JPH0613538B2

JPH0613538B2 - リン脂質の製造方法

Info

Publication number: JPH0613538B2
Application number: JP62015782A
Authority: JP
Inventors: 研一藤田; 孝一岩並; 幸子村上; 悟徳山; 理仲地
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1987-01-26
Filing date: 1987-01-26
Publication date: 1994-02-23
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: JPS63185990A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はリン脂質混合物を原料として、構造の明確なリ
ン脂質を製造する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

リン脂質は単に乳化剤に用い得るのみならず、リボソー
ムの基材として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への
応用が近年注目されており、またそれ自体生理活性、薬
理作用を持つものとして、医学、薬学、工学的分野等に
おいて様々な用途が考えられている。このような多様な
要求に対応するためには、それぞれの用途に応じた構造
を有するリン脂質を効率的に製造することが必要とな
る。

従来構造の明確なリン脂質を製造する方法としては、全
合成により製造する方法、グリセリルリン酸エステルを
原料としてアシル基導入により製造する方法、既に構造
の明確な合成リン脂質を原料として塩基部分の交換によ
り別の構造に変換する方法などが知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記全合成により製造する方法はホスフ
ァチジルコリンなどで知られているが、工程が長く複雑
で大規模化が困難、副生する異性体等の分離が困難など
の欠点があり、製造し得るリン脂質の種類も限られてい
る。

リン脂質を脱アシルしたグリセリルリン酸エステルを原
料としてアシル基導入により製造する方法は、含窒素ア
ルコール残基またはポリオール残基部分（以下、塩基と
呼ぶ）の種類によっては、アシル化反応時にグリセリン
部分の他にもアシル基が導入されてしまうため、この方
法では製造することができない。

またホスファチジルコリンの場合に限れば、ホスファチ
ジルコリンを含む粗リン脂質の脱アシル化からグリセリ
ルホスホリルコリンをカドミウムをはじめとする重金属
との錯塩として分離し、アシル基を導入することにより
合成ホスファチジルコリンを製造する方法が知られてい
るが、微量に残存する重金属の除去が困難であり、製造
したホスファチジルコリンの用途が限定されてしまう。

さらに既に構造の明確な合成リン脂質を原料として塩基
部分の交換により別の構造に変換する方法は、合成ホス
ファチジルコリンを原料としてホスフォリパーゼＤを作
用させることによりホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルグリセロールに変換する場合などが知ら
れている。しかし、一旦ホスファチジルコリンを合成し
た上で変換しなければならず、変換時にロスが生じるた
め効率が低い。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、粗リン脂
質を原料とし、簡単な工程で効率よく、構造の明確なリ
ン脂質を製造できるリン脂質の製造方法を提案すること
を目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、粗リン脂質に着脱可能な保護基を導入し、脱
アシル化して下記式(I) （式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
基を、Ｙは容易に着脱可能な保護基を、ｎは１２以下の
自然数を示す。）で示されるグリセリルリン酸エステル誘導体に変換し、
ケイ酸を分離剤として分離精製した後、任意のアシル基
を導入して保護基を脱離させることを特徴とするリン脂
質の製造方法である。

本発明では、粗リン脂質の塩基に適当な保護基（置換
基）を導入した後、脱アシル化してグリセリルリン酸エ
ステル誘導体とし、ケイ酸クロマトグラフィーで分離精
製する。そして各グリセリルリン酸エステル誘導体にア
シル基を導入してリン脂質誘導体とし、保護基を脱離さ
せてリン脂質を製造する。

本発明において重要な点は、リン脂質をグリセリルリン
酸エステル誘導体として分離精製することである。リン
脂質の脱アシル化物であるグリセリルリン酸エステルは
溶解性等の問題から、その混合物を工業的に分離精製す
る方法が存在しなかった。本発明においては、保護基を
導入してグリセリルリン酸エステル誘導体とすることに
より、ケイ酸クロマトグラフィーによる分離精製が可能
である。この場合塩基の種類により保護基の導入数が変
わるため、リン脂質の形でのケイ酸クロマトグラフィー
よりも分離精製能が向上する。保護基はまたグリセリル
リン酸エステル誘導体のグリセリン部分の水酸基に任意
のアシル基を導入してリン脂質誘導体にする際に、塩基
にアシル基が導入されないように保護する役割をも果
す。

本発明において用いられる原料粗リン脂質としては、天
然から抽出したあるいは市販のホスファチジルセリン、
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルＮ−
メチルエタノールアミン、ホスファチジルN,N-ジメチル
エタノールアミン、ホスファチジルN,N,N-トリメチルエ
タノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ
ァチジルアミノアシルグリセロール、ホスファチジルグ
リセロリン酸、カルジオリピン、ホスファチジルイノシ
トール、ホスファチジルイノシトールジリン酸、ホスフ
ァチジルイノシトールトリリン酸、糖リン脂質等の混合
物である粗リン脂質を精製することなく、そのまま使用
するとができる。このような粗リン脂質の例としては、
卵黄レシチン、脱脂大豆レシチン、酵母から抽出したリ
ン脂質画分、牛脳から抽出した粗セファリン画分等があ
げられる。粗リン脂質を溶媒分画等により前処理して用
いたり、クロマトグラフィー等により精製して用いるこ
ともできるが、粗リン脂質を精製することなくそのまま
用いる方が工業的に有利である。

ホスファチジルコリンは保護基が導入されないため、そ
のままグリセリルホリルコリンを経て合成ホスファチジ
ルコリンを得ることができる。

容易に着脱できる保護基は式(I)においてＹで示される
基であり、その例としては、直鎖状、分岐鎖状または環
状のアルキル基、直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキ
ロイル基、直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル
基、直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケロイル基、お
よびアリール基から選ばれる基を用いることができる。
このような保護基の例としては、粗リン脂質の塩基部分
と結合してアルキルエーテル、アリルエーテル、ベンジ
ルエーテル、トリアリールメチルエーテル、トリアルキ
ルシリルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル等の
エーテル類；酢酸エステル、蟻酸エステル、トリフルオ
ロ酢酸エステル、安息香酸エステル等のエステル類；メ
チレンアセタール、エチリデンアセタール、ベンジリデ
ンアセタール、イソプロピリデンアセタール等のアセタ
ール類などを生成する基をあげることができる。これら
の基の選択については、導入先であるリン脂質の塩基の
官能基の反応性などにより決定することが望ましく、そ
の反応方法および反応条件等については、糖およびアミ
ノ酸の反応に一般に採用されている方法および条件を採
用することができる。ただし、その後の任意のアシル基
導入の反応時に保護基が脱離しないものでなければなら
ない。

保護基の導入方法は、例えばベンジル化の場合は、溶媒
としてジメチルスルホキサイド、N,N-ジメチルホルムア
ミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のよく脱水し
たものを使用し、水素化ナトリウムや金属ナトリウム等
を用いてアルカリ金属のアルコラートを形成させ、続い
てハロゲン化ベンジルを加えることにより、ベンジルエ
ーテルを形成し、水酸基をベンジル基で保護することが
できる。またテトラヒドロピラニール化の場合は、溶媒
としてジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ベ
ンゼン等のリン脂質をよく溶解または分散するものを使
用し、触媒として酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタ
ンスルホン酸、H⁺型イオン交換樹脂等の酸を使用し、3,
4-ジヒドロ−α−ピランと攪拌下に反応させることによ
り、テトラヒドロピラニールエーテルを形成し、水酸基
を保護することができる。他の反応も上記に準じて行う
ことができる。反応温度は保護基の種類により−20〜10
0℃の範囲が適当であるが、基質の安定性から−20〜40
℃が最も好ましい。反応時間は15分〜数日間の範囲で適
宜選択することができる。

原料粗リン脂質にＹで示される保護基を導入した後、脱
アシル化することにより式(I)で示されるグリセリルリ
ン酸エステル誘導体の混合物を得ることができる。脱ア
シン化の方法は、リン脂質の脱アシル化に一般に用いら
れているメチルエステル化分解あるいはケン化分解等を
採用することができる。

この場合、水酸基を保護したリン脂質の脱アシル化はテ
トラブチルアンモニウムヒドロキサイド等の四級アルキ
ルアンモニウム水酸化物あるいはアルカリ金属などを使
用してアルコリシスすることにより行うことができる
が、低濃度のアルカリ等で穏やかに加水分解してもよ
い。脱アシル化反応に使用する溶媒としてはクロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、エーテル等がある
が、必要に応じてメタノール、エタノール等の親水性溶
媒との混合溶媒を使用することもできる。反応温度は０
〜100℃の範囲が好ましいが、基質の安定性から０〜40
℃が特に好ましい。反応時間は15〜数日間の範囲で適当
な時間を選択すればよい。

こうして得られた式(I)のグリセリルリン酸エステル誘
導体は原料粗リン脂質の種類により、Ｘがセリン基、エ
タノールアミン基、Ｎ−メチルエタノールアミン基、N,
N-ジメチルエタノールアミン基、N,N,N-トリメチルエタ
ノールアミン基、グリセロール基、アミノアシルグリセ
ロール基、グリセロリン酸基、グリセリルホスファチジ
ル基、イノシトール基、イノシトールリン酸基、イノシ
トールジリン酸基、単糖、二糖またはオリゴ糖の混合物
となっている。そしてこのグリセリルリン酸エステル誘
導体は保護基Ｙの導入により、全体の極性が低下して有
機溶媒に可溶となり、従来グリセリルリン酸エステルで
は不可能であった液体クロマトグラフィーによる分離精
製が可能となる。また脱アシル化時に生じた脂肪酸、未
反応物等もグリセリルリン酸エステル誘導体混合物と分
離することができる。エステル結合以外のエーテル結
合、酸アミド結合等によるアルキル鎖を持つリン脂質
等、例えばプラズマローゲン類、スフィンゴリン脂質等
もリン脂質のままでは分離が困難であるが、Ｙの導入に
より極性が極めて低くなるために容易に分離することが
できる。

分離剤として使用するケイ酸としては、破砕型のもので
もゲル状のもの（シリカゲル等）でもよく、粒径10〜80
0μｍ、細孔径0.25〜10μｍの範囲のものが好ましい。
市販品を用いることもでき、例えば、Clarkson Chemica
ls Co.製Unisil、和光純薬工業（株）製ワコーゲル、Me
rck社製Silica Gel60、（株）ヤトロン製イアトロビー
ズ（いずれも商標）等が分離性能等の面で好適である。
高速液体クロマトグラフィー用といて市販されているケ
イ酸は、分離性能では一段優れてはいるが、コスト的に
は不利である。その他の製品でも、使用前に粒径を揃え
る等の精製を充分に行えば、使用に耐える。

分離の方法としては、上述のケイ酸を使用する公知のカ
ラムクロマトグラフィーに準じた方式を採用することが
できる。すなわちグリセリルリン酸エステル誘導体が吸
着し得る低極性溶媒でケイ酸を前処理し、同様の低極性
溶媒に溶かしたグリセリルリン酸エステル誘導体を含む
試料を加えてケイ酸に展着させ、不用物等を洗い流した
後、高極性の溶媒を用いてグリセリルリン酸エステル誘
導体を順次溶離させる。吸着剤から不用物を洗い流す洗
浄効果を高めるためには、化合物が溶離しない程度に極
性の高い溶媒を用いることが望ましい。グリセリルリン
酸エステル誘導体をＸの種類ごとに順次溶離させるため
には、高極性溶媒を少しずつより極性の高いものに切り
替えながら順次流す、傾斜溶出を行うなどの操作が望ま
しい。

このような溶媒系としては、例えば以下のような組み合
せを示すことができる。高極性溶媒としては、炭素数１
〜10の直鎖状、分岐鎖状もしくは環状の脂肪族アルコー
ルまたはアルデヒド等および水もしくはそれらの混合物
などがあり、これらは分子内にエーテル結合、エステル
結合または二重結合を有していてもよく、アルキル基、
シアン基、アミン基等の官能基を有していてもよい。こ
のような高極溶媒の例としてはメタノール、３％含水イ
ソプロパノール、アセトニトリル、酪酸プロピルおよび
これらのうち２種以上の混合系があげられる。低極性溶
媒としては、炭素数１〜10の直鎖状、分岐鎖状もしくは
環状の炭化水素化合物または炭素数１〜２のハロゲン化
炭化水素化合物等があり、これらは分子内に二重結合ま
たはエーテル結合を有していてもよく、アルキル基等の
官能基を有していてもよい。またこれらと上記高極性溶
媒群から選ばれる少なくとも１種以上の混合物も使用可
能である。このような低極性溶媒の例としてはｎ−ヘキ
サン、イソオクタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピ
ルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、キシレン、ク
ロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、イソオクタ
ン−クロロホルム（３：７）、ｎ−ヘキサン−ベンゼン
（４：７）、クロロホルム−メタノール−水(65:25:4)
等があげられる。

このようにして分離、精製したグリセリルリン酸エステ
ル誘導体は、任意のアシル基を導入することにより、リ
ン脂質誘導体にすることができる。アシル基の導入方法
としては、脂肪酸塩化物による方法、酸無水物による方
法、酸イミダゾール塩による方法など、任意の方法を採
用することができるが、不飽和脂肪酸を導入しようとす
る場合は酸無水物による方法が安全である。

導入する任意の脂肪酸としては、炭素数30以下の直鎖
状、分岐鎖状の飽和または不飽和脂肪酸を用いることが
でき、例としては、酢酸、酪酸、カプリル酸、ラウリン
酸、ステアリン酸、セロチン酸、パルミトレイン酸、エ
ライジン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、αー
シノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘ
キサエン酸、イソステアリン酸、フィタン酸などをあげ
ることができる。原理的にはこれ以外のものでも導入す
るとが可能である。これらのカルボン酸を目的に応じ、
単独あるいは自由に組み合わせて用いることができる。

アシル基を導入する反応方法は、例えば上記カルボン酸
を酸無水物、酸ハロゲン化物、脂肪酸イミダゾール化物
等の活性アシル化状態にしたものをアシル化剤とし、水
酸基を保護した式(I)のグリセリルリン酸エステル誘導
体のグリセリル部分の水酸基と反応させる。アシル化剤
の添加量は反応基質に対し１〜20当量、好ましくは１〜
５当量とするのが良い。

反応に使用する触媒は塩基性触媒が用いられ、好ましく
はリン脂質の異性化を生じさせない穏やかなものがよ
い。アシル化剤に酸無水物、酸ハロゲン化物を使用する
場合、触媒としては、ピリジン、N,N-−ジメチル−４−
アミノピリジン、N,N-−ジメチル−４−アミノ−２−メ
チルピリジン、４−ピロリジノピロリジン等のピリジン
誘導体、およびトリエチルアミン、トリブチルアミン等
の三級アミン類等が使用できるが、酸無水物の場合には
N,N-ジメチル−４−アミンピリジンまたは４−ピロリジ
ノピリジン、酸ハロゲン化物の場合にはピリジンが好ま
しい。脂肪酸イミダゾール化物を使用する場合はイミダ
ゾールナトリウム、トリアゾールナトリウム、ベンツイ
ミダゾールナトリウムなどの含窒素五員複素環状化合物
のアルカリ塩が使用できるが、なかでもイミダゾールナ
トリウムが好ましい。触媒の添加量は原料に対し0.01〜
20当量程度、好ましくは0.1〜2当量が良い。

溶媒としてはクロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭
素等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン等の芳
香族炭化水素、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素；酢酸
エチル、酢酸プロピル等のエステル；ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン等のエーテル類などを用いるこ
とができ、これらの溶媒は乾燥していることが好まし
い。

アシル化反応は０〜80℃程度、好ましくは10〜50℃の範
囲で行うことができ、通常15分〜数日間、好ましくは30
分〜３日間で終了し、目的とする任意のアシル基で組み
換えたリン脂質誘導体を得ることができる。また反応系
は必ずしも制限されないが、特にアシル基に高度不飽和
脂肪酸を用いる場合は、窒素、アルゴン等の不活性ガス
気流下で行うことが好ましい。

上記のようにして任意のアシル基の導入により得たリン
脂質誘導体の保護基を脱離させることにより、構造の明
確なリン脂質を得ることができる。保護基を離脱させる
方法としては、酸触媒による加水分解、還元反応などの
通常保護基の結合を切断するために用いられている方法
を採用することができる。ただし、アルカリ条件下では
アシル基の脱離をも生じる可能性があるため、避けるこ
とが望ましい。還元により脱離する保護基を使用した場
合、反応は水素による接触還元が一般的であるが、もっ
と穏やかなギ酸、ギ酸アンモニウム、シクロヘキサジエ
ン等を水素供給源とした還元反応を用いることができ
る。

溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロ
ゲン化炭化水素類；テトラヒドロフラン、ジエチルエー
テル等のエーテル類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭
化水素類を使用することができ、触媒にはパラジウム、
酸化パラジウム、パラジウム−カーボン等を用いること
ができる。触媒添加量は、保護基１モルにつき10〜100g
のパラジウム量が好ましい。

反応は水酸基を保護し、任意のアシル基に組み換えたリ
ン脂質誘導体を適当な溶媒に溶解し、触媒を添加後、接
触還元の場合には水素を吹き込み攪拌すればよく、ギ
酸、ギ酸アンモニウム、シクロヘキサジエン等の助触媒
を用いる場合は、この助触媒を基質中の保護基１モルに
つて１〜20当量添加し、不活性ガス気流下で攪拌するこ
とにより得ることができる。この反応は温度−20〜80℃
で行い、好ましくは０〜40℃が良い。10分〜４時間で反
応は終了し、後処理として、反応物をろ過により除き、
ろ液を水でよく洗浄し、乾燥後溶媒を除き、目的とする
任意のアシル基を組み換えたリン脂質を得ることができ
る。

保護基に酸触媒により脱離するものを用いた場合には、
溶媒はクロロホルム、ジクロロメタン、ベンゼン、テト
ラヒドロフラン、ジメチルスルホキサイド等の基質をよ
く溶解または分散するものであればよい。酸触媒には、
塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等の無機酸、および酢酸、ｐ
−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸、
ならびにH⁺型イオン交換樹脂を用いることができる。酸
触媒の添加量は、分子内の保護基１モルに対し、上記の
酸0.1〜５当量使用すればよく、好ましくは0.5〜２当量
が良い。５分〜数日間の適当な時間を反応時間とするこ
とができ、反応温度は−20〜100℃の間で行うことがで
きるが、基質の安定性を考慮すると０〜40℃で15分〜４
時間の反応が好ましい。反応後水でよく洗浄し、乾燥後
溶媒を除き、目的とする任意のアシル基に組み換えたリ
ン脂質を得ることができる。

こうして得られるリン脂質は天然のリン脂質の構造をそ
のまま保持し、アシル基のみが組み換えられた構造であ
るため、組み換えられたアシル基に応じた目的に使用さ
れる。例えばアシル基の鎖長、不飽和度、結合位置を明
らかにする目的の場合には、それらが明らかなリン脂質
として薬理効果の確認等に用いられる。またアシル基に
機能性を持たせる目的の場合、例えばアシル基が生理活
性を有する高度不飽和脂肪酸の場合には、生理活性物質
として用いられ、アシル基が重合性基である場合には、
重合用の単量体として用いられる。さらにこれらのリン
脂質は目的に応じて塩として用いられる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、容易に得られる天然リン脂質混合物を
原料とし、構造の明確なリン脂質を、従来法よりも高い
簡便性、容易性、経済性、純度および収率で製造できる
とともに、従来製造し得なかったリン脂質をも製造でき
る。

〔実施例〕

以下、実施例および参考例に基づいて本発明を具体的に
説明する。

各例中、％は重量％を示す。また化合物の同定は主とし
て分析法１に示す薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分
析で基準物質との比較で行ったが、必要に応じて分析法
２に示すように質量分析を行った。

分析法１ＴＬＣ分析を以下の要領で行った。

Merck社製NO.5717プレートに20〜100μgの試料を直径３
〜５mmにスポットし、クロロホルム−メタノール−水(6
5:25:4)またはクロロホルム−メタノール−水(120:70:
5)で展開した。展開溶媒を風乾後、検出試薬を噴霧し
た。検出にはDittmer試薬、50％硫酸、ニンヒドリン試
薬、アンスロン試薬を目的に応じて使用した。定量的な
測定には50％硫酸と噴霧し、120℃で20分間加熱して発
色させたものを島津製作所製高速薄層クロマトスキャナ
ーCS-920型で測定した。

分析法２試料を日本電子（株）製JMS-DX303型質分析装置を用
い、下記条件にて分析した。

測定条件イオン化法：FAB法衝撃ガス：Xe 一次イオン加速電圧：６kV フィラメント電流：20mA 検出器：Conversion Dynode 押し出し電圧：15kv マトリクス：トリエタノールアミン（陽イオンの場合塩化ナトリウム添加）データ処理：JMA-DA5000 また不純物が多く、そのままでは質量分析にかけられな
い試料については、分析法１と同様にしてＴＬＣで展開
し、該当するスポットの部分を掻く取って抽出したもの
について分析した。

参考例１酵母から総脂質を抽出し、アセトン分画によりリン脂質
を濃縮した。

市販のパン酵母１kgをクロロホルム−メタノール（１：
１）４、２、１で計３回抽出した。抽出液を集
め、0.2Ｍ塩化カリウム水溶液を加えて分層させ、クロ
ロホルム層を減圧乾固し、総脂質16.8gを得た。

このものを500mlの冷アセトン中に分散して５℃で30分
攪拌し、生じた沈澱を遠心分離して集めた。同じ操作を
200ml、100mlのアセトンを用いて２回繰り返し、得られ
た沈澱2.7gを酵母粗リン脂質とした。

このものの組成は中性脂質28％、ホスファチジルイノシ
トール34％、ホスファチジル酸18％、ホスファチジルコ
リン９％、ホスファチジルエタノールアミン８％であっ
た。

参考例２牛脳からM.Leesの方法[in"Methods in Enxymology"(S.
P.Colowick and N.O.Kaplaned.),vo1.3,pp328,Achademi
c Press,NewYork(1957)]により粗セファリンを抽出し
た。

近在の屠殺場で入手した新鮮な牛脳の脳膜、血管を取り
除いたもの300gを1.2のアセトン中でホモジナイズ
し、抽出した。ろ過残渣をもう一度1.2のアセトンで
抽出し、そのろ過残渣を1.2のエタノールで抽出し
た。さらにそのろ過残渣を同様にして1.2の石油エー
テルで２回抽出し、抽出液を集めた減圧乾固し、粗セフ
ァリン画分3.9gを得た。

このものの組成はホスファチジルエタノあルアミン31
％、ホスファチジルコリン23％、ホスファチジルイノシ
トール14％、スフィンゴミエリン12％、ホスファチジル
セリン11％、ホスファチジン酸７％であった。

実施例１市販脱脂大豆レシチン（中性脂質６％、ホスファチジル
コリン26％、ホスファチジルエタノールアミン19％、ホ
スファチジン酸16％、ホスファチジルイノシトール15
％）５ｇをベンゼン500mlに溶解し、メタンスルホン酸
0.32g，エチルビニルエーテル3.5mlを加えて室温で一夜
攪拌した。反応混液を５％NaHCO₃水溶液500mlで洗浄
後、Na₂SO₄で乾燥し、減圧濃縮した。

得られた反応物をクロロホルム300mlに溶かし、30℃で
攪拌しつつ１ＭNaOHメタノール溶液35mlを滴下してアル
カリ加水分解し、脱アシル化した。反応混液にメタノー
ルと水と加え、Folchらの方法[J.Folch,et.al.,J.Biol.
Chem.226,497(1957)]で水洗した。クロロホルム層を取
り、Na₂SO₄で脱水した後、減圧乾固したものをｎ−ヘキ
サン約５mlに溶かした。

Clarkson Chemicals Co.製Unisilをカラム（径2.2cm、
高さ20cm）に充填し、ｎ−ヘキサンで前処理した。先の
反応物を展着し、ｎ−ヘキサン−クロロホルム（１：
１）150mlでカラムを洗浄後、ｎ−ヘキサンーメタノー
ル（１：９）300mlを流して後半の100mlを集めた。さら
にメタノール150mlを流して後半の100mlを集めた。

ｎ−ヘキサン−メタノール（１：９）溶出画分およびメ
タノール溶出画分をそれぞれNa₂SO₄で脱水した後、減圧
乾固し、質量分析にかけたところ、ｎ−ヘキサン−メタ
ノール（１：９）溶出画分にはグリセリルホスホリルイ
ノシトールにエトキシエチル基が導入されたと推定され
るものが、メタノール溶出画分にはグリセリルホスホリ
ルエタノールアミンにエトキシエチル基が導入されたと
推定されるものが溶出されていた。

ｎ−ヘキサン−メタノール（１：９）画分溶出物にジシ
クロヘキシルカルボジイミドを触媒としてジメチルアミ
ノピリジンの存在下にリノール酸を無水物化させて作用
させ、導入した。反応混液を減圧乾固し、クロロホルム
−メタノール−酢酸（４：２：１）に溶かして攪拌し、
適量の水を加えて分層させてクロロホルム層を集め、減
圧乾固した。保護基を離脱させた反応物をＴＬＣ分析し
たところ、ホスファチジルイノシトールとRf値が一致す
るスポットが現れ、ＴＬＣで分取して質量分析したとこ
ろ、ジリノレイルホスファチジルイノシトールであるこ
とが確認された。

メタノール画分溶出物にミリスチン酸クロライドを作用
させ、同様にして保護基を脱離させたものについて分析
したところ、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミンの生成が認められた。シリカゲルカラムクロマト
グラフィーにて精製し、ジミリストイルホスファチジル
エタノールアミン324mgを得た。

実施例２参考例１で得た酵母粗リン脂質2.5gをベンゼン−ジメチ
ルスルホキサイド（１：１）250mlに溶解し、窒素気流
下であらかじめ調製した水素化ナトリウム−ジメチルス
ルホキサイドのカルバニオン溶液（水素化ナトリウム1.
2gをジメチルスルホキサイド72ml中で窒素圧流下に65〜
70℃で攪拌して得られた暗緑色の溶液）62.5mlを攪拌し
つつ滴下した。３時間攪拌後、氷冷下に塩化ベンジル20
mlを滴下し、さらに６時間攪拌した。ベンゼン450mlで
抽出し、１の水で３回洗浄後減圧濃縮した。

実施例１と同様にして脱アシル化し、水洗した。クロロ
ホルム層を乾燥し、減圧乾固したものを３mlのベンゼン
に溶かした。

Merck社製Silica Gel 60を充填し、イソオクタン−ベン
ゼン（９：１）で前処理したカラム（径２cm、高さ18c
m）に上記試験料を展着した。カラムをイソオクタン−
アセトン（３：２）200mlで洗浄後、イソオクタン−ア
セトン（２：８）200mlで溶出した。イソオクタンーア
セトン（２：８）画分を濃縮し、グリセリルホスホリル
イノシトールベンジル化物205mgを得た。

これをジクロロメタン200mlに溶解し、ピリジン0.1ml、
２％ミリスチン酸塩化物クロロホルム溶液20mlを加え、
室温で５時間攪拌後200mlの水で３回洗浄し、減圧濃縮
した。クロロホルム−メタノール−水(65:25:4)で前処
理したシリカゲルカラム（径1.5cm、高さ20cm）にクロ
ロホルム10mlに溶かした反応物を展着し、同じ溶媒で溶
出して未反応物を除去した。目的反応物を含む画分を集
めて減圧乾固した。

このものをベンゼン200mlに溶解し、0.63gの10％パラジ
ウム−チャコールを加えて水素気流下にて42℃で攪拌し
た。パラジウム−チャコールをろ別し、減圧濃縮したも
のをクロロホルム10mlに溶かした。クロロホルムーメタ
ノール−水(65:25:4)で前処理されたシリカゲルカラム
（径1.5cm、高さ20cm）に展着し、同じ溶媒で溶出して
酵母標準ホスファチジルイノシトールとＴＬＣ上でRf値
のほぼ一致するスポットを与える目的反応物の溶出した
画分を集めて減圧乾固し、固形物219mgを得た。

このものがジミリストイルホスファチジルイノシトール
であることを質量分析で確認した。

実施例３参考例２で得た牛脳粗セファリン画分3.9gをクロロホル
ム380mlに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸１ｇ、イソ
プロピルケトン4.5mlを加え、35３時間攪拌した。実施
例１と同様にして洗浄し、一旦減圧濃縮したものをクロ
ロホルム溶液として脱アシル化した。

クロロホルムで前処理した（株）ヤトロン製イアトロビ
ーズ6RS-80100カラム（径2.2cm、高さ33cm）に試料を展
着し、クロロホルム−メノルール（２：１）240mlにて
カラムを洗浄後、クロロホルム−メタノール（３：２）
130ml，クロロホルム−メタノール（３：７）200mlおよ
びクロロホルム−メタノール−水(65:25:4)300mlで順次
溶出した。

クロロホルム−メタノール（３：２）画分にはグリセリ
ルホスホリルイノシトールにイソプロピリデン基が導入
されたものが、クロロホルム−メタノール（３：７）画
分にはグリセリルホスホリルセリンにイソプロピリデン
基が導入されたものが、クロロホルム−メタノール−水
(65:25:4)画分にはグリセリルホスホリルエタノールア
ミンにイソプロピリデン基が導入されたものがそれぞれ
溶出されていた。

クロロホルム−メタノール（３：２）溶出画分にはカプ
リル酸を、クロロホルム−メタノール（３：７）溶出画
分にはイソステアリン酸をそれぞれ脂肪酸塩化物として
作用させ、クロロホルム−メタノール−水(65:25:4)溶
出画分にはアラキドン酸を酸無水物として作用させ導入
した。

それぞれイソプロピリデン基を脱離させ、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにて精製して、ジオクタノイル
ホスファチジルイノシトール97mg、ジイソステアロイル
ホスファジルエタノールアミン353mg、ジアラキドイル
ホスファチジルセリン112mgを得た。

実施例４市販卵黄レシチン（ホスファチジルコリン64％、ホスフ
ァチジルエタノールアミン19％、ホスファチジン酸７
％、スフィンゴミエリン５％、リゾホスファチジルコリ
ン３％）10gを四塩化炭素500mlに溶解し、ｐ−トルエン
スルホン酸0.75gおよび3,4-ジヒドロ−α−ピラン5.2g
を加え、室温で４時間攪拌した。実施例１と同様にして
洗浄後減圧濃縮し、クロロホルム中でアルカリ加水分解
により脱アシル化した。アルカリを蟻酸エチルで中和
し、そのまま減圧乾固したものをジイソプロピルエーテ
ル50mlに溶かし、試料を調製した。

ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（８：２）で
前処理した和光純薬工業（株）製ワコーゲルＣ300を200
g充填したカラムに上記試料を加え、バッチ式で処理し
た。ゲルを同じ溶媒２で３回洗浄した後、ジイソプロ
ピルエーテル−アセトニトリル（２：８）２で３回抽
出し、さらに10％含水メタノール２で５回抽出した。

ＴＬＣ分析したところ、ジイソプロピルエーテル−アセ
トニトリル（２：８）画分にはグリセリルホスホリルエ
タノールアミンにテトラヒドロピラニル基が導入された
ものが、10％含水メタノール画分にはグリセリルホスホ
リルコリンが、それぞれ溶出されていた。

ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（２：８）溶
出画分にフィタン酸を脂肪酸塩化物として作用させて導
入し、テトラヒドロピラニル基を脱離させ、カラムクロ
マトグラフィーにて精製し、ジフィタノイルホスファチ
ジルエタノールアミン1.08gを得た。

10％含水メタノール溶出画分にはパルミチン酸を脂肪酸
塩化物として作用させて導入し、カラムクロマトグラフ
ィーにて精製してジパルミトイルホスファチジルコリン
4.15gを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】粗リン脂質に着脱可能な保護基を導入し、
脱アシル化して下記式(I) （式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
基を、Ｙは容易に着脱可能な保護基を、ｎは12以下の自
然数を示す。）で示されるグリセリルリン酸エステル誘導体に変換し、
ケイ酸を分離剤として分離精製した後、任意のアシル基
を導入して保護基を脱離させることを特徴とするリン脂
質の製造方法。
【請求項２】Ｘがセリン基、エタノールアミン基、Ｎ−
メチルエタノールアミン基、N,N-ジメチルエタノールア
ミン基、N,N,N-トリメチルエタノールアミン基、グリセ
ロール基、アミノアシルグリセロール基、グリセロリン
酸基、グリセリルホスファチジル基、イノシトール基、
イノシトールリン酸基、イノシトールジリン酸基、単
糖、二糖およびオリゴ糖から選ばれる少なくとも１種類
からなるものである特許請求の範囲第１項記載の製造方
法。
【請求項３】Ｙが直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキ
ル基、アルキロイル基、アルケニル基、アルケロイル基
またはアリール基である特許請求の範囲第１項または第
２項記載の製造方法。
【請求項４】導入するアシル基が炭素数30以下の直鎖
状、分岐鎖状もしくは環状の飽和または不飽和脂肪酸で
ある特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記
載の製造方法。
【請求項５】分離剤としてのケイ酸が粒径10〜800μ
ｍ、細孔径0.25〜10μｍである特許請求の範囲第１項な
いし第４項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】極性の低い溶媒の存在下にグリセリルリン
酸エステル誘導体を分離剤に吸着させ、分離剤を洗浄
後、極性の高い溶媒でグリセリルリン酸エステル誘導体
を溶離する特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
かに記載の製造方法。