JPH06145065A - 固相化された肝実質細胞増殖剤 - Google Patents
固相化された肝実質細胞増殖剤Info
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Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫
酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン、グ
ルカンまたはその誘導体に肝実質細胞増殖因子を結合し
て固相化された肝実質細胞増殖剤を得る。 【効果】 本発明により、肝実質細胞増殖因子を、適当
なグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体を
用いることによって活性を保持したまま固相化すること
が可能であり、その結果、この固相化増殖因子をｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで利用できるようにな
った。本発明を基に肝実質細胞増殖因子の固相化担体を
工夫することにより、医療分野での広範な利用が期待で
き、さらに生体への投与における際に徐放効果・集積効
果も期待できる。
酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン、グ
ルカンまたはその誘導体に肝実質細胞増殖因子を結合し
て固相化された肝実質細胞増殖剤を得る。 【効果】 本発明により、肝実質細胞増殖因子を、適当
なグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体を
用いることによって活性を保持したまま固相化すること
が可能であり、その結果、この固相化増殖因子をｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで利用できるようにな
った。本発明を基に肝実質細胞増殖因子の固相化担体を
工夫することにより、医療分野での広範な利用が期待で
き、さらに生体への投与における際に徐放効果・集積効
果も期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は肝実質細胞増殖剤に関す
るものであり、詳しくは、グリコサミノグリカン、グル
カンまたはその誘導体と肝実質細胞増殖因子を結合する
ことにより、該増殖因子が固相化された肝実質細胞増殖
剤に関するものである。
るものであり、詳しくは、グリコサミノグリカン、グル
カンまたはその誘導体と肝実質細胞増殖因子を結合する
ことにより、該増殖因子が固相化された肝実質細胞増殖
剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
種々の細胞増殖因子がクロ−ニングされているが、それ
らの中で、ヘパリンに強い親和性を有する一群の増殖因
子が見出されている。これをヘパリン結合性増殖因子と
総称するが、この中には線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧ
Ｆと略す）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、プレ
イオトロフィン、顆粒球／マクロファ−ジ・コロニ−形
成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インタ−ロイキン３及び
７、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、種々の既知
または未同定の増殖因子が含まれる（実験医学、９（１
４）、１７７２−１７７６（１９９１））。 これらの
因子は、ヘパリンやヘパラン硫酸に代表されるグリコサ
ミノグリカンと結合することが知られており、中でもＦ
ＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合により
細胞表面や細胞外基質に貯蔵されること、及びＦＧＦの
有する生物学的活性がヘパリンによって調節され得るこ
とが確認された（Ｃｅｌｌ、６４、８４１−８４８（１
９９１））。
種々の細胞増殖因子がクロ−ニングされているが、それ
らの中で、ヘパリンに強い親和性を有する一群の増殖因
子が見出されている。これをヘパリン結合性増殖因子と
総称するが、この中には線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧ
Ｆと略す）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、プレ
イオトロフィン、顆粒球／マクロファ−ジ・コロニ−形
成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インタ−ロイキン３及び
７、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、種々の既知
または未同定の増殖因子が含まれる（実験医学、９（１
４）、１７７２−１７７６（１９９１））。 これらの
因子は、ヘパリンやヘパラン硫酸に代表されるグリコサ
ミノグリカンと結合することが知られており、中でもＦ
ＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合により
細胞表面や細胞外基質に貯蔵されること、及びＦＧＦの
有する生物学的活性がヘパリンによって調節され得るこ
とが確認された（Ｃｅｌｌ、６４、８４１−８４８（１
９９１））。
【０００３】大工原らは、肝実質細胞を生体内より取り
出して生体外においてその増殖を促進させうるヒト由来
の蛋白性因子、即ちヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧ
Ｆ）を劇症肝炎患者血漿より見いだし（特開昭６３−２
２５２６号公報）、さらに喜多村らはｈＨＧＦ蛋白質の
アミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）配列（特開平３−７２８８３号公報）、さらにこの
ｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦ蛋白質の生産方法および形質
転換体を発明するに至った（特開平３−２８５６９３号
公報）。かかる発明により生産されるｈＨＧＦ蛋白質
は、生体外において肝実質細胞の増殖を促進する働きが
認められている。また、ｈＨＧＦに限らずＨＧＦ蛋白質
は、ヘパリンに強い親和性を有する上記ヘパリン結合性
増殖因子の一種であることが判明している。
出して生体外においてその増殖を促進させうるヒト由来
の蛋白性因子、即ちヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧ
Ｆ）を劇症肝炎患者血漿より見いだし（特開昭６３−２
２５２６号公報）、さらに喜多村らはｈＨＧＦ蛋白質の
アミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）配列（特開平３−７２８８３号公報）、さらにこの
ｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦ蛋白質の生産方法および形質
転換体を発明するに至った（特開平３−２８５６９３号
公報）。かかる発明により生産されるｈＨＧＦ蛋白質
は、生体外において肝実質細胞の増殖を促進する働きが
認められている。また、ｈＨＧＦに限らずＨＧＦ蛋白質
は、ヘパリンに強い親和性を有する上記ヘパリン結合性
増殖因子の一種であることが判明している。
【０００４】一方、一般に細胞の増殖や運動性の調節に
は、液性因子のみならず、細胞に隣接する細胞外基質
（ＥＣＭ）が重要な役割を果たすと考えられている。Ｅ
ＣＭを構成する主成分は、コラ−ゲン、エラスチンなど
の繊維状蛋白質、フィブロネクチオン、ラミニンなどの
接着性蛋白質、そしてグリコサミノグリカン糖鎖をもつ
プロテオグリカンなどの複合糖質である。このうち、生
体材料からプロテオグリカンを調製するのは容易でな
く、ＥＣＭ中のグリコサミノグリカンの生理的意義や増
殖因子との相互作用について解析が遅れていた。
は、液性因子のみならず、細胞に隣接する細胞外基質
（ＥＣＭ）が重要な役割を果たすと考えられている。Ｅ
ＣＭを構成する主成分は、コラ−ゲン、エラスチンなど
の繊維状蛋白質、フィブロネクチオン、ラミニンなどの
接着性蛋白質、そしてグリコサミノグリカン糖鎖をもつ
プロテオグリカンなどの複合糖質である。このうち、生
体材料からプロテオグリカンを調製するのは容易でな
く、ＥＣＭ中のグリコサミノグリカンの生理的意義や増
殖因子との相互作用について解析が遅れていた。
【０００５】プロテオグリカンはグリコサミノグリカン
と蛋白質との共有結合化合物の総称であるが、近年、各
種グリコサミノグリカンを、天然コア蛋白質の代わりに
他の蛋白質やリン脂質に共有結合させたプロテオグリカ
ンのモデル化合物が作成されている（ネオプロテオグリ
カン；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（１４）、８
０１２−８０１８（１９８９），特開平４−８０２０１
号および同４−８０２０２号各公報）。このネオプロテ
オグリカンは、効率よくグリコサミノグリカン糖鎖を培
養皿に固相化する方法を初めて可能にした。
と蛋白質との共有結合化合物の総称であるが、近年、各
種グリコサミノグリカンを、天然コア蛋白質の代わりに
他の蛋白質やリン脂質に共有結合させたプロテオグリカ
ンのモデル化合物が作成されている（ネオプロテオグリ
カン；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（１４）、８
０１２−８０１８（１９８９），特開平４−８０２０１
号および同４−８０２０２号各公報）。このネオプロテ
オグリカンは、効率よくグリコサミノグリカン糖鎖を培
養皿に固相化する方法を初めて可能にした。
【０００６】従来の技術では、ｈＨＧＦ等のヘパリン結
合性増殖因子も含め、種々の増殖因子を溶液中に添加し
てその作用を見ることは可能であったが、該増殖因子を
活性を保持した状態で固相化できなかったために、固相
化した増殖因子の作用については解析されていない。ま
た、増殖因子を生体内に投与した場合、該増殖因子を作
用局所にとどめておくことは、技術的に困難であった。
合性増殖因子も含め、種々の増殖因子を溶液中に添加し
てその作用を見ることは可能であったが、該増殖因子を
活性を保持した状態で固相化できなかったために、固相
化した増殖因子の作用については解析されていない。ま
た、増殖因子を生体内に投与した場合、該増殖因子を作
用局所にとどめておくことは、技術的に困難であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＨＧＦのグ
リコサミノグリカンへの結合性を利用して、該増殖因子
を固相化し、その作用を検討することを試みた。その結
果、興味深いことに、ＨＧＦはグリコサミノグリカンを
介して固相化され、肝実質細胞に対して増殖刺激と成り
得ることが判明し本発明を完成するに至った。
リコサミノグリカンへの結合性を利用して、該増殖因子
を固相化し、その作用を検討することを試みた。その結
果、興味深いことに、ＨＧＦはグリコサミノグリカンを
介して固相化され、肝実質細胞に対して増殖刺激と成り
得ることが判明し本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明の要旨は、グリコサミノグ
リカン、グルカンまたはその誘導体に肝実質細胞増殖因
子を結合してなることを特徴とする固相化された肝実質
細胞増殖剤に存する。以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明で使用する肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）
は、生体材料から精製して得られたもの及び組換え法に
よりそのｃＤＮＡを発現させて得られたもののいずれの
ものも使用できる。ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の具体例と
しては、特開昭６３−２２５２６号公報に記載された方
法に従い劇症肝炎患者血漿から蛋白化学的に分離精製す
ることによって、或は、特開平３−２８５６９３号公報
に記載された方法に従いｈＨＧＦをコ−ドするｃＤＮＡ
を含む発現ベクタ−を構築し、ＣＨＯ細胞等の宿主中で
発現させることによって得られるものが挙げられる。か
かるｈＨＧＦは、約０．５〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で肝実
質細胞の増殖活性を示しはじめ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌ
の濃度で最高の増殖誘導活性に到達する。
リカン、グルカンまたはその誘導体に肝実質細胞増殖因
子を結合してなることを特徴とする固相化された肝実質
細胞増殖剤に存する。以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明で使用する肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）
は、生体材料から精製して得られたもの及び組換え法に
よりそのｃＤＮＡを発現させて得られたもののいずれの
ものも使用できる。ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の具体例と
しては、特開昭６３−２２５２６号公報に記載された方
法に従い劇症肝炎患者血漿から蛋白化学的に分離精製す
ることによって、或は、特開平３−２８５６９３号公報
に記載された方法に従いｈＨＧＦをコ−ドするｃＤＮＡ
を含む発現ベクタ−を構築し、ＣＨＯ細胞等の宿主中で
発現させることによって得られるものが挙げられる。か
かるｈＨＧＦは、約０．５〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で肝実
質細胞の増殖活性を示しはじめ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌ
の濃度で最高の増殖誘導活性に到達する。
【０００９】本発明において、上記ＨＧＦを固相化する
担体として、グリコサミノグリカン、グルカンまたはそ
の誘導体が使用される。グリコサミノグリカンとは、ヘ
キソサミンを構成糖として含む多糖の総称であり、具体
的にはヒアルロン酸、コンドロイチン、テイクロン酸、
コロミン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫
酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コン
ドロイチン硫酸ＤおよびＥ（コンドロイチンポリ硫
酸）、ヘパリン、ケラト硫酸（ケラタン硫酸）、ヘパリ
チン硫酸（ヘパラン硫酸）、ポリアセチルガラクトサミ
ンリン酸等の酸性グリコサミノグリカンや、キチン、ガ
ラクトサミノグリカン等が挙げられる。一方、グルカン
とはグルコースを構成糖として含む多糖の総称であり、
具体的にはデキストラン、デキストラン硫酸、ラミナラ
ン、リヘナン、セルロース、アミロース、アミロペクチ
ン等が挙げられ、本発明においてはデキストランまたは
デキストラン硫酸が好ましい。これらは既知の方法を用
いて適宜調製することができる。
担体として、グリコサミノグリカン、グルカンまたはそ
の誘導体が使用される。グリコサミノグリカンとは、ヘ
キソサミンを構成糖として含む多糖の総称であり、具体
的にはヒアルロン酸、コンドロイチン、テイクロン酸、
コロミン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫
酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コン
ドロイチン硫酸ＤおよびＥ（コンドロイチンポリ硫
酸）、ヘパリン、ケラト硫酸（ケラタン硫酸）、ヘパリ
チン硫酸（ヘパラン硫酸）、ポリアセチルガラクトサミ
ンリン酸等の酸性グリコサミノグリカンや、キチン、ガ
ラクトサミノグリカン等が挙げられる。一方、グルカン
とはグルコースを構成糖として含む多糖の総称であり、
具体的にはデキストラン、デキストラン硫酸、ラミナラ
ン、リヘナン、セルロース、アミロース、アミロペクチ
ン等が挙げられ、本発明においてはデキストランまたは
デキストラン硫酸が好ましい。これらは既知の方法を用
いて適宜調製することができる。
【００１０】また、かかるグリコサミノグリカンまたは
グルカンの誘導体としては特に制限はされないが、本発
明においてはグリコサミノグリカンまたはグルカンと共
有結合しうる蛋白質、またはリン脂質との誘導体である
ことが好ましい。蛋白質としては、アルブミン等の生体
内蛋白質が、リン脂質としては、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
グリセロール、ジホスファチジルグリセロール等のグリ
セロリン脂質や、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリ
ン脂質等が挙げられる。これらの蛋白誘導体は、いわゆ
るネオプロテオグリカンの製法として既知の方法（例え
ば，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１４），８０
１２−８０１８（１９８９）に記載の方法）により調製
することができ、またリン脂質誘導体は特開平４−８０
２０１号、同４−８０２０２号公報等に記載の方法に準
じて調製することができる。
グルカンの誘導体としては特に制限はされないが、本発
明においてはグリコサミノグリカンまたはグルカンと共
有結合しうる蛋白質、またはリン脂質との誘導体である
ことが好ましい。蛋白質としては、アルブミン等の生体
内蛋白質が、リン脂質としては、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
グリセロール、ジホスファチジルグリセロール等のグリ
セロリン脂質や、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリ
ン脂質等が挙げられる。これらの蛋白誘導体は、いわゆ
るネオプロテオグリカンの製法として既知の方法（例え
ば，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１４），８０
１２−８０１８（１９８９）に記載の方法）により調製
することができ、またリン脂質誘導体は特開平４−８０
２０１号、同４−８０２０２号公報等に記載の方法に準
じて調製することができる。
【００１１】本発明において、ＨＧＦはグリコサミノグ
リカン、グルカンまたはその誘導体に結合される。この
とき、ＨＧＦはもともとヘパリン結合性であることから
両者を混合することにより容易に結合されるが、その性
質を損なわない範囲においてリン酸緩衝−生理食塩水等
を共存させても差し支えない。またＨＧＦとグリコサミ
ノグリカン、グルカンまたはその誘導体とは、モル比で
１：１〜１：１０００の割合で結合させることが好まし
い。さらに本発明においては、グリコサミノグリカン、
グルカンまたはその誘導体を予めコラーゲン、エラスチ
ン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カ
ドヘリン等の細胞接着性蛋白質（以下、「培養基質」と
略す）上に結合させておくと、より安定に固相化するこ
とができるので好ましい。その際、グリコサミノグリカ
ン、グルカンまたはその誘導体を直接、或は間接的に培
養基質にコ−トし、その上にＨＧＦを溶液の状態で添加
して固相化してもよいし、培養基質の代わりに例えばシ
−ト状の高分子基材を用いてもよい。かかる高分子基材
としては、生体に適合する材料であれば特に制限はされ
ない。培養基質を用いる場合は、これを更に高分子基材
上に結合させて使用してもよい。かくして固相化された
ＨＧＦは、細胞或は組織にさらすことによって、局所に
て該増殖因子本来の生理活性を誘導することができる。
リカン、グルカンまたはその誘導体に結合される。この
とき、ＨＧＦはもともとヘパリン結合性であることから
両者を混合することにより容易に結合されるが、その性
質を損なわない範囲においてリン酸緩衝−生理食塩水等
を共存させても差し支えない。またＨＧＦとグリコサミ
ノグリカン、グルカンまたはその誘導体とは、モル比で
１：１〜１：１０００の割合で結合させることが好まし
い。さらに本発明においては、グリコサミノグリカン、
グルカンまたはその誘導体を予めコラーゲン、エラスチ
ン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カ
ドヘリン等の細胞接着性蛋白質（以下、「培養基質」と
略す）上に結合させておくと、より安定に固相化するこ
とができるので好ましい。その際、グリコサミノグリカ
ン、グルカンまたはその誘導体を直接、或は間接的に培
養基質にコ−トし、その上にＨＧＦを溶液の状態で添加
して固相化してもよいし、培養基質の代わりに例えばシ
−ト状の高分子基材を用いてもよい。かかる高分子基材
としては、生体に適合する材料であれば特に制限はされ
ない。培養基質を用いる場合は、これを更に高分子基材
上に結合させて使用してもよい。かくして固相化された
ＨＧＦは、細胞或は組織にさらすことによって、局所に
て該増殖因子本来の生理活性を誘導することができる。
【００１２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するがその要旨を越えない限り、以下の実施例に限
定されるものではない。 実施例１：ネオプロテオグリカンで固相化したｈＨＧＦ
の肝実質細胞増殖誘導能 担体の調製：直径２．３ｃｍのウェルを有するマルチウ
ェル プラスチックディッシュ（コ−ニング社）に、ま
ずウシ由来Ｉ型コラ−ゲン溶液（１０μｇ／ｍｌ、コ−
ケン社）をコ−トして培養基質とし、次いで合成グリコ
サミノグリカン脂質誘導体（ＧＡＧ−ＰＥ）としてヘパ
リン−フォスファチジルエタノ−ルアミン（Ｈｅｐ−Ｐ
Ｅ）を１０μｇ／ｍｌの濃度でコ−トして固相化の担体
とした（Ｈｅｐ−ＰＥは、特開平４−８０２０１号公報
の実施例１に記載の方法に準じて調製した）。対照実験
として合成グリコサミノグリカン脂質誘導体をコ−トし
ないウェルも用意した。
説明するがその要旨を越えない限り、以下の実施例に限
定されるものではない。 実施例１：ネオプロテオグリカンで固相化したｈＨＧＦ
の肝実質細胞増殖誘導能 担体の調製：直径２．３ｃｍのウェルを有するマルチウ
ェル プラスチックディッシュ（コ−ニング社）に、ま
ずウシ由来Ｉ型コラ−ゲン溶液（１０μｇ／ｍｌ、コ−
ケン社）をコ−トして培養基質とし、次いで合成グリコ
サミノグリカン脂質誘導体（ＧＡＧ−ＰＥ）としてヘパ
リン−フォスファチジルエタノ−ルアミン（Ｈｅｐ−Ｐ
Ｅ）を１０μｇ／ｍｌの濃度でコ−トして固相化の担体
とした（Ｈｅｐ−ＰＥは、特開平４−８０２０１号公報
の実施例１に記載の方法に準じて調製した）。対照実験
として合成グリコサミノグリカン脂質誘導体をコ−トし
ないウェルも用意した。
【００１３】ｈＨＧＦの固相化：リコンビナントｈＨＧ
Ｆ（特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に準じ
て調製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるよう１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）含有の１０ｍＭリン酸緩衝−
生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ（−））にて調製し、
上記担体中に添加した。４℃にて６時間反応後、溶液を
除き、担体をＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。比較実験
として担体をさらに１ＭＮａＣｌで２回洗浄したウェル
も用意した。
Ｆ（特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に準じ
て調製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるよう１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）含有の１０ｍＭリン酸緩衝−
生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ（−））にて調製し、
上記担体中に添加した。４℃にて６時間反応後、溶液を
除き、担体をＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。比較実験
として担体をさらに１ＭＮａＣｌで２回洗浄したウェル
も用意した。
【００１４】細胞の調製：セグレン（Ｓｅｇｌｅｎ）の
方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ｖｏｌ１３，ｐ２９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６））に従い、ウィスタ
−系雄ラット（体重２００ｇ）より、０．０５％コラゲ
ナ−ゼ（タイプＩ，シグマ社）を用いて肝実質細胞を単
離した。この肝実質細胞を、上記担体及びｈＨＧＦをコ
−トしたマルチウェル プラスチック ディッシュ（コ
−ニング社）に２．５×１０4個／０．２５ｍｌ／ｃｍ2
の濃度でまき込み、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７
℃で単層培養した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４，９３７−９４６（１９７
８））。培養培地としては５％牛胎児血清（ＦＣＳ，フ
ィルトロン社）、１０-8Ｍインスリン、１０-8Ｍデキサ
メサゾン及び６０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した
ウィリアムスＥ（ＷＥ）培地（フロ−ラボラトリ−ズ
社、以下「基本培地」と略す）を使用した。
方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ｖｏｌ１３，ｐ２９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６））に従い、ウィスタ
−系雄ラット（体重２００ｇ）より、０．０５％コラゲ
ナ−ゼ（タイプＩ，シグマ社）を用いて肝実質細胞を単
離した。この肝実質細胞を、上記担体及びｈＨＧＦをコ
−トしたマルチウェル プラスチック ディッシュ（コ
−ニング社）に２．５×１０4個／０．２５ｍｌ／ｃｍ2
の濃度でまき込み、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７
℃で単層培養した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４，９３７−９４６（１９７
８））。培養培地としては５％牛胎児血清（ＦＣＳ，フ
ィルトロン社）、１０-8Ｍインスリン、１０-8Ｍデキサ
メサゾン及び６０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した
ウィリアムスＥ（ＷＥ）培地（フロ−ラボラトリ−ズ
社、以下「基本培地」と略す）を使用した。
【００１５】細胞増殖誘導活性の測定：培養開始２時間
後に新たな基本培地に交換し、さらに１８時間後に牛胎
児血清を含まないＷＥ培地（１０-7Ｍインスリン及び６
０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有）に交換した。培養
開始２８時間後にウェル当り１．２５μＣｉの［メチル
3Ｈ］チミジン（アマシャム社）を添加し、必要に応じ
て１０μｇ／ｍｌのアフィジコリン（シグマ社）を加え
た。２４時間後、細胞を１ｍｌの冷１０％トリクロロ酢
酸で１−２時間固定し、９５％エタノ−ルで３回洗浄
後、１ＭＮａＯＨで溶解した。中和後の細胞溶解液にシ
ンチレ−タ−を加え、よく混合後、液体シンチレ−ショ
ンカウンタ−にて細胞中に取り込まれた放射活性を測定
した。複製ＤＮＡ合成値は、各放射活性カウントからア
フィジコリン存在下のカウントを差し引いて算出した。
コントロ−ル群として、各試料にＧＡＧ−ＰＥを添加し
なかった場合の放射活性を求め、その値に対する比で結
果を示した（図１）。また、比較実験として、ｈＨＧＦ
の代わりにグリコサミノグリカンに親和性を持たない上
皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて、同様の実験を行った。
図１に結果を示す。縦軸は各試料のＤＮＡ合成誘導活
性を、ＧＡＧ−ＰＥを使用しなかったコントロ−ル群の
ＤＮＡ合成誘導活性に対する比（％）で示してある。培
養基質にＨｅｐ−ＰＥを用いた場合、細胞まき込み以前
に添加されたｈＨＧＦが効果的に固相化され、培地交換
後も肝実質細胞のＤＮＡ合成を刺激し得ることがわか
る。すなわち、コントロ−ルに比べて６６％の増強を認
めた（ａ）。また、Ｈｅｐ−ＰＥ上の肝実質細胞に、従
来のようにｈＨＧＦを溶液として後添加してもコントロ
−ルに比べ約２０％のＤＮＡ合成増強が見られた
（ｂ）。固相化したｈＨＧＦを１ＭＮａＣｌで洗浄した
場合、ＤＮＡ合成増強は、６６％から３３％へと減少し
た（ｃ）。これは、１ＭＮａＣｌの洗浄によって、固相
化していたｈＨＧＦの一部が外れたためと解釈される。
ヘパリン結合能を持たないＥＧＦでは、ＧＡＧ−ＰＥの
有無によって、全く差が認められなかった（ｄおよび
ｅ）。このことは、ｈＨＧＦが予想通りグリコサミノグ
リカンとの結合性によってＧＡＧ−ＰＥ上に結合し、培
養基質上に固相化されることを示唆する。
後に新たな基本培地に交換し、さらに１８時間後に牛胎
児血清を含まないＷＥ培地（１０-7Ｍインスリン及び６
０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有）に交換した。培養
開始２８時間後にウェル当り１．２５μＣｉの［メチル
3Ｈ］チミジン（アマシャム社）を添加し、必要に応じ
て１０μｇ／ｍｌのアフィジコリン（シグマ社）を加え
た。２４時間後、細胞を１ｍｌの冷１０％トリクロロ酢
酸で１−２時間固定し、９５％エタノ−ルで３回洗浄
後、１ＭＮａＯＨで溶解した。中和後の細胞溶解液にシ
ンチレ−タ−を加え、よく混合後、液体シンチレ−ショ
ンカウンタ−にて細胞中に取り込まれた放射活性を測定
した。複製ＤＮＡ合成値は、各放射活性カウントからア
フィジコリン存在下のカウントを差し引いて算出した。
コントロ−ル群として、各試料にＧＡＧ−ＰＥを添加し
なかった場合の放射活性を求め、その値に対する比で結
果を示した（図１）。また、比較実験として、ｈＨＧＦ
の代わりにグリコサミノグリカンに親和性を持たない上
皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて、同様の実験を行った。
図１に結果を示す。縦軸は各試料のＤＮＡ合成誘導活
性を、ＧＡＧ−ＰＥを使用しなかったコントロ−ル群の
ＤＮＡ合成誘導活性に対する比（％）で示してある。培
養基質にＨｅｐ−ＰＥを用いた場合、細胞まき込み以前
に添加されたｈＨＧＦが効果的に固相化され、培地交換
後も肝実質細胞のＤＮＡ合成を刺激し得ることがわか
る。すなわち、コントロ−ルに比べて６６％の増強を認
めた（ａ）。また、Ｈｅｐ−ＰＥ上の肝実質細胞に、従
来のようにｈＨＧＦを溶液として後添加してもコントロ
−ルに比べ約２０％のＤＮＡ合成増強が見られた
（ｂ）。固相化したｈＨＧＦを１ＭＮａＣｌで洗浄した
場合、ＤＮＡ合成増強は、６６％から３３％へと減少し
た（ｃ）。これは、１ＭＮａＣｌの洗浄によって、固相
化していたｈＨＧＦの一部が外れたためと解釈される。
ヘパリン結合能を持たないＥＧＦでは、ＧＡＧ−ＰＥの
有無によって、全く差が認められなかった（ｄおよび
ｅ）。このことは、ｈＨＧＦが予想通りグリコサミノグ
リカンとの結合性によってＧＡＧ−ＰＥ上に結合し、培
養基質上に固相化されることを示唆する。
【００１６】以上の結果から、肝実質細胞増殖因子とグ
リコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体とを組
み合わせることにより、効果的に該増殖因子が固相化さ
れ、固相化増殖因子は生理作用を発揮し得ることがわか
る。
リコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体とを組
み合わせることにより、効果的に該増殖因子が固相化さ
れ、固相化増殖因子は生理作用を発揮し得ることがわか
る。
【００１７】
【発明の効果】従来、肝実質細胞増殖因子を利用する上
で、かかる蛋白の活性を保持した状態での固相化方法も
しくは固相化該増殖因子の利用については知られていな
かった。本発明が示すように、肝実質細胞増殖因子を、
適当なグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導
体を用いることによって活性を保持したまま固相化する
ことが可能であり、その結果、この固相化増殖因子をｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで利用できるように
なった。本発明を基に肝実質細胞増殖因子の固相化担体
を工夫することにより、医療分野での広範な利用が期待
でき、さらに生体への投与における際に徐放効果・集積
効果も期待できる。
で、かかる蛋白の活性を保持した状態での固相化方法も
しくは固相化該増殖因子の利用については知られていな
かった。本発明が示すように、肝実質細胞増殖因子を、
適当なグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導
体を用いることによって活性を保持したまま固相化する
ことが可能であり、その結果、この固相化増殖因子をｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで利用できるように
なった。本発明を基に肝実質細胞増殖因子の固相化担体
を工夫することにより、医療分野での広範な利用が期待
でき、さらに生体への投与における際に徐放効果・集積
効果も期待できる。
【図１】合成グリコサミノグリカン脂質誘導体（Ｈｅｐ
−ＰＥ）によるｈＨＧＦの固相化を表す図面である。
−ＰＥ）によるｈＨＧＦの固相化を表す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｂ 37/08 Ｚ 7329−4Ｃ 37/10 7329−4Ｃ
Claims (7)
- 【請求項１】 グリコサミノグリカン、グルカンまたは
その誘導体に肝実質細胞増殖因子を結合してなることを
特徴とする固相化された肝実質細胞増殖剤。 - 【請求項２】 グリコサミノグリカンまたはグルカン
が、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸および
コンドロイチン硫酸から選ばれることを特徴とする請求
項１記載の肝実質細胞増殖剤。 - 【請求項３】 グリコサミノグリカンまたはグルカンの
誘導体を使用することを特徴とする請求項１記載の肝実
質細胞増殖剤。 - 【請求項４】 誘導体が、グリコサミノグリカンまたは
グルカンと蛋白質またはリン脂質とを結合したものであ
ることを特徴とする請求項３記載の肝実質細胞増殖剤。 - 【請求項５】 誘導体が、グリコサミノグリカンまたは
グルカンとリン脂質とを結合したものであることを特徴
とする請求項４記載の肝実質細胞増殖剤。 - 【請求項６】 高分子基材または細胞接着性蛋白質上に
グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体が結
合されていることを特徴とする請求項１記載の肝実質細
胞増殖剤。 - 【請求項７】 細胞接着性蛋白質が、コラーゲン、エラ
スチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン
およびカドヘリンから選ばれることを特徴とする請求項
６記載の肝実質細胞増殖剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25013192A JP3859732B2 (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 固相化された肝実質細胞増殖剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25013192A JP3859732B2 (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 固相化された肝実質細胞増殖剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06145065A true JPH06145065A (ja) | 1994-05-24 |
| JP3859732B2 JP3859732B2 (ja) | 2006-12-20 |
Family
ID=17203294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25013192A Expired - Lifetime JP3859732B2 (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 固相化された肝実質細胞増殖剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3859732B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995007097A1 (en) * | 1993-09-08 | 1995-03-16 | Genentech, Inc. | Inhibition of heparin-binding |
| US5654404A (en) * | 1992-09-16 | 1997-08-05 | Genentech, Inc. | Protection against liver damage by HGF |
| JP2005168654A (ja) * | 2003-12-09 | 2005-06-30 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | 増殖因子結合低分子ヘパリン修飾体 |
| JP2008120835A (ja) * | 2008-02-18 | 2008-05-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 角膜障害症治癒促進剤 |
| JP2012233204A (ja) * | 2005-06-28 | 2012-11-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 酵素活性の測定方法 |
-
1992
- 1992-09-18 JP JP25013192A patent/JP3859732B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5654404A (en) * | 1992-09-16 | 1997-08-05 | Genentech, Inc. | Protection against liver damage by HGF |
| WO1995007097A1 (en) * | 1993-09-08 | 1995-03-16 | Genentech, Inc. | Inhibition of heparin-binding |
| US5464815A (en) * | 1993-09-08 | 1995-11-07 | Genentech, Inc. | Inhibition of heparin-binding |
| US5849689A (en) * | 1993-09-08 | 1998-12-15 | Genentech, Inc. | Method of extending the plasma half-life of deletion variants of hepatocyte growth factor |
| US5851989A (en) * | 1993-09-08 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of extending the plasma half-life of vascular endothelial cell growth factor |
| JP2005168654A (ja) * | 2003-12-09 | 2005-06-30 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | 増殖因子結合低分子ヘパリン修飾体 |
| JP2012233204A (ja) * | 2005-06-28 | 2012-11-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 酵素活性の測定方法 |
| JP5279269B2 (ja) * | 2005-06-28 | 2013-09-04 | 生化学工業株式会社 | 酵素活性の測定方法 |
| US9150902B2 (en) | 2005-06-28 | 2015-10-06 | Seikagaku Corporation | Method for determination of N-deacetylase/N-sulfotransferase activity |
| JP2008120835A (ja) * | 2008-02-18 | 2008-05-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 角膜障害症治癒促進剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3859732B2 (ja) | 2006-12-20 |
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