JPH06135997A - イノシトール三リン酸受容体の精製法及び活性測定法 - Google Patents
イノシトール三リン酸受容体の精製法及び活性測定法Info
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- JPH06135997A JPH06135997A JP31395592A JP31395592A JPH06135997A JP H06135997 A JPH06135997 A JP H06135997A JP 31395592 A JP31395592 A JP 31395592A JP 31395592 A JP31395592 A JP 31395592A JP H06135997 A JPH06135997 A JP H06135997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞内小胞体上に存在し、カルシウムイオン
放出チャネルとして作用するイノシトール三リン酸受容
体の精製法及びそれを用いたイノシトール三リン酸受容
体活性の測定法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の精製法は、イノシトール三リン酸受
容体を含有する試料を、当該受容体を認識する抗体が結
合した担体を用いるアフィニティクロマトグラフィーに
付して精製することからなり、簡便に当該受容体を分離
・精製することができる。また、本発明の測定法は、上
記の方法により精製されたイノシトール三リン酸受容体
を含む脂質二重膜を用い、カルシウムイオンの膜通過量
に基づいてイノシトール三リン酸受容体活性を測定する
ことからなり、高精度で当該受容体活性を測定すること
ができる。
放出チャネルとして作用するイノシトール三リン酸受容
体の精製法及びそれを用いたイノシトール三リン酸受容
体活性の測定法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の精製法は、イノシトール三リン酸受
容体を含有する試料を、当該受容体を認識する抗体が結
合した担体を用いるアフィニティクロマトグラフィーに
付して精製することからなり、簡便に当該受容体を分離
・精製することができる。また、本発明の測定法は、上
記の方法により精製されたイノシトール三リン酸受容体
を含む脂質二重膜を用い、カルシウムイオンの膜通過量
に基づいてイノシトール三リン酸受容体活性を測定する
ことからなり、高精度で当該受容体活性を測定すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はイノシトール三リン酸受
容体の精製法及び活性測定法に関する。より詳細には、
カルシウムイオン放出チャネルとして作用するイノシト
ール三リン酸受容体の精製法及び当該受容体の活性の測
定法に関する。
容体の精製法及び活性測定法に関する。より詳細には、
カルシウムイオン放出チャネルとして作用するイノシト
ール三リン酸受容体の精製法及び当該受容体の活性の測
定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】イノシトール三リン酸受容体は細胞内小
胞体上に存在し、その内腔に蓄えられているカルシウム
をイノシトール三リン酸依存的に細胞質中に放出するカ
ルシウムイオンチャネルである。この活性は、細胞内の
種々の因子により調節されており、例えばSupattapone
らは、ラット小脳の膜画分を用い、そこに含まれるイノ
シトール三リン酸受容体を、リン酸化酵素フォスフォキ
ナーゼＡによりリン酸化すると受容体のチャネル活性が
抑制されることを報告している(Proc. Natn. Acad. Sc
i. USA. Vol.85. 8747-8750, 1988)。イノシトール三リ
ン酸受容体の分離・精製については、上記文献の他、本
発明者等により精力的に研究が行われ、本発明者等によ
りその詳細が明らかにされている（代謝 Vol.28. 臨時
増刊号 p141-148, 1991)。即ち、受容体が豊富に存在す
ると思われるマウス小脳のミクロソーム画分を用い、そ
の可溶化を行い、ゲル濾過などの方法によるイノシトー
ル三リン酸受容体の精製法を報告している。一方、イノ
シトール三リン酸受容体の生理活性の測定は、イノシト
ール三リン酸受容体のイノシトール三リン酸結合部位に
対する拮抗剤や活性化剤（すなわち、Ｃａ2+の放出の亢
進剤や抑制剤）を開発する際に必要となる測定であり、
かかる活性測定法としては、従来、主として生体膜であ
るミクロソームを用いて、そのミクロソーム中のカルシ
ウムイオンの放出を指標として測定する方法が多く提案
されている。また、前記のSupattaponeらが報告してい
るように、脂質平面膜法にイノシトール三リン酸受容体
を再構築してその受容体活性を測定する方法も知られて
いる。
胞体上に存在し、その内腔に蓄えられているカルシウム
をイノシトール三リン酸依存的に細胞質中に放出するカ
ルシウムイオンチャネルである。この活性は、細胞内の
種々の因子により調節されており、例えばSupattapone
らは、ラット小脳の膜画分を用い、そこに含まれるイノ
シトール三リン酸受容体を、リン酸化酵素フォスフォキ
ナーゼＡによりリン酸化すると受容体のチャネル活性が
抑制されることを報告している(Proc. Natn. Acad. Sc
i. USA. Vol.85. 8747-8750, 1988)。イノシトール三リ
ン酸受容体の分離・精製については、上記文献の他、本
発明者等により精力的に研究が行われ、本発明者等によ
りその詳細が明らかにされている（代謝 Vol.28. 臨時
増刊号 p141-148, 1991)。即ち、受容体が豊富に存在す
ると思われるマウス小脳のミクロソーム画分を用い、そ
の可溶化を行い、ゲル濾過などの方法によるイノシトー
ル三リン酸受容体の精製法を報告している。一方、イノ
シトール三リン酸受容体の生理活性の測定は、イノシト
ール三リン酸受容体のイノシトール三リン酸結合部位に
対する拮抗剤や活性化剤（すなわち、Ｃａ2+の放出の亢
進剤や抑制剤）を開発する際に必要となる測定であり、
かかる活性測定法としては、従来、主として生体膜であ
るミクロソームを用いて、そのミクロソーム中のカルシ
ウムイオンの放出を指標として測定する方法が多く提案
されている。また、前記のSupattaponeらが報告してい
るように、脂質平面膜法にイノシトール三リン酸受容体
を再構築してその受容体活性を測定する方法も知られて
いる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来技術におけるイノシトール三リン酸受容体の精製法及
び活性測定にはいくつかの問題点があった。即ち、精製
法においては、受容体が豊富な生体内画分においては、
多様性がみられること及び数段階の精製過程が必要であ
ること、また、精製工程中に受容体蛋白質の変成が起こ
ってしまうことが知られている。一方、その受容体の活
性測定法においては、上記の如く部分精製した多様性が
ある受容体蛋白質を用いていることから、測定感度が劣
るとともに測定値の信頼性に欠けるという問題があり、
優れた感度及び精度を有するイノシトール三リン酸受容
体活性測定法が求められていた。本発明は上記の問題点
を解消するためになされたもので、本発明者らは、簡便
にして高精製度のイノシトール三リン酸受容体を得る方
法及び高精度でイノシトール三リン酸受容体活性を測定
できる方法を開発することを目的として鋭意研究を行っ
た。その結果、イノシトール三リン酸受容体を含む試料
から当該受容体を一段階で分離・精製し得ることを見出
し、またそれを用いてリポソームに再構築することによ
って、イノシトール三リン酸受容体活性を高精度で測定
し得ることを見出して本発明を完成した。すなわち、本
発明は、イノシトール三リン酸受容体の精製法及び当該
受容体の活性測定法を提供することを目的とする。
来技術におけるイノシトール三リン酸受容体の精製法及
び活性測定にはいくつかの問題点があった。即ち、精製
法においては、受容体が豊富な生体内画分においては、
多様性がみられること及び数段階の精製過程が必要であ
ること、また、精製工程中に受容体蛋白質の変成が起こ
ってしまうことが知られている。一方、その受容体の活
性測定法においては、上記の如く部分精製した多様性が
ある受容体蛋白質を用いていることから、測定感度が劣
るとともに測定値の信頼性に欠けるという問題があり、
優れた感度及び精度を有するイノシトール三リン酸受容
体活性測定法が求められていた。本発明は上記の問題点
を解消するためになされたもので、本発明者らは、簡便
にして高精製度のイノシトール三リン酸受容体を得る方
法及び高精度でイノシトール三リン酸受容体活性を測定
できる方法を開発することを目的として鋭意研究を行っ
た。その結果、イノシトール三リン酸受容体を含む試料
から当該受容体を一段階で分離・精製し得ることを見出
し、またそれを用いてリポソームに再構築することによ
って、イノシトール三リン酸受容体活性を高精度で測定
し得ることを見出して本発明を完成した。すなわち、本
発明は、イノシトール三リン酸受容体の精製法及び当該
受容体の活性測定法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の精製法は、イノシトール三リン酸
受容体を含有する試料を、当該受容体を認識する抗体が
結合した担体を用いるアフィニティクロマトグラフィー
に付して分離・精製することからなる。特に、抗体とし
ては、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認識
する抗体が好適に使用される。また、本発明のイノシト
ール三リン酸受容体活性の測定法は、上記の方法により
精製されたイノシトール三リン酸受容体を含む脂質二重
膜を用い、カルシウムイオンの膜通過量に基づいてイノ
シトール三リン酸受容体活性を測定することからなる。
特に、脂質二重膜としては、リポソームを用いるのが好
ましい。
めになされた本発明の精製法は、イノシトール三リン酸
受容体を含有する試料を、当該受容体を認識する抗体が
結合した担体を用いるアフィニティクロマトグラフィー
に付して分離・精製することからなる。特に、抗体とし
ては、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認識
する抗体が好適に使用される。また、本発明のイノシト
ール三リン酸受容体活性の測定法は、上記の方法により
精製されたイノシトール三リン酸受容体を含む脂質二重
膜を用い、カルシウムイオンの膜通過量に基づいてイノ
シトール三リン酸受容体活性を測定することからなる。
特に、脂質二重膜としては、リポソームを用いるのが好
ましい。
【０００５】本発明は上記の構成よりなり、本発明の精
製法においていは、イノシトール三リン酸受容体を認識
する抗体が結合した担体が用いられる。ここで用いられ
る抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
のいずれであってもよく、かかる抗体は常法に準じて調
製することができる。また、当該抗体は、イノシトール
三リン酸受容体のいずれの部位を認識するものであって
もよいが、好適には、イノシトール三リン酸受容体の末
端部位、特にＣ末端部位を認識する抗体が使用される。
すなわち、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位
は、構造的な要因から、当該末端部位を認識する抗体を
結合させたアフィニティ担体に容易に結合し、また溶出
液で容易に担体から脱離させることができるので、精製
工程が簡便になると共に高精製度のイノシトール三リン
酸受容体を得ることができる。本発明で用いられる抗体
の調製法の例として、イノシトール三リン酸受容体のＣ
末端部位を認識する抗体の調製法をもって説明すると、
まず、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位に相当
するぺプチドを合成する。このぺプチドは、本発明者ら
により既に明らかになっているイノシトール三リン酸受
容体のアミノ酸配列(Nature, Vol.342, 32, 1989)に基
づき、そのＣ末端部位に相当するぺプチドを慣用のぺプ
チド合成法を用いて合成することができる。かくして得
られたぺプチドは、抗原性を付与するための担体（例え
ば、血清アルブミン、血清グロブリン、サイトグロブリ
ン、ヘモグロビンなど）と結合させて免疫抗原を調製す
る。得られた免疫抗原を、Freundの完全アジュバントな
どのアジュバントとともに実験動物に投与して免疫化
し、免疫化されて実験動物から採血し、塩析、遠心分離
などの適当な手段を用いて血清を分離することにより、
イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認識するポ
リクローナル抗体を得ることができる。イノシトール三
リン酸受容体のＣ末端部位を認識するモノクローナル抗
体も常法に準じて調製することができ、たとえば、上記
免疫抗原で免疫化されたマウス脾臓細胞とミエローマ細
胞とを、ポリエチレングリコールなどの細胞融合促進剤
を用いて細胞融合させる。融合細胞を適当な選択培地を
用いてハイブリドーマの選択を行い、次いで抗体産生を
チェックし、陽性ハイブリドーマのクローニングを行
う。かくして得られた抗体産生ハイブリドーマ株を適当
な培地を用いて培養することにより、イノシトール三リ
ン酸受容体のＣ末端部位を認識するモノクローナル抗体
が得られる。より具体的には、本発明者等により報告さ
れている方法(J. Neurochem., Vol.51, 1724-1730, 198
8; Nature, Vol.342, 32-38, 1989)などに準じて調製す
ることができる。
製法においていは、イノシトール三リン酸受容体を認識
する抗体が結合した担体が用いられる。ここで用いられ
る抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
のいずれであってもよく、かかる抗体は常法に準じて調
製することができる。また、当該抗体は、イノシトール
三リン酸受容体のいずれの部位を認識するものであって
もよいが、好適には、イノシトール三リン酸受容体の末
端部位、特にＣ末端部位を認識する抗体が使用される。
すなわち、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位
は、構造的な要因から、当該末端部位を認識する抗体を
結合させたアフィニティ担体に容易に結合し、また溶出
液で容易に担体から脱離させることができるので、精製
工程が簡便になると共に高精製度のイノシトール三リン
酸受容体を得ることができる。本発明で用いられる抗体
の調製法の例として、イノシトール三リン酸受容体のＣ
末端部位を認識する抗体の調製法をもって説明すると、
まず、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位に相当
するぺプチドを合成する。このぺプチドは、本発明者ら
により既に明らかになっているイノシトール三リン酸受
容体のアミノ酸配列(Nature, Vol.342, 32, 1989)に基
づき、そのＣ末端部位に相当するぺプチドを慣用のぺプ
チド合成法を用いて合成することができる。かくして得
られたぺプチドは、抗原性を付与するための担体（例え
ば、血清アルブミン、血清グロブリン、サイトグロブリ
ン、ヘモグロビンなど）と結合させて免疫抗原を調製す
る。得られた免疫抗原を、Freundの完全アジュバントな
どのアジュバントとともに実験動物に投与して免疫化
し、免疫化されて実験動物から採血し、塩析、遠心分離
などの適当な手段を用いて血清を分離することにより、
イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認識するポ
リクローナル抗体を得ることができる。イノシトール三
リン酸受容体のＣ末端部位を認識するモノクローナル抗
体も常法に準じて調製することができ、たとえば、上記
免疫抗原で免疫化されたマウス脾臓細胞とミエローマ細
胞とを、ポリエチレングリコールなどの細胞融合促進剤
を用いて細胞融合させる。融合細胞を適当な選択培地を
用いてハイブリドーマの選択を行い、次いで抗体産生を
チェックし、陽性ハイブリドーマのクローニングを行
う。かくして得られた抗体産生ハイブリドーマ株を適当
な培地を用いて培養することにより、イノシトール三リ
ン酸受容体のＣ末端部位を認識するモノクローナル抗体
が得られる。より具体的には、本発明者等により報告さ
れている方法(J. Neurochem., Vol.51, 1724-1730, 198
8; Nature, Vol.342, 32-38, 1989)などに準じて調製す
ることができる。
【０００６】次に、イノシトール三リン酸受容体を認識
する抗体と担体との結合体を調製する。担体としては、
従来よりアフィニティクロマトグラフィーの担体として
使用されているいずれの担体も使用でき、好適にはセフ
ァロースゲルが使用される。抗体と担体との結合は、従
来知られているアフィニティクロマトグラフィー作製の
常法に従って行うことができ、例えば、ＢｒＣＮを用い
る化学結合法、物理的結合法などが例示される。
する抗体と担体との結合体を調製する。担体としては、
従来よりアフィニティクロマトグラフィーの担体として
使用されているいずれの担体も使用でき、好適にはセフ
ァロースゲルが使用される。抗体と担体との結合は、従
来知られているアフィニティクロマトグラフィー作製の
常法に従って行うことができ、例えば、ＢｒＣＮを用い
る化学結合法、物理的結合法などが例示される。
【０００７】かくして得られた抗体結合担体は、イノシ
トール三リン酸受容体を含む試料と接触させてイノシト
ール三リン酸受容体を担体に結合させ、次いで担体を適
当な溶出液と接触させ、イノシトール三リン酸受容体を
溶出させることより、精製イノシトール三リン酸受容体
を得ることができる。かかる操作は、カラム法、バッチ
法のいずれの方法でも行うことができるが、精製効率の
点からカラム法が好ましい。上記工程をより具体的に示
すため、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認
識する抗体が結合した担体を用いて、イノシトール三リ
ン酸受容体を精製する方法をもって説明すると、まず、
イノシトール三リン酸受容体が豊富に存在すると思われ
る臓器・組織（例えば、小脳、大脳、膵臓、胃粘膜、内
分泌細胞など）を、安定化剤などを含む適当な緩衝液
（例えば、トリス−塩酸緩衝液など）とホモジェナイズ
した後、遠心分離し、イノシトール三リン酸受容体が含
まれている上清を分離する。この上清を、前記の抗体が
結合した担体と接触させ、イノシトール三リン酸受容体
を担体に結合させる。次いで、得られた担体をカラムに
充填し、前記のイノシトール三リン酸受容体のＣ末端部
位に相当するぺプチド溶液を溶出液としてカラムに流
し、担体に結合したイノシトール三リン酸受容体を担体
から離脱させることにより、高度に精製されたイノシト
ール三リン酸受容体が得られる。上記の方法によれば、
目的とするイノシトール三リン酸受容体を蛋白質の変成
をもたらすことなく一段階にて精製することができる。
トール三リン酸受容体を含む試料と接触させてイノシト
ール三リン酸受容体を担体に結合させ、次いで担体を適
当な溶出液と接触させ、イノシトール三リン酸受容体を
溶出させることより、精製イノシトール三リン酸受容体
を得ることができる。かかる操作は、カラム法、バッチ
法のいずれの方法でも行うことができるが、精製効率の
点からカラム法が好ましい。上記工程をより具体的に示
すため、イノシトール三リン酸受容体のＣ末端部位を認
識する抗体が結合した担体を用いて、イノシトール三リ
ン酸受容体を精製する方法をもって説明すると、まず、
イノシトール三リン酸受容体が豊富に存在すると思われ
る臓器・組織（例えば、小脳、大脳、膵臓、胃粘膜、内
分泌細胞など）を、安定化剤などを含む適当な緩衝液
（例えば、トリス−塩酸緩衝液など）とホモジェナイズ
した後、遠心分離し、イノシトール三リン酸受容体が含
まれている上清を分離する。この上清を、前記の抗体が
結合した担体と接触させ、イノシトール三リン酸受容体
を担体に結合させる。次いで、得られた担体をカラムに
充填し、前記のイノシトール三リン酸受容体のＣ末端部
位に相当するぺプチド溶液を溶出液としてカラムに流
し、担体に結合したイノシトール三リン酸受容体を担体
から離脱させることにより、高度に精製されたイノシト
ール三リン酸受容体が得られる。上記の方法によれば、
目的とするイノシトール三リン酸受容体を蛋白質の変成
をもたらすことなく一段階にて精製することができる。
【０００８】また、本発明のイノシトール三リン酸受容
体活性の測定法は、上記の方法により高度に精製された
イノシトール三リン酸受容体を用い、脂質二重膜にイノ
シトール三リン酸受容体を再構築して、Ｃａ2+の膜通過
量を測定し、その値から当該受容体の活性を測定するも
のであり、脂質二重膜としてリポソームを用いるのが好
ましい。上記の脂質二重膜は常法に準じて調製すること
ができ、例えば、イノシトール三リン酸受容体をリポソ
ームに再構築するには、フォスファチジルコリン、フォ
スファチジルセリンなどのリン脂質を、有機溶媒（例え
ば、クロロホルムなど）に溶解し、得られた溶液から溶
媒を不活性ガス気流下又は減圧下に蒸発させることによ
り脂質フィルムを調製する。得られた脂質フィルムを適
当な緩衝液にサスペンドさせ、ここにイノシトール三リ
ン酸受容体を添加し、十分にインキュベートした後、透
析などの手段を用いて精製することにより、イノシトー
ル三リン酸受容体が再構築されたリポソームを得ること
ができる。
体活性の測定法は、上記の方法により高度に精製された
イノシトール三リン酸受容体を用い、脂質二重膜にイノ
シトール三リン酸受容体を再構築して、Ｃａ2+の膜通過
量を測定し、その値から当該受容体の活性を測定するも
のであり、脂質二重膜としてリポソームを用いるのが好
ましい。上記の脂質二重膜は常法に準じて調製すること
ができ、例えば、イノシトール三リン酸受容体をリポソ
ームに再構築するには、フォスファチジルコリン、フォ
スファチジルセリンなどのリン脂質を、有機溶媒（例え
ば、クロロホルムなど）に溶解し、得られた溶液から溶
媒を不活性ガス気流下又は減圧下に蒸発させることによ
り脂質フィルムを調製する。得られた脂質フィルムを適
当な緩衝液にサスペンドさせ、ここにイノシトール三リ
ン酸受容体を添加し、十分にインキュベートした後、透
析などの手段を用いて精製することにより、イノシトー
ル三リン酸受容体が再構築されたリポソームを得ること
ができる。
【０００９】カルシウムイオンの膜通過量の測定は、例
えば、膜の一方に放射活性を有するカルシウムイオン及
びイノシトール三リン酸を加え、膜の反対側に移動した
カルシウムイオン量を測定することにより行われる。リ
ポソームの場合には、膜の外液に放射活性を有するカル
シウムイオン及びイノシトール三リン酸を加え、リポソ
ームの内部に移動したカルシウムイオン量を測定するこ
とにより行われる。なお、放射活性を有するカルシウム
イオンに代え、適当な標識で標識化されたカルシウムイ
オンを用いてもよい。かくして測定されたカルシウムイ
オンの膜通過量に基づいてイノシトール三リン酸受容体
の活性を求める。この際、測定系に上記のカルシウムイ
オンなどとともにイノシトール三リン酸受容体のイノシ
トール三リン酸結合部位に対する拮抗剤や活性化剤が存
在すると、カルシウムイオンの膜通過量が減少又は増加
することから、イノシトール三リン酸受容体に対する拮
抗剤又は活性化剤のスクリーニングを行うことができ
る。また、このシステムを用いることにより、イノシト
ール三リン酸の定量も行うことができる。
えば、膜の一方に放射活性を有するカルシウムイオン及
びイノシトール三リン酸を加え、膜の反対側に移動した
カルシウムイオン量を測定することにより行われる。リ
ポソームの場合には、膜の外液に放射活性を有するカル
シウムイオン及びイノシトール三リン酸を加え、リポソ
ームの内部に移動したカルシウムイオン量を測定するこ
とにより行われる。なお、放射活性を有するカルシウム
イオンに代え、適当な標識で標識化されたカルシウムイ
オンを用いてもよい。かくして測定されたカルシウムイ
オンの膜通過量に基づいてイノシトール三リン酸受容体
の活性を求める。この際、測定系に上記のカルシウムイ
オンなどとともにイノシトール三リン酸受容体のイノシ
トール三リン酸結合部位に対する拮抗剤や活性化剤が存
在すると、カルシウムイオンの膜通過量が減少又は増加
することから、イノシトール三リン酸受容体に対する拮
抗剤又は活性化剤のスクリーニングを行うことができ
る。また、このシステムを用いることにより、イノシト
ール三リン酸の定量も行うことができる。
【００１０】上記のイノシトール三リン酸受容体活性の
測定法においては、精製されたイノシトール三リン酸受
容体が再構築された脂質二重膜が用いられており、イノ
シトール三リン酸受容体活性を簡便且つ正確に測定する
ことが可能となる。即ち、公知の文献（The Journal of
Biological Chemistry Vol.257, No. 16, 9372-9378,
1982及びNature Vol.342, 87-89, 1989）に記載される
ミクロソームや平面脂質二重膜を用いた方法では、カル
シウムイオンを内部に取り込んだ試料を用い、カルシウ
ムイオンの放出を測定するため、かかる試薬の調製が煩
雑であるが、本発明の方法によれば、外液にカルシウム
イオンなどを添加するだけで足りるので、極めて簡単な
操作により測定を行うことができる。
測定法においては、精製されたイノシトール三リン酸受
容体が再構築された脂質二重膜が用いられており、イノ
シトール三リン酸受容体活性を簡便且つ正確に測定する
ことが可能となる。即ち、公知の文献（The Journal of
Biological Chemistry Vol.257, No. 16, 9372-9378,
1982及びNature Vol.342, 87-89, 1989）に記載される
ミクロソームや平面脂質二重膜を用いた方法では、カル
シウムイオンを内部に取り込んだ試料を用い、カルシウ
ムイオンの放出を測定するため、かかる試薬の調製が煩
雑であるが、本発明の方法によれば、外液にカルシウム
イオンなどを添加するだけで足りるので、極めて簡単な
操作により測定を行うことができる。
【００１１】
【発明の効果】本発明の精製法によれば、イノシトール
三リン酸受容体含む試料（特に当該受容体を豊富に含む
生体内画分）から一段階で純粋な受容体蛋白質を得るこ
とができる。また、本発明の測定法によれば、イノシト
ール三リン酸受容体を容易に測定することができ、当該
受容体が関与する種々の生理現象に解析、研究などに有
用である。
三リン酸受容体含む試料（特に当該受容体を豊富に含む
生体内画分）から一段階で純粋な受容体蛋白質を得るこ
とができる。また、本発明の測定法によれば、イノシト
ール三リン酸受容体を容易に測定することができ、当該
受容体が関与する種々の生理現象に解析、研究などに有
用である。
【００１２】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１イノシトール三リン酸レセプターＣ末端ペプチドに対す
るポリクローナル抗体の取得 イノシトール三リン酸受容体のアミノ酸配列は既に公知
となっているｃＤＮＡから判明している。今回、その２
７３６番目から２７４７番目のアミノ酸配列、即ち、Ｇ
ＨＰＰＨＭＮＶＮＰＱＱのペプチドを慣用の方法により
調製した。そのペプチド１０ｍｇを１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）存在下、１０ｍｇのＢＳＡと結合させた。得られた
混合物を一昼夜撹拌し、未反応のＥＤＣもしくはペプチ
ドはセファデックスＧ−５０カラムを用いて、ゲル濾過
によって分離した。尚、カラムは５０ｍＭ−酢酸アンモ
ニウムで平衡化しておいた。精製したＢＳＡの結合した
ペプチドを集め、リン酸緩衝液にて溶解した。次に、ニ
ュージーランド白ウサギに１ｍｌのFreundの完全アジュ
バントと２００μｇのペプチドを含むＢＳＡ結合物１ｍ
ｌを皮下投与し一次免疫を行った。３週間後、１ｍｌの
Freundの不完全アジュバントと１００μｇのペプチド相
当のＢＳＡ結合物１ｍｌで感作する。尚、抗血清の抗体
価が飽和するまで２週間おきにこの作業を繰り返した。
上記方法にて、イノシトール三リン酸受容体に対するポ
リクローナル抗体を調製できた。
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１イノシトール三リン酸レセプターＣ末端ペプチドに対す
るポリクローナル抗体の取得 イノシトール三リン酸受容体のアミノ酸配列は既に公知
となっているｃＤＮＡから判明している。今回、その２
７３６番目から２７４７番目のアミノ酸配列、即ち、Ｇ
ＨＰＰＨＭＮＶＮＰＱＱのペプチドを慣用の方法により
調製した。そのペプチド１０ｍｇを１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）存在下、１０ｍｇのＢＳＡと結合させた。得られた
混合物を一昼夜撹拌し、未反応のＥＤＣもしくはペプチ
ドはセファデックスＧ−５０カラムを用いて、ゲル濾過
によって分離した。尚、カラムは５０ｍＭ−酢酸アンモ
ニウムで平衡化しておいた。精製したＢＳＡの結合した
ペプチドを集め、リン酸緩衝液にて溶解した。次に、ニ
ュージーランド白ウサギに１ｍｌのFreundの完全アジュ
バントと２００μｇのペプチドを含むＢＳＡ結合物１ｍ
ｌを皮下投与し一次免疫を行った。３週間後、１ｍｌの
Freundの不完全アジュバントと１００μｇのペプチド相
当のＢＳＡ結合物１ｍｌで感作する。尚、抗血清の抗体
価が飽和するまで２週間おきにこの作業を繰り返した。
上記方法にて、イノシトール三リン酸受容体に対するポ
リクローナル抗体を調製できた。
【００１３】実施例２ミクロソーム画分の調製 成熟ｄｄＹマウスを麻酔した後、断頭し、小脳を断片化
した。組織は０．３２Ｍのシュクロース、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド、１０ｍＭのロイペプチン、１０μＭのペプスタ
チンＡ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、５ｍＭの
トリス塩酸の混和物でｐＨ７．４となるよう混和してお
いた。次に、グラス−テフロンポッターホモジェナイザ
ーにより８５０ｒｐｍにて１０ストロークにホモジェナ
イズする。その上清を１２，０００ｇで１５分間２℃で
遠心分離した。残渣も同条件で再度洗浄した。得られた
上清を、次に１０５，０００ｇで６０分間２℃の条件下
で遠心分離し、目的としたミクロソーム画分を得た。得
られたミクロソーム画分は、０．１Ｍシュクロース、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、１０ｍＭのトリス塩酸の混合物からなり、ｐＨ７．
４となるよう調整したバッファーＡに混和し、１％ＣＨ
ＡＰＳにて可溶化した。
した。組織は０．３２Ｍのシュクロース、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド、１０ｍＭのロイペプチン、１０μＭのペプスタ
チンＡ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、５ｍＭの
トリス塩酸の混和物でｐＨ７．４となるよう混和してお
いた。次に、グラス−テフロンポッターホモジェナイザ
ーにより８５０ｒｐｍにて１０ストロークにホモジェナ
イズする。その上清を１２，０００ｇで１５分間２℃で
遠心分離した。残渣も同条件で再度洗浄した。得られた
上清を、次に１０５，０００ｇで６０分間２℃の条件下
で遠心分離し、目的としたミクロソーム画分を得た。得
られたミクロソーム画分は、０．１Ｍシュクロース、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、１０ｍＭのトリス塩酸の混合物からなり、ｐＨ７．
４となるよう調整したバッファーＡに混和し、１％ＣＨ
ＡＰＳにて可溶化した。
【００１４】実施例３イムノアフィニティによるイノシトール三リン酸受容体
の精製 実施例１で得られたイノシトール三リン酸受容体のポリ
クローナル抗体を硫酸アンモニウム沈降法で精製し、Ｃ
ＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂビーズに結合させ
た。次に、実施例２で得られたミクロソーム画分からイ
ノシトール三リン酸を単離する目的で、１％ＣＨＡＰＳ
含有のバッファーＡで可溶化したミクロソーム画分を上
記ビーズとともに２時間、４℃で撹拌しながらインキュ
ベートした。次に、得られたビーズをカラムに添加し、
バッファーＡ ５０ｍｌと１ｍｇのフォスファチジルコ
リン／ｍｌで洗浄した。その後、溶出液として、１ｍｇ
フォスファチジルコリン／ｍｌを含むバッファーＡであ
ってペプチド（実施例１に記載のぺプチド）の濃度が５
μＭとなるように調整した液を用い、この溶液をカラム
に流してイノシトール三リン酸受容体を含む画分を分離
することにより、精製されたイノシトール三リン酸受容
体を得た。
の精製 実施例１で得られたイノシトール三リン酸受容体のポリ
クローナル抗体を硫酸アンモニウム沈降法で精製し、Ｃ
ＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂビーズに結合させ
た。次に、実施例２で得られたミクロソーム画分からイ
ノシトール三リン酸を単離する目的で、１％ＣＨＡＰＳ
含有のバッファーＡで可溶化したミクロソーム画分を上
記ビーズとともに２時間、４℃で撹拌しながらインキュ
ベートした。次に、得られたビーズをカラムに添加し、
バッファーＡ ５０ｍｌと１ｍｇのフォスファチジルコ
リン／ｍｌで洗浄した。その後、溶出液として、１ｍｇ
フォスファチジルコリン／ｍｌを含むバッファーＡであ
ってペプチド（実施例１に記載のぺプチド）の濃度が５
μＭとなるように調整した液を用い、この溶液をカラム
に流してイノシトール三リン酸受容体を含む画分を分離
することにより、精製されたイノシトール三リン酸受容
体を得た。
【００１５】実施例４イノシトール三リン酸受容体のリポソームへの再構築 リン脂質溶液（クロロホルム中、フォスファチジルコリ
ンとフォスファチジルセリンが３：１となるよう調整し
た）を調製し、得られた混合物を窒素ガス気流下、薄層
フィルム上で乾燥した。更に、得られた脂質フィルム
を、１ｍｇ／ｍｌのバッファーＢ（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸の混合物で
ｐＨ７．４）及び１％ＣＨＡＰＳにサスペンドした。こ
こで、実施例３で得られたイノシトール三リン酸受容体
を上記で調製した脂質含有溶液と混和し、イノシトール
三リン酸受容体が５μｇ／ｍｌとなるように調整した。
次に、上記で得られた蛋白質と脂質と界面活性剤の混合
物を氷上で最低でも２０分間インキュベートした後、２
−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＥＧＴＡを含有する１０００倍の容量のバッファーＢに
透析した。透析に用いたバッファーは８時間毎に取替
え、４８時間透析した。最後に、２ｍＭ２−メルカプト
エタノール含有の１０００倍量のバッファーＢに透析液
を代え、用いたＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを除去し、更に８
時間透析を行った。以上のように得られたリポソームを
１００，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を集め、
目的とするイノシトール三リン酸受容体のリポソームへ
の再構築ができた。
ンとフォスファチジルセリンが３：１となるよう調整し
た）を調製し、得られた混合物を窒素ガス気流下、薄層
フィルム上で乾燥した。更に、得られた脂質フィルム
を、１ｍｇ／ｍｌのバッファーＢ（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸の混合物で
ｐＨ７．４）及び１％ＣＨＡＰＳにサスペンドした。こ
こで、実施例３で得られたイノシトール三リン酸受容体
を上記で調製した脂質含有溶液と混和し、イノシトール
三リン酸受容体が５μｇ／ｍｌとなるように調整した。
次に、上記で得られた蛋白質と脂質と界面活性剤の混合
物を氷上で最低でも２０分間インキュベートした後、２
−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＥＧＴＡを含有する１０００倍の容量のバッファーＢに
透析した。透析に用いたバッファーは８時間毎に取替
え、４８時間透析した。最後に、２ｍＭ２−メルカプト
エタノール含有の１０００倍量のバッファーＢに透析液
を代え、用いたＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを除去し、更に８
時間透析を行った。以上のように得られたリポソームを
１００，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を集め、
目的とするイノシトール三リン酸受容体のリポソームへ
の再構築ができた。
【００１６】実施例５ 45Ｃａ2+の流入量の測定 45 Ｃａ2+流入量の測定は公知のFerrisら及びNunokiらの
方法により測定を行った。即ち、45Ｃａ2+流入量の測定
は、実施例４で得られたリポソーム粒子溶液２５μｌを
２ｍＭの２−メルカプトエタノール及び２μＣｉのＣａ
2+を含むバッファーＢ７５μｌで希釈した溶液をインキ
ュベートすることにより測定できる。例えば、１分間３
０℃でインキュベート後、カルシウムイオンコンダクタ
ンスをイノシトール三リン酸でカルシウムチャネルを開
いたときのリポソーム内に45Ｃａ2+が流入するときの条
件下で測定する。次に、更に３０℃で１分間インキュベ
ートした後、０．３ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ4、１ｍＭ ＣｄＣｌ2含有の３００μｌのバッファー
Ｂと１００μｇ／ｍｌのヘパリンで流入を阻害した後、
前もって２００ｍＭのシュクロース、２０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）で調整したchlex100カ
ラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）３ｍｌに４００μｌの混合物を
添加し、更に５ｍｌの同じバッファーでリポソーム粒子
を洗浄し、リポソーム粒子内に含まれる45Ｃａ2+を測定
することにより行うことができる。本発明の方法により
精製されたイノシトール三リン酸受容体を用いた場合に
は、測定精度及び再現性に優れた結果が得られた。
方法により測定を行った。即ち、45Ｃａ2+流入量の測定
は、実施例４で得られたリポソーム粒子溶液２５μｌを
２ｍＭの２−メルカプトエタノール及び２μＣｉのＣａ
2+を含むバッファーＢ７５μｌで希釈した溶液をインキ
ュベートすることにより測定できる。例えば、１分間３
０℃でインキュベート後、カルシウムイオンコンダクタ
ンスをイノシトール三リン酸でカルシウムチャネルを開
いたときのリポソーム内に45Ｃａ2+が流入するときの条
件下で測定する。次に、更に３０℃で１分間インキュベ
ートした後、０．３ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ4、１ｍＭ ＣｄＣｌ2含有の３００μｌのバッファー
Ｂと１００μｇ／ｍｌのヘパリンで流入を阻害した後、
前もって２００ｍＭのシュクロース、２０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）で調整したchlex100カ
ラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）３ｍｌに４００μｌの混合物を
添加し、更に５ｍｌの同じバッファーでリポソーム粒子
を洗浄し、リポソーム粒子内に含まれる45Ｃａ2+を測定
することにより行うことができる。本発明の方法により
精製されたイノシトール三リン酸受容体を用いた場合に
は、測定精度及び再現性に優れた結果が得られた。
【００１７】実施例６イムノアフィニティによるイノシトール三リン酸受容体
の精製 実施例３において、イノシトール三リン酸受容体のポリ
クローナル抗体に代えてイノシトール三リン酸受容体の
モノクローナル抗体(J. Neurochem., Vol.51,1724-173
0, 1988に記載の方法により調製したモノクローナル抗
体を使用)を用いる以外は同様な方法で、イノシトール
三リン酸受容体を精製した。
の精製 実施例３において、イノシトール三リン酸受容体のポリ
クローナル抗体に代えてイノシトール三リン酸受容体の
モノクローナル抗体(J. Neurochem., Vol.51,1724-173
0, 1988に記載の方法により調製したモノクローナル抗
体を使用)を用いる以外は同様な方法で、イノシトール
三リン酸受容体を精製した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/28 8517−4Ｈ
Claims (4)
- 【請求項１】 イノシトール三リン酸受容体を含有す
る試料を、当該受容体を認識する抗体が結合した担体を
用いるアフィニティクロマトグラフィーに付して精製す
ることを特徴とするイノシトール三リン酸受容体の精製
法。 - 【請求項２】 抗体が、イノシトール三リン酸受容体
のＣ末端部位を認識するモノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体である請求項１記載のイノシトール三リン
酸受容体の精製法。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法により精製された
イノシトール三リン酸受容体を含む脂質二重膜を用い、
カルシウムイオンの膜通過量に基づいてイノシトール三
リン酸受容体活性を測定することを特徴とするイノシト
ール三リン酸受容体活性の測定法。 - 【請求項４】 脂質二重膜が、リポソームである請求
項３記載のイノシトール三リン酸受容体活性の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31395592A JPH06135997A (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | イノシトール三リン酸受容体の精製法及び活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31395592A JPH06135997A (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | イノシトール三リン酸受容体の精製法及び活性測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135997A true JPH06135997A (ja) | 1994-05-17 |
Family
ID=18047505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31395592A Withdrawn JPH06135997A (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | イノシトール三リン酸受容体の精製法及び活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06135997A (ja) |
-
1992
- 1992-10-28 JP JP31395592A patent/JPH06135997A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000104 |