JPH06128280A - 高純度５ーメチルウリジンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 結晶の沈降速度差を利用して不純物を分離せ
しめ、５ーメチルウリジンを精製する。 【構成】 ５ーメチルウリジン結晶が不純物結晶と共存
する流体を攪判後、静置し、結晶を沈降せしめると、５
ーメチルウリジン結晶が下部に、不純物結晶が上部に分
かれる。そこで、上部と下部を分離し、下部より、精製
された５ーメチルウリジンを得る。上部の流体中の不純
物結晶を分離し、その母液を下部の５ーメチルウリジン
層に戻し、一連の操作を繰り返すことにより、更に精製
された５ーメチルウリジンを得る。代表的な不純物とし
ては、チミン等の５ーメチルウリジン以外の核酸があ
る。５ーメチルウリジンの製造法としては、他の核酸を
原料とし、微生物により変換する方法がある。 【効果】 ５ーメチルウリジンを簡便な方法で高純度に
精製できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬品原料として有用
な５ーメチルウリジンの精製方法に関するものである。
５ーメチルウリジンは、エイズ薬として市販されている
アジドチミジン、また同じく臨床試験中のｄ４Ｔ
（２’、３’ージデヒドロ−３’−デオキシチミジン）
の合成中間体として有望視されている。

【０００２】

【従来の技術】５ーメチルウリジンは従来、化学的合成
法で製造されており、その精製は、主として、メタノー
ル、エタノール等の有機溶剤を用いた結晶化により行わ
れていた（Ｊ．Ｆｏｘ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，２１１７（１９５６）；特開昭
６３ー６３６６８、；Ｖ．Ｓｋａｒｉｃ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔ
ａ、２１７９（１９８０）；Ｓ．Ｓ．Ｊｏｎｅｓ ｅ
ｔ．ａｌ．、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２５９（１９８
２））。

【０００３】しかし、５ーメチルウリジンを、核酸を原
料として微生物を用いて変換する方法により取得する場
合は、化学的合成法により副生する不純物と異なる為、
前記精製法では不適切であった。

【０００４】たとえば、核酸系の不純物であるチミン
（５ーメチルウラシルともいう）は温度、ｐＨ等に対す
る溶解度変化のパターンが５ーメチルウリジンに類似し
ているため、結晶化によって除去することは難しい。ま
た、イオン解離パターンも類似しているのでイオン交換
樹脂等の処理による除去も困難である。これら核酸系の
不純物は、核酸を原料とした微生物による製造法に特有
のものであり、公知の知識を活用することができない。

【０００５】また、これらの文献では、本発明で示す結
晶の沈降速度差で分離を図る試みは全く開示されていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】５ーメチルウリジンを
高純度かつ効率的に分離する方法を開発する。特に、核
酸を原料とした微生物による製造法に特有の不純物を分
離する方法を開発する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】発明者は、核酸を原料と
して微生物により５ーメチルウリジンを製造しその精製
を検討した際、５ーメチルウリジンが不純物結晶と比較
して大きな結晶に成長することを見いだし、この性質が
５ーメチルウリジンの精製に活用できうるとの着想を得
た。

【０００８】一般的に、工業的に粒度の揃った結晶を得
ようとする場合、被晶析流体をその流体自体で下方より
流動させ、大きな結晶を下部に、細かい結晶を上部に分
級させ、上部の細かい結晶を系外で溶解、再循環させる
方法が取られる。本発明のように、製品結晶と不純物結
晶を沈降速度で分ける方法は数少ない。その理由は、そ
のような粒度分布を持った系が無いこと、製品結晶中に
不純物結晶が取り込まれ、たとえ分けることができても
純度が上がらないこと等から、発想がそこに至らない為
と考えられる。

【０００９】５ーメチルウリジンの場合、市販試薬の結
晶粒系は大きくとも５０μｍ程度であるが、発明者がこ
れを水より再結晶化したところ、５００μｍ程の結晶が
得られた。

【００１０】一方、不純物を含む実液系から得られた５
ーメチルウリジン結晶の粉末Ｘ線回折の結果、５ーメチ
ルウリジンは他の不純物と”混晶”を作らないことが判
明した。よって、混合した結晶群の中から主に５ーメチ
ルウリジン結晶のみを取り出せるので、５ーメチルウリ
ジンが高純度化できることを見い出した。また、実液系
での５ーメチルウリジンの結晶粒系は通常、３００から
６００μｍ、小さい場合でも５０から１００μｍの範囲
にあり、この時、不純物側の結晶粒系は５から５０μｍ
であった。更に、攪判後静置した晶析スラリーの観察に
より、５ーメチルウリジン結晶がガラス容器の下部にあ
り、上部の液は短時間であれば濁っていることを見い出
し、沈降速度の差を使えば、他の結晶を分離できる着想
を得た。

【００１１】すなわち、本発明は、５ーメチルウリジン
結晶を沈降速度差で他の不純物と分離せしめる５ーメチ
ルウリジンの精製方法に関するものである。

【００１２】沈降速度の差で５ーメチルウリジン結晶を
他の不純物と分離する方法として、公知のデカンテーシ
ョン法がある。結晶スラリーをよく混合し、しかる後静
置し、５ーメチルウリジンが大方沈降し、他の結晶が浮
遊してる間に５ーメチルウリジン以外の層を容器を傾け
て流し去る方法である。流出液を結晶分離し、その母液
を元の容器に戻し、再度上記の操作を繰り返す操作を何
回か繰り返すことにより、不純物結晶を含まない５ーメ
チルウリジン結晶を取得できる。

【００１３】また、大きな装置では、容器を傾けるのは
難しいので、機械的分離に頼らざるを得ない。たとえ
ば、非沈降層をポンプを用いて吸い出す方法、叉は、適
当な位置にオーバーフロー口を設けておいて、沈降後、
そこから上部の液をオーバーフローさせる方法等が考え
られる。また、一般的な流動層型連続晶析槽を改良し、
清澄母液を槽の下部から流し、５ーメチルウリジンの結
晶は流出させず、不純物結晶のみを流出させる方法、叉
は、スーパーデカンターで一気に、大きな結晶と小さな
結晶を分ける方法が考えられる。

【００１４】デカンテーション叉は機械的分離は必要に
応じて繰り返すのがよい。繰り返し回数は、その分離効
率と、製品の要求純度によって決められる。

【００１５】これらのいずれの方法も、分離された不純
物結晶を含む流体を遠心分離機、ろ過等で結晶分離し、
その母液を元の装置にもどす操作があれば不純物結晶分
離効率をより高めることが可能になる。

【００１６】分離した５ーメチルウリジン側の結晶の層
を遠心分離、ろ過等で分離し、さらにこの時、結晶を水
で、可能ならば冷水で洗浄すれば、より純度の高い結晶
が得られる。

【００１７】５ーメチルウリジンを製造するに当たり、
核酸を原料として微生物を用いて変換する方法の代表例
として、ヌクレオシド、無機リン酸 およびチミンを微
生物存在下で作用させる方法がある（特開平２ー２３８
８２号公報）。ここで、ヌクレオシドとしては、アデノ
シン、グアノシン、イノシン、ウリジン、シチジン、ま
たは、キサントシンが例示される。この反応において、
不純物としてそれぞれの残留ヌクレオシドと、チミン、
及び、使用したヌクレオシドから副成した塩基、及びリ
ン酸が存在する。これらの不純物を５ーメチルウリジン
との溶解度の差で分離することは容易に考えられるが、
核酸成分の温度、ｐＨに対する溶解度変化のパターンは
お互いに類似しており、これ以上分けることは困難であ
る。

【００１８】特開平２ー２３８８２号公報記載の条件に
従って得たｐＨ３から９の範囲の反応液を冷却、ろ過、
活性炭脱色、ろ過して得たろ液を濃縮し、３から１５℃
の範囲に冷却晶析して、他の溶媒を加えることなく、析
出してくる結晶のうち、５ーメチルウリジン結晶の平均
粒系が５０から５５０μｍであるのに対し、不純物のそ
れは１０から３０μｍ程度である。

【００１９】次に、流体中の５ーメチルウリジン結晶を
５分から１０分で沈降させておいた後、５ーメチルウリ
ジン結晶層以外の部分を容器を傾けて流出させ（デカン
テーション法）、更に流出液中の結晶を分離後、その母
液を容器に戻し、攪判後、再びデカンテーションする操
作を繰り返すと、他の不純物結晶をあまり含まない高純
度５ーメチルウリジンが得られる。

【００２０】５ーメチルウリジンは、精製装置が大きく
なったり、結晶粒径の変化により、沈降に要する時間が
変化するが、その場合でも、容易に沈降時間を設定する
ことができる。例えば、晶泥の一部を抜き取り、メスシ
リンダー等の中で実際に沈降させ、それに要した時間と
沈降距離を計り、これから実際の装置中での所要沈降速
度を計算することができる。

【００２１】一方、不純物の結晶粒系は、常にほぼ一定
であるから、沈降時間は５ーメチルウリジン側だけを考
えれば良い。長時間の沈降時間を設定すると、不純物結
晶も多少沈降してくる。メスシリンダーのような小さな
装置では、３０分程度で微結晶の沈降層が形成された。
この場合にも、不純物結晶の沈降時間は、装置の大きさ
を元にして容易に計算でき、沈降時間の限度はこれによ
り決めることができる。

【００２２】流動層型連続晶析槽を改良して、叉は流動
層分級型晶析缶を設計して用いる場合には、清澄母液を
槽の下部から流し、５ーメチルウリジンの結晶は流出さ
せず、不純物結晶のみを流出させるに必要な流体の線速
度を測定することにより、容易に実装置での線速度を決
定することができる。

【００２３】また同様に、スーパーデカンターを用いる
場合、小型機を用い、沈降面積あたりの流体フィード流
速と結晶の分離性等を測定することにより、容易に実機
でのフィード流速等の分離条件を設定することができ
る。

【００２４】本発明の方法は、特に、５ーメチルウリジ
ンとの分離が極めて難しいチミンの分離に大きな効力を
発揮する。チミンは溶解度の温度、ｐＨに対する変化の
パターンが５ーメチルウリジンに相似であり、分け難
い。また、イオン解離のパターンも似ており、イオン交
換樹脂等でも抜け難い。

【００２５】また、共存する他の核酸不純物であるグア
ノシン、グアニン、シュドグアノシンについても非常に
有効な分離手段である。

【実施例】

【００２６】［実施例１］特開平２ー２３８８２号公報
の実施例２により調製した発酵液を冷却、ろ過後、活性
炭脱色、ろ過、真空濃縮をして、５ーメチルウリジン２
５．２％、チミン１．５５％、グアノシン０．４２％含
む濃縮液７．０５ｋｇを得た。これをさらに攪判しなが
ら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出させた。これをバ
スケット型遠心ろ過機で全量分離し、５ーメチルウリジ
ンを４．５％、チミンを０．２６％、グアノシンを０．
１２％含む５２２３ｇの母液を得た。更に結晶層を８１
４ｇの冷水で洗浄した。この洗浄時の母液は、５ーメチ
ルウリジンを５．１８％、チミンを０．３１％、グアノ
シンを０．１９％含み、１９２６ｇあった。分離結晶を
乾燥し、１．５２ｋｇの水和物結晶を得た。濃縮液から
の５ーメチルウリジンの収率は７６．３％であった。こ
の結晶の純度は８９．２８％であり、不純物として、
５．２１％のチミン、０．６９％のグアノシンが含まれ
ていた。５ーメチルウリジンに対するチミンの比率は、
濃縮液で６．２％、製品で５．８％であり、晶析工程で
の減少は全くなかった。

【００２７】［実施例２］特開平２ー２３８８２号公報
の実施例２により調製した発酵液を冷却、ろ過後、活性
炭脱色、ろ過、真空濃縮をして、５ーメチルウリジン２
５．５％、チミン１．９５％、グアノシン０．５７％含
む濃縮液３８４．９ｇを得た。これをさらに５０ｒｐｍ
で攪判しながら徐徐に１０℃まで冷却し、結晶を析出さ
せた。これを１０分間静置し、下部の５ーメチルウリジ
ン層以外の上部の微結晶懸濁部分をデカンテーション分
離して流出させ、流出液中の結晶をろ過分離し、乾重量
あたり５ーメチルウリジンを２２．６％、チミンを５
０．７％、グアノシンを１０．７％含む８．６２ｇの湿
結晶を得た。この母液側を５ーメチルウリジン結晶層の
残っている元の容器に戻し、攪判し、再び１０℃に冷却
した。これを再度、上記と同様にデカンテーション分離
し、再び流出液中の結晶をろ過分離し、乾重量あたり５
ーメチルウリジンを４１．４％、チミンを２６．１％、
グアノシンを１４．４％、グアニンを０．０５２％を含
む乾燥状態で４．５７ｇの結晶を得た。この母液側を５
ーメチルウリジン結晶層の残っている元の容器に戻し、
攪判しながら１０℃に冷却後、バスケット型遠心ろ過機
で流体全量を分離した。分離時に結晶層を５７．８ｇの
冷水で結晶を洗浄した。分離結晶を乾燥し、７５．２１
ｇの水和物結晶を得た。濃縮液からの５ーメチルウリジ
ンの収率は７１．４％であった。この結晶の純度は９
３．２４％であり、不純物として、３．３３％のチミ
ン、０．３４２％のグアノシンが含まれていた。５ーメ
チルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮液で７．６
％、製品で３．６％であり、晶析、デカンテーション工
程で半減していた。更に言えば、定性的であるが、シュ
ドグアノシンも大幅に減少していた。さらに、デカンテ
ーションを繰り返すことにより、不純物核酸は更に減少
させ得たであろう。なお、この晶析での５ーメチルウリ
ジンの結晶平均粒径は約３５０μｍ、微結晶の平均粒径
は１０μｍであった。

【００２８】［実施例３］特開平２ー２３８８２号公報
の実施例２により調製した発酵液を冷却、ろ過後、活性
炭脱色、ろ過、真空濃縮をして、５ーメチルウリジン２
３．０％、チミン１．７１％、グアノシン０．４５％含
む濃縮液５８０Ｌを得た。これを晶析缶中で１００ｒｐ
ｍで攪判しながら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出さ
せた。攪判を停止し、約１５分間、５ーメチルウリジン
結晶を沈降させた後、微結晶を含んだ上部微結晶懸濁液
をポンプを用いて機械的に分離した。この分離液中の微
結晶をろ過分離し、この母液側を元の晶析缶に戻し、攪
判し、再び５℃に冷却した。この攪判、静置、上部微結
晶懸濁液分離、微結晶ろ過分離、再懸濁操作を４度繰り
返した後、バスケット型遠心ろ過機で懸濁液全体を分離
した。分離時に６０Ｌの水で結晶を洗浄した。分離結晶
を乾燥し、９６Ｋｇの水和物結晶を得た。濃縮液からの
５ーメチルウリジンの収率は７２．０％であった。この
結晶の純度は９３．８％であり、不純物として、１．８
％のチミン、０．１６％のグアノシンが含まれていた。
５ーメチルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮液で
７．４％、製品で１．９％であり、晶析、デカンテーシ
ョン工程で４分の１に減少していた。更に言えば、定性
的であるが、シュドグアノシンも大幅に減少していた。
さらに、デカンテーションを繰り返すことにより、不純
物核酸は更に減少させ得たであろう。なお、この晶析で
の５ーメチルウリジンの結晶平均粒径は約５５０μｍ、
微結晶の平均粒径は１５μｍであった。

【００２９】［実施例４］特開平２ー２３８８２号公報
の実施例２で、リン酸バッファの代わりにグリシンバッ
ファを用いて調製した発酵液を冷却、ろ過後、活性炭脱
色、ろ過、真空濃縮して、５ーメチルウリジン２４．８
％、チミン１．５８％、グアノシン０．４１％含む濃縮
液３７２．７ｇを得た。これをさらに攪判しながら徐徐
に５℃まで冷却し、結晶を析出させた。この懸濁液を１
０分間静置した。この時、５ーメチルウリジンの結晶層
と微結晶層の分離界面は、実施例２、３ほどには明確で
は無かったが、上部微結晶懸濁液をデカンテーションに
より分離する事ができた。これをバスケット型遠心ろ過
機で全量分離した。分離結晶を乾燥し、７７．４ｇの水
和物結晶を得た。濃縮液からの５ーメチルウリジンの収
率は７６．９％であった。この結晶の純度は９１．８％
であり、不純物として、２．９％のチミン、０．５４％
のグアノシンが含まれていた。５ーメチルウリジンに対
するチミンの比率は、濃縮液で６．４％、製品で３．１
％であり、晶析、デカンテーション工程で半減してい
た。なお、この晶析での５ーメチルウリジンの結晶平均
粒径は約５０μｍ、微結晶の平均粒径は３０μｍであっ
た。

【００３０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、エイズ薬等の合
成原料となる５ーメチルウリジンを、有機溶剤等の特殊
溶媒を用いること無く、簡便な方法で高純度に精製でき
ることから、工業上の利用が期待される。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５ーメチルウリジン結晶を沈降速度差で
   他の不純物と分離せしめる５ーメチルウリジンの精製方
   法。
2. 【請求項２】 分離をデカンテーション法で行う請求項
   １の方法。
3. 【請求項３】 分離を機械的分離法で行う請求項１の方
   法。
4. 【請求項４】 他の不純物が、５ーメチルウリジン以外
   の核酸成分である請求項１の方法。
5. 【請求項５】 ５ーメチルウリジンが、他の核酸を原料
   として微生物により変換する方法から得られる請求項１
   の方法。
6. 【請求項６】 不純物が、チミン、グアニン、グアノシ
   ン、及び２−アミノ−７−β−Ｄ−リボフラノシル−７
   Ｈ−プリン−６（１Ｈ）オン（シュドグアノシン）の少
   なくとも１種である請求項１の方法。