JPH06122633A

JPH06122633A - ストレプトコッカス・ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体及びう蝕予防剤

Info

Publication number: JPH06122633A
Application number: JP29810292A
Authority: JP
Inventors: Yasukuni Nishida; 安邦西田; Motoyuki Nakai; 素行中井
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1994-05-06

Abstract

(57)【要約】【構成】ストレプトコッカス・ミュータンスから得ら
れる歯面への付着作用を有するタンパク質抗原を切断し
た断片であって、該断片がアミノ酸４７８番（アスパラ
ギン酸）〜１０００番（グルタミン）の一部又は全部を
含むポリペプチドを抗原とし、これを哺乳類又は鳥類に
免疫することによって得られた、ストレプトコッカス・
ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体。【効果】本発明の抗体はう蝕予防効果が高く、この抗
体を有効成分とするう蝕予防剤は優れたう蝕予防効果を
与える上、安全性も非常に高いものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、う蝕を誘発する病原菌
である口腔連鎖球菌のストレプトコッカス・ミュータン
ス（以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓという）に対して免疫活性
を有する抗体及び該抗体を有効成分として含むう蝕予防
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ストレ
プトコッカス・ミュータンス・グループ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓｇｒｏｕｐ）は、ヒトや
動物にう蝕を引き起こす細菌であることが知られてい
る。このグループの中で、ヒトのう蝕に深く関与してい
るのは、血清型ｃ型に属するＳ．ｍｕｔａｎｓである。
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、ヒトの歯面上に形成されるペリク
ルに吸着する。ペリクルとは、唾液中のタンパク質等か
らなる歯面上の被膜のことを指す。本菌は、ペリクルへ
の吸着後、グルコシルトランスフェラーゼと呼ばれる菌
体外酵素により合成される多糖によって強固に固着し、
酸で歯のエナメル質の脱灰を引き起こす。

【０００３】Ｓ．ｍｕｔａｎｓがペリクルに吸着する際
に重要な因子は、本菌の表層に存在する分子量約１９万
のフィムブリエと呼ばれるタンパク質抗原であり、ＰＡ
ｃ、Ｉ／ＩＩ、Ｂ，Ｐ１，ＩＦ等様々な名称で呼ばれる
が、本明細書では、ＰＡｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉ
ｇｅｎｓｅｒｏｔｙｐｅｃ）と呼ぶ。また、ペリク
ル側の因子としては、唾液中に含まれるＳ．ｍｕｔａｎ
ｓの凝集因子の関与が示唆されている。

【０００４】ＰＡｃで免疫した動物より得られる抗体に
より、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの付着が阻止されることは、既
に報告されている。しかし、このような方法で得られる
抗体をう蝕予防剤として利用する際、最も重要なこと
は、ＰＡｃのどの部位を認識する抗体が有効抗体となる
かという点である。しかし、この点に関しては、現在ま
で明らかにされていない。

【０００５】即ち、ＰＡｃに対する抗体をう蝕予防抗体
として用いる際、有効な抗体を効率に得ることが必要と
されるが、ＰＡｃそのもので免疫した場合、有効性に関
与しない抗体が多量に生成されるという問題点が生ず
る。このことは、有効性、安全性の点からみても好まし
いことではない。

【０００６】このため、このような不利のない、よりう
蝕予防効果の高い抗体が望まれる。

【０００７】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者は上記
要望に応えるため鋭意検討を行った結果、ＰＡｃを切断
して得られた断片のうち、アミノ酸４７８番（アスパラ
ギン酸）〜１０００番（グルタミン）を含む断片がＰＡ
ｃの唾液付着領域となることを知見すると共に、この断
片のポリペプチドを抗原とし、これを哺乳類や鳥類に免
疫することによって得られた抗体がＳ．ｍｕｔａｎｓに
対する免疫活性を特異的に示し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの歯
面への付着に対する充分な阻害効果を有し、う蝕予防の
有効成分として非常に優れた効果を与えることを知見
し、本発明をなすに至った。

【０００８】従って、本発明は、ストレプトコッカス・
ミュータンスから得られる歯面への付着作用を有するタ
ンパク質抗原を切断した断片であって、該断片がアミノ
酸４７８番（アスパラギン酸）〜１０００番（グルタミ
ン）の一部又は全部を含むポリペプチドを抗原とし、こ
れを哺乳類又は鳥類に免疫することによって得られた、
ストレプトコッカス・ミュータンスに対して免疫活性を
有する抗体、及び、この抗体を有効成分とするう蝕予防
剤を提供する。なお、上記アミノ酸番号はシグナルペプ
チドを含むものである。

【０００９】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明の抗体は、ＰＡｃ断片のうちアミノ酸４７８
番（アスパラギン酸）〜１０００番（グルタミン）の一
部又は全部を含むポリペプチドを抗原として哺乳類又は
鳥類を免疫することによって得られる免疫グロブリンか
らなるものである。

【００１０】ここで、このようなポリペプチドは、公知
の遺伝子工学的手法を採用してＰＡｃを断片化し、その
発現タンパク質を得る方法によって製造することができ
る。

【００１１】この方法を更に詳しく説明すると、Ｓ．ｍ
ｕｔａｎｓの染色体ＤＮＡより、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりＰ
Ａｃ遺伝子断片を増幅する。ＰＣＲ法に用いるプライマ
ーＤＮＡは、既に公知であるｐａｃ遺伝子の塩基配列を
もとにＤＮＡ合成機で適当な長さを合成する。その際、
ベクタープラスミドへのクローニングが容易になるよう
適当な制限酵素認識配列を付加するのが望ましい。

【００１２】プラスミドベクターとしては、一般に市販
されている発現ベクターを用いることができるが、アフ
ィニィティー精製が可能なよう、あるクロマト担体に選
択的に結合できるタンパク質との融合タンパク質として
発現できるように設計されたものが望ましい。融合させ
るタンパク質の例としては、ＡＰＴＧ（ｐ−Ａｍｉｎｏ
ｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ）をリガンドとするβ−ガラクトシダー
ゼ、クロラムフェニコールをリガンドとするクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＩｇＧをリガ
ンドとするｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ、マルトースをリガンド
とするマルトース結合タンパク質（ＭＢＡ）等が挙げら
れる。また、ポリアルギニン付加による陽イオン交換で
の精製、ポリヒスチジン付加によるＮｉ²⁺金属キレート
精製等も可能である。更に、これら融合させるタンパク
質の上流あるいは下流にプロテアーゼによる切断部位を
コードする配列が挿入されていれば、目的のタンパク質
のみを遊離させることができる。

【００１３】ｐａｃ遺伝子断片のクローニングは、増幅
した断片及びベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、次いでリガーゼを用いて連結することができる。組
換えＤＮＡの大腸菌への導入は、従来からの方法により
行い、目的のプラスミドであることは、制限酵素による
切断等で確認できる。また、クローニングされた遺伝子
断片を大腸菌で発現させ、ＰＡｃに対する抗体を用いた
ウェスタンブロット等で確認すれば、さらに確実であ
る。

【００１４】発現させたＰＡｃ断片タンパク質の精製
は、ベクターの種類により異なる。また、精製を容易に
する機能の付加されていないベクター系の場合でも、Ｐ
Ａｃに対する抗体を用いたアフィニィティークロマトグ
ラフィーが可能である。更に、従来から使用されている
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、塩析等古典
的方法も使用できる。

【００１５】なお、上記の方法は、大腸菌を宿主とした
場合であるが、この他、枯草菌、酵母、動植物等の宿主
−ベクター系も使用できることはいうまでもない。

【００１６】また、本発明では、ｃ型のＳ．ｍｕｔａｎ
ｓについて述べたが、ｇ型のＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓもほ
ぼ同じアミノ酸配列を有する表層タンパク質抗原をも
ち、これも同様な領域が付着部位と予想される。

【００１７】本発明の抗体は、上記ポリペプチドを抗原
とし、これを免疫した哺乳動物（馬、牛、羊、ヤギ等）
又は鳥類、特に家禽（鶏等）の血清、乳、卵、卵黄等よ
り得られるが、この場合免疫方法などは公知の方法を採
用し得る。

【００１８】具体的には、哺乳動物への免疫方法として
は、皮下注射、筋肉注射、腹腔内投与等による通常の方
法や点鼻、点眼等の方法によって行うことができる。抗
原の投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ免疫動物に
対して悪影響を与えない量を適宜選択すればよい。な
お、必要に応じて例えばフロイント完全アジュバント
（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩ
Ａ）、水酸化アルミニウム等のアジュバントを該抗原と
共に併用してもよい。

【００１９】例えば、小動物では抗原１〜５００μｇ
（タンパク質として）、大動物は０．１〜１ｍｇを１回
量として２〜５週間おきに３〜５回常法によって免疫す
る。兎の場合、抗原液（タンパク質として１００〜２０
０μｇ／ｍｌ）を等量のフロイント完全アジュバントと
混合したものを２〜５週間おきに３〜５回投与し、最終
免疫後、１０〜１４日目に動物から常法により採血し、
免疫グロブリンを含有するプラズマを得る。これをその
まま使用することもできるし、更に常法により精製して
抗血清、あるいは免疫グロブリンとして使用することも
できる。

【００２０】一方、免疫に使用する鶏としては、特に制
限はないが、抗体の生産性という観点から、白色レッグ
ホーン等の卵用種を使用できる。また、抗原による免疫
方法としては、皮下注射、腹腔内投与等による通常の方
法や、点鼻、点眼等の方法によって行うことができる。
抗原の投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ鶏に対し
て悪影響を与えない量を適宜選択すればよい。通常初回
免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗
体が鶏卵（卵黄）中に得られる。なお、必要に応じて例
えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイン
ト不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウム
等のアジュバントを該抗原と共に併用してもよい。免疫
から１ヶ月以上経過した鶏から採取した卵より、本発明
の抗ＰＡｃ断片抗体を調製することができる。

【００２１】なお、卵黄中の抗体価は、酵素免疫吸着法
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ等を用いて測定
することができる。これらの方法により、免疫後に２週
間程度間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移
を追跡することができる。また、精製抗体の活性は、菌
体凝集法も利用される。抗体力価の持続性については約
３ヶ月くらい高抗体価である。免疫後抗体価の減少が見
られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫をすることによ
り抗体価を上昇させることができる。

【００２２】本発明の抗ＰＡｃ断片抗体は、例えば上記
のようにして免疫した鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリ
ンを抽出・分離することによって得ることができる。こ
の抽出・分離方法としては、例えば多糖、ポリエチレン
グリコールを用いた沈澱法や、エタノール、プロパノー
ル、クロロホルムを用いた抽出法等、通常用いられてい
る免疫グロブリンを抽出・分離できる種々の方法が利用
できる。

【００２３】以上のようにして得られた本発明の抗ＰＡ
ｃ断片抗体は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌に存在している菌体
表層蛋白（ＰＡｃ）と特異的に反応し、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ菌に対して免疫活性を有する。即ち、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓの歯面への付着を阻害する効果を有し、該抗体を口腔
内に投与することによってＳ．ｍｕｔａｎｓの口腔への
定着を阻止し、う蝕を予防することができる。

【００２４】従って、本発明の抗体は、う蝕予防剤の有
効成分として好適に使用されるもので、本発明のう蝕予
防剤は、上記の抗ＰＡｃ断片抗体を含み、その口腔への
投与形態に応じて種々の形に調製される。例えば、マウ
スウオッシュや練歯磨等として利用する場合には、各種
成分を用いてこれらを調製する際に、本発明の抗ＰＡｃ
断片抗体の有効量を含有させればよい。抗ＰＡｃ断片抗
体のう蝕予防剤への配合量は、その投与形態に応じた投
与量に従って適宜選択すればよく、例えば菌体凝集価１
０００凝集単位以上の抗体を０．０００１〜１０重量％
程度とすることができる。

【００２５】なお、本発明のう蝕予防剤において、上記
抗体としては精製した抗体を用いてもよく、或いは上記
抗原を免疫した哺乳動物や鳥類の血清、乳、卵、卵黄を
そのまま用いてもよい。

【００２６】また、本発明のう蝕予防剤は、上述したよ
うにマウスウオッシュ、歯磨類、その他の種々の口腔用
組成物の形態に調製され、これらの成分としては組成物
の種類に応じた公知の成分を配合し得る。

【００２７】

【発明の効果】本発明の抗体はう蝕予防効果が高く、こ
の抗体を有効成分とするう蝕予防剤は優れたう蝕予防効
果を与える上、安全性も非常に高いものである。

【００２８】

【実施例】以下、参考例、実施例を示して本発明を更に
具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限され
るものではない。

【００２９】〔参考例〕Ｓ．ｍｕｔａｎｓ染色体の調製Ｓ．ｍｕｔａｎｓＭＴ８１４８株を２０ｍＭＤ，Ｌ
−トレオニンを添加したトッド・ヘビット培地で３７℃
で１８時間培養した。遠心して集菌後、ＴＥ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ）バッファーで洗
い、２０％グルコースを含む同バッファーに懸濁した。
菌懸濁液に８ｍｇ／ｍｌリゾチームを加え、３７℃で３
０分作用させ、次いで０．１ｍｇ／ｍｌＮ−アセチル
ムラミダーゼＳＧを添加して５０℃において３０分で溶
菌させた。溶菌液に０．３ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ、
０．３ｍｇ／ｍｌプロナーゼＥで各々３７℃で３０分作
用させた。次いで、２％Ｎ−ラウリルザルコシンＮａ塩
を加え、３７℃で３０分後、遠心して染色体を得た。こ
れをさらにフェノール−クロロホルム１：１の抽出溶媒
で抽出し、ＴＥバッファーで透析して精製した。

【００３０】ｐａｃ遺伝子断片のクローニングｐａｃ遺伝子の図１に示す領域をＰＣＲ法で増幅した。
その際プライマーＤＮＡの５’末端側に制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＳａｌＩ認識配列をもつよう合成した。ベクター
ＤＮＡとしては市販のｐＡＸプラスミドを使用した。な
お、図中の番号は、シグナル配列を含むｐａｃ遺伝子の
塩基番号を示し、括弧内の番号はアミノ酸配列番号を示
す。

【００３１】ｐａｃ遺伝子断片及びベクターＤＮＡをＫ
ｐｎＩ及びＳａｌＩで切断した。次に両断片をリガーゼ
で連結し、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５
２２株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミド
を抽出し、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで再切断し、ベクター
に挿入された断片の長さが予期された通りであることを
確認した。

【００３２】ｐａｃ遺伝子断片の発現及び精製ｐａｃ断片の挿入されたｐＡＸをもつプラスミドをＬＢ
培地で培養し、ＯＤ₆₀₀が０．５程度になったらラクト
ース・プロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧを０．１
〜０．２ｍＭ添加し、２５℃で１８時間培養した。集菌
後、適当なバッファーで洗い、１ｍＭＥＤＴＡを含む
トリスバッファーに懸濁した。超音波で菌体を破壊後、
遠心して上清を得た。発現は、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及びＰＡｃに対する抗体によるウェスタンブロット法で
確認した。

【００３３】発現したβ−ガラクトシダーゼとＰＡｃ断
片の融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼの基質の
誘導体であるＡＰＴＧ（ｐ−Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−
β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を
担体に結合させたアフィニィティークロマトグラフィー
に吸着させた後、ｐＨを１０．０に上げることで溶出し
た。さらにｐＡＸは、β−ガラクトシダーゼの下流に−
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−の配列を有するよう
設計されており、この融合タンパク質をエンドプロテア
ーゼＸａで処理することによりＰＡｃ断片を遊離し、上
記のＡＰＴＧカラムを再度通すことでＰＡｃ断片を精製
した。

【００３４】ＰＡｃ断片と唾液成分の相互作用上記方法で得られたＰＡｃ断片を炭酸バッファー（ｐＨ
９．６）で希釈してＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。
１ｍＭＣａＣｌ₂を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．
２）で洗浄後、ヒトより採取した全唾液を添加した。同
様にリン酸バッファーで洗浄後、ビオチンで標識したＰ
Ａｃタンパク質を加えた。同様に洗浄後、アルカリフォ
スファターゼで標識したストレプトアビジンを添加し
た。次いで洗浄後、発色基質を加えてＯＤ₄₀₅を測定し
た。以上の方法でＰＡｃ断片の唾液付着性を検討した結
果を図２に示す。

【００３５】図２の結果より、アミノ酸４７８番〜１０
００番を含むＰＡｃ断片がＰＡｃと同等の唾液成分付着
性を有することが確認された。

【００３６】〔実施例１〕（ＰＡｃ断片に対する鶏卵抗
体の調製）参考例で得られたβ−ガラクトシダーゼとＰＡｃ（４７
８〜１０００）の融合蛋白質をエンドプロテアーゼＸａ
で処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＰＡｃ断片の遊離を確
認した後、再度ＡＰＴＧカラムを通し、その素通り画分
を得ることでＰＡｃ（４７８〜１０００）を精製した。

【００３７】以上の調製法によって得られた抗原を１ｍ
ｇ／ｍｌ含む液０．５ｍｌとＦＩＡ（フロイント不完全
アジュバント）０．５ｍｌを１：１の割合で混合して、
Ｗ／Ｏ型のエマルジョンとした。得られたエマルジョン
を鶏の左右の胸筋に０．５ｍｌずつ注射し、初回免疫を
行った後、下記の方法に従って、採取した卵から得た水
溶性画分（ＷＳＦ）抗体価を測定し、その推移を検討し
た結果、鶏卵抗体８０単位ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の液が
１０ｍｌ得られた。

【００３８】卵からの抗体の採取方法卵から分離した卵黄に等量の水を加え、さらに等量の
０．５％λカラギーナンの懸濁液を加え、撹拌後、８０
００ｒｐｍ，２０分で遠心上清を得、これを抗体含有画
分（ＷＳＦ）とした。なお、ＷＳＦの力価の測定法は下
記の通りである。

【００３９】抗体価の測定法（１）菌体浮遊液ＴＹＣａｇａｒ上のコロニー１〜２個を２００ｍｌの
ＢＨＩｂｒｏｔｈに接種し、３７℃で１８時間嫌気的
に培養後、集菌し、０．１％牛血清アルブミンを添加し
た生理食塩水（以下、ＢＳＡ生食水という）で３回洗浄
する。洗浄した菌体をＢＳＡ生食水に浮遊させ、ＯＤ
_550nm１．０に調整する。菌体浮遊液は、用時調製とす
る。（２）試料抗体希釈倍率２０，３０，５０，７０，９０からそれぞれ２
ⁿ倍希釈する。（３）操作法マイクロプレート上で５０μｌの希釈抗体と５０μｌの
菌体浮遊液を混合、撹拌後、３７℃で３時間、更に４℃
で一夜静置する。（４）菌体凝集の判定一夜静置後、マイクロプレート底を観察し、菌体のスポ
ットが出現しない場合を凝集陽性とし、わずかなスポッ
トでも観察された場合は凝集陰性とする。

【００４０】〔実施例２〕（抗血清、母乳及び抗体の調
製法）実施例１と同様に精製したＰＡｃ（４７８〜１０００）
を５０〜２０００μｇ／ｍｌの濃度に調製し、等量のフ
ロイント不完全アジュバントと混合し、妊娠ヤギ、ウサ
ギ、ウシ、ウマの背部皮下に体重１ｋｇ当り０．３ｍｌ
を注射して免疫し、その後２〜４週間おきに抗原とフロ
イント不完全アジュバントとを混合したもので３回免疫
し、出産後に初乳を採取し、また抗血清については、上
記と同様に４回免疫後、採血し凝固させ、その遠心上清
をサンプルとした。

【００４１】次に上記初乳サンプルに等量の０．９％の
食塩水を加え、１２０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し
た後、上層の脂肪と沈澱物を除いて中間の液成分を採取
し、これに濃塩酸を加え、ｐＨ４に調製した。更に５０
００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、その上清をトリ
スハイドロキシアミノメタンで中和し、硫酸アンモニウ
ムを加えて７５％飽和にし、得られた沈澱物を採取し、
これをリン酸緩衝液で透析して、母乳の抗体成分（内
液）を得た。また、上記抗血清に硫酸アンモニウムを加
えて５０％飽和とし、得られた沈澱物をリン酸緩衝液で
透析して、抗血清の抗体（内液）を得た。

【００４２】実施例１と同様に抗体価を測定した結果、
血清抗体約２８０単位／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の液及び
初乳抗体２０単位／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の液がそれぞ
れ得られた。

【００４３】〔実施例３〕（抗体によるＳ．ｍｕｔａｎ
ｓの平滑面への付着抑制効果）ＴＹＣａｇａｒプレートにＳ．ｍｕｔａｎｓ１０４４
９を塗抹して、１８時間嫌気的に培養後、同プレートよ
り単コロニーを採取し、４ｍｌのＢＨＩ培地に１８時間
嫌気培養した。その後、培養液２００μｌを１００ｍｌ
のＢＨＩ培地に植菌し、１８時間嫌気培養した。菌体を
遠心で集め、５０ｍＭのリン酸緩衝液で３回洗浄後、同
緩衝液にて菌の濁度２．０になるように調製した（用時
調製）。

【００４４】次に、下記の実験液を約６０度の傾斜状態
にし、３７℃、１８時間好気条件下で培養した。次いで
４ｍｌの蒸留水で３回洗浄した後、３ｍｌの蒸留水を加
え、超音波処理し、ＯＤ_550nmで濁度を測定し、下記式
から付着抑制率を評価した。結果を表１に示す。実験液調製菌液１．５ｍｌ１０％ショ糖液０．３ｍｌ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．９ｍｌ３０凝集単位抗体液０．３ｍｌ（または５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８））

【００４５】

【数１】

【００４６】

【表１】

【００４７】〔実施例４〕（抗ＰＡｃ断片抗体のう蝕抑
制効果）兎を用いて調製した３種の抗血清を用いてハムスターに
よるう蝕抑制実験を行った。ハムスターは実験開始時３
週令の雄各群８匹を、飼料はう蝕誘発性飼料Ｄｉｅｔ２
０００を、感染菌株はＳ．ｍｕｔａｎｓ１０４４９を
使用した。実験期間は、菌感染終了後３週間で、その
間、１日２回、凝集単位３単位に調製した抗血清０．２
ｍｌをハムスター口腔内に滴下し、２０ストロークそれ
ぞれ歯列をブラッシングした。う蝕の判定はカイズの方
法（Ｋｅｙｅｓ，Ｐ．Ｈ．：Ｊ．ｄｅｎｔ．Ｒｅ
ｓ．，２３：４３９−４４４，１９４４）に準じて行
った。結果を表２に示す。

【００４８】

【表２】

【００４９】実施例３，４の結果より、本発明の抗ＰＡ
ｃ断片抗体が抗ＰＡｃ抗体や抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓ全菌抗
体より優れたう蝕抑制効果を与えることが認められる。

【００５０】〔実施例５〕以下、う蝕予防剤の処方例を
示す。（１）歯磨剤第２リン酸カルシウム・２水和物５０．０％ソルビット１０．０％グリセリン１０．０％カラゲナン１．０％ソジウムラウリルサルフェート１．０％香料１．０％サッカリン０．１％エタノール２．０％デキストラナーゼ０．０２％抗ＰＡｃ断片ヤギ乳抗体０．２％水残１００．０％

【００５１】（２）歯磨剤無水ケイ酸３０．０％グリセリン３０．０％ソルビット２０．０％カルボキシメチルセルロース１．０％ソジウムラウリルサルフェート１．２％香料１．０％サッカリン０．１％エタノール２．０％フッ化ナトリウム０．１％抗ＰＡｃ断片馬血清抗体０．１％水残１００．０％

【００５２】（３）歯磨剤水酸化アルミニウム４５．０％ソルビット２０．０％カラゲナン０．５％カルボキシメチルセルロース１．０％ラウリルジエタノールアマイド１．０％ショ糖モノラウレート２．０％香料１．０％サッカリン０．１％抗ＰＡｃ断片牛乳抗体０．３％水残１００．０％

【００５３】（４）歯磨剤第２リン酸カルシウム４５．０％カルボキシメチルセルロース１．０％カラゲナン０．５％ソルビット３５．０％プロピレングリコール３．０％Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム０．５％ゼラチン１．０％パラオキシ安息香酸エチル０．２％サッカリンナトリウム０．１％香料１．０％モノフルオロリン酸ナトリウム０．７％抗ＰＡｃ断片鶏卵抗体０．４％水残１００．０％

【００５４】（５）歯磨剤水酸化アルミニウム４０．０％カルボキシメチルセルロースナトリウム１．０％カラゲナン０．５％ソルビット３５．０％プロピレングリコール３．０％Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム０．５％ペプタイド１．０％パラオキシ安息香酸メチル０．２％サッカリンナトリウム０．１％香料１．０％抗ＰＡｃ断片羊血清抗体０．５％水残１００．０％

【００５５】（６）歯磨剤無水ケイ酸２０．０％カルボキシメチルセルロースナトリウム１．０％ソルビット５０．０％ポリエチレングリコール５．０％Ｎ−パルミトイルメチルタウリンナトリウム０．５％カゼイン１．０％パラオキシ安息香酸ナトリウム０．２％サッカリンナトリウム０．１％香料１．０％フッ化ナトリウム０．２％抗ＰＡｃ断片鶏卵抗体０．３％水残１００．０％

【００５６】（７）洗口剤エタノール２０．０％香料１．０％サッカリン０．０５％ラウリルジエタノールアマイド０．３％クロルヘキシジングルコン酸塩０．０１％抗ＰＡｃ断片馬血清抗体０．１％水残１００．０％

【００５７】（８）洗口剤ソルビット１０．０％エタノール２０．０％Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム０．５％ショ糖ステアリン酸エステル１．０％ペプタイド０．５％パラオキシ安息香酸メチル０．１％ステビオサイド０．１％香料０．５％デキストラナーゼ０．２％フッ化ナトリウム０．２％抗ＰＡｃ断片鶏卵抗体０．２％水残１００．０％

【００５８】（９）洗口剤ソルビット１０．０％エタノール２０．０％Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム０．５％ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレート１．０％コラーゲン０．５％パラオキシ安息香酸メチル０．１％サッカリンナトリウム０．１％香料０．５％抗ＰＡｃ断片牛乳抗体０．４％水残１００．０％

【００５９】（１０）タブレットアラビアゴム６．０％ブドウ糖７２．０％ゼラチン３．０％香料０．２％ｌ−メントール０．１％スペアミントオイル０．１％アスコルビン酸ナトリウム０．１％抗ＰＡｃ断片羊乳抗体０．１％水残１００．０％

【００６０】（１１）ガムガムベース４３．９％炭酸カルシウム２．０％水アメ１５．０％砂糖３０．０％ショ糖パルミテイト１．０％フルクトース４．０％アルドース３．０％香料１．０％抗ＰＡｃ断片鶏卵抗体０．１％１００．０％

【００６１】（１２）アイスクリームクリーム（脱脂率５０％）１６．８４％無糖脱脂練乳２４．２４％砂糖１１．２５％コーンシロップ４．６５％安定剤０．３５％抗ＰＡｃ断片抗体含有牛乳３７．６７％抗ＰＡｃ断片抗体含有卵黄５．００％１００．０％

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例で用いたｐａｃ遺伝子断片領域の説明図
である。

【図２】同領域の唾液付着性の結果を示すグラフであ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成４年１１月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】例えば、小動物では抗原１〜５００μｇ
（タンパク質として）、大動物は０．１〜１０ｍｇを１
回量として２〜５週間おきに３〜５回常法によって免疫
する。兎の場合、抗原液（タンパク質として１００〜２
０００μｇ／ｍｌ）を等量のフロイント完全アジュバン
トと混合したものを２〜５週間おきに３〜５回投与し、
最終免疫後、１０〜１４日目に動物から常法により採血
し、免疫グロブリンを含有するプラズマを得る。これを
そのまま使用することもできるし、更に常法により精製
して抗血清、あるいは免疫グロブリンとして使用するこ
ともできる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３９】抗体価の測定法（１）菌体浮遊液ＴＹＣａｇａｒ上のＳ．ｍｕｔａｎｓ１０４４９コロ
ニー１〜２個を２００ｍｌのＢＨＩｂｒｏｔｈに接種
し、３７℃で１８時間嫌気的に培養後、集菌し、０．１
％牛血清アルブミンを添加した生理食塩水（以下、ＢＳ
Ａ生食水という）で３回洗浄する。洗浄した菌体をＢＳ
Ａ生食水に浮遊させ、ＯＤ_{５５０ｎｍ}１．０に調整す
る。菌体浮遊液は、用時調製とする。（２）試料抗体希釈倍率２０，３０，５０，７０，９０からそれぞれ２
^ｎ倍希釈する。（３）操作法マイクロプレート上で５０μｌの希釈抗体と５０μｌの
菌体浮遊液を混合、撹拌後、３７℃で３時間、更に４℃
で一夜静置する。（４）菌体凝集の判定一夜静置後、マイクロプレート底を観察し、菌体のスポ
ットが出現しない場合を凝集陽性とし、わずかなスポッ
トでも観察された場合は凝集陰性とする。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４６】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＣＫＧ 9284−4Ｃ 39/09 9284−4Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ストレプトコッカス・ミュータンスから
得られる歯面への付着作用を有するタンパク質抗原を切
断した断片であって、該断片がアミノ酸４７８番（アス
パラギン酸）〜１０００番（グルタミン）の一部又は全
部を含むポリペプチドを抗原とし、これを哺乳類又は鳥
類に免疫することによって得られた、ストレプトコッカ
ス・ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体。
【請求項２】請求項１記載の抗体を有効成分とするう
蝕予防剤。