JPH0612994B2 - 生理活性物質固定化磁気微粒子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医学的治療、分析等の手段として有用である
生理活性物質を固定化してなる磁気微粒子に関する。

〔従来の技術〕 走磁性細菌が、磁鉄鉱からなる磁気微粒子を、鎖状に配
列した状態で含んでいることは、R.P.Blakemoveにより
発見され、報告されている（Science,190,337-379(197
5))。この磁気微粒子は、寸法が約500〜1500Åと微小で
単磁区構造を有しており、同種の菌から得られるものは
寸法、形状とも非常に均一性が高く、人工的に合成する
ことは困難である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来、このような走磁性細菌から得られる磁気微粒子を
医薬等の生理活性物質の担体として用いる試みはまった
く行なわれていない。

本発明の目的は、かかる走磁性細菌から得られる磁気微
粒子の医学的あるいは分析手段等としての利用を図るこ
とにある。

〔発明の構成〕 本発明者らは、走磁性細菌から得られる前記微粒子が生
理活性物質の担体として極めて有用であることを見出し
た。

すなわち、本発明は、走磁性細菌から分離されたもので
あって、生理活性物質を固定化させた磁気微粒子を提供
するものである。

走磁性細菌とは磁力線に沿って泳ぐ性質を有する細菌で
あり、体内に磁鉄鉱からなる磁気微粒子を自から合成
し、これを１ないし２列に鎖状に配列した状態で含んで
いる。このような走磁性細菌としては、桿菌、球菌、ら
せん菌等その形態などの異なる種々のものが淡水中およ
び海水中に生息することが知られており、具体例として
はATCC31632として寄託されている菌株(MS-1)を挙げる
ことができる。このような走磁性細菌は、例えば後述す
る実施例１に示す方法により磁石を用いて淡水および海
水中から容易に採取することができる。

走磁性細菌に含まれる磁気微粒子は、前述のように約50
0〜1500Åの寸法で、由来する細菌が同種の場合には寸
法および形状は高い均一性を有している。この磁気微粒
子は、菌体内で、主としてタンパク質からなる被覆膜で
覆われた状態で存在し、マグネトソームと称されてい
る。

本発明に生理活性物質のキャリアとして用いられる磁気
微粒子は上記のような走磁性細菌中から分離されたもの
であり、被覆膜で覆われた状態でも被覆膜を除去した状
態でも使用することができる。一般には、被覆膜を有し
たままの磁気微粒子は生体との調和性が高いという利点
を有している。

磁気微粒子を採取または培養により集菌した走磁性細菌
から分離するには、例えば微量遠心機で濃縮後、リゾチ
ーム溶液で細胞壁を溶かし再び遠心を繰返せばよく、被
覆膜を有する状態で磁気微粒子が得られる。さらに被覆
膜を除去するには、例えばアルカリで処理すればよく、
洗浄により磁鉄鉱の磁気微粒子が得られる。

このようにして走磁性細菌から分離した磁気微粒子に固
定化される生理活性物質の種類には特に制約はなく、次
のものを例示することができる。

○酵素： 加水分解酵素、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、
リゾチーム、ウレアーゼ、インベルターゼ、デキストラ
ーゼ、ペプチターゼ、溶菌酵素（カビ、酵母）等； 酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、リポキシナーゼ、チトクロームＣ、ペルオキシ
ダーゼ、 異性化酵素、例えば、グルコースイソメラーゼ等； 転移酵素； 脱離酵素、例えば、アスパルターゼ、ヒアロウロンダー
ゼ等；および 各種の制限酵素。

○免疫関連物質； リンフォカイン、例えば、インターロイキン２(IL-2)、
リンフォトキシン(LT)、ガン破壊因子(CBF)等、 モノカイン、例えば、TNF(腫瘍壊死因子)等、その他の
サイトカイン； インターフェロン、即ち、α−インターフェロン、β−
インターフェロン、γ−インターフェロン； 抗原類、例えば、IgG、IgA、IgM、IgE、アルブミン、HCG、AF
P、カルジオライピン抗原、血液型物質、コンカナバリ
ンＡ、DNT、プロスタグランジン、CRP、HBs、ヒト成長ホ
ルモン、ステロイドホルモン等； 抗体類、例えば、抗アルブミン抗体、抗HCG抗体、抗IgG
抗体、抗IgA抗体、抗IgM抗体、抗IgE抗体、抗IgC抗体、
抗AFP抗体、抗DNT抗体、抗プロスタグランジン抗体、抗
ヒト凝固ファクター抗体、抗CRP抗体、抗HBs抗体、抗ヒ
ト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホルモン抗体、およ
びこれらを含む血清、並びにモノクローナル抗体； ○成長因子 ○核酸関連物質 ○植物由来生理活性物質 ○その他の生理活性物質、例えば、プロスタグランジン
(PG)、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)等。

これらの生理活性物質を磁気微粒子に固定化する方法と
しては、酵素等の固定化方法として既に知られている技
術を利用することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ (1)走磁性細菌の捕集 第１図に示す走磁性細菌採取器を用いて池の中に生息す
る走磁性細菌を捕集した。この採取器の容器は、円筒状
の側壁２（長さ８cm）と上端壁３（直径８cm）とからな
り下端は開口している。下端には瀘紙（No.2）４が取付
具５により着脱自在に固定され、上端壁の外側には中央
部にサマリウム−コバルト磁石６のＳ極側が固定されて
いる。この採取器の容器１に蒸留水を満たして瀘紙４を
取付け、池の中に沈めた（７：水底堆積物）。10時間放
置後池から回収すると、容器１の上端壁内側の中央部
（磁石固定部）に黒ずんだ状態で走磁性細菌が付着し、
採取された。

(2)磁気微粒子への抗α−フェトプロティン抗体の固定
化、該固定化抗体によるα−フェトプロテインの検出 捕集した走磁性細菌を微量遠心機で濃縮、分離後、0.2
％リゾチーム溶液で37℃、１時間処理して細胞壁を溶か
し、再び遠心を繰り返し磁気微粒子を分離、洗浄した。
磁気微粒子を被覆しているタンパク等を5M-NaOHで12時
間処理し除去した。この磁気微粒子10mgにγ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン原液と10分間反応後、2.5％
グルタルアルデヒド溶液（pH7.0）と１時間反応させ
た。そして抗AFP（α−フェトプロテイン）抗体溶液（5
mg/ml抗体含有）１mlを加え磁気微粒子に抗AFP抗体を固
定化した。また、タンパク膜で被覆されたままの磁気微
粒子にはγ−アミノプロピルトリエトキシシラン処理を
行わずに抗ＡＦＰ抗体を固定化した。次にＡＦＰ溶液
（5mg/ml、pH8.0）3ml、25％グルタルアルデヒド溶液３
μｌ、カタラーゼ20mg(40,000 units）を混合し25℃、
１時間放置しＡＦＰをカタラーゼで標識した。抗ＡＦＰ
抗体を固定化した磁気微粒子10mgはカタラーゼ標識した
ＡＦＰ溶液１mlと非標識ＡＦＰ溶液（試料）１mlを混合
した後、37℃、２時間競争反応させた。その後、磁気微
粒子を磁石で集め洗浄した。磁気微粒子は結合したカタ
ラーゼ標識されたＡＦＰ量を測定するため0.05Mリン酸
緩衝液（pH7.0）に加え、スターラーバーを用いずに磁
気的に撹拌し、100μｌ３％、H₂O₂を加え生成した酸素
を酸素電極で測定した。そしてあらかじめ作成した検量
線から試料中のＡＦＰ濃度を推定した。酸素免疫センタ
ーの応答はH₂O₂を加えた後、約30秒程で定常となり短時
間でＡＦＰの測定ができた。

実施例２ グルコースオキシダーゼ固定化磁気微粒子 実施例１と同様にしてタンパク等の被覆膜まで除去した
磁気微粒子0.2mgを1mlのγ−アミノプロピルトリエトキ
シシランと10分間反応させ洗浄し、2.5％のグルタルア
ルデヒドを含むリン酸緩衝液1mlと１時間反応させた。
これを1mlのグルコースオキシダーゼ溶液中（250μg/m
l）で４℃で12時間反応させ、洗浄した。

こうして、本発明に係るグルコースオキシダーゼ固定化
磁気微粒子を得た。

また、人工の磁気微粒子であるZn−フェライオ（5000
Å）も同様にグルコースオキシダーゼを固定化した。ま
た、タンパク膜で被覆されたままの走磁性細菌の磁気微
粒子にはγ−アミノプロピルトリエトキシシラン処理は
行わずにグルタルアルデヒドだけでグルコースオキシダ
ーゼの固定化を行なった。

こうして得られた各グルコースオキシダーゼ固定化微粒
子のグルコースオキシダーゼ固定化量、活性などを測定
したところ、次の結果が得られた。

本発明の走磁性細菌より分離した磁気微粒子には、200
μg／mgのグルコースオキシダーゼが固定化された。こ
れに対しZn−フェライト粒子では1.8μg／mgのグルコー
スオキシダーゼが固定化された。走磁性細菌より分離し
た磁気微粒子はZn−フェライト粒子に比べ1/10と粒子径
が小さいために表面積が大きい。そのため酵素がZn−フ
ェライト粒子に対し100倍以上が固定化された。また本
実施例の磁気微粒子は、表面積が大きいことおよび固定
化された酵素量が多いため非常に高い酵素活性を示し
た。すなわち、グルコースオキシダーゼを固定化した場
合、グルコースオキシダーゼ固定化Zn−フェライトの40
倍の酵素活性が見られた。またZn−フェライト粒子を担
体とした固定化酵素反応はzn−フェライトの金属による
阻害が見られ、EDTAを加えると通常の非阻害型Michaeli
s反応に戻った。一方、走磁性細菌より分離したタンパ
クで被覆された磁気微粒子を用いた場合、阻害は見られ
なかった。また、酵素を固定化した磁気微粒子では少な
くとも６回の酵素の再使用性があることが示された。

実施例３ グルコースセンサー 上の実施例で製造したグルコースオキシダーゼ固定化量
200μg／mgのグルコースオキシダーゼ固定化磁気微粒子
10ｇを、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）30mlに加え、スタ
ーラーバーを用いずに磁気的に撹拌し、酸素電極を投入
し電流値が定常となった後、試料であるグルコース溶液
を加えるとグルコースオキシダーゼの作用により酸素が
消費され電流値が減少した。そしてあらかじめ作成した
検量線からグルコース濃度を推定できた。

実施例４ 大腸菌抗体固定化磁気微粒子 実施例と同様にして走磁性細菌から分離し、タンパク等
の被覆膜を除去した磁気微粒子（500〜1500Å）をγ−
アミノプロピルトリエトキシシランと10分間反応させ洗
浄し、2.5％のグルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.0）と１時間反応させ洗浄した。さらにトリ
アミンと１時間反応させ洗浄し、再びグルタルアルデヒ
ド溶液で１時間反応させた。この磁気微粒子を大腸菌抗
体溶液中で４℃、12時間反応し抗体を固定化した。人工
の磁気微粒子であるZn−フェライト（5000Å）も同様に
大腸菌抗体を固定化した。またタンパク膜で被覆された
ままの走磁性細菌の磁気微粒子にはγ−アミノプロピル
トリエトキシシラン処理を行わずに大腸菌抗体を固定化
した。

このように抗体を固定化したそれぞれの微粒子につい
て、定常期まで培養した大腸菌を用い、抗原抗体反応を
行なわしめた。すなわち、大腸菌懸濁液中に抗体を固定
化した磁気微粒子を加え撹拌し反応させ磁気微粒子に大
腸菌を結合させた後、磁気微粒子を磁気的に分離し大腸
菌懸濁液中の残存菌数を測定した。また、抗体の代りに
牛血清アルブミンを固定化した磁気微粒子についても同
様にして測定を行なった。これらにより、次のような結
果が得られた。

走磁性細菌より分離した磁気微粒子はZn−フェライトに
比べ微粒子径が１／10と小さいために単位磁気微粒子あ
たりの表面積が非常に大きい。そのために抗体の固定化
量が多く非常に表面活性が高かった。大腸菌抗体を固定
化した磁気微粒子50mgを用い抗原抗体反応により大腸菌
を結合させた場合、２時間で約８×10⁶個の大腸菌と結
合した。これに対し、抗体のかわりに牛血清アルブミン
を固定化した磁気微粒子50mgを用いた場合、２時間後に
おいても全く大腸菌と結合しなかった。さらにアルブミ
ンを固定化した磁気微粒子上に再び大腸菌抗体を固定化
した磁気微粒子50mgを用いた場合、２時間で２×10⁶個
の大腸菌と結合した。そして、大腸菌の結合した磁気微
粒子を酸素電極上に固定したところ、大腸菌の呼吸活性
があり、明らかに大腸菌抗体を固定化した磁気微粒子に
大腸菌が結合したことが示された。このことにより磁気
微粒子に大腸菌抗体を固定化することで大腸菌が分離で
きることが示された。また、大腸菌が結合した磁気微粒
子を0.2Mグリシン−HC1緩衝液（pH2.3）で洗浄すること
で抗原抗体反応により結合した大腸菌を分離することが
でき、抗体を固定化した磁気微粒子を再使用することが
可能であった。

実施例５ 制限酵素固定化磁気微粒子 実施例１と同様にして、タンパク等の被覆膜まで除去し
た磁気微粒子に制限酵素Bam HIを固定化した。Bam HIは
大腸菌プラスミッドのpBR 322の１ケ所を切断する酵素
である。蒸留水16μｌ、pBR322(0.1μg／μl）10μl、
×10反応用緩衝液３μlを混合したものにBam HIを固定
化した磁気微粒子を加え磁気的に撹拌し、37℃、１時間
インキュベートしてpBR 322を切断した。これに色素液
を加えアガロースゲル電気泳動によりpBR 322の切断が
確認できた。さらにBam HIを固定化した磁気微粒子を回
収し、同様の操作をすることで再使用ができ、再びpBR
322が切断されたことが示された。

〔発明の効果〕

本発明の生理活性物質固定化磁気微粒子は、キャリアで
ある走磁性細菌から分離された磁気微粒子が粒子サイズ
500〜15000Åと小さいために表面積が大きく、生理活性
物質担持量が非常に高い。したがって、得られる生理活
性が極めて高い。また、上記のように非常に微小である
ので血管等の中を支障なく移動させることができる上
に、磁気微粒子が単磁区構造を有するものであるため磁
気モーメントが大きくて比較的弱い磁場で移動を制御す
ることができる。また、このように磁場の適用により所
望箇所に局部的に生理活性物質を集中させることができ
るため、薬剤等の場合にはその投与量を大幅に低減する
ことができ、また回収が容易で再使用が可能である。

本発明の生理活性物質固定化磁気微粒子は、このよう
に、薬剤として、あるいは分析用などのセンサー材料、
バイオリアクター用生体触媒、細胞分離用材料などとし
て有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、走磁性細菌採取器の一例を表わす。 １……容器 ４……瀘紙 ６……磁石 ７……水底堆積物

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/553 9015−2Ｊ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】走磁性細菌から分離されたものであって、
   生理活性物質を固定化させた磁気微粒子。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の磁気微粒子で
   あって、細菌中で備えていた被覆膜を有している磁気微
   粒子。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   磁気微粒子であって、生理活性物質が、酵素、免疫関連
   物質、成長因子、核酸関連物質又は植物由来生理活性物
   質であるもの。