JPH0613558B2 - ヒトプロゲステロン受容体に対する抗体及び試薬及び使用方法 - Google Patents

ヒトプロゲステロン受容体に対する抗体及び試薬及び使用方法

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JPH0613558B2
JPH0613558B2 JP62502823A JP50282387A JPH0613558B2 JP H0613558 B2 JPH0613558 B2 JP H0613558B2 JP 62502823 A JP62502823 A JP 62502823A JP 50282387 A JP50282387 A JP 50282387A JP H0613558 B2 JPH0613558 B2 JP H0613558B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １．発明の分野 ヒトプロゲステロンまたはヒトプロゲスチン受容体（ｈ
ＰＲ）を細胞から単離する方法、ならびにこのｈｐＲを
抗体の生産に利用する方法について述べる。この抗体の
生産は、ヒトプロゲステロン受容体に特異的な多クロー
ン性及び単クローン性の両抗体、および生産された前記
抗体を用いたヒトプロゲステロン受容体を検出および測
定する方法を包含する。
２．発明の背景 本発明は、ヒトプロゲステロンまたはヒトプロゲスチン
受容体の単離、ならびにこの受容体蛋白質の抗体分子生
産における利用一般に関する。より詳細には、本発明
は、ｈＰＲに特異的な反応性を有し、免疫学的反応によ
るｈＰＲの検出および定量化のための改良試験方法と試
薬を提供する新規な抗体の製造方法を提供する。
ある種の組織、特にある種のヒト乳癌組織は、これらを
維持するホルモンを全身的に剥奪することによりその組
織の生長および細胞増殖の減退がされるという意味に
おいて、ステロイドホルモン“依存性”と規定されてき
た。両側副腎摘出術が閉経後の女性の進行した乳癌の顕
著な緩解に有効なこと、および同様な緩解が下垂体切除
術後にも観察されることは、この依存性の一例である。
現在のところ進行とした乳癌に適用可能な最も有効な治
療法は、エストロゲン産生に重要な役割を果す組織の外
科的切除によるエストロゲンの剥奪、および／または内
分泌物添加療法である。不運なことに、このタイプの治
療法に反応するのは、閉経前の患者の半数未満、および
さらに低いの割合の閉経後の患者であり、このことは、
乳癌組織は全てがエストロゲン様ホルモン依存性タイプ
の細胞からなる組織であるとは限らないことを示してい
る。従って、乳癌患者から切除した腫瘍組織が主にエス
トロゲン依存性細胞により構成されているか否かを確認
できることが、ヒト乳癌の予後および治療にとって重要
である。そのような知見に基づけば、切除に対する応答
を正しく予測することができる。エストロゲン剥奪を目
的としたエストロゲン産生腺の外科的切除の適用は、そ
の方法による治療が最も有効な患者だけに限られる。そ
れと関連して、適用外の患者は本質的に無益な外科手術
の外傷から免れることができ、直ちに放射線照射あるい
は化学療法のような代替的プログラムに組み込まれるこ
とができる。
プロゲステロン受容体は特定のプロゲステロンに結合す
る蛋白質であって、結合するプロゲステロンもしくは別
のプロゲスチンに特異的であり、ある種の組織における
プロゲステロンに特異的な生物学的応答の刺激に関与し
ている。そのような応答性の標的組織は、プロゲステロ
ンがプロゲステロン受容体に結合するとプロゲステロン
受容体の複合体が細胞の染色質に固く結合して活性化を
受け、その結果として、その細胞はあるタイプのＲＮＡ
を合成する能力を得る。真核生物の細胞において、プロ
ゲスチンおよび他のステロイドホルモンによるこの遺伝
子表現の制御は、特定の細胞間受容体蛋白質とステロイ
ドホルモンおよびゲノム両者の相互作用に関与し、その
結果として特定の遺伝子が何組かこれに応答して活性化
する（１：本明細書本文においては、引用文献を全て文
献番号で表し、本文の末尾にその書誌的事項を記す）。
ホルモン受容体とステロイドホルモン間の相互作用の結
果がＤＮＡ合成の変化であり、ＲＮＡ合成及び蛋白質産
生の変化である。この蛋白質は、細胞増殖、分化、およ
び種々の組織における生理学的機能に関与している。エ
ストロゲンホルモンはプロゲステロン受容体蛋白質を誘
導するが、その合成はエストロゲン受容体が染色質に結
合することによって、転写的に制御されるようである。
さらに、そのようなステロイドホルモンおよびその受容
体は、種々の腫瘍および腫瘍細胞株における異常な生長
の制御に関与しているようである（２）。幾つかの研究
所のデータ（３）から、ステロイドホルモンの作用は配
位子を欠く核成分（ステロイド）と弱く結び付いている
細胞間受容体分子に直接ホルモンが結合することと関連
することが示唆される。ホルモンの配位子がその受容体
と結合すると、次に、ステロイド−受容体複合体が１つ
またはそれ以上の核成分と高い親和力で結合した形態に
転換する。ステロイド受容体に関する知見は、主として
生殖組織に認められ細胞間ステロイドに結合した受容体
蛋白質を検出、定量化および定性化するための放射標識
ホルモン（４）およびホルモン類似物質を使用すること
により得られたものである。プロゲステロン受容体を含
むすべてのステロイド受容体蛋白質にはステロイドホル
モンおよびＤＮＡに結合する分域が明確に存在すると仮
定されてきたが、ステロイドホルモンとＤＮＡの両者に
結合するサブユニットの構造、組成および化学的特性に
関する詳細なデータはほとんど入手不可能であり、事実
上、ステロイドホルモンに対する組織の応答に関係する
他の非ステロイド結合成分の関与については何も知られ
ていない。
これまで、乳房腫瘍試料におけるステロイドホルモン依
存性組織の存在は、主として、放射化学検定法を用いて
試料中のステロイドホルモン受容体を定量的に検出する
ことにより測定されてきた。そのような手法の一つにお
いて、放射性の（例えばトリチウムを有する）プロゲス
テロンは、均質化した組織試料の細胞質もしくはその上
澄画分に添加され、そしてトリチウムを有するプロゲス
テロンが細胞質に存在するすべてのｈＰＲと可逆的に結
合する。その試料を次に低塩のショ糖密度勾配超遠心分
離にかければ、高分子である受容体−プロゲステロン複
合体は定性的な速度で沈降する。放射能カウントは複合
体を定量化するために使用されることができる。この手
法は、すべての非特異的結合を同定および除外するため
に、望ましい特異的結合の阻害剤の存在下ならびに不在
下に実施される。
上記の分析技法には、かなり複雑で、高価かつ一般的で
ない超遠心分離器の使用が必要であり、その操作にはそ
の部門の研究員に高度の熟練が要求される。受容体検定
に用いられる他の方法にも、類似した制限がある［例え
ば、コレンマン(Korenman)ほか、ジャーナル・オブ・ク
リニカルエンドクリノロジー・アンド・メタボリズム
(J.Clin.Endocrinol.& Metab.)３０，６９９−６４５
（１９７０）参照］。その結果、内分泌治療法に対する
応答を予測するに際してｈＰＲの定量的検出は非常に有
益であるにもかかわらず、先行する放射化学的検定法の
利用性は化学的、地理学的、かつ経済的条件により制限
を受けている。
ステロイドホルモン受容体に対する単クローン性抗体の
生産は、近年、イー・ミルグロム(E.Milgrom)が、ファ
ーマ・テラピー(Pharmac Ther.)２８，３８９（１９８
５）に取り上げた。ヒトステロイド受容体蛋白質に関す
る敏感な免疫学的検定法の成果についてを、ノラン(Nol
an)他が、「乳癌における現在の論争」(Current Contro
versies In Breast Cancer,University of Texas Pres
s,1984)に述べている。免疫化学的方法を、エストロゲ
ン受容体の構造と機能の分析に応用することは、キー・
エル・グリーン(G.L.Greene)がバイオケミカル・アクシ
ョンズ・オブ・ホルモンズ(Biochemical Actions of Ho
rmones)，１１巻８章（１９８４）に述べている。乳癌
の管理における受容体の重要性は、ハウキンス(Hawkin
s)が、ザ・ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ホスピ
タル・メディシン(The British Journal of Hospital M
edicine))、１６０頁、１９８５年９月号に示してい
る。
癌がホルモン応答性であるか否かを決定することの臨床
的有用性は、内分泌治療に対する患者の応答と、乳癌に
おけるヒトエストロゲン受容体（ｈＥＲ）およびヒトプ
ロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の含有量との相関関係に
よって示される。これらの研究は、生化学的なｈＥＲお
よびｈＰＲ検定の重要性ならびに有用性を明確に立証し
た。種々の内分泌治療の結果、非選別患者群のわずか２
５〜３０％が転移性疾患の客観的緩解を得たにすぎない
のに対して、その癌がｈＥＲとｈＰＲの双方を含んでい
た患者群の７５％以上が緩解した（５）が、２つのステ
ロイドの片方しか存在しない場合の応答率は３３％にす
ぎなかった（６）。さらに、原発癌がｈＥＲ／ｈＰＲを
多く含む患者の方が、原発癌にこれら受容体のどちらか
一方を欠く患者よりも病気に罹っていない間隔が長いよ
うである（７，８）。幾つかの臨床治験のデータ（９〜
１１）は、（エストロゲン作用の最終生産物としての）
ｈＰＲが乳癌患者における好ましい予後と内分泌応答の
マーカーとしてエストロゲン受容体よりも優れているこ
とを示している。従来、ｈＥＲとｈＰＲを測定する受容
体結合検定法は、放射標識ステロイドホルモンまたはそ
の類似物と適切な受容体蛋白質との飽和結合によるもの
であった。この検定法はかなりな実験技術と努力を必要
とするので、免疫学的診断法の有効性はステロイド受容
体の存在の確認をはるかに容易にするであろう。
ｈＰＲ検出のための免疫化学的方法が利用可能になれ
ば、より簡単で、より安価な分析方法を提供し、かつよ
り広く臨床的に利用できるであろうと認められていた。
しかし今まで、ｈＰＲに対する抗体を製造し、かつその
抗体をヒトの組織および細胞中のｈＰＲの検出に効果的
に採用することができる確実な証明のなされた技法は提
供されていなかった。事実、ｈＰＲ単離の困難さは、い
つまでも首尾よく開発されないのではないかという疑い
を生んでいる。
他のステロイド受容体に関しては、ステロイド受容体抗
体に依存する検定法が開発されている。十分に明らかに
なっているｈＥＲ抗体の生産については、最初にグリー
ン(Greene)らが報告している（１２）。多クローン性抗
体はグルココルチコイド受容体を一部精製した調製品
（１３〜１５）、子牛及びヒトのエストロゲン受容体
（１６，１７）、及びウサギとモルモットの子宮（１
８，１９）、およびひな鳥の卵管（２０）から単離した
プロゲステロン受容体に対して生じる。さらにヒト血清
ではアンドロゲン受容体に対する自己免疫性抗体が発見
されている（２１）。抗体は、別種生物起源の、対応す
る受容体と結合することもある。しかし、サブユニット
に結合しているステロイドに対して方向づけられている
抗体はすべて、ホルモン特異性のようである。単クロー
ン性抗体は、エストロゲン受容体（２２〜２４）、グル
ココルチコイド受容体（２５〜２７，２８）、およびウ
サギのプロゲステロン受容体（２８）に対して作製され
ている。ウサギのプロゲステロン受容体に対する抗体は
ｈＰＲと交叉反応するが、その親和性は非常に低いと報
告されている。単クローン性抗体は、ニワトリの卵管プ
ロゲステロン受容体のＢ−サブユニット（３０）および
Ａ−サブユニット（３１）の、推定上の非ホルモン結合
形に対して準備されているが、これらＢおよびＡ「抗
原」と、サブユニットに結合しているステロイドとの関
係は立証されていない。多クローン性（３２）および単
クローン性（３３）抗体は両者とも、ステロイド受容体
と密接に結合している蛋白質に対して準備されている
が、それ自身はホルモンと結合しない。
発明の要約 ヒトのプロゲスチン受容体の単離方法及び、単離したプ
ロゲスチン受容体をヒトのプロゲスチン受容体に特異的
な免疫グロブリン産生に利用する方法を提供する。さら
に特別なことに、プロゲスチン受容体の精製調製品で免
疫化された動物血清からも、プロゲスチン受容体を免疫
原体として用いて産生した単クローン性抗体からも、免
疫グロブリンが得られた。この発明で産生された免疫グ
ロブリンは各々、次の特徴を持っている。
（ａ）プロゲスチン受容体は流体から免疫的に沈降させ
る能力； （ｂ）高速で沈降する免疫グロブリン・プロゲスチン受
容体複合体を形成する能力； （ｃ）生物学的抽出物からプロゲスチン受容体を吸着す
る能力；及び （ｄ）透過可能にされた組織、腫瘍切片あるいは固体の
細胞において、プロゲスチン受容体に結合する能力。
この発明の免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＤあるいはＩｇＥでよく、それらは単クローン法あ
るいは多クローン法のいずれによって産生されてもよ
い。この発明のもう一つの具象化は、ヒトのプロゲスチ
ン受容体を蛋白質の２％以上に精製することである。精
製プロゲスチン受容体は、より好ましくは純度２０％以
上であり、最も好ましくは純度６０％以上である。さら
に、本発明のもう一つの具象化には、抗ヒトプロゲスチ
ン受容体と検出可能なマーカーとの結合が含まれる。さ
らに本発明のもう一つの実施例は、ヒトプロゲスチン受
容体が検出可能な粒子等の担体と、あるいはクロマトグ
ラフィーに適する基質に結合することである。本発明の
もう一つの実施例は抗−ヒトプロゲスチン受容体免疫グ
ロブリンを、ヒトの癌組織のような生物学的試料中の、
ヒトプロゲスチン受容体の存在を検出して、診断上の検
定法に用いることである。さらに、本発明のもう一つの
実施例は、ヒトプロゲスチン受容体に特異的な免疫グロ
ブリン類を獲得する方法で、その方法では受容体は、動
物の免疫システムでは免疫原体として、また生体内ある
いは生体外では感作リンパ球における免疫原体として用
いられている（４２）。本発明にはまだ、感作リンパ球
を用いた雑種細胞株形成による単クローン性抗体の製造
方法がある。本発明の他の特徴は、組織、細胞あるいは
生物学的流体におけるプロゲステロン受容体を測定する
組織学的方法であり、その方法では、ヒトプロゲステロ
ン受容体に特異的な、検出可能なマーカーを有する抗体
をプロゲステロン受容体に接触させて同定する。本発明
の最終的な目的は、ヒトプロゲステロン受容体の検出に
有用な診断用キットの調製であり、検出可能なマーカー
および付加的に適切な担体溶液と結合したヒトプロゲス
テロン受容体に対する抗体を含むキットの調製である。
発明のそれ以上の特徴と利点は、本発明の独特な具象化
に関する次の記述から当業者には明らかであろう。
独特な態様に関する記述 現行のｈＥＲ及びｈＰＲ検定法の価値にもかかわらず、
乳癌及び他の婦人科学的な癌に対する応答の正確さと予
後の予測を改善する必要がある。５００列以上の乳癌に
おいて、生化学的ｈＥＲ検定と定量的かつ細胞化学的な
免疫学的ｈＥＲ検定との間に見られる良好な相関関係
（３４〜３６）は、内分泌物応答性の癌においてステロ
イド受容体分析を免疫化学的に研究する潜在的価値を示
している。ｈＰＲは予後および診断において重要な腫瘍
マーカーでもあるので、放射標識ホルモンの結合に依存
せずに、測定および精製するｈＰＲを位置づける手段
は、ある種の癌における受容体介在性事象とホルモン応
答性に関する我々の知識を広げることは明らかである。
単クローン性抗体を利用することは、プロゲスチンホル
モンの存在下でも不在下でも、ｈＰＲ蛋白質の配置特異
性と親和性を測定するには優れた方法である。その上、
特異的抗体は受容体蛋白質の精製および定量を促すため
に、あらかじめ固定される。それらは、組織、培養細胞
あるいは無細胞抽出物において、受容体の位置を確認お
よび／または定量化するために、指示薬酵素、電子不伝
導性物質あるいは放射性同位元素で標識される。ｈＰＲ
の免疫化学的検定は比較的簡単、迅速、敏感かつ特異的
であり、容易に標準化することができ、操作中の受容体
の変性による影響が少なく、かつ試料中に存在する、ス
テロイドと結合したあるいは結合していない受容体の総
量を測定することができる。さらに、免疫細胞化学的検
定は、周囲の正常な組織におけるものと同様に、腫瘍に
おいても、ｈＰＲ含有細胞の不均衡な分布に関する情報
を提供する。その情報は、応答性腫瘍細胞集団中にホル
モン非感受性腫瘍細胞の亜集団が存在することを確認す
る際に重要なものである。同様な原理体系によって、腫
瘍のｈＥＲおよびｈＰＲを同時に評価することは、腫瘍
の状態の補足的指標としてのパラメーターおよび種々の
治療方法に対する応答性の両者の評価を可能にする。こ
のような二重検査は、時間、労力および診断検査室にお
ける２つのタイプの受容体検定法の維持費を節約する。
プロゲステロン受容体の抗体は、他に、細胞間、溶液お
よび特定の組織においてプロゲステロン受容体の位置の
探知と定量化にも用いられる。非プロゲステロン受容体
を含む組織と、ヒトプロゲステロン受容体を含む組織と
を識別することにも有用である。ヒトプロゲステロン受
容体に特異的な抗体は、血液あるいは他の体液中のｈＰ
Ｒの存在を確認することにも使用される。このような確
認は、ｈＰＲを含む細胞が傷ついているのか、または死
んでいるのかを評価する際に有用である。プロゲステロ
ン受容体の抗体は、手術中あるいは頸管拡張術及び掻爬
術中の子宮組織のｈＰＲ量を定量化るのにも用いられ
る。さらに、ｈＰＲ抗体は、薬剤設計の領域にも用いら
れる。ｈＰＲ抗体、およびそのような特異的抗体を用い
て単離したプロゲステロン受容体は、結合親和性を評価
することによって、プロゲスチン作動薬あるいは拮抗薬
の設計に有用である。
特異的なｈＰＲ多クローン性および単クローン性抗体の
生産には、ｈＰＲの単離および精製が必要である。ひと
たび精製あるいは部分的に精製されれば、ｈＰＲは多ク
ローン性あるいは単クローン性抗体の生産に用いられ
る。
これらの抗体は、ｈＰＲ、もしくは結合プロゲステロン
を含むｈＰＲ複合体に応答し得る適格な免疫システムを
有するあらゆる動物において生産され得る。中でも好ま
しい動物類は、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツ
ジ、ウマ、ウシあるいはブタのような哺乳動物である。
抗体の分類の中では、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ
およびＩｇＥに限られず、すべての免疫グロブリンタイ
プが含まれる。抗体全体が使用される必要はなく、むし
ろＦａｂ、（Ｆａｂ１）２、Ｆｖまたはその他の断片が
使用される。検定に使用する際に重要な因子は、ｈＰＲ
に特異的な抗体断片の親和性である。
プロゲステロン受容体自体は高張の溶液中では４Ｓで沈
降し、低張の溶液中では８〜１０Ｓで沈降する。免疫原
体として用いる場合には、プロゲステロン受容体は本来
の状態であっても、変性した状態であってもよい。変性
は、熱、pH、あるいは有機溶剤を用いた化学的変性によ
るものであってもよい。免疫原体として用いる場合、プ
ロゲステロン受容体はプロゲステロンあるいはプロゲス
テロ類似物との複合体でもよい。さらに、プロゲステロ
ン受容体はリン酸化されていても、リン酸化されていな
くともよい。
ｈＰＲに対する抗体は、ヒトの組織、癌および培養した
腫瘍または腫瘍でない細胞株由来の細胞間プロゲステロ
ン結合受容体蛋白質に特異的に結合する。このようにｈ
ＰＲに特異的な抗体は、ｈＰＲで免疫化された動物の血
清中に発見されるか、あるいは、骨髄腫細胞と融合した
動物の脾臓リンパ球の融合、あるいは生体外で形質転換
したリンパ球の融合により生じる雑種細胞から得られ
る。単クローン性抗体は、ウイルス粒子、突然変異誘発
物質または他の形質転換剤により形質転換された哺乳動
物のリンパ球から得ることができる。ｈＰＲ抗体を産生
する雑種細胞の生産には全ての骨髄腫細胞を使用し得る
が、（丁寧に言えば、両者のＡＴＣＣ番号がそれぞれＣ
ＲＬ−１５８１とＣＲＬ−１５８０である）ＳＰ２／０
−Ａｇ１４あるいはＸ６３−Ａｇ８の骨髄腫細胞株が最
も好ましい。
多クローン性抗体も単クローン性抗体も共に次の特性を
持っている。；ヒトの組織、腫瘍及びその抽出物中の特
定のプロゲスチン受容体に存在するエピトープに特異的
に結合する能力、これは（ａ）第一の免疫グロブリンに
対して方向づけられた異種抗体等の、抗体及び抗体受容
体複合体を塩析し得る試薬を１つ以上添加して、流体中
のプロゲステロン受容体を免疫沈降させることにより確
認される；（ｂ）超遠心分離で分析したときに変化した
沈降速度を有し、かつゲル過あるいは排除クロマトグ
ラフィーで分析したときに変化した溶離特性を有する、
ｈＰＲとの複合体を形成する能力；（ｃ）不溶性の支持
体または表面に結合した場合、あるいは抗体受容体複合
体が、基質または表面につながった。黄色ブドウ球菌蛋
白質Ａのような抗体と結合している不溶性の支持体に吸
着されている場合に、細胞抽出物または他の流体からｈ
ＰＲを吸着する能力；（ｄ）透過性を持たせた組織、腫
瘍切片または個々の細胞中のｈＰＲに結合する能力。
上記抗体はいずれも、放射性同位元素または比色定量試
薬（色素原）、および電子不伝導物質（コロイド状金）
あるいは、形成される抗体受容体複合体の存在または量
を検出または測定する方法を提供する他の免疫学的に活
性または不活性な物質等の、検出可能なマーカーと結合
することができる。ｈＰＲ自体は、プロゲステロン（４
−プレグネン−３，２０−ジオン）、プロメゲステロン
１７，２１−ジメチル−１９−ノルプレグン−４，９−
ジエン−３，２０−ジオン、（Ｒ−５０２０）；１６ア
ルファーエチル−２１−ヒドロキシ−１９−ノルプレグ
ン−４−エン−３，２０−ジオン；ＯＲＧ２０５８；エ
ステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸
ヒドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ヌレチ
ノドレル、二酢酸エチノジオール、ジドロゲステロン、
ジメチルステロン、エチニルエストレノール、酢酸メゲ
ストロールあるいはノルゲストレルのような他のプロゲ
スチンまたはプロゲステロン類似物等の合成あるいは天
然プロゲスチンを含むマーカーで標識されることができ
る。
本発明によれば、精製ｈＰＲ−プロゲスチン複合体で免
疫した動物の血清の免疫グロブリン画分、あるいは類似
の雑種細胞の細胞株から得た免疫グロブリンを使用した
場合に、免疫グロブリン中の非特異的抗体または他の蛋
白質を除去する前処理をしてもしていなくても、新規な
免疫学的試薬が提供される。これらの免疫グロブリン
は、安定化した免疫学的に不活性な粒状物質のような、
免疫学的に不活性な粒状物質の感作に用いられる。その
ような感作粒子の例として、（例えば、米国特許第3714
345号；第3715427号；および／または第3924541号の方
法に従って調製される）安定化した赤血球、ベントナイ
ト、コロジウム、結晶コレステロール、水晶、合成樹
脂、色々な種類の合成ラテックス（例えば、米国特許第
3551555号参照）、ポリスチレンのビーズ、あるいはリ
ン脂質、および放射性物質または遊離基を含んでいるリ
ポソームを含むステロールから調製したリポソームが挙
げられる。このような感作粒子は、組織試料中のｈＰＲ
が粒子の凝集体に結合および影響する直接凝集検定に用
いるに有用であり、標準的な免疫検定技術により複合体
を定量化することができる。代替的に、放射性物質ある
いは遊離基含有粒子の感作に抗体材料を用いたときに
は、そのような粒子を試料に添加して粒子を凝集体とし
て除去して、均質化した組織試料のｈＰＲ含有量を測定
することもできる。さらに、放射化学的に標識した免疫
グロブリン、あるいは酵素と結合した免疫グロブリン、
さもなければ検出可能な抗ｈＰＲ免疫グロブリンを用い
た技法は、ｈＰＲを検出するｈＰＲ検定の基礎を提供す
ることになる。試料中のプロゲステロンのｈＰＲとの可
逆的結合に依存しない方法の有する大きな利点が期待さ
れている。特に、このような方法で、すでに非放射性の
内性プロゲスチンと結合しているｈＰＲと同等に、結合
していないｈＰＲの量を検定することもできるに違いな
い。
さらにもう一つの適用として、抗ｈＰＲは、癌組織の病
理学的切片標本におけるｈＰＲの検出および定量化のた
めの特別な免疫組織化学的方法の基礎を提供する。その
ような切片を抗体溶液とともにインキュベートし、緩衝
液で洗浄した後、蛍光標識した（免疫グロブリンに対す
る抗体である）第２の抗体か、またはペルオキシダーゼ
ー抗ペルオキシダーゼと複合した第２の抗体のいずれか
と一緒にインキューベートする。次に、洗浄した後、こ
の切片を蛍光顕微鏡、またはペルオキダーゼ染色後に光
学顕微鏡で観察して、ｈＰＲの存在を調査する。この技
法は、癌の診断を行う外科的病理学研究室において、そ
の同じ室内で組織切片中のｈＰＲを検出することを可能
にする。
さらに、腫瘍成分またはその部分的分解成分はしばしば
血液中に遊離しているので、ｈＰＲを含有する癌（また
はその疑いのある）患者の血清における免疫反応性の断
片またはｈＰＲの検定法は、転移性疾患の早期診断の手
段を提供する。
定義 生物学的試料： あらゆる器官、組織、腫瘍、細胞あるいは、あらゆる器
官、組織、腫瘍、または細胞の抽出物、あるいは、あら
ゆる体液またはあらゆる体液の一部。
癌： あらゆる悪性、増殖性、腫瘍性、前癌性の、あるいは組
織学的に異常な、細胞または組織。
クロマトグラフィー： アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、あるいはイ
オン交換クロマトグラフィー。
検出可能なマーカー：3 H、125I、131Iのようなあらゆる放射性同位元素；フル
オレセイン、フィコビリ蛋白質、希土類のキレート、ダ
ンシル、ローダミンのような蛍光発光体；酵素の基質お
よび阻害剤、ワサビ大根のペルオキシダーゼ、グルコー
ス酸化酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセ
チルコリネステラーゼ等のような酵素；デキストランの
ような粒子、セファロースのビーズ、ポリスチレンのビ
ーズ、アガロース、金属粒子、磁性粒子等。
単クローン性： 単一クローン細胞由来の免疫グロブリン産生細胞を用
い、単一タイプの抗体を産生する系であり、しばしば雑
種細胞の細胞株等の細胞融合の結果である。
多クローン性： 一般に免疫原体に対して複数の親和性を持つ、多くのタ
イプの細胞由来の免疫グロブリン産生系であり、一般に
免疫化された動物の生体内で産生される免疫グロブリン
に起因する。
プロゲスチン受容体： 常態ではプロゲステロンと結合する受容体であるが、あ
らゆるプロゲスチンと結合することができる。受容体は
Ａ−ポリペプチド、Ｂ−ポリペプチド、あるいはＡ−ポ
リペプチドとＢ−ポリペプチドの混合物から成ってい
る。
脱離物： 細胞あるいは組織から脱離した、蛋白質を含むあらゆる
媒体。
形質転換試薬： あらゆる化学的突然変異誘発物質、突然変異を引き起こ
すあらゆる放射線、あらゆるウィルス、あるいは結果と
して不死の細胞株を作るあらゆる細胞培養方法。
次の実施例は例示の目的で提供するもので、これに限定
されるものではない。
実施例Ｉ−抗体の精製： Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ，１３
３）から細胞質ｈＰＲおよび核ｈＰＲの形態で得たｈＰ
Ｒを、セファロース(Sepharose)２Ｂにデオキシコルチ
コステロンを結合された市販の調製品であるステロゲル
(Sterogel)（３７）に選択的に吸着させること、および
セファロース４Ｂに結合させた単クローン性抗体（ＪＵ
６０１）に吸着させることによって、部分的に精製し
た。ｈＰＲ複合体は２つの異なるサブユニットから成る
が、これらのサブユニットは合成プロゲスチン3H−Ｒ５
０２０により特異的に光学的光親和性標識されて、分子
量９５，０００（Ａサブユニット）および分子量１２
０，０００（Ｂサブユニット）の位置で、還元ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルの自動アジオグラムによ
り視覚化され得る（３８）。これら２つの蛋白質は異な
る遺伝子の産物であるのかもしれず、あるいはＡがＢか
ら誘導されるのかもしれない。細胞質は、１０ｍＭモリ
ブデン酸ナトリウムと１０ｍＭチオグリセロールを含有
する、pH７の、４倍量の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（緩衝液Ａ）中での細胞のホモジェネーション、およ
び、０．４Ｍ塩酸カリウムを含有する緩衝液Ａを用いた
核顆粒抽出による核抽出によって調製される。ヒトプロ
ゲステロン受容体含有量は3H−ＯＲＧ２０５８（ＯＲＧ
＊）または3H−Ｒ５０２０で標識した受容体をコントロ
ールド・ポア・グラス・ビーズに特異的に吸着させる、
エストロゲン受容体検定法に類似の方法により日常的に
分析している。この方法の信頼性は、標準ショ糖密度勾
配とｈＰＲのためのデキストラン被膜木炭分析の比較に
より確認される。（表１に示した）典型的な精製におい
て、 ９７００pmolのｈＰＲを含む１７６mlの細胞質が、１０
mlのカラムを通夜４℃で通過し；この条件下で、入手可
能な受容体の９０％が吸着剤に結合した。負荷緩衝液で
洗浄した後、結合した受容体は、１０％グリセロール
（緩衝液Ｂ）、１０％ジメチルホルムアミドおよび１×
１０-5Ｍ ＯＲＧ＊（４．５Ｃｉ／mmol）を含む緩衝液
Ａで回分方式で溶離した。場合によっては、未標識プロ
ゲステロンがｈＰＲの溶離に用いられた。溶離したステ
ロイド−受容体複合体は、次にジエチルアミノエチルバ
イオゲル(DEAE-Biogel)クロマトグラフィーに供し、
０．２Ｍ食塩を含む緩衝液Ｂで段階的に溶離した。緩衝
液Ｂの中で４℃で５時間、ＯＲＧ＊または3H−Ｒ５０２
０と共にステロイド−受容体複合体をインキューベート
することによって、結合しているプロゲステロンは容易
に交換された。０．４Ｍ塩化カリウムを含む負荷緩衝液
以外は同じ方法で、未結合核ｈＰＲを精製した。２段階
精製後の受容体（およびサブユニット）の収率は３０〜
７０％の範囲内であり、この純度は、平均分子量１０
０，０００ダルトンとしたときに期待される比放射能の
２〜１５％であった。粗ｈＰＲと同様に、3H−Ｒ５０２
０で光学的親和性標識した精製ｈＰＲは１２０キロダル
トン（Ｂ）および９５キロダルトン（Ａ）の２本のバン
ドとして移動した。
実施例II−多クローン性ｈＰＲ抗体の調製と特性指摘 ＤＥＡＥバイオゲルから溶離したＴ４７Ｄステロイド−
受容体複合体（純度２〜１５％）あるいはＪＵ６０１免
疫吸着剤から溶離したＴ４７Ｄステロイド−受容体複合
体（純度２０〜６０％）を、フロイント完全アジュバン
ドまたは不完全アジュバンドのいずれかで乳化し、これ
を皮下注射して動物を免疫した。完全アジュバンド中に
３００〜５００pmolのステロイド−受容体複合体を含有
する最初の注射、および不完全アジュバンド中に１５０
〜５００pmolの受容体を含有する追加免疫注射を２〜４
回行った後に、オスのルイスラット３匹（Ｋ，Ｗ）およ
びBalb/cマウス１匹がこれに応答して、血清を８００倍
以上に希釈しても検出可能な、ｈＰＲに対する抗体を産
生した。動物は、１匹（ラットｋ）が、アジュバンドに
乳化する前に１％ＳＤＳで熱変性させた受容体の注射を
受けた点で異なっていた。ラット血清の硫酸アンモニウ
ム分別により部分的に精製された多クローン性抗体とｈ
ＰＲとの免疫複合体の形成は、 （１）ショ糖勾配におけるＯＲＧ＊−、3H−Ｒ５０２０
−あるいは3H−プロゲステロン−受容体複合体の沈降速
度の増加、 （２）ラットの抗血清と標識ｈＰＲの混合物にヤギの抗
ラットＩｇＧ抗体を添加したときの、同一複合体の特異
的沈降、 （３）高圧液体クロマトグラフィーの後、ＴＳＫ４００
０排除カラムの溶出液の空隙容積における抗体−受容体
複合体の出現、 により実証される。ショ糖勾配で観察された免疫複合体
のピークの広さは、それぞれ受容体分子の異なる領域を
認識する複数の抗体イデオタイプの存在を示すものであ
る。抗体と受容体とのほぼ完全な反応は、これらの抗体
が（ＡおよびＢ）両方のプロゲスチン結合種を認識した
ことを示している。
実施例III 単クローン性抗体の調整 ２匹のルイスラット由来の１０系統の単クローン性抗体
と１匹のBalb/C由来の４系統の単クローン性抗体とを含
む１４系統の単クローン性抗体は、ヒト（Ｔ４７Ｄ）プ
ロゲステロン受容体の、ＡまたはＢステロイド結合プロ
ゲステロン成分に対して調整したものである。これらの
抗体の既知特性を表２に要約してある。脾臓のリンパ球
をＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞株の非分泌変異株である、
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合した
（４１）。抗体産生雑種細胞は、雑種細胞用培地、正常
ラットの血清担体およびヤギの抗ラット免疫グロブリン
抗体の存在下における標識ｈＰＲの特異的沈降により検
出した。検定は、９６ウエルのマイクロ滴定板にて行っ
た。全ての雑種細胞を、円筒状のビン内で限界希釈して
展開させるか、あるいは無胸腺マウスの腹水腫瘍とする
かして、クローン化した。ヤギの抗ラットＩｇＧ抗体を
セファロース４Ｂに接続したカラムに、得られた抗体を
特異的に免疫吸着させ、次にＩｇＭタイプの抗体のため
に、バイオゲルＡ−１．５ｍを通過させてゲル過を行
い、抗体を精製した。還元ＳＤＳゲル上で、精製抗体は
２本のバンドに移動した：ＩｇＭタイプの抗体では７０
キロダルトン（ｍｕ鎖）と２３キロダルトン（カッパ
鎖）、およびＩｇＧタイプの抗体では５０キロダルトン
（ガンマ鎖）と２３キロダルトン（カッパ）。
抗ｈＰＲ単クローン性抗体の特性指摘 表２に掲げた１４の抗体の内、１３の抗体がＡおよびＢ
成分に共通なエピトープを認識したが、このことは、Ｓ
ＤＳゲル電気泳動法後のＴ４７ＤおよびＭＣＦ−７の細
胞質と核抽出物の免疫ブロット分析、ならびに、それら
と3H−ＯＲＧ ２０５８−ｈＰＲとの相互作用のショ糖
勾配分析により判定した。一つの抗体、ＫＣ１４６は、
Ｂ成分に特異的であった。ｈＰＲ抗体は、ｈＥＲ単クロ
ーン性抗体と同様に、ステロイド結合受容体に対して未
結合受容体と同程度の高い親和性を有し、それらの核お
よび細胞質における形態の双方を認識した。３つの抗体
がウサギのプロゲステロン受容体のＡおよびＢ成分と交
叉反応し、これらの抗体のうちの１つ（ＪＺＢ３９）
は、ラットおよび子牛の子宮プロゲステロン受容体も同
様に認識した。また、ヒトのＢ成分に特異的なマウスの
単クローン性抗体（ＫＣ１４６）も、ラットおよび子牛
の子宮ならびにニワトリの卵管から得られた細胞質中の
ＰＲのＢ成分を認識した。含塩勾配において、これらの
抗体はどれも、ＭＣＦ−７3H−エストラジオール−受容
体複合体と反応しなかった。１４の抗体の内、１２の抗
体は、ＳＤＳゲル電気泳動後のＴ４７ＤおよびＭＣＦ−
７抽出物の免疫ブロットを行った際にｈＰＲのＡおよび
／またはＢ成分に特異性を示したが、２つの抗体（ＪＵ
１４５とＪＵ６０１）は、これらのブロットにおいて少
なくとも１種類の別の蛋白質を認識した。細胞質または
核抽出物に存在するＴ４７Ｄ プロゲステロン受容体を
3H−Ｒ５０２０で光学的親和性標識してＣＮＢｒ活性化
セファロース４Ｂに接続したＪＵ６０１ ＩｇＭからな
る吸着剤に免疫吸着させたときに、ＳＤＳに溶離した蛋
白質は、還元ＳＤＳゲル上で、１２０キロダルトンおよ
び９５キロダルトンの２本の放射性バンドとして移動
し；９５キロダルトンのバンドが優勢であった。銀染色
したゲルにおいても同じバンドが出現したが、より低分
子量の（非放射性の）薄いバンドを３〜４本伴ってい
た。
実施例IV−ｈＰＲ免疫検定法の開発と適用 細胞抽出物及び流体内のｈＰＲを定量的に測定するため
に、ｈＥＲ酵素免疫検定法（ｈＥＲ−ＥＩＡ）用に開発
されたものに類似の酵素免疫検定法を、ホルモン応答性
癌抽出物の分析のために開発した。表２に掲げた抗体の
幾つかの組み合わせをポリスチレンビーズで試験したと
ころ、少なくとも１組（ＫＤ６８／ＪＢＺ３９）はｈＰ
Ｒの正確な測定に必要な感度および特異性を有してい
た。２８列のヒト乳癌から得た細胞質（０．２ml）のｈ
ＰＲ含有量を評価するために、ポリスチレンビーズにＫ
Ｄ６８をコーティングし、ＪＢＺ３９をわさび大根のペ
ルオキシダーゼに結合させる、基本的な検定法を用い
た。ｈＰＲに結合しているステロイドのスキャチヤード
(scatchard)分析にたよる、ＮＥＮプロゲステロン受容
体検定キットによって、同一の細胞質を分析した。２つ
の方法で得られた結果を比較したところ、０．９６の相
関係数が得られた。ｈＰＲ−ＥＩＡの感度は２〜３fmol
hpR/mlであった。このように、ｈＰＲ−ＥＩＡ分析
は、乳癌抽出物のｈＰＲに関する従来からのステロイド
結合の結果と十分に相関関係があった。その上、ｈＰＲ
−ＥＩＡの感度はｈＥＲ−ＥＩＡ及び従来のｈＰＲ検定
法に匹敵するものであった。
ホルモン応答性の組織および癌に局在するｈＰＲのため
に、ヒトエストロゲン受容体の免疫細胞化学的な検定法
（ｈＥＲ−ＩＣＡ）に類似した、間接免疫ペルオキシダ
ーゼ法を確立することの実現可能性を判断するために、
ＪＺＢ３９抗体を用いて、固定したＭＣＦ−７、Ｔ４７
ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞内の免疫反応性ｈ
ＰＲと、同様に種々のヒト組織および腫瘍の凍結切片内
の免疫応答性ｈＰＲの存在位置を突き止める試験を実施
した。組織切片（８／ｍ）あるいは細胞をピクリン酸パ
ラホルムアルデヒド中で固定し、１０％の正常なヤギ血
清で固定化を止め、そして１０％のヤギ血清を含有する
リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）中で、ＪＺＢ３９ Ｉｇ
Ｇと共に室温で３０分間インキュベートした。その他の
工程はすべて、ＥＲで確立されている方法（８，９）と
同一であった。各検体を、単クローン性のＨ２２２ Ｉ
ｇＧを用いた免疫反応性ｈＰＲ分析に供した。エストロ
ゲン受容体で観察されたように、ｈＰＲの特異的な染色
は、ホルモン状態に拘わらず、染色されたすべての細胞
の核に局限され、そして染色された腫瘍細胞の数は検体
ごとに大きく異なっていた。結腸上皮、ｈＰＲのすくな
い乳癌及び非エストロゲン治療を行ったＭＣＦ−７細胞
のような非標的組織は染色されず；その上、一部精製し
たｈＰＲを第１の抗体に添加することによって特異的染
色をなくすことができる。今まで調査してきたあらゆる
組織または腫瘍細胞において、ｈＰＲまたはｈＥＲによ
る細胞質染色はほとんどまたはまったく観察されなかっ
た。今までのところ、ＪＺＢ３９ ＩｇＧがｈＰＲの位
置決定に最も有用であったが、ＫＤ６７およびＫＤ６８
抗体はそれと同等またはそれ以上に作用することができ
るであろう。入手可能な１４の抗体全てに関する特異性
と染色特性の要約を表３に示す。ＪＵ１４５とＪＵ６０
１のＩｇＭだけがｈＰＲに対して必要な特異性を欠いて
いる。マウス抗体とＪＺＢ６３は必要な感度に欠けてい
るが、ｈＰＲに対して特異的である。ｈＰＲ−ＩＣＡに
よる５０例の乳癌の予備的評価においては、細胞質ｈＰ
Ｒ含有量と、腫瘍細胞内ｈＰＲの特異的染色の存在また
は不在との間に、統計学的に重大な関係が認められた。
両者が一致しない場合には常に、生化学的数値が低いと
きに免疫反応性受容体が検出された。ｈＰＲに関する免
疫細胞化学的検定の正確な感度は確認されていないが、
これらの結果は特異的単クローン性抗体を用いたｈＰＲ
の位置決定が実現可能であることを示している。
また、ＪＺＢ３９抗体は乳房腫瘍内のｈＰＲのプローブ
として、特に生化学的に測定した細胞質中のｈＰＲとの
比較、およびｈＥＲ−ＩＣＡ法によるｈＥＲの測定およ
び位置決定との比較に用いられる。
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デューク，オー・レンジ，ケイ・カールシュトロムおよ
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ド−フォイ(C,Radanyi,G.Redeuilh,E.Eigenmann,M.C.Le
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ー・ミルグロム(F.Logeat・T.V.Mai and E.Milgrom,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.78,1426(1981))。 １９．ピー・ディー・フェイル(P.D.feil,Endocrinolog
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ー・アール・ヤング，イー・イー・バウロー(J.M.Renoi
r,C.Radanyi,C.R.Yang,E.E.Baulieu,Eur J.Biochem.12
7,81(1982))。 ２１．エス・リアロ，ディー・ウイッテ(S.Liao,D.Witt
e,P.N.A.S.82,p.8345-8348(1985))。 ２２．ジー・エル・グリーン，シー・ノラン，ジェイ・
ピー・エングラーおよびイー・ヴィー・ジェンセン(G.
L.Greene,C.Nolan,J.P.Engler and E.V.Jensen,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 77,5115-5119(1980))。 ２３．ビー・モンチャーモント，ジェイ・エル・スーお
よびアイ・パリク(B.Momcharmont,J.L.Su and I.Parik
h,Biochemistry 21,6916(1982))。 ２４．ジー・エル・グリーン，エフ・ダフリュー・フィ
ッチおよびイー・ヴィー・ジェンセン(G.L.Greene,F.W.
Fitch and E.V.Jensen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,157
-161 (1980))。 ２５．ピー・グランディックス，ディー・エル・ガッサ
ー，およびジー・リトウアック(P.Grandics,D.L.Gasser
and G.Litwack,Endocrinology 111,1731(1982))。 ２６．エイチ・エム・ウエストファル，シー・モルデン
ハウアーおよびエム・ビート(H.M.Westphal,C.Moldenha
uer and M.Beato,EMBOJ,1,1467(1982))。 ２７．エス・オクレット，エイ・シー・ウイクストロー
ム，オー・レンジ，ビー・アンダースンおよびジェイ・
エイ・グスタフスン(S.Okret,A.C.Wikstrom,O.Wrange,
B.Anderson and J.A.Gustafsson,Proc.Natl.Acad.Sci.8
1,1609(1984))。 ２８．エフ・ロギート，エム・ティー．ヴァルタイ，エ
イ・フォーニアー，ピー・レグレイン，ジー・ブティン
およびイー・ミルグロム(F.Logeat,M.T.Vultai,A.Fourn
ier,P.Legrain,G.Buttin and E.Milgrom,Proc.Natl.Aca
d.Sci.80,6456(1983))。 ２９．イー・エイ・ピアース他(E.A.Pierce etal.,P.N.
A.S.82,p.8429-8433(1985))。 ３０．ディー・ピー・エドワード，エヌ・エル・ウイー
ゲル，ダブリュー・ティー・シュレーダー，ビー・ダブ
リュー・オマリーおよびダフリュー・エル・マクガイア
ー(D.P.Edwards,N.L.Weigel,W.T.Schrader,B.W.O′Mall
ey and W.L.McGuire,Biochemistry 1984 23,4427-4435
(1984))。 ３１．エイ・ピー・マクヘイル，ダブリュー・ティー・
シュレーダーおよびビー・ダブリュー・オクリー(A.P.M
cHale,W.T.Schrader and B.W.O′Malley,Proc.of 7th I
nter.Cong,of Endo.Quebec p.1059(1985))。 ３２．シー・ラダニー他(C.Radanyi et al.,P.N.A.S.8
0,p.1854-2858(1983)); ディー・エイ・スリヴァン他(D.A.Sullivanet al.,Bioc
hemistry 24,4215-4222(1985))。 ３３．エイ・アイ・コファー他(A.I.Coffer et al.,Can
cer Reseach 45,3686-3693(1985))。 ３４．ダフリュー・ジェイ・キング，イー・アール・デ
ゾムバー，イー・ヴィー・ジェンセンおよびジー・エル
・グリーン(W.J.King,E.R.DeSombre,E.V.Jensen and G.
L.Greene,Cancer Res.45,293-304(1985))。 ３５．イー・アール・デゾムバー，エス・エム・トー
プ，シー・ローズおよびダブリュー・ジェイ・キング
(E.R.DeSombre,S.M.Thorp,C.Rose and W.J.King,Abstra
ct,AACR Meeting,Houston,Texas,1985)。 ３６．単クローン性抗体によるエステロゲン受容体の決
定についてのシンポジウム(Symposium on Estrogen Rec
eptor Determination with Monoclonal Antibodies,Unp
ublished resultspresented in Monte Carlo,December
14,1984)。 ３７．ピー・グランディクス，アール・ケイ・ピューリ
およびディー・オー・トフト(P.Grandics,R.K.Puri and
D.O.Toft,Endocrinology 110,1055(1982)。 ３８．ケイ・ビー・ホーヴィッツおよびピー・エス・ア
レキサンダー(K.B.Horwits and P.S.Alexander,Endocri
nology 113,2195-2201(1983))。 ３９．ヴィー・ディー・ホスペルホーン，ティー・シ
ダ，イー・アール・デゾムバーおよびイー・ヴィー・ジ
ェンセン(V.D.Hospelhorn,T.Shida,E.R.DeSombre and
E.V.Jensen,Abstracts 60th Meeting The Endocrine So
ciety,Miami,1978,p.335)。 ４０．ジェイ・エイ・ホルト，エム・エイ・ロリネズお
よびヴィー・ディー・ホスペルホーン(J.A.Holt,M.A.Lo
rinez and V.D.Hospelhorn,Abstracts 63rd Meeting Th
e Endorine Society,Cinncinnati,Ohio,p.125) ４１．ジェイ・エフ・カーニー，エイ・ラドブルック，
ビー・リースガングおよびケイ・ラジュースキー(J.F.K
earny,A.Radbruch,B.Liesegang and K.Rajewsky,J.Immu
nol.123,1548-1550 (81979))。 ４２．アール・エイ・ルーベン，ビー・ブラゾー，ピー
・ボーレルンおよびアール・アール・ギミレン(R.A.Lub
en,P.Brazeau,P.Bohleln and R.R.Guillemin,Science V
ol,218,p・887-889(1982))。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ 8310−2Ｊ 33/566 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 5/24 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトプロゲスチン受容体を含む免疫原体に
    応答する動物の機構で産生された免疫グロブリンを含
    む、ヒトプロゲステロン受容体に特異的な免疫グロブリ
    ン。
  2. 【請求項２】次の特性を持つ、請求の範囲第１項に記載
    の免疫グロブリン： (a)前述の免疫グロブリンを添加すると、流体中の、前
    述のプロゲスチン受容体の免疫沈降を引き起こす能力； (b)より高い沈降速度と、前述のプロゲスチン受容体複
    合体にのみ匹敵する、ゲル過クロマトグラフィ−変法
    のプロフィールを持つ、免疫グロブリンプロゲスチン受
    容体複合体を形成する能力； (c)前述の免疫グロブリンが不溶性支持器に結合してい
    るとき、細胞抽出物または他の流体から前述のプロゲス
    チン受容体を吸着する能力； (d)透過可能な組織、腫瘍切片あるいは個体の細胞にお
    いて、前述の受容体に結合する能力。
  3. 【請求項３】前述の免疫グロブリンが、次に挙げる免疫
    グロブリンのタイプから選択された、請求の範囲第１項
    記載の免疫グロブリン：IgA，IgG，IgM，IgDまたはIg
    E。
  4. 【請求項４】前述の、動物の機構が多クローン性であ
    る、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン。
  5. 【請求項５】前述の、動物の機構が単クローン性であ
    る、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン。
  6. 【請求項６】前述の、免疫原体が２０％より純粋なヒト
    プロゲスチン受容体である、請求の範囲第１項記載の免
    疫グロブリン。
  7. 【請求項７】前述の、免疫原体が２０％より純粋なヒト
    プロゲスチン受容体である、請求の範囲第６項記載の免
    疫グロブリン。
  8. 【請求項８】前述の、免疫原体が６０％より純粋なヒト
    プロゲスチン受容体である請求の範囲第７項記載の免疫
    グロブリン。
  9. 【請求項９】ヒトプロゲスチン受容体に対する、請求の
    範囲第１項記載の免疫グロブリンを含む、検出可能なマ
    ーカーと結合した、免疫学的試薬。
  10. 【請求項１０】前述の検出可能なマーカーが、放射性同
    位元素である、請求の範囲第９項記載の試薬。
  11. 【請求項１１】前述の検出可能なマーカーが、酵素であ
    る、請求の範囲第９項記載の試薬。
  12. 【請求項１２】前述の検出可能なマーカーが蛍光発光体
    である、請求の範囲第９項記載の試薬。
  13. 【請求項１３】前述の検出可能なマーカーが、電子不伝
    導性物質である、請求の範囲第９項記載の試薬。
  14. 【請求項１４】前述の放射性同位元素が、放射標識をし
    たプロゲスチンあるいはプロゲスチン抗抗剤である、請
    求の範囲第１０項に記載の試薬。
  15. 【請求項１５】前述の抗プロゲスチン受容体の、請求の
    範囲第１項記載の免疫グロブリンを含む、担体と結合し
    ている免疫学的試薬。
  16. 【請求項１６】前述の担体が検出可能な粒子である、請
    求の範囲第１５項記載の免疫学的試薬。
  17. 【請求項１７】前述の担体が、クロマトグラフィーに適
    している、水透過性の物質である、請求の範囲第１５項
    記載の免疫学的試薬。
  18. 【請求項１８】前述の担体がヒトプロゲスチン受容体を
    含む溶液との接触に適している考案物である、請求の範
    囲第１５項記載の免疫学的試薬。
  19. 【請求項１９】前述の担体が、条件つきで可溶性の、可
    溶性ポリマーである、請求の範囲第１５項記載の免疫学
    的試薬。
  20. 【請求項２０】生化学的試料におけるヒトプロゲスチン
    受容体の免疫学的検定法で、前述の試料と請求の範囲第
    ９項記載の試薬との接触及び、前述の結合している免疫
    グロブリンマーカーの検出を含むものである。
  21. 【請求項２１】前述の生物学的試料がヒト癌組織であ
    る、請求の範囲第２０項記載に従う免疫学的検定法。
  22. 【請求項２２】次の段階を含む、ヒトプロゲスチン受容
    体を単離する方法 (a)細胞溶解産物または遊離物を含む媒体の調製； (b)免疫グロブリン−プロゲスチン受容体複合物を形成
    するために、前述の媒体と請求の範囲第１項記載の免疫
    グロブリンとの接触； (c)前述の媒体からの、前述の複合体の分離；
  23. 【請求項２３】特異的なプロゲスチン受容体の抗体を含
    む免疫グロブリンの獲得方法で、前述の方法は次の段階
    をから成る； (a)放射標識したプロゲスチンの存在下で、媒体を含む
    プロゲスチン受容体をインキュベートし、沈澱、ゲル
    過、電気泳動あるいはクロマトグラフィーによって、前
    述のインキュベートから、放射活性なプロゲスチンとプ
    ロゲスチン受容体の複合体を単離することによる、精製
    した前述の複合体の調製； (b)前述の複合体の、免疫学的に適格な動物への接種；
    および (c)前述の動物からの、血清免疫グロブリンの単離。
  24. 【請求項２４】前述の免疫グロブリンが、ハイブリドー
    マの細胞形成によって産生された、請求の範囲第２３項
    記載の方法で、前述の方法は、さらに次の段階が含まれ
    る； (d)前述の接種動物の免疫機構から除去された、感作リ
    ンパ球の単離； (e)前述のリンパ球と骨髄腫細胞との融合； (f)ヒトプロゲスチン受容体に特異的な免疫グロブリン
    を産生できる交雑細胞の選択；および (g)前述のハイブリドーマ細胞および、ハイブリドーマ
    細胞増殖培地からの、前述の免疫グロブリンの単離。
  25. 【請求項２５】段階(b)及び(c)の代わりに、さらに次の
    段階を含む、請求の範囲第２３項記載の方法： (e)感作リンパ球を産生するための、前述の単離した複
    合体とリンパ球との接触；および (1)ハイブリドーマ細胞を産生するための、前述の感作
    リンパ球と骨髄腫細胞との融合；または (2)融合せずに免疫グロブリンを産生するための、感作
    リンパ球の形質転換； (f)前述のハイブリドーマ細胞、前述の形質転換細胞、
    前述のハイブリドーマ細胞および前述の形質転換細胞の
    増殖培地からの、免疫グロブリンの単離。
  26. 【請求項２６】プロゲステロン受容体を含む前述の複合
    体が、前述の免疫学的に適格な動物に接種する以前に変
    性している、請求の範囲第２３項記載の方法。
  27. 【請求項２７】前述の、請求の範囲第１項記載の免疫グ
    ロブリンが、クロマトグラフィーに適する水透過性物質
    に結合している、請求の範囲第２２項記載の方法。
  28. 【請求項２８】組織あるいは細胞、あるいは体液中のプ
    ロゲステロン受容体の存在を確認する方法で、次の段階
    から成る： (a)請求の範囲第９項記載の抗体と、前述の組織、細胞
    あるいは体液との接触；及び (b)前述のマーカーの検出。
  29. 【請求項２９】前述の組織あるいは細胞が癌にかかって
    いる、請求の範囲第２８項記載の方法。
  30. 【請求項３０】免疫グロブリン及び担体溶液に結合し
    た、前述の免疫グロブリンに適当な、検出可能なマーカ
    ーを持つ、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリンを含
    む、ヒトプロゲステロン受容体の検出のための診断用キ
    ット。
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