケージングキット（ストラトジーン社製）を用い
て反応させた。このようにして得られたラムダファージ
ベクターλｇｔ１１ライブラリーはエシェリヒア・コリ
Ｙ１０９０（ストラトジーン社製）に感染させ、総数を
調べたところ、１×１０6pfu（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍ
ｉｎｇ ｕｎｉｔ）から成っていた。
mMトリス−塩酸（pH７.６）、１０mMＭｇＣｌ2、１０mM
ジチオスレイトール、０.１mMスペルミジン、０.１mMＥ
ＤＴＡ、１mMＡＴＰ及び３単位のＴ４ポリヌクレオチド
カイネース（宝酒造社製）を加え、全量を１０μｌと
し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、これをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理後の前記サンプルに全量加え、
さらに６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシア社製）を
加え、１４℃で一晩反応させたのち、この反応液に１０
０mMＮａＣｌ、５０mMトリス−塩酸（pH７.５）、１０m
MＭｇＣｌ2、７mM２−メルカプトエタノール、１００μ
ｇ／mlＢＳＡ及び２５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量
４０μｌにて、３７℃で２時間反応させた。この反応液
を１％低融点アガロースゲルにて分画し、６００〜２０
００ベースのＤＮＡを含むゲルを回収したのち、６５℃
で１０分間保温し、ゲルを融解後、これに等量のフェノ
ールを加え、１０分間氷冷してから、１５,０００rpm、
４℃で１０分間遠心分離処理した。得られた水層に等量
のフェノールを加え、この操作を繰り返したのち、水層
をクロロホルムで２回処理し、１０分の１容の３Ｍ酢酸
ナトリウム及び２.５倍容のエタノールを加え、−７０
℃に放置し、次いで１５,０００rpmで１５分間遠心分離
処理したのち、沈殿を７５％エタノールで２回洗浄し、
減圧乾燥した。次に、この乾燥沈殿に、ラムダファージ
ベクターλｇｔ１１（ストラトジーン社製）アーム１μ
ｇを加え、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
て、２６℃で１０分間反応させたのち、さらにインビト
ロパッケージングキット（ストラトジーン社製）を用い
て反応させた。このようにして得られたラムダファージ
ベクターλｇｔ１１ライブラリーはエシェリヒア・コリ
Ｙ１０９０（ストラトジーン社製）に感染させ、総数を
調べたところ、１×１０6pfu（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍ
ｉｎｇ ｕｎｉｔ）から成っていた。
【００３３】調製例３ λＺＡＰライブラリーの調製 調製例２におけるラムダファージベクターλｇｔ１１の
代わりにラムダファージベクターλＺＡＰを用いた以外
は、調製例２と同様にしてλＺＡＰライブラリーを調製
した。
代わりにラムダファージベクターλＺＡＰを用いた以外
は、調製例２と同様にしてλＺＡＰライブラリーを調製
した。
【００３４】調製例４ ランダムプライムλｇｔ１１ラ
イブラリーの調製 調製例２におけるオリゴ（ｄＴ）の代わりにランダムプ
ライマー（宝酒造社製）を用いた以外は、調製例２と同
様にしてランダムプライムλｇｔ１１ライブラリーを調
製した。
イブラリーの調製 調製例２におけるオリゴ（ｄＴ）の代わりにランダムプ
ライマー（宝酒造社製）を用いた以外は、調製例２と同
様にしてランダムプライムλｇｔ１１ライブラリーを調
製した。
【００３５】実施例１ 調製例２のλｇｔ１１ライブラリーについて、Δ4−３
−ケトステロイド−５β−還元酵素のｃＤＮＡを選択す
るために、まず、該酵素特異的ポリクローナル抗体を用
いてスクリーニングを行った。すなわち、調製例２で得
られたオリゴ（ｄＴ）プライムλｇｔ１１ライブラリー
１×１０5クローンを、エシェリヒア・コリＹ１０９０
を指示菌として、１.５％寒天培地（１リットル当た
り、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキスト
ラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを含有）上にひらき、ＬＢ
プレート上の溶菌したプラーク上に、１０mMＩＰＴＧに
浸しておいたニトロセルロース膜を乗せ、さらに３時間
培養して、ニトロセルロース膜上にタンパク質を移し
た。次いで、この膜をＴＢＳＴ［５０mMトリス−塩酸
（pH８.０）、１５０mMＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ
２０］でリンスしたのち、２０％ウシ胎児血清−ＴＢＳ
Ｔ液中にて、室温で３０分間インキュベイトした。
−ケトステロイド−５β−還元酵素のｃＤＮＡを選択す
るために、まず、該酵素特異的ポリクローナル抗体を用
いてスクリーニングを行った。すなわち、調製例２で得
られたオリゴ（ｄＴ）プライムλｇｔ１１ライブラリー
１×１０5クローンを、エシェリヒア・コリＹ１０９０
を指示菌として、１.５％寒天培地（１リットル当た
り、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキスト
ラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを含有）上にひらき、ＬＢ
プレート上の溶菌したプラーク上に、１０mMＩＰＴＧに
浸しておいたニトロセルロース膜を乗せ、さらに３時間
培養して、ニトロセルロース膜上にタンパク質を移し
た。次いで、この膜をＴＢＳＴ［５０mMトリス−塩酸
（pH８.０）、１５０mMＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ
２０］でリンスしたのち、２０％ウシ胎児血清−ＴＢＳ
Ｔ液中にて、室温で３０分間インキュベイトした。
【００３６】次に、該膜を、ポリクローナル抗体を２０
％ウシ胎児血清−ＴＢＳＴ液で５０倍希釈した溶液中で
１２時間反応させたのち、ＴＢＳＴ液で１０分間３回洗
浄後、「125Ｉ」−抗マウス抗体を２０％ウシ胎児血清
−ＴＢＳＴ液で５００倍に希釈した液と２時間反応させ
た。次いで、この膜をＴＢＳＴ液で１０分間５回洗浄し
たのち、通風乾燥して一晩オートラジオグラムを行っ
た。シグナルの出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ液
［０.１Ｍ ＮａＣｌ、８mMＭｇＳＯ4、５０mMトリス−
塩酸（pH７.５）、０.０１％ゼラチン］１mlに懸濁し、
希釈してＬＢプレート上にひらきなおし、同じ手順でス
クリーニングを繰り返してプラークを純化して、８個の
クローンλ2、λ4、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13
を得た。さらに、これらのクローンを、それぞれＬＢプ
レートにひらきなおし、ＬＢプレート上の溶菌したプラ
ークをニトロセルロース膜上に移し、膜を０.５Ｍ Ｎ
ａＯＨと１.５Ｍ ＮａＣｌ溶液で５分間、３Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液（pH５.５）で５分間処理したのち、８０
℃で減圧下に２時間乾燥した。次に、この膜をビニール
袋に入れ、６倍濃度ＳＳＣ（１倍：１５０mMＮａＣｌ、
１５mMクエン酸ナトリウム）、１倍デンハルト液（０.
０２％フィコール、０.０２％ポリビニルピロリドン、
０.０２％ＢＳＡ）、０.５％ＳＤＳを含む溶液１０ml中
で２８℃、４時間保温した。次いで、溶液を除いてか
ら、図６で示す５'末端を32Ｐでラベルした２０塩基か
らなる合成ＤＮＡ５０mgを加え、２８℃で一晩ハイブリ
ダイズさせたのち、この膜を６倍ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ溶液で、２８℃にて２回洗浄し、次いで通風乾燥して
一晩オートラジオグラムを行い、ポジティブに反応した
７つのクローンλ2、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13
を得た。
％ウシ胎児血清−ＴＢＳＴ液で５０倍希釈した溶液中で
１２時間反応させたのち、ＴＢＳＴ液で１０分間３回洗
浄後、「125Ｉ」−抗マウス抗体を２０％ウシ胎児血清
−ＴＢＳＴ液で５００倍に希釈した液と２時間反応させ
た。次いで、この膜をＴＢＳＴ液で１０分間５回洗浄し
たのち、通風乾燥して一晩オートラジオグラムを行っ
た。シグナルの出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ液
［０.１Ｍ ＮａＣｌ、８mMＭｇＳＯ4、５０mMトリス−
塩酸（pH７.５）、０.０１％ゼラチン］１mlに懸濁し、
希釈してＬＢプレート上にひらきなおし、同じ手順でス
クリーニングを繰り返してプラークを純化して、８個の
クローンλ2、λ4、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13
を得た。さらに、これらのクローンを、それぞれＬＢプ
レートにひらきなおし、ＬＢプレート上の溶菌したプラ
ークをニトロセルロース膜上に移し、膜を０.５Ｍ Ｎ
ａＯＨと１.５Ｍ ＮａＣｌ溶液で５分間、３Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液（pH５.５）で５分間処理したのち、８０
℃で減圧下に２時間乾燥した。次に、この膜をビニール
袋に入れ、６倍濃度ＳＳＣ（１倍：１５０mMＮａＣｌ、
１５mMクエン酸ナトリウム）、１倍デンハルト液（０.
０２％フィコール、０.０２％ポリビニルピロリドン、
０.０２％ＢＳＡ）、０.５％ＳＤＳを含む溶液１０ml中
で２８℃、４時間保温した。次いで、溶液を除いてか
ら、図６で示す５'末端を32Ｐでラベルした２０塩基か
らなる合成ＤＮＡ５０mgを加え、２８℃で一晩ハイブリ
ダイズさせたのち、この膜を６倍ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ溶液で、２８℃にて２回洗浄し、次いで通風乾燥して
一晩オートラジオグラムを行い、ポジティブに反応した
７つのクローンλ2、λ5、λ7、λ9、λ11、λ12、λ13
を得た。
【００３７】次に、これらのクローンをＬＢプレートに
ひらき、それぞれのＬＢプレートに、１枚につき１５ml
のＳＭ液を加えて、ファージをＳＭに浸潤させ、試験管
に上層寒天とともに移し、８,０００rpmで１０分間遠心
分離処理したのち、上澄に６０単位のＤＮａｓｅＩ（宝
酒造社製）及びＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）１００μｇ
を加え、３７℃で３０分間保温した。これに等量の２０
％ポリエチレングリコールと２.５Ｍ ＮａＣｌを加
え、１時間氷冷したのち、１５,０００rpmで２０分間遠
心分離処理し、沈殿物を得た。この沈殿物を０.５mlの
ＳＭ液に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、
遠心分離後の水層に密度が１.１５になるように塩化セ
シウムを加えたのち、これを、密度が１.６（２ml）、
１.５（３ml）、１.４（３ml）になるように塩化セシウ
ムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０,０００rpmで３
時間遠心分離処理した。遠心分離後、密度１.５と１.４
の間に表れるファージを含むバンドを分取し、トリス−
塩酸（pH７.５）に溶解し、４０,０００rpmで１時間遠
心分離処理によって沈殿物を得た。この沈殿物を、２０
mMＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテアー
ゼＫ（シグマ社製）で、６５℃、１時間処理し、次いで
この反応液に等量のフェノールを加え、遠心分離後の水
層を等量のフェノール／クロロホルムで処理し、再度遠
心分離後の水層をクロロホルムで処理したのち、水層に
１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍容のエタ
ノールを加え−７０℃に１５分放置した。続いて１５,
０００rpmで１５分間の遠心分離処理して沈殿物を回収
したのち、この沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄
し、減圧乾燥してから、５μｇ／mlＲＮａｓｅＡを含む
水５０μｌに溶かし、その１０μｌをＨ緩衝液［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
１０４、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８
２）］中においてＥｃｏＲＩ消化して挿入断片を調べる
と、約３.０kbpの最長の断片を有するΔ4−３−ケトス
テロイド−５β−還元酵素遺伝子クローンが得られ、消
化後に得られた約３.０kbpの挿入断片を低融点アガロー
スゲル電気泳動により回収した。次に、この挿入断片を
ＥｃｏＲＩで完全に消化して、１.８kbpと１.２kbpの挿
入断片を得た。この１.８kbp挿入断片をプローブとし
て、調製例１で得られたｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡのノーザ
ン・ブロット解析を行ったところ、該酵素のｍＲＮＡの
サイズは約３.５kbpであることが判明し、このｍＲＮＡ
のサイズと比較して、前記クローンはサイズが小さく、
不完全クローンであることが分かった。
ひらき、それぞれのＬＢプレートに、１枚につき１５ml
のＳＭ液を加えて、ファージをＳＭに浸潤させ、試験管
に上層寒天とともに移し、８,０００rpmで１０分間遠心
分離処理したのち、上澄に６０単位のＤＮａｓｅＩ（宝
酒造社製）及びＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）１００μｇ
を加え、３７℃で３０分間保温した。これに等量の２０
％ポリエチレングリコールと２.５Ｍ ＮａＣｌを加
え、１時間氷冷したのち、１５,０００rpmで２０分間遠
心分離処理し、沈殿物を得た。この沈殿物を０.５mlの
ＳＭ液に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、
遠心分離後の水層に密度が１.１５になるように塩化セ
シウムを加えたのち、これを、密度が１.６（２ml）、
１.５（３ml）、１.４（３ml）になるように塩化セシウ
ムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０,０００rpmで３
時間遠心分離処理した。遠心分離後、密度１.５と１.４
の間に表れるファージを含むバンドを分取し、トリス−
塩酸（pH７.５）に溶解し、４０,０００rpmで１時間遠
心分離処理によって沈殿物を得た。この沈殿物を、２０
mMＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテアー
ゼＫ（シグマ社製）で、６５℃、１時間処理し、次いで
この反応液に等量のフェノールを加え、遠心分離後の水
層を等量のフェノール／クロロホルムで処理し、再度遠
心分離後の水層をクロロホルムで処理したのち、水層に
１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍容のエタ
ノールを加え−７０℃に１５分放置した。続いて１５,
０００rpmで１５分間の遠心分離処理して沈殿物を回収
したのち、この沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄
し、減圧乾燥してから、５μｇ／mlＲＮａｓｅＡを含む
水５０μｌに溶かし、その１０μｌをＨ緩衝液［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
１０４、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８
２）］中においてＥｃｏＲＩ消化して挿入断片を調べる
と、約３.０kbpの最長の断片を有するΔ4−３−ケトス
テロイド−５β−還元酵素遺伝子クローンが得られ、消
化後に得られた約３.０kbpの挿入断片を低融点アガロー
スゲル電気泳動により回収した。次に、この挿入断片を
ＥｃｏＲＩで完全に消化して、１.８kbpと１.２kbpの挿
入断片を得た。この１.８kbp挿入断片をプローブとし
て、調製例１で得られたｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡのノーザ
ン・ブロット解析を行ったところ、該酵素のｍＲＮＡの
サイズは約３.５kbpであることが判明し、このｍＲＮＡ
のサイズと比較して、前記クローンはサイズが小さく、
不完全クローンであることが分かった。
【００３８】実施例２ 実施例１で得られたクローンは不完全クローンであった
ため、調製例３で得られたλＺＡＰライブラリー及び調
製例４で得られたランダムプライムλｇｔ１１ライブラ
リーについて、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素の完全なｃＤＮＡを選択するために、実施例１で得
られたｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングを行っ
た。すなわち、λＺＡＰライブラリー及びランダムプラ
イムλｇｔ１１ライブラリーそれぞれ約２×１０5クロ
ーンをエシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＹ１０
９０を指示菌として、１.５％ＬＢ寒天培地（１リット
ル当たり、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエ
キストラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを含有）上にひら
き、ＬＢプレート上の溶菌したプラークをナイロン膜上
に移し、この膜を０.５Ｍ ＮａＯＨ、１.５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液で５分間、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（pH５.５）
で５分間処理したのち、８０℃減圧下で２時間乾燥し
た。
ため、調製例３で得られたλＺＡＰライブラリー及び調
製例４で得られたランダムプライムλｇｔ１１ライブラ
リーについて、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素の完全なｃＤＮＡを選択するために、実施例１で得
られたｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングを行っ
た。すなわち、λＺＡＰライブラリー及びランダムプラ
イムλｇｔ１１ライブラリーそれぞれ約２×１０5クロ
ーンをエシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＹ１０
９０を指示菌として、１.５％ＬＢ寒天培地（１リット
ル当たり、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエ
キストラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを含有）上にひら
き、ＬＢプレート上の溶菌したプラークをナイロン膜上
に移し、この膜を０.５Ｍ ＮａＯＨ、１.５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液で５分間、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（pH５.５）
で５分間処理したのち、８０℃減圧下で２時間乾燥し
た。
【００３９】次いで、この膜をビニール袋に入れ、５倍
濃度ＳＳＣ（１倍：１５０mMＮａＣｌ、１５mMクエン酸
ナトリウム）、５倍デンハルト液（１倍：０.０２％フ
ィコール、０.０２％ポリビニルピロリドン、０.０２％
ＢＳＡ）、５０mMリン酸ナトリウム（pH６.５）、０.１
％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、２５０μｇ／ml
サケ精子ＤＮＡ、２０％ホルムアミドを含む溶液１０ml
中で、３７℃にて４時間保温した。溶液を除いてから、
これに、５'末端を32Ｐでラベルした約１.８kbp及び１.
２kbpのＤＮＡ挿入断片プローブ（１０8cpm／μｇ；実
施例１で得られたファージクローンをＥｃｏＲＩ制限酵
素にて完全消化して得られた１.８kbp及び１.２kbpのＤ
ＮＡ断片を用いた）２０ngを加え、３７℃で一晩ハイブ
リダイズさせたのち、この膜を２倍ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ溶液で室温にて３回、３７℃にて１０分間洗浄し、
通風乾燥して一晩オートラジオグラムを行った。次に、
シグナルの出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ液［０.１
Ｍ ＮａＣｌ、８mMＭｇＳＯ4、５０mMトリス−塩酸（p
H７.５）、０.０１％ゼラチン］１mlに懸濁し、希釈し
てＬＢプレート上にひらきなおし、同じプローブでスク
リーニングを繰り返してプラークを純化して、２０クロ
ーンを得た。さらにこのクローンをエシェリヒア・コリ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ、ＬＢ寒天培地プレート
（１３cm×９cm）を２枚にひらいたのち、１枚につき１
５mlのＳＭ液を加えて、ファージをＳＭに浸潤させ、試
験管に上層寒天とともに移し、８,０００rpmで１０分間
遠心分離処理した。上澄に６０単位のＤＮａｓｅＩ（宝
酒造社製）及びＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）１００μｇ
を加え、３７℃で３０分間保温した。これに等量の２０
％ポリエチレングリコールと２.５Ｍ ＮａＣｌを加
え、１時間氷冷したのち、１５,０００rpmで２０分間遠
心分離処理し、沈殿物を得た。この沈殿物を０.５mlの
ＳＭ液に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、
遠心分離後の水層に密度が１.１５になるように塩化セ
シウムを加えたのち、これを、密度が１.６（２ml）、
１.５（３ml）、１.４（３ml）になるように塩化セシウ
ムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０,０００rpmで３
時間遠心分離処理した。遠心分離後、密度１.５と１.４
の間に表れるファージを含むバンドを分取し、トリス−
塩酸（pH７.５）に溶解し、４０,０００rpmで１時間遠
心分離処理によって沈殿物を得た。
濃度ＳＳＣ（１倍：１５０mMＮａＣｌ、１５mMクエン酸
ナトリウム）、５倍デンハルト液（１倍：０.０２％フ
ィコール、０.０２％ポリビニルピロリドン、０.０２％
ＢＳＡ）、５０mMリン酸ナトリウム（pH６.５）、０.１
％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、２５０μｇ／ml
サケ精子ＤＮＡ、２０％ホルムアミドを含む溶液１０ml
中で、３７℃にて４時間保温した。溶液を除いてから、
これに、５'末端を32Ｐでラベルした約１.８kbp及び１.
２kbpのＤＮＡ挿入断片プローブ（１０8cpm／μｇ；実
施例１で得られたファージクローンをＥｃｏＲＩ制限酵
素にて完全消化して得られた１.８kbp及び１.２kbpのＤ
ＮＡ断片を用いた）２０ngを加え、３７℃で一晩ハイブ
リダイズさせたのち、この膜を２倍ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ溶液で室温にて３回、３７℃にて１０分間洗浄し、
通風乾燥して一晩オートラジオグラムを行った。次に、
シグナルの出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ液［０.１
Ｍ ＮａＣｌ、８mMＭｇＳＯ4、５０mMトリス−塩酸（p
H７.５）、０.０１％ゼラチン］１mlに懸濁し、希釈し
てＬＢプレート上にひらきなおし、同じプローブでスク
リーニングを繰り返してプラークを純化して、２０クロ
ーンを得た。さらにこのクローンをエシェリヒア・コリ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ、ＬＢ寒天培地プレート
（１３cm×９cm）を２枚にひらいたのち、１枚につき１
５mlのＳＭ液を加えて、ファージをＳＭに浸潤させ、試
験管に上層寒天とともに移し、８,０００rpmで１０分間
遠心分離処理した。上澄に６０単位のＤＮａｓｅＩ（宝
酒造社製）及びＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）１００μｇ
を加え、３７℃で３０分間保温した。これに等量の２０
％ポリエチレングリコールと２.５Ｍ ＮａＣｌを加
え、１時間氷冷したのち、１５,０００rpmで２０分間遠
心分離処理し、沈殿物を得た。この沈殿物を０.５mlの
ＳＭ液に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、
遠心分離後の水層に密度が１.１５になるように塩化セ
シウムを加えたのち、これを、密度が１.６（２ml）、
１.５（３ml）、１.４（３ml）になるように塩化セシウ
ムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０,０００rpmで３
時間遠心分離処理した。遠心分離後、密度１.５と１.４
の間に表れるファージを含むバンドを分取し、トリス−
塩酸（pH７.５）に溶解し、４０,０００rpmで１時間遠
心分離処理によって沈殿物を得た。
【００４０】この沈殿物を、２０mMＥＤＴＡ、０.５％
ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテアーゼＫ（シグマ社製）
で、６５℃、１時間処理し、次いでこの反応液に等量の
フェノールを加え、遠心分離後の水層を等量のフェノー
ル／クロロホルムで処理し、再度遠心分離後の水層をク
ロロホルムで処理し、水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２.５倍容のエタノールを加え−７０℃に１
５分放置した。続いて１５,０００rpmで１５分間の遠心
分離処理して沈殿物を回収したのち、この沈殿物を７５
％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥してから、５μｇ
／mlＲＮａｓｅＡを含む水５０μｌに沈殿を溶かし、そ
の１０μｌをＨ緩衝液［Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８２）］中においてＥｃｏ
ＲＩ消化して挿入断片を調べると、実施例１で得られた
クローンよりも３'端に１００bpの長い断片を有するク
ローンと、５'端に１００bp長い断片を有するΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子クローンがそれ
ぞれ得られ、消化後に得られたそれぞれの挿入断片を低
融点アガロースゲル電気泳動により回収した。次いでこ
れらのクローンについて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐ
ｈａｇｅｍｉｄに変換して制限酵素地図を作成した。得
られた２クローンとも同一の制限酵素地図を示す部分を
もつものであり、それぞれをＺ８及びＨ２４１と命名し
た。この２つのクローンの中で、Ｈ２４１はｃｏｄｉｎ
ｇ ｒｅｇｉｏｎをすべて含む完全なクローンであっ
た。しかしＺ８をＣＯＳ細胞にトランスフェクトしたと
ころ目的の酵素タンパクの発現はみられなかった。
ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテアーゼＫ（シグマ社製）
で、６５℃、１時間処理し、次いでこの反応液に等量の
フェノールを加え、遠心分離後の水層を等量のフェノー
ル／クロロホルムで処理し、再度遠心分離後の水層をク
ロロホルムで処理し、水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２.５倍容のエタノールを加え−７０℃に１
５分放置した。続いて１５,０００rpmで１５分間の遠心
分離処理して沈殿物を回収したのち、この沈殿物を７５
％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥してから、５μｇ
／mlＲＮａｓｅＡを含む水５０μｌに沈殿を溶かし、そ
の１０μｌをＨ緩衝液［Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８２）］中においてＥｃｏ
ＲＩ消化して挿入断片を調べると、実施例１で得られた
クローンよりも３'端に１００bpの長い断片を有するク
ローンと、５'端に１００bp長い断片を有するΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子クローンがそれ
ぞれ得られ、消化後に得られたそれぞれの挿入断片を低
融点アガロースゲル電気泳動により回収した。次いでこ
れらのクローンについて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐ
ｈａｇｅｍｉｄに変換して制限酵素地図を作成した。得
られた２クローンとも同一の制限酵素地図を示す部分を
もつものであり、それぞれをＺ８及びＨ２４１と命名し
た。この２つのクローンの中で、Ｈ２４１はｃｏｄｉｎ
ｇ ｒｅｇｉｏｎをすべて含む完全なクローンであっ
た。しかしＺ８をＣＯＳ細胞にトランスフェクトしたと
ころ目的の酵素タンパクの発現はみられなかった。
【００４１】実施例３ 実施例２で得られたクローンｐ５β−２４１（Ｈ２４
１）を用いて、ＸｂａＩで完全消化したのち、５０mMト
リス−塩酸（pH８.０）中にバクテリアアルカリホスフ
ァターゼ（東洋紡績社製）を０.５単位加え、６５℃で
１時間反応させた（以下ＢＡＰ処理と略す）。反応液を
フェノール／クロロホルム液で２回処理したのち、水層
に１０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノ
ールを加え、遠心分離処理してベクターを回収した。ゲ
ルから回収した挿入断片とＸｈｏＩ消化したベクターｐ
ＳＶＬ（ファルマシア社製）を、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて連結させ、プラスミドｐＳＶ５
β−２４１と命名した。１００mlのＬＢ培地（１リット
ル当たり、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエ
キストラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ含有）で培養した対
数増殖期のエシェリヒア・コリＭＶ１１８４（宝酒造か
ら購入）を集菌し、４０mlの氷冷した３０mM酢酸カリウ
ム、１００mMＲｂＣｌ、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＭｎ
Ｃｌ2及び１５％グリセリン（pH５.８）で懸濁したの
ち、０℃で５分間放置後遠心分離して集菌し、さらに、
４mlの１０mMＭＯＰＳ、７５mMＣａＣｌ2、１０mMＲｂ
Ｃｌ及び１５％グリセリン（pH６.５）に懸濁してコン
ピテント細胞とした。この大腸菌懸濁液２００μｌにラ
イゲーションしたプラスミドｐＳＶ５β−２４１のＤＮ
Ａ溶液２０μｌを加え、０℃で３０分間放置したのち、
これにＬＢ培地８００μｌを加え、３７℃、１時間保温
し、アンピシリン５０ng／mlを含有するＬＢ寒天プレー
トにまき、一晩培養して形質転換体エシェリヒア・コリ
ＭＶ１１８４ｐＳＶ５β−２４１を得た。このプラスミ
ドｐＳＶ５β−２４１にて形質転換されたエシェリヒア
・コリＭＶ１１８４ ｐＳＶ５β−２４１を工業技術院
微生物工業技術研究所に「微工研菌寄第１２２１９号、
ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１９」として寄託した。
１）を用いて、ＸｂａＩで完全消化したのち、５０mMト
リス−塩酸（pH８.０）中にバクテリアアルカリホスフ
ァターゼ（東洋紡績社製）を０.５単位加え、６５℃で
１時間反応させた（以下ＢＡＰ処理と略す）。反応液を
フェノール／クロロホルム液で２回処理したのち、水層
に１０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノ
ールを加え、遠心分離処理してベクターを回収した。ゲ
ルから回収した挿入断片とＸｈｏＩ消化したベクターｐ
ＳＶＬ（ファルマシア社製）を、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて連結させ、プラスミドｐＳＶ５
β−２４１と命名した。１００mlのＬＢ培地（１リット
ル当たり、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエ
キストラクト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ含有）で培養した対
数増殖期のエシェリヒア・コリＭＶ１１８４（宝酒造か
ら購入）を集菌し、４０mlの氷冷した３０mM酢酸カリウ
ム、１００mMＲｂＣｌ、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＭｎ
Ｃｌ2及び１５％グリセリン（pH５.８）で懸濁したの
ち、０℃で５分間放置後遠心分離して集菌し、さらに、
４mlの１０mMＭＯＰＳ、７５mMＣａＣｌ2、１０mMＲｂ
Ｃｌ及び１５％グリセリン（pH６.５）に懸濁してコン
ピテント細胞とした。この大腸菌懸濁液２００μｌにラ
イゲーションしたプラスミドｐＳＶ５β−２４１のＤＮ
Ａ溶液２０μｌを加え、０℃で３０分間放置したのち、
これにＬＢ培地８００μｌを加え、３７℃、１時間保温
し、アンピシリン５０ng／mlを含有するＬＢ寒天プレー
トにまき、一晩培養して形質転換体エシェリヒア・コリ
ＭＶ１１８４ｐＳＶ５β−２４１を得た。このプラスミ
ドｐＳＶ５β−２４１にて形質転換されたエシェリヒア
・コリＭＶ１１８４ ｐＳＶ５β−２４１を工業技術院
微生物工業技術研究所に「微工研菌寄第１２２１９号、
ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１９」として寄託した。
【００４２】次いで、形質転換した単一の白コロニーを
５０μｇ／mlアンピシリンを含む２mlのＬＢ培地で一晩
培養し、遠心分離処理により集菌した。これに１mg／ml
リゾチーム（シグマ社製）を含む５０mMトリス−塩酸
（pH８.０）、５０mMＥＤＴＡ（pH８.０）、１５％ショ
糖０.６mlを加え、３７℃で１５分間反応させたのち、
１０％ＳＤＳ１２μｌを加え混ぜ合わせ、次いで５Ｍ酢
酸カリウム６０μｌを加え、０℃で３０分間放置した。
その後、１５,０００rpmで１０分間遠心分離処理し、上
澄に等量のフェノール／クロロホルムを加えて処理し、
水層をエーテルで２回処理してから、２倍容のエタノー
ルを加え、−７０℃で１５分間放置したのち、１５,０
００rpmで１５分間遠心分離処理して沈殿物を回収し、
７５％エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥した。次に、
この沈殿物をＲＮａｓｅＡ５μｇ／mlを含む水に溶き、
ＸｂａＩで消化して挿入断片を含むクローンを選別し
た。このクローンを含む単一コロニーをアンピシリン５
０μｇ／mlを含むＬＢ培地６mlにて３７℃で一晩培養
後、その５mlを５００mlのＬＢ液に植菌し、３７℃で培
養した。対数増殖期の菌液に２０μｇ／mlのクロラムフ
ェニコールを加え、さらに一晩培養したのち、６,００
０rpmで１０分間の遠心分離処理して集菌し、次いで、
これに８％ショ糖、１０％トリトンＸ、２５mMＥＤＴ
Ａ、５０mMトリス−塩酸（pH８.０）及び０.２５Ｍトリ
ス−塩酸（pH８.０）を含む溶液１５mlに溶解した１０m
g／mlのリゾチーム１.５mlを加え、加熱により溶菌させ
た。さらに、１４,０００rpmで３０分間の遠心分離後の
上澄に、等量のフェノール／クロロホルムを加えて処理
し、水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容
のエタノールを加えて、−７０℃で１５分放置したの
ち、３,０００rpmで１５分間遠心分離処理して沈殿物を
回収した。
５０μｇ／mlアンピシリンを含む２mlのＬＢ培地で一晩
培養し、遠心分離処理により集菌した。これに１mg／ml
リゾチーム（シグマ社製）を含む５０mMトリス−塩酸
（pH８.０）、５０mMＥＤＴＡ（pH８.０）、１５％ショ
糖０.６mlを加え、３７℃で１５分間反応させたのち、
１０％ＳＤＳ１２μｌを加え混ぜ合わせ、次いで５Ｍ酢
酸カリウム６０μｌを加え、０℃で３０分間放置した。
その後、１５,０００rpmで１０分間遠心分離処理し、上
澄に等量のフェノール／クロロホルムを加えて処理し、
水層をエーテルで２回処理してから、２倍容のエタノー
ルを加え、−７０℃で１５分間放置したのち、１５,０
００rpmで１５分間遠心分離処理して沈殿物を回収し、
７５％エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥した。次に、
この沈殿物をＲＮａｓｅＡ５μｇ／mlを含む水に溶き、
ＸｂａＩで消化して挿入断片を含むクローンを選別し
た。このクローンを含む単一コロニーをアンピシリン５
０μｇ／mlを含むＬＢ培地６mlにて３７℃で一晩培養
後、その５mlを５００mlのＬＢ液に植菌し、３７℃で培
養した。対数増殖期の菌液に２０μｇ／mlのクロラムフ
ェニコールを加え、さらに一晩培養したのち、６,００
０rpmで１０分間の遠心分離処理して集菌し、次いで、
これに８％ショ糖、１０％トリトンＸ、２５mMＥＤＴ
Ａ、５０mMトリス−塩酸（pH８.０）及び０.２５Ｍトリ
ス−塩酸（pH８.０）を含む溶液１５mlに溶解した１０m
g／mlのリゾチーム１.５mlを加え、加熱により溶菌させ
た。さらに、１４,０００rpmで３０分間の遠心分離後の
上澄に、等量のフェノール／クロロホルムを加えて処理
し、水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容
のエタノールを加えて、−７０℃で１５分放置したの
ち、３,０００rpmで１５分間遠心分離処理して沈殿物を
回収した。
【００４３】この沈殿物に２１mlのトリス−塩酸（pH
７.４）を加えて溶解し、塩化セシウム２０ｇ及び１０m
g／mlのエチジウムブロマイド１mlを加え、５０,０００
rpm、４℃にて一晩遠心分離処理して閉環状プラスミド
ＤＮＡを分取したのち、これにエチジウムブロマイドを
除くために等量のブタノールを加えて遠心分離処理し、
さらに水層を２回ブタノールを加えて処理した。そのサ
ンプルを０.２Ｍ ＮａＣｌを含んだトリス−塩酸（pH
７.４）で洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲル（ファル
マシア社製）にてゲルろ過し不純物を除いたのち、２倍
容のエタノールを加えて、−７０℃で１５分間放置し、
次いで３,０００rpmで３０分間遠心分離処理し、沈殿物
を７５％エタノールで２回洗浄後乾燥し、濃度を１μｇ
／μｌになるように調製した。得られたプラスミドか
ら、全領域にわたって塩基配列を決定するに当たり、こ
の遺伝子内を各制限酵素で消化し、各プラスミドｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔと連結し、エシェリヒア・コリＸＬ−
Ｂｌｕｅを宿主菌として常法により形質転換した。挿入
の確認された単一クローンを５０μｇ／mlアンピシリン
と０.０１％チアミンを含む２倍ＹＴ培地（１リットル
当たり、バクトトリプトン１６ｇ、バクトイーストエキ
ストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇを含有）１０mlに植菌
し、３７℃で１時間培養してからヘルパーファージＭ１
３ＫＯ７（宝酒造社製）を６×１０8pfu感染させ、一晩
培養したのち、１０,０００rpmで１０分間遠心分離後の
上澄に、５分の１容のＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（２０％ポ
リエチレングリコール６０００、２.５Ｍ ＮａＣｌ）
を加え、室温に１５分間放置した。次いで、１５,００
０rpmで１０分間の遠心分離後の沈殿物に、５μｇ／ml
ＲＮａｓｅＡを含む水を加えて溶解し、室温に１５分間
放置したのち、等量のフェノールで処理した。遠心分離
後の水層をフェノール／クロロホルムで処理し、水層に
１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノ
ールを加え−７０℃に１５分間放置したのち、１５,０
００rpmで１５分間遠心分離後の沈殿物を７５％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥した。このようにして得た
ＤＮＡを、ＥｘｏIII／Ｍｕｎｇ・ｂｅａｎ ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［タカラ社
製：Ｇｅｎｅ，２８，３５１−３５９（１９８４）］及
びＳｅｑｕｅｎｓｅ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて、Δ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素をコードする領域
付近の塩基配列を求めた。図１にそのアミノ酸配列を、
図２に該アミノ酸配列をコードする塩基配列示す。
７.４）を加えて溶解し、塩化セシウム２０ｇ及び１０m
g／mlのエチジウムブロマイド１mlを加え、５０,０００
rpm、４℃にて一晩遠心分離処理して閉環状プラスミド
ＤＮＡを分取したのち、これにエチジウムブロマイドを
除くために等量のブタノールを加えて遠心分離処理し、
さらに水層を２回ブタノールを加えて処理した。そのサ
ンプルを０.２Ｍ ＮａＣｌを含んだトリス−塩酸（pH
７.４）で洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲル（ファル
マシア社製）にてゲルろ過し不純物を除いたのち、２倍
容のエタノールを加えて、−７０℃で１５分間放置し、
次いで３,０００rpmで３０分間遠心分離処理し、沈殿物
を７５％エタノールで２回洗浄後乾燥し、濃度を１μｇ
／μｌになるように調製した。得られたプラスミドか
ら、全領域にわたって塩基配列を決定するに当たり、こ
の遺伝子内を各制限酵素で消化し、各プラスミドｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔと連結し、エシェリヒア・コリＸＬ−
Ｂｌｕｅを宿主菌として常法により形質転換した。挿入
の確認された単一クローンを５０μｇ／mlアンピシリン
と０.０１％チアミンを含む２倍ＹＴ培地（１リットル
当たり、バクトトリプトン１６ｇ、バクトイーストエキ
ストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇを含有）１０mlに植菌
し、３７℃で１時間培養してからヘルパーファージＭ１
３ＫＯ７（宝酒造社製）を６×１０8pfu感染させ、一晩
培養したのち、１０,０００rpmで１０分間遠心分離後の
上澄に、５分の１容のＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（２０％ポ
リエチレングリコール６０００、２.５Ｍ ＮａＣｌ）
を加え、室温に１５分間放置した。次いで、１５,００
０rpmで１０分間の遠心分離後の沈殿物に、５μｇ／ml
ＲＮａｓｅＡを含む水を加えて溶解し、室温に１５分間
放置したのち、等量のフェノールで処理した。遠心分離
後の水層をフェノール／クロロホルムで処理し、水層に
１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノ
ールを加え−７０℃に１５分間放置したのち、１５,０
００rpmで１５分間遠心分離後の沈殿物を７５％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥した。このようにして得た
ＤＮＡを、ＥｘｏIII／Ｍｕｎｇ・ｂｅａｎ ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［タカラ社
製：Ｇｅｎｅ，２８，３５１−３５９（１９８４）］及
びＳｅｑｕｅｎｓｅ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて、Δ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素をコードする領域
付近の塩基配列を求めた。図１にそのアミノ酸配列を、
図２に該アミノ酸配列をコードする塩基配列示す。
【００４４】この結果から、Δ4−３−ケトステロイド
−５β−還元酵素遺伝子は９７８塩基から成り、３２６
残基のアミノ酸をコードする遺伝子であり、開始コドン
ＭｅｔをコードするＡＴＧから始まり、Ｍｅｔ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａをコードする５'−
ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＣＴ ＧＣＡ−
３'の塩基配列を有し、かつＣ末端側アミノ酸配列が−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒをコ
ードする５'−ＣＣＡ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＡＣＧＡＡ
ＴＡＣ−３'の塩基配列を有し、ＴＧＡの終止コドン
からなる塩基配列を有するラット由来のΔ4−３−ケト
ステロイド−５β−還元酵素遺伝子であるポリペプチド
をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片であることが確
認された。このようにして得られたΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子を含むＤＮＡの全塩基配
列を、配列表の配列番号１に示す。
−５β−還元酵素遺伝子は９７８塩基から成り、３２６
残基のアミノ酸をコードする遺伝子であり、開始コドン
ＭｅｔをコードするＡＴＧから始まり、Ｍｅｔ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａをコードする５'−
ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＣＴ ＧＣＡ−
３'の塩基配列を有し、かつＣ末端側アミノ酸配列が−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒをコ
ードする５'−ＣＣＡ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＡＣＧＡＡ
ＴＡＣ−３'の塩基配列を有し、ＴＧＡの終止コドン
からなる塩基配列を有するラット由来のΔ4−３−ケト
ステロイド−５β−還元酵素遺伝子であるポリペプチド
をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片であることが確
認された。このようにして得られたΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素遺伝子を含むＤＮＡの全塩基配
列を、配列表の配列番号１に示す。
【００４５】実施例４ 実施例３で得られたΔ4−３−ケトステロイド−５β−
還元酵素遺伝子を挿入したベクターが目的とする酵素活
性を発現することを確認するために、動物細胞で発現さ
せるベクターを構築した。まず、Δ4−３−ケトステロ
イド−５β−還元酵素遺伝子を含むクローンｐ５β−２
４１のＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（１.９kbp）を「サイエ
ンス（Ｓｉｅｎｃｅ）」第２３４巻、第１２５８〜１２
６１ページ（１９８６年）に従い、プラスミドｐＳＶＬ
発現ベクターに組換えた。この組換えに当たり、まずク
ローンｐ５β−２４１のＤＮＡ１０μｇをＨ緩衝液（前
出）中において１５単位のＸｂａＩで３７℃で２時間消
化して切断したのち、低融点アガロースゲル電気泳動に
かけ、ＤＮＡ断片を抽出精製乾燥した。また、これとは
別に、プラスミドｐＳＶＬ（ファルマシア社製）ＤＮＡ
３μｇをＭ緩衝液［Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）］中で、８単位のＸｂ
ａＩを加え、３０℃で２時間反応させた。反応後、ＢＡ
Ｐ処理（前述）し、約１.９kbpのＤＮＡ断片とライゲイ
ションキットを用いて連結した。これをエレコトロポレ
ーション法でＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。
還元酵素遺伝子を挿入したベクターが目的とする酵素活
性を発現することを確認するために、動物細胞で発現さ
せるベクターを構築した。まず、Δ4−３−ケトステロ
イド−５β−還元酵素遺伝子を含むクローンｐ５β−２
４１のＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（１.９kbp）を「サイエ
ンス（Ｓｉｅｎｃｅ）」第２３４巻、第１２５８〜１２
６１ページ（１９８６年）に従い、プラスミドｐＳＶＬ
発現ベクターに組換えた。この組換えに当たり、まずク
ローンｐ５β−２４１のＤＮＡ１０μｇをＨ緩衝液（前
出）中において１５単位のＸｂａＩで３７℃で２時間消
化して切断したのち、低融点アガロースゲル電気泳動に
かけ、ＤＮＡ断片を抽出精製乾燥した。また、これとは
別に、プラスミドｐＳＶＬ（ファルマシア社製）ＤＮＡ
３μｇをＭ緩衝液［Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）］中で、８単位のＸｂ
ａＩを加え、３０℃で２時間反応させた。反応後、ＢＡ
Ｐ処理（前述）し、約１.９kbpのＤＮＡ断片とライゲイ
ションキットを用いて連結した。これをエレコトロポレ
ーション法でＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。
【００４６】実施例５ ＣＯＳ細胞によるΔ4−３−ケトステロイド−５β−還
元酵素の発現を確認した。２５mMトリス−塩酸（pH７.
４）、１３７mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、０.７mM
ＣａＣｌ2、０.５mM ＭｇＣｌ2及び０.６mM Ｎａ2Ｈ
ＰＯ4から成る緩衝液（以下、ＴＢＳと略称する）１７
５μｌに、ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社
製）４mgと前記のライゲイションしたＤＮＡ１０μｇを
加えた。このＤＥＡＥ−デキストラン／ＤＮＡ混合液
を、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ジプコ
社製）で培養されたＣＯＳ７細胞（１×１０8個）に加
えて、常法によるエレコトロポレーション法でＣＯＳ７
細胞にトランスフェクトした。次いで同一培養液を使用
して、５％ＣＯ2濃度、３７℃で細胞培養した。この培
養物についてΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素活性の測定を行った。トランスフェクトしたＣＯＳ７
細胞を６０時間培養したのち、細胞を集めＦｕｒｕｅｂ
ｉｓｕらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ、９１２、１１０〜１１４）に従い、反応プロダ
クトの量を測定した。すなわち、トランスフェクト後、
６０時間培養したＣＯＳ７細胞を０.１Ｍリン酸緩衝液
（pH７.４）中へホモジナイズして、１０,０００rpm、
１０分間遠心分離し、その上澄に、１００mMトリス−塩
酸（pH７.４）、０.６μmolＮＡＤＰＨ及び０.２５μmo
lの基質（アンドロステンジオン、コルチゾン、７α−
ヒドロキシ−４−コレスタン−３−オン）を加え、３７
℃で２時間反応させたのち、エタノール１mlを加えて反
応を停止させ、さらに石油エーテル５mlを加えて反応産
物を抽出し、この反応産物をガスクロマトグラフィー
［カラム：ケミカルボンディドタイプのメチルシリコン
キャピラリー（島津社製、モデルＣＢＰ１−Ｍ５０−０
２５、０.２５×５０ｍ）、カラム温度：２９０℃、イ
ンジェクションポイント：３２０℃］にて分析した。ま
た、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素に対す
る抗血清を用いたウエスタン・ブロッティング法により
免疫反応性を確認した。その結果、それぞれの基質に対
して５β−反応産物を検出することができた。一方、ｐ
ＳＶＬベクターのみをトランスフェクトしたＣＯＳ７細
胞では、全くΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素を検出できなかった。さらに、ウエスタン・ブロッテ
ィングの結果、抗体に反応するタンパク質を確認し（図
４）、これを精製して分子量が３７０００で、アンドロ
ステンジオンを基質とし、還元型ＮＡＤＰから５β−ア
ンドロステンジオンとＮＡＤＰを生成する反応を触媒す
るΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を得た。
元酵素の発現を確認した。２５mMトリス−塩酸（pH７.
４）、１３７mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、０.７mM
ＣａＣｌ2、０.５mM ＭｇＣｌ2及び０.６mM Ｎａ2Ｈ
ＰＯ4から成る緩衝液（以下、ＴＢＳと略称する）１７
５μｌに、ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社
製）４mgと前記のライゲイションしたＤＮＡ１０μｇを
加えた。このＤＥＡＥ−デキストラン／ＤＮＡ混合液
を、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ジプコ
社製）で培養されたＣＯＳ７細胞（１×１０8個）に加
えて、常法によるエレコトロポレーション法でＣＯＳ７
細胞にトランスフェクトした。次いで同一培養液を使用
して、５％ＣＯ2濃度、３７℃で細胞培養した。この培
養物についてΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素活性の測定を行った。トランスフェクトしたＣＯＳ７
細胞を６０時間培養したのち、細胞を集めＦｕｒｕｅｂ
ｉｓｕらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ、９１２、１１０〜１１４）に従い、反応プロダ
クトの量を測定した。すなわち、トランスフェクト後、
６０時間培養したＣＯＳ７細胞を０.１Ｍリン酸緩衝液
（pH７.４）中へホモジナイズして、１０,０００rpm、
１０分間遠心分離し、その上澄に、１００mMトリス−塩
酸（pH７.４）、０.６μmolＮＡＤＰＨ及び０.２５μmo
lの基質（アンドロステンジオン、コルチゾン、７α−
ヒドロキシ−４−コレスタン−３−オン）を加え、３７
℃で２時間反応させたのち、エタノール１mlを加えて反
応を停止させ、さらに石油エーテル５mlを加えて反応産
物を抽出し、この反応産物をガスクロマトグラフィー
［カラム：ケミカルボンディドタイプのメチルシリコン
キャピラリー（島津社製、モデルＣＢＰ１−Ｍ５０−０
２５、０.２５×５０ｍ）、カラム温度：２９０℃、イ
ンジェクションポイント：３２０℃］にて分析した。ま
た、Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素に対す
る抗血清を用いたウエスタン・ブロッティング法により
免疫反応性を確認した。その結果、それぞれの基質に対
して５β−反応産物を検出することができた。一方、ｐ
ＳＶＬベクターのみをトランスフェクトしたＣＯＳ７細
胞では、全くΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素を検出できなかった。さらに、ウエスタン・ブロッテ
ィングの結果、抗体に反応するタンパク質を確認し（図
４）、これを精製して分子量が３７０００で、アンドロ
ステンジオンを基質とし、還元型ＮＡＤＰから５β−ア
ンドロステンジオンとＮＡＤＰを生成する反応を触媒す
るΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を得た。
【００４７】
【発明の効果】本発明によると、ラット肝由来のｍＲＮ
Ａを基にして得られたｃＤＮＡライブラリーの中から、
Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する
ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築された発
現ベクターを細胞に導入することにより得られた形質転
換細胞は、効率よくΔ4−３−ケトステロイド−５β−
還元酵素を生産する。該酵素は、例えばステロイド代謝
関連医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不
活化剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクロ
ーナル抗体などの抗体作成用の抗原などとして有用であ
る。また、本発明により、Δ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素の全アミノ酸配列及びこのアミノ酸配列
をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたの
で、該酵素の基質特異性の変換や耐熱性向上などのプロ
テインエンジニアリングが可能となった。
Ａを基にして得られたｃＤＮＡライブラリーの中から、
Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を発現する
ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築された発
現ベクターを細胞に導入することにより得られた形質転
換細胞は、効率よくΔ4−３−ケトステロイド−５β−
還元酵素を生産する。該酵素は、例えばステロイド代謝
関連医薬品開発のための材料、ステロイドホルモンの不
活化剤、診断薬としてのモノクローナル抗体やポリクロ
ーナル抗体などの抗体作成用の抗原などとして有用であ
る。また、本発明により、Δ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素の全アミノ酸配列及びこのアミノ酸配列
をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたの
で、該酵素の基質特異性の変換や耐熱性向上などのプロ
テインエンジニアリングが可能となった。
【００４８】
【図１】図１はΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
酵素タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【００４９】
【図２】図２は図１のアミノ酸配列をコードするΔ4−
３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡの塩
基配列を示す図である。
３−ケトステロイド−５β−還元酵素遺伝子ＤＮＡの塩
基配列を示す図である。
【００５０】
【図３】図３はプラスミドｐＳＶ５β−２４１の構築を
示す図である。
示す図である。
【００５１】
【図４】図４はＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２４１において発
現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭａｂ−５
βを用いたウエスタン−ブロット解析結果を示す写真図
である。
現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭａｂ−５
βを用いたウエスタン−ブロット解析結果を示す写真図
である。
【００５２】
【図５】図５はラット肝由来のΔ4−３−ケトステロイ
ド−５β−還元酵素標品をリジルエンドペプチダーゼ処
理して得られたペプチドフラグメントのアミノ酸配列を
示す図である。
ド−５β−還元酵素標品をリジルエンドペプチダーゼ処
理して得られたペプチドフラグメントのアミノ酸配列を
示す図である。
【００５３】
【図６】図６は、実施例１において、λｇｔ１１ライブ
ラリーからΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
のｃＤＮＡをスクリーニングするのに用いたＤＮＡプロ
ーブの塩基配列を示す図である。
ラリーからΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素
のｃＤＮＡをスクリーニングするのに用いたＤＮＡプロ
ーブの塩基配列を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】図４はＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２４１において発
現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭａｂ−５
βを用いたウエスタン−ブロット解析結果を示す図であ
る。
現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭａｂ−５
βを用いたウエスタン−ブロット解析結果を示す図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素を発現するＤＮＡを有する組換えプラスミドによって
形質転換された細胞であることを特徴とするΔ4−３−
ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋
な細胞。 - 【請求項２】形質転換された細胞がプラスミドｐＳＶ５
β−２４１によって形質転換されたものである請求項１
記載の細胞。 - 【請求項３】プラスミドｐＳＶ５β−２４１によって形
質転換された細胞がＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２４１である
請求項２記載の細胞。 - 【請求項４】図１で表されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有することを特徴とするΔ4−３−ケトステ
ロイド−５β−還元酵素を発現する実質上純粋なＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】塩基配列が図２で表されるものである請求
項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】Δ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵
素を発現するＤＮＡを有する組換えプラスミドによって
形質転換された細胞であるΔ4−３−ケトステロイド−
５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞を培地に培
養し、次いでその培養物からΔ4−３−ケトステロイド
−５β−還元酵素を採取することを特徴とするΔ4−３
−ケトステロイド−５β−還元酵素の製造方法。 - 【請求項７】形質転換された細胞がプラスミドｐＳＶ５
β−２４１によって形質転換されたものである請求項６
記載のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元酵素の製
造方法。 - 【請求項８】プラスミドｐＳＶ５β−２４１によって形
質転換された細胞がＣＯＳ−ｐＳＶ５β−２４１である
請求項７記載のΔ4−３−ケトステロイド−５β−還元
酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03133482A JP3078353B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03133482A JP3078353B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121673A true JPH06121673A (ja) | 1994-05-06 |
| JP3078353B2 JP3078353B2 (ja) | 2000-08-21 |
Family
ID=15105804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03133482A Expired - Lifetime JP3078353B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3078353B2 (ja) |
-
1991
- 1991-05-09 JP JP03133482A patent/JP3078353B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3078353B2 (ja) | 2000-08-21 |
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