JPH06121687A - バキュロウイルスで発現させたブタのｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）及びその製造方法 - Google Patents
バキュロウイルスで発現させたブタのｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）及びその製造方法Info
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- JPH06121687A JPH06121687A JP5071875A JP7187593A JPH06121687A JP H06121687 A JPH06121687 A JP H06121687A JP 5071875 A JP5071875 A JP 5071875A JP 7187593 A JP7187593 A JP 7187593A JP H06121687 A JPH06121687 A JP H06121687A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウシやウマの卵胞発育不全等の繁殖障害の治
療、体外受精等のための多排卵誘起法などに用いられる
下垂体ホルモンのＦＳＨを、ＬＨ等の他のタンパクの混
入がないように、組換えタンパクとしてバキュロウイル
スで発現させて得る。 【構成】 ＦＳＨα鎖を発現する組換え体バキュロウイ
ルスと、ＦＳＨβ鎖を発現する組換え体バキュロウイル
スとを、感受性細胞に重感染させ、その培養上清よりＦ
ＳＨαβ鎖２量体を回収する
療、体外受精等のための多排卵誘起法などに用いられる
下垂体ホルモンのＦＳＨを、ＬＨ等の他のタンパクの混
入がないように、組換えタンパクとしてバキュロウイル
スで発現させて得る。 【構成】 ＦＳＨα鎖を発現する組換え体バキュロウイ
ルスと、ＦＳＨβ鎖を発現する組換え体バキュロウイル
スとを、感受性細胞に重感染させ、その培養上清よりＦ
ＳＨαβ鎖２量体を回収する
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えタンパクとして
バキュロウイルスで発現させたＦＳＨ、並びにその製造
方法に関し、特に、他の下垂体ホルモンの夾雑のないＦ
ＳＨ、及びその製造方法に関する。
バキュロウイルスで発現させたＦＳＨ、並びにその製造
方法に関し、特に、他の下垂体ホルモンの夾雑のないＦ
ＳＨ、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来の技術】ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモ
ン）は下垂体前葉ホルモンの１つであり、ＬＨとの共同
作用により生殖線の機能の調整を行っており、これら２
つのホルモンは性腺刺激ホルモンと呼ばれている。ＦＳ
Ｈは、α、β２つのサブユニットよりなるタンパク性の
ホルモンであり、それぞれ糖の付加部位を２つ持ってい
る。このうちのαサブユニットはＦＳＨ、ＬＨ（黄体形
成ホルモン）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ＣＧ
（絨毛性性腺刺激ホルモン）で共通であり、ホルモンの
特性はβサブユニットにより特徴づけられる。
ン）は下垂体前葉ホルモンの１つであり、ＬＨとの共同
作用により生殖線の機能の調整を行っており、これら２
つのホルモンは性腺刺激ホルモンと呼ばれている。ＦＳ
Ｈは、α、β２つのサブユニットよりなるタンパク性の
ホルモンであり、それぞれ糖の付加部位を２つ持ってい
る。このうちのαサブユニットはＦＳＨ、ＬＨ（黄体形
成ホルモン）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ＣＧ
（絨毛性性腺刺激ホルモン）で共通であり、ホルモンの
特性はβサブユニットにより特徴づけられる。
【０００３】ＦＳＨの代表的な作用は、卵巣においては
卵胞を刺激して卵胞を成長、成熟させることにある。卵
子の成熟、排卵は主にＬＨの作用による。精巣において
は、ＦＳＨは精細管に作用してこれを肥大させそれに伴
って精巣重量を増加させ、精祖細胞と精母細胞の分裂増
殖を進め静止形成にも関与する。
卵胞を刺激して卵胞を成長、成熟させることにある。卵
子の成熟、排卵は主にＬＨの作用による。精巣において
は、ＦＳＨは精細管に作用してこれを肥大させそれに伴
って精巣重量を増加させ、精祖細胞と精母細胞の分裂増
殖を進め静止形成にも関与する。
【０００４】産業的には、本ホルモンは、その生理活性
を利用してウシやウマの卵胞発育不全などの繁殖障害の
治療、ウシの体外受精や誘起多胎を目的とした多排卵誘
起法に用いられている。これらの目的に使用されている
ホルモンはブタの脳下垂体より調製されている。
を利用してウシやウマの卵胞発育不全などの繁殖障害の
治療、ウシの体外受精や誘起多胎を目的とした多排卵誘
起法に用いられている。これらの目的に使用されている
ホルモンはブタの脳下垂体より調製されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のごとく、産業目
的に使用されているＦＳＨはブタの下垂体より精製され
ているためＦＳＨ以外の下垂体（脳下垂体）ホルモンの
混入を防ぐことは現在のところ非常に困難である。これ
らのうちで、特にＬＨの混入があると例えば多排卵誘起
法に使用した場合に排卵時期のコントロールが困難とな
り、充分に成熟していない卵子が排卵されたり、受精卵
異色の供卵牛において回収胚の性状が不良であるなどの
問題が生じている。また、基礎研究の面でも純粋なＦＳ
Ｈが得づらいことは、このホルモンの詳細な生理活性の
研究を困難にしている。
的に使用されているＦＳＨはブタの下垂体より精製され
ているためＦＳＨ以外の下垂体（脳下垂体）ホルモンの
混入を防ぐことは現在のところ非常に困難である。これ
らのうちで、特にＬＨの混入があると例えば多排卵誘起
法に使用した場合に排卵時期のコントロールが困難とな
り、充分に成熟していない卵子が排卵されたり、受精卵
異色の供卵牛において回収胚の性状が不良であるなどの
問題が生じている。また、基礎研究の面でも純粋なＦＳ
Ｈが得づらいことは、このホルモンの詳細な生理活性の
研究を困難にしている。
【０００６】本発明者らは、これらの問題を解決するた
めに遺伝子工学的にＦＳＨを発現させることを考え、こ
れによって、他のホルモン活性の混入の危険をなくし、
ＦＳＨ単独の生理活性を安定して利用できるＦＳＨの提
供、あるいは偶蹄類のＦＳＨの製造方法の提供を目的と
するものである。
めに遺伝子工学的にＦＳＨを発現させることを考え、こ
れによって、他のホルモン活性の混入の危険をなくし、
ＦＳＨ単独の生理活性を安定して利用できるＦＳＨの提
供、あるいは偶蹄類のＦＳＨの製造方法の提供を目的と
するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような課題を達成す
るために本発明者は、上記特許請求の範囲の各請求項に
記載した本発明を完成した。
るために本発明者は、上記特許請求の範囲の各請求項に
記載した本発明を完成した。
【０００８】本発明の特徴の一つは、バキュロウイルス
で発現させたブタのＦＳＨα鎖、ブタのＦＳＨβ鎖、並
びにブタのＦＳＨαβ鎖２量体を提供するところにあ
る。
で発現させたブタのＦＳＨα鎖、ブタのＦＳＨβ鎖、並
びにブタのＦＳＨαβ鎖２量体を提供するところにあ
る。
【０００９】このようなＦＳＨα鎖の製造は、偶蹄類の
下垂体よりＦＳＨα鎖の遺伝子をクローン化する工程
と、このクローン化したＦＳＨα鎖の遺伝子をバキュロ
ウイルストランスファーベクターに組み込む工程と、野
生型バキュロウイルスと上記トランスファーベクターの
間で組換え体を作る工程と、この組換え体を感受性細胞
に感染させてＦＳＨα鎖を発現させこれを回収する工程
とを含む製造により行なうことができ、同様にＦＳＨβ
鎖の製造は、偶蹄類の下垂体よりＦＳＨβ鎖の遺伝子を
クローン化する工程と、このクローン化したＦＳＨβ鎖
の遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターに
組み込む工程と、野生型バキュロウイルスと上記トラン
スファーベクターの間で組換え体を作る工程と、この組
換え体を感受性細胞に感染させてＦＳＨβ鎖を発現させ
これを回収する工程とを含む方法により行なうことがで
きる。
下垂体よりＦＳＨα鎖の遺伝子をクローン化する工程
と、このクローン化したＦＳＨα鎖の遺伝子をバキュロ
ウイルストランスファーベクターに組み込む工程と、野
生型バキュロウイルスと上記トランスファーベクターの
間で組換え体を作る工程と、この組換え体を感受性細胞
に感染させてＦＳＨα鎖を発現させこれを回収する工程
とを含む製造により行なうことができ、同様にＦＳＨβ
鎖の製造は、偶蹄類の下垂体よりＦＳＨβ鎖の遺伝子を
クローン化する工程と、このクローン化したＦＳＨβ鎖
の遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターに
組み込む工程と、野生型バキュロウイルスと上記トラン
スファーベクターの間で組換え体を作る工程と、この組
換え体を感受性細胞に感染させてＦＳＨβ鎖を発現させ
これを回収する工程とを含む方法により行なうことがで
きる。
【００１０】また上記ＦＳＨα鎖を発現する組換え体バ
キュロウイルスと、ＦＳＨβ鎖を発現する組換え体バキ
ュロウイルスとを、感受性細胞に重感染させ、その培養
上清よりＦＳＨαβ鎖２量体を回収することで偶蹄類の
ＦＳＨαβ鎖２量体を製造することができる。
キュロウイルスと、ＦＳＨβ鎖を発現する組換え体バキ
ュロウイルスとを、感受性細胞に重感染させ、その培養
上清よりＦＳＨαβ鎖２量体を回収することで偶蹄類の
ＦＳＨαβ鎖２量体を製造することができる。
【００１１】本発明のブタのＦＳＨαβ鎖２量体、又は
偶蹄類のＦＳＨαβ鎖２量体ＦＳＨは、これを有効成分
として、動物の繁殖障害の治療剤、動物の多排卵誘起剤
として用いることができ、また抗ＦＳＨ血清を製造する
ための抗原として用いることができる。
偶蹄類のＦＳＨαβ鎖２量体ＦＳＨは、これを有効成分
として、動物の繁殖障害の治療剤、動物の多排卵誘起剤
として用いることができ、また抗ＦＳＨ血清を製造する
ための抗原として用いることができる。
【００１２】
【実施例】以下本発明を実施例に基づいてさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００１３】実施例１ ＦＳＨα及びβ遺伝子の発現 ブタの下垂体より調製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）よりλｇｔ１１のｃＤＮＡライブラリーを作出し
た。このｃＤＮＡライブラリーよりラットのｐｒｅ−α
ｍＲＮＡと相補的な合成オリゴマーをプローブとしてα
遺伝子に特異的なクローンをスクリーニングした（Ｔ．
Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６３，２０９−２１７（１９８
９） ）。これらのクローンのうちのα４９クローンよ
りＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩでＦＳＨαの遺伝子の全長を
切り出し、クレノー（ｋｌｅｎｏｗ）で末端を平滑化し
た後バキュロウイルスのトランスファーベクターｐＡｃ
ＹＭ１のＳｍａＩサイトに挿入した（ｐＡｃＹＭ１ＦＳ
Ｈα）（図１）。挿入した遺伝子の向きはクローン化し
たＤＮＡをＥｃｏＲＶとＰｖｕＩＩで切断して確認し
た。常法に従い（Ｙ．Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８．１２３３−１２
５０（１９８７））ｐＡｃＹＭ１ＦＳＨαとバキュロウ
イルスＤＮＡをＳＦ細胞にコ・トランスフェクション
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、ポリヘドリン
の発現のないプラックをひろいさらにプラッククローニ
ングを２回繰り返してＳＦＨのα鎖を発現する組換えバ
キュロウイルスを得た（ＡｃＮＰＶＦＳＨα）。
ＮＡ）よりλｇｔ１１のｃＤＮＡライブラリーを作出し
た。このｃＤＮＡライブラリーよりラットのｐｒｅ−α
ｍＲＮＡと相補的な合成オリゴマーをプローブとしてα
遺伝子に特異的なクローンをスクリーニングした（Ｔ．
Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６３，２０９−２１７（１９８
９） ）。これらのクローンのうちのα４９クローンよ
りＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩでＦＳＨαの遺伝子の全長を
切り出し、クレノー（ｋｌｅｎｏｗ）で末端を平滑化し
た後バキュロウイルスのトランスファーベクターｐＡｃ
ＹＭ１のＳｍａＩサイトに挿入した（ｐＡｃＹＭ１ＦＳ
Ｈα）（図１）。挿入した遺伝子の向きはクローン化し
たＤＮＡをＥｃｏＲＶとＰｖｕＩＩで切断して確認し
た。常法に従い（Ｙ．Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８．１２３３−１２
５０（１９８７））ｐＡｃＹＭ１ＦＳＨαとバキュロウ
イルスＤＮＡをＳＦ細胞にコ・トランスフェクション
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、ポリヘドリン
の発現のないプラックをひろいさらにプラッククローニ
ングを２回繰り返してＳＦＨのα鎖を発現する組換えバ
キュロウイルスを得た（ＡｃＮＰＶＦＳＨα）。
【００１４】ＦＳＨβの遺伝子は、上記ｃＤＮＡライブ
ラリーより抗ヒトＦＳＨβ抗体をプローブとしてＦＳＨ
βに特異的なクローンをスクリーニングした（ｐＵＣＦ
ＳＨβ）（Ｙ．Ｋａｔｏ， Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ． Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５５，１０７−１１２（１９８
８））。ｐＵＣＦＳＨβよりＥｃｏＲＩでＦＳＨβの遺
伝子全長を切り出し、クレノー（ｋｌｅｎｏｗ）で末端
を平滑化した後バキュロウイルスのトランスファーベク
ターｐＡｃＹＭ１のＳｍａＩサイトに挿入した（ｐＡｃ
ＹＭ１ＦＳＨβ）（図２）。挿入した遺伝子の向きはク
ローン化したＤＮＡをＳｍａＩとＥｃｏＲＶで切断して
確認した。ｐＡｃＮＰＶＦＳＨβよりαクローンと同様
にして組換えバキュロウイルスを得た（ＡｃＮＰＶＦＳ
Ｈβ）。
ラリーより抗ヒトＦＳＨβ抗体をプローブとしてＦＳＨ
βに特異的なクローンをスクリーニングした（ｐＵＣＦ
ＳＨβ）（Ｙ．Ｋａｔｏ， Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ． Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５５，１０７−１１２（１９８
８））。ｐＵＣＦＳＨβよりＥｃｏＲＩでＦＳＨβの遺
伝子全長を切り出し、クレノー（ｋｌｅｎｏｗ）で末端
を平滑化した後バキュロウイルスのトランスファーベク
ターｐＡｃＹＭ１のＳｍａＩサイトに挿入した（ｐＡｃ
ＹＭ１ＦＳＨβ）（図２）。挿入した遺伝子の向きはク
ローン化したＤＮＡをＳｍａＩとＥｃｏＲＶで切断して
確認した。ｐＡｃＮＰＶＦＳＨβよりαクローンと同様
にして組換えバキュロウイルスを得た（ＡｃＮＰＶＦＳ
Ｈβ）。
【００１５】実施例２ 組換えバキュロウイルスで発現されたα鎖、β鎖の抗原
性の確認 組換えバキュロウイルスを約１０ＰＦＵ／ｃｅｌｌでＳ
Ｆ細胞に感染させ、この感染ＳＦ細胞を感染３日目に回
収し、その１０５個の細胞を電気泳動しウエスタンブロ
ッティング（ＷＢ）法により抗体との反応性を調べた。
ＡｃＮＰＶＦＳＨα感染細胞中には、ブタ共通α鎖に特
異的な合成ペプチドに対する抗体と反応する２本のバン
ドが認められた（図３）。このことより組換えα鎖は、
ブタ共通α鎖と少なくとも一部分同じ抗原性を持ってい
ることが確認された。組換えα鎖の分子量は約１６と１
７ｋｄ（キロダルトン）であり、アミノ酸配列より予想
される１３ｋｄより大きく、糖の付加は起こっていると
思われた。
性の確認 組換えバキュロウイルスを約１０ＰＦＵ／ｃｅｌｌでＳ
Ｆ細胞に感染させ、この感染ＳＦ細胞を感染３日目に回
収し、その１０５個の細胞を電気泳動しウエスタンブロ
ッティング（ＷＢ）法により抗体との反応性を調べた。
ＡｃＮＰＶＦＳＨα感染細胞中には、ブタ共通α鎖に特
異的な合成ペプチドに対する抗体と反応する２本のバン
ドが認められた（図３）。このことより組換えα鎖は、
ブタ共通α鎖と少なくとも一部分同じ抗原性を持ってい
ることが確認された。組換えα鎖の分子量は約１６と１
７ｋｄ（キロダルトン）であり、アミノ酸配列より予想
される１３ｋｄより大きく、糖の付加は起こっていると
思われた。
【００１６】α鎖同様にＡｃＮＰＶＦＳＨβ感染細胞に
ついても抗ラットＦＳＨβ抗体を用いてＷＢ法によって
抗原性の確認を行った。１９と２１ｋｄにこの抗体と反
応性を持つ２つのバンドが認められた（図３）。これは
アミノ酸配列より予想される１４ｋｄより大きく、また
同様な抗原性をもつ２本のバンドが認められたことより
糖の付加が起こっていると推定される。
ついても抗ラットＦＳＨβ抗体を用いてＷＢ法によって
抗原性の確認を行った。１９と２１ｋｄにこの抗体と反
応性を持つ２つのバンドが認められた（図３）。これは
アミノ酸配列より予想される１４ｋｄより大きく、また
同様な抗原性をもつ２本のバンドが認められたことより
糖の付加が起こっていると推定される。
【００１７】実施例３ ＦＳＨαβ２量体の発現 α鎖、β鎖発現組換えバキュロウイルス重感染による、
αβ鎖２量体の発現ＦＳＨは、生体内では下垂体の同一
細胞内でαβ両鎖が翻訳され、修飾を受けて２量体を作
った後に細胞外に分泌されることが知られている。また
バキュロウイルスでは、数種類の異なるタンパク質を発
現する組換え体を同時に感染させることによりそれらの
タンパク質の重合体を細胞内で作らせることが可能であ
ることが報告されている。
αβ鎖２量体の発現ＦＳＨは、生体内では下垂体の同一
細胞内でαβ両鎖が翻訳され、修飾を受けて２量体を作
った後に細胞外に分泌されることが知られている。また
バキュロウイルスでは、数種類の異なるタンパク質を発
現する組換え体を同時に感染させることによりそれらの
タンパク質の重合体を細胞内で作らせることが可能であ
ることが報告されている。
【００１８】そこで本発明者等は、αβ両鎖を発現する
組換え体をＳＦ細胞に重感染させることによりその培養
上清中に２量体が検出されるかどうか確かめた。
組換え体をＳＦ細胞に重感染させることによりその培養
上清中に２量体が検出されるかどうか確かめた。
【００１９】すなわち、上記実施例１で作成したＳＦＨ
のβ鎖を発現する組換えバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ
ＦＳＨβ）を約１０ＰＦＵ／ｃｅｌｌでＳＦ細胞に感染
させ、その１時間後に、α鎖を発現する組換えバキュロ
ウイルス（ＡｃＮＰＶＦＳＨα）を約１０ＰＦＵ／ｃｅ
ｌｌでＳＦ細胞に重感染させ、感染５日目に培養上清を
回収して検体とした。
のβ鎖を発現する組換えバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ
ＦＳＨβ）を約１０ＰＦＵ／ｃｅｌｌでＳＦ細胞に感染
させ、その１時間後に、α鎖を発現する組換えバキュロ
ウイルス（ＡｃＮＰＶＦＳＨα）を約１０ＰＦＵ／ｃｅ
ｌｌでＳＦ細胞に重感染させ、感染５日目に培養上清を
回収して検体とした。
【００２０】この検体を、Ｓｏｉｎｉ とＫｏｊｏｌａ
によって開発された、時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｓ
ｏｉｎｉ ａｎｄ Ｋｏｊｏｌａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，２９，６５−６８（１９８３） ）で、ヒツジＦ
ＳＨを標準としてＦＳＨ量を測定したところ、培養上清
中には１１３ｎｇ／ｍｌの濃度でＦＳＨが存在すること
が明らかとなった。この測定系の特異性は、この系でヒ
ツジＬＨおよびウシＴＳＨの標準品が検出されないこ
と、およびウエスタンブロティング法により、本発明の
β鎖の存在の確認されている検体中のβ鎖を検出しない
ことにより、αβ２量体に特異的であると考えられる。
によって開発された、時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｓ
ｏｉｎｉ ａｎｄ Ｋｏｊｏｌａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，２９，６５−６８（１９８３） ）で、ヒツジＦ
ＳＨを標準としてＦＳＨ量を測定したところ、培養上清
中には１１３ｎｇ／ｍｌの濃度でＦＳＨが存在すること
が明らかとなった。この測定系の特異性は、この系でヒ
ツジＬＨおよびウシＴＳＨの標準品が検出されないこ
と、およびウエスタンブロティング法により、本発明の
β鎖の存在の確認されている検体中のβ鎖を検出しない
ことにより、αβ２量体に特異的であると考えられる。
【００２１】よって、この感染細胞上清中にαβ２量体
が分泌されていることが確認された。
が分泌されていることが確認された。
【００２２】実施例４ＦＳＨαβ鎖２量体の生理活性の測定 活性の測定用検体は、以下のように調製した。Ｔｎ５細
胞を無血清培地（ＳＦ９００II）で培養し、αおよびβ
鎖を再現するバキュロウイルス組換え体を重感染させ
た。Ｔｎ５細胞は、分泌型の蛋白の発現に適するとされ
ている細胞であり、上清中の２量体量は、約１μｇ／ｍ
ｌで実施例３のＳＦ２１細胞を使った場合の約１０倍で
あった。この検体を限外濾過法により１０倍濃縮した
後、ＰＢＳ透析し、さらに活性測定用のＭ１９９培地で
透析したものを用いた。
胞を無血清培地（ＳＦ９００II）で培養し、αおよびβ
鎖を再現するバキュロウイルス組換え体を重感染させ
た。Ｔｎ５細胞は、分泌型の蛋白の発現に適するとされ
ている細胞であり、上清中の２量体量は、約１μｇ／ｍ
ｌで実施例３のＳＦ２１細胞を使った場合の約１０倍で
あった。この検体を限外濾過法により１０倍濃縮した
後、ＰＢＳ透析し、さらに活性測定用のＭ１９９培地で
透析したものを用いた。
【００２３】ＦＳＨαβ鎖２量体の生理活性を、ブタの
卵数に対するＦＳＨの作用に基づいて測定した（Jan Mo
tlik et al.J.Exp.Zoolgy 259,386〜391,1991）。卵巣
から取出された卵胞は、ＦＳＨを作用させると卵胞細胞
の膨化と卵細胞の減数分裂の再開が起こる。この変化
は、この系ではＬＨの作用では起こらない。この検出系
の感度は、ＮＩＨの標準ＦＳＨ（ヒツジ）を用いた場合
２５ｎｇ／ｍｌである。この系で、組換えＦＳＨαβ鎖
２量体の生物活性を測定したところその検出限界は、卵
胞細胞に対する活性では１ｎｇ／μｌであり、卵細胞に
対する活性では１０ｎｇ／μｌであり組換えＦＳＨが天
然ＦＳＨとほぼ同等の生理活性を持つことが示された。
卵数に対するＦＳＨの作用に基づいて測定した（Jan Mo
tlik et al.J.Exp.Zoolgy 259,386〜391,1991）。卵巣
から取出された卵胞は、ＦＳＨを作用させると卵胞細胞
の膨化と卵細胞の減数分裂の再開が起こる。この変化
は、この系ではＬＨの作用では起こらない。この検出系
の感度は、ＮＩＨの標準ＦＳＨ（ヒツジ）を用いた場合
２５ｎｇ／ｍｌである。この系で、組換えＦＳＨαβ鎖
２量体の生物活性を測定したところその検出限界は、卵
胞細胞に対する活性では１ｎｇ／μｌであり、卵細胞に
対する活性では１０ｎｇ／μｌであり組換えＦＳＨが天
然ＦＳＨとほぼ同等の生理活性を持つことが示された。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【発明の効果】本発明は、ブタのＦＳＨをバキュロウイ
ルスの組換え体を用いて発現させる事により他の下垂体
ホルモンの夾雑のないＦＳＨを得る方法を提供できる。
ルスの組換え体を用いて発現させる事により他の下垂体
ホルモンの夾雑のないＦＳＨを得る方法を提供できる。
【００２６】これによって、純粋にＦＳＨの作用のみを
取り出すことが可能となるためウシ、ウマ等の繁殖障害
の治療に安定した効果を期待することができる。
取り出すことが可能となるためウシ、ウマ等の繁殖障害
の治療に安定した効果を期待することができる。
【００２７】同様にウシの多排卵誘起法においてもＬＨ
作用によるトラブルがなくなり良好な効果が期待され
る。また、これまで特異性の高い抗血清を得ることが困
難であったが、本発現タンパクを用いることによってこ
のような問題が解決される。
作用によるトラブルがなくなり良好な効果が期待され
る。また、これまで特異性の高い抗血清を得ることが困
難であったが、本発現タンパクを用いることによってこ
のような問題が解決される。
【図１】ＦＳＨα鎖発現バキュロウイルスベクターの構
築の操作を説明する図、
築の操作を説明する図、
【図２】ＦＳＨβ鎖発現バキュロウイルスベクターの構
築の操作を説明する図、
築の操作を説明する図、
【図３】特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法
による発現タンパクを確認した図、この図において各レ
ーンは以下の通りである。 １）レーン１，２ ブタ共通α鎖に特異的な合成ペプチ
ドに対する抗体を用いた染色レーン ２）レ−ン３，４ 抗ラットＦＳＨβ抗体を用いた染色
レーン ３）レ−ン１，３ ＦＳＨα鎖発現組換えバキュロウイ
ルス感染細胞レーン ４）レ−ン２，４ ＦＳＨβ鎖発現組換えバキュロウイ
ルス感染細胞レーン
による発現タンパクを確認した図、この図において各レ
ーンは以下の通りである。 １）レーン１，２ ブタ共通α鎖に特異的な合成ペプチ
ドに対する抗体を用いた染色レーン ２）レ−ン３，４ 抗ラットＦＳＨβ抗体を用いた染色
レーン ３）レ−ン１，３ ＦＳＨα鎖発現組換えバキュロウイ
ルス感染細胞レーン ４）レ−ン２，４ ＦＳＨβ鎖発現組換えバキュロウイ
ルス感染細胞レーン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/63 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 上田 進 埼玉県所沢市中新井３−12−19
Claims (8)
- 【請求項１】 バキュロウイルスで発現させたブタのＦ
ＳＨα鎖。 - 【請求項２】 バキュロウイルスで発現させたブタのＦ
ＳＨβ鎖。 - 【請求項３】 バキュロウイルスで発現させたブタのＦ
ＳＨαβ鎖２量体。 - 【請求項４】 偶蹄類の下垂体よりＦＳＨα鎖の遺伝子
をクローン化する工程と、このクローン化したＦＳＨα
鎖の遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクター
に組み込む工程と、野生型バキュロウイルスと上記トラ
ンスファーベクターの間で組換え体を作る工程と、この
組換え体を感受性細胞に感染させてＦＳＨα鎖を発現さ
せこれを回収する工程と、を含むことを特徴とするＦＳ
Ｈα鎖の製造方法。 - 【請求項５】 偶蹄類の下垂体よりＦＳＨβ鎖の遺伝子
をクローン化する工程と、このクローン化したＦＳＨβ
鎖の遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクター
に組み込む工程と、野生型バキュロウイルスと上記トラ
ンスファーベクターの間で組換え体を作る工程と、この
組換え体を感受性細胞に感染させてＦＳＨβ鎖を発現さ
せこれを回収する工程と、を含むことを特徴とするＦＳ
Ｈβ鎖の製造方法。 - 【請求項６】 請求項４のＦＳＨα鎖を発現する組換え
体バキュロウイルスと、請求項５のＦＳＨβ鎖を発現す
る組換え体バキュロウイルスとを、感受性細胞に重感染
させ、その培養上清よりＦＳＨαβ鎖２量体を回収する
ことを特徴とする偶蹄類のＦＳＨαβ鎖２量体の製造方
法。 - 【請求項７】 請求項３のブタのＦＳＨαβ鎖２量体、
又は偶蹄類のＦＳＨαβ鎖２量体ＦＳＨを有効成分とす
る動物の繁殖障害の治療剤。 - 【請求項８】 請求項３のブタのＦＳＨαβ鎖２量体、
又は偶蹄類のＦＳＨαβ鎖２量体ＦＳＨを有効成分とす
る動物の多排卵誘起剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5071875A JPH06121687A (ja) | 1992-08-26 | 1993-03-30 | バキュロウイルスで発現させたブタのｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-227159 | 1992-08-26 | ||
| JP22715992 | 1992-08-26 | ||
| JP5071875A JPH06121687A (ja) | 1992-08-26 | 1993-03-30 | バキュロウイルスで発現させたブタのｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121687A true JPH06121687A (ja) | 1994-05-06 |
Family
ID=26412997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5071875A Pending JPH06121687A (ja) | 1992-08-26 | 1993-03-30 | バキュロウイルスで発現させたブタのｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06121687A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| CN110938657A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-03-31 | 中国大熊猫保护研究中心 | 重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法 |
-
1993
- 1993-03-30 JP JP5071875A patent/JPH06121687A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| AU720337B2 (en) * | 1995-02-17 | 2000-05-25 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone (REC bFSH) in the baculovirus expression system |
| CN110938657A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-03-31 | 中国大熊猫保护研究中心 | 重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法 |
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