JPH06145198A - 大豆トリプシンインヒビターの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明者らは、大豆トリプシンインヒビターを
高収率で且つ高純度で工業的に生産可能な製造方法を目
的とした。 【構成】大豆ホエーをｐＨ５．０〜８．５に調整し，５
０°Ｃ以下の温度において，分画分子量１００００〜４
００００の限外濾過膜を用いて，濃縮および透析濾過
し，粗蛋白含有量を８０％以上とした濃縮洗浄液を得る
第１工程と，該濃縮洗浄液を陰イオン交換体に添加し，
トリプシンインヒビター活性を吸着せしめ，塩濃度０．
１０Ｍ以下にて不純物を洗浄除去したのち塩濃度を０．
１Ｍ以上にあげて活性画分を得る第２工程を含む大豆ト
リプシンインヒビターの製造方法。 【効果】本発明により、大豆トリプシンインヒビターを
高収率で且つ高純度で工業的に生産可能な製造方法が可
能になったものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は大豆ホエーから高純度の
トリプシンインヒビターを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】大豆に含まれる生理活性物質のなかで
も，トリプシンインヒビターは古くより，研究され、既
に，Ｋｕｎｉｔｚ型及びＢＢＩ型の２種の存在が明らか
になっている。又、その用途についても、抗癌作用、抗
炎症作用（特開昭６２─１７７４４１号公報）等の生理
機能、魚肉摺身のゲル強化等の食品加工、アフィニティ
ークロマトグラフィー用担体などが知られている。一般
に、大豆トリプシンインヒビターの製造方法は、実験室
レベルでの精製方法として、溶剤分画、塩析、吸着、イ
オン交換、ハイドロフォービッククロマトグラフィー，
逆相クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル濾過等の組み合わせにより種々の精製法が
提案されているが、その反面、工業的に実施可能な高純
度大豆トリプシンインヒビターの製造方法は知られてい
ない。大豆に存在するトリプシンインヒビターは分子量
約２００００のＫｕｎｉｔｚ型及び分子量約８０００の
ＢＢＩ型が主体であるがこれらはアルブミン類に属する
蛋白性トリプシンインヒビターであり、大豆を水抽出
し、濾過した後、酸を加えてグロブリン蛋白質を等電点
沈殿させて得たホエー画分には大量のトリプシン阻害活
性が含まれる。一方，大豆ホエーは一般に糖類，塩類及
び蛋白質を含有しているが，固形物の含有量は数％程度
である上，固形物中の蛋白質は２０％程度と比較的低
い。従って，大豆ホエー蛋白の有効利用において，その
濃縮，糖や塩類の除去が必須工程であり，とりわけ，膜
濃縮は有効な手段であると考えられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】しかしながら、膜濃
縮法による大豆トリプシンインヒビターの分離精製に関
する検討は少なく，また，酸沈ホエーを用いたＪ．Ａｇ
ｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３５，９６７−９７１
（１９８７）等の報告においても、純度や菌汚染の点で
問題が残されている。本発明者らは、大豆トリプシンイ
ンヒビターを高収率で且つ高純度で工業的に生産可能な
製造方法を目的とした。

【０００４】

【発明の構成】本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭
意研究した結果、大豆ホエーを限外濾過濃縮及び透析濾
過する工程とそれに引き続いて陰イオン交換体に活性を
吸着せしめたのち溶出させることによって、高い活性回
収率で高純度の大豆トリプシンインヒビターを得ること
が可能であることを見出して、本発明を完成するに到っ
た。

【０００５】即ち、本発明は、大豆ホエーをｐＨ５．０
〜８．５に調整し，５０°Ｃ以下の温度において，分画
分子量１００００〜４００００の限外濾過膜を用いて，
濃縮および透析濾過し，粗蛋白含有量を８０％以上とし
た濃縮洗浄液を得る第１工程と，該濃縮洗浄液を陰イオ
ン交換体に添加し，トリプシンインヒビター活性を吸着
せしめ，塩濃度０．１０Ｍ以下にて不純物を洗浄除去し
たのち塩濃度を０．１Ｍ以上にあげて活性画分を得る第
２工程を含む大豆トリプシンインヒビターの製造方法、
である。

【０００６】本発明の第１工程は、大豆製品製造工程に
おいて得られる大豆ホエーをトリプシンインヒビター活
性が安定で，且つ大豆ホエー成分の不溶化が起きないｐ
Ｈ並びに温度条件に調製し、限外濾過膜にて濾過並びに
透析濾過することによって蛋白成分特に大豆トリプシン
インヒビター活性成分を濃縮すると共に、低分子成分、
とりわけ、糖類や塩類を除去することにあり、本発明の
第２工程は、更に、陰イオン交換基を結合した多糖類製
担体を充填し緩衝液にて平衡化したカラムを用い、第１
工程にて得た濃縮洗浄した大豆ホエーを添加したのち、
塩濃度を順次上昇させて、不純物を除去し、次いでトリ
プシンインヒビター活性画分を回収することにあり、本
発明はこれら第１工程及び第２工程を含むことによって
高純度大豆トリプシンインヒビターの製造が可能となる
ものである。

【０００７】本発明に用いる大豆ホエーは，丸大豆又は
脱脂大豆を水または温水にて抽出して，豆乳を作成し，
酸または塩を添加することによって蛋白質を凝固または
沈澱させて得られるもので、工業的には分離大豆蛋白等
の製造工程中に得られるものを用いることができる。

【０００８】第１工程に大豆ホエーを供与する当たり，
その前処理として，殺菌及び除粒子工程を加えることが
できる。例えば，口径０．１〜０．４５マイクロｍの濾
過膜処理を用いることが出来るが，第１工程完了後の濃
縮洗浄液においても同様の濾過膜処理を行うことも出来
る。工業的生産における連続運転を可能にする目的にお
いて，装置の殺菌洗浄が必要であり，特に後述の第１工
程における限外濾過膜は耐熱性や耐薬品性が要求され
る。本発明においてこれら限外濾過膜はポリスルホン，
ポリエーテルスルホン，等の素材で作られた膜を用いる
ことが可能である。

【０００９】本発明の第１工程において、大豆ホエーを
限外濾過膜処理する。大豆ホエーはｐＨ５．０〜８．
５，好ましくは５．５〜８．０の領域に調整することが
適当である。大豆ホエーの濁り成分の主体がＫｕｎｉｔ
ｚ型トリプシンインヒビターであり，その変性に伴い濁
り成分を形成すると共にその活性を失うこと及び，運転
温度の上昇に伴い，変性が進行することが判明し，同時
に大豆ホエーの膜濃縮時の液性においてもｐＨ５以上、
ｐＨ８．５以下の範囲で大豆トリプシンインヒビターが
安定で且つ不溶物の形成が少なく，更には，ホエー成分
の変性による着色反応を抑制できることができるからで
ある。

【００１０】大豆ホエーを限外濾過膜処理する温度は５
０°Ｃ以下、好ましくは３０°Ｃ以下が適当である。通
常、常温付近で行うことができる。

【００１１】本発明に用いる限外濾過膜は分画分子量１
００００〜４００００が適当である。本発明における第
１工程で使用する限外濾過膜の分画分子量としては実質
的に蛋白成分を保持可能であれば用いることが可能であ
る。大豆トリプシンインヒビターの分子量がＫｕｎｉｔ
ｚ型分子量約２００００，ＢＢＩ型分子量約８０００と
報告があるが、本発明者の検討によればそれらは会合体
を形成していると考えられ，分画分子量が１００００〜
４００００，好ましくは２００００〜３００００が使用
可能である。

【００１２】本第１工程においては濃縮倍率を１０倍以
上とした上で，適宜加水して，透析濾過し，濃縮物中固
形物に占める粗蛋白質含有量が８０％以上になった時点
をもって工程完了とすることができる。第２工程処理す
るに当たり粗蛋白質含有量が８０％以上が効率的だから
である。

【００１３】又、本発明に用いる限外濾過膜の形状は中
空糸型，平膜型，管状型，スパイラル型等が採用可能で
あるが，本発明においては，サニタリー性が要求され，
濃縮倍率が大きく，溶質による膜汚染が透過流束の経時
低下を起こす本用途に於いては，構成要素が少なく，構
造が簡単で保持容量も少なく，特に逆透過洗浄が可能で
ある点で中空糸が適当である。又、限外濾過膜の内径は
一般的には運転時の圧力損失及び入口圧力を考慮して決
定するが，本用途に於いては，膜透過流束の操作圧力依
存性は１〜１．５ｋｆｇ／平方ｃｍで略飽和して，それ
以上の圧力は殆ど透過流束の増加に寄与せず，効果が少
ない。

【００１４】従って，膜モジュールの出口圧力を１〜
１．５ｋｆｇ／平方ｃｍに保ち，入口圧力は３ｋｆｇ／
平方ｃｍ程度以下，即ち，膜モジュール内の流動圧損を
２ｋｆｇ／平方ｃｍ以下に抑えることが好ましい。流動
圧損は，層流領域においては，流量に比例し，中空糸内
径の４乗に逆比例する。従って，流動圧損を少なくする
には流量を少なくするか，中空糸内径を大きくするかで
あるが，膜の透過流束は膜面線速と正の相関関係にあ
り，被処理液の特性による限度が存在する。

【００１５】本発明に於いては１ｍ／ｓｅｃ以上の膜面
線速を保持することが好ましく，従って，流動圧損を２
ｋｆｇ／平方ｃｍ程度以下に抑制する為には，中空糸内
径を大きくする事が好ましい。本発明において、中空糸
内径を０．８ｍｍ以上，好ましくは１ｍｍ以上とするこ
とによって，出口圧力１ｋｆｇ／平方ｃｍ以上，且つ，
入口圧力３ｋｆｇ／平方ｃｍ以下で大豆ホエーを２０倍
まで濃縮することが可能である。尚，中空糸内径を必要
以上に大きくすると，必要な膜面線速を保持する為に流
量を内径の２乗に比例して増加させる必要が生じるし，
モジュールの容積も内径に比例して増加するので，１．
５ｍｍ以上は不経済である。

【００１６】本発明の第２工程におけるイオン交換クロ
マトグラフィには陰イオン交換基を結合した担体を用い
ることができる。陰イオン交換基としてはジエチルアミ
ノエチル基等の３級アミン誘導体や４級アミン誘導体が
適当である。担体としては，蛋白質に対して低吸着であ
る親水性多糖類や合成ポリマーが使用可能であるが，親
水性多糖類が吸着の安定性において優れている。多糖類
系担体としては，セルロース，デキストラン，アガロー
スキチン及びそれらの修飾化合物並びに架橋を施した化
合物が利用可能であり，合成ポリマーにおいてはポリス
チレン，ジビニルベンゼン，ポリアクリルアミド等から
適宜選択可能である。

【００１７】イオン交換クロマトグラフィーにおけるカ
ラム容量及び形状においては，濃縮大豆ホエー溶液の添
加量に応じて適宜設定可能であるが，通常，添加濃縮大
豆ホエー溶液蛋白１０〜１００ｍｇあたり１ミリリット
ルの担体量が用いられる。また，通液速度は１０〜３０
０ｃｍ／ｓが用いられるが，濃縮大豆ホエー溶液の添加
においてはその粘度を考慮すれば，１０〜１００ｃｍ／
ｓが好ましい。カラム耐圧においてはそれに充填する担
体の強度に対応して選択することが出来，例えば，多糖
類系の担体を用いる場合には３ｋｇ／平方ｃｍ以下が好
ましい。

【００１８】用いる緩衝液は中性領域を中心として緩衝
能力を保持するものであれば使用可能である。ｐＨ範囲
としては６〜８，濃度は０．１０Ｍ以下であれば良く，
例えば，燐酸及びその塩, クエン酸及びその塩, マレイ
ン酸及びその塩, ピロ燐酸及びその塩，炭酸及びその
塩，グリシン，トリスアミノヒドロキシアミノメタン並
びにそれらの酸及び塩の組み合わせが適宜採用できる。
また，緩衝液に添加する塩は，塩化ナトリウム，塩化カ
リウム，硫酸アンモニウム，燐酸ナトリウム等を単品ま
たは組み合わせて用いることができる。

【００１９】第２工程を例示して具体的に説明する。ま
ず、第１工程にて得た濃縮洗浄ホエーを適宜ｐＨ調整
し，カラムに添加する。この際，濃縮洗浄ホエーは必要
に応じて，遠心分離や膜濾過により，不溶化した成分の
除去や除菌を行う前処理を施すこともできる。次に，濃
度が０．１Ｍ以下になるように塩を添加した緩衝液でカ
ラムを洗浄する。本工程により，大豆ホエー画分に含有
される分子量約３００００の不純蛋白を溶出することが
でき，また，ＵＶ領域に吸収を持つ不純成分も溶出でき
る。

【００２０】大豆トリプシンインヒビター活性の回収は
塩濃度を更に増加させて０．１５Ｍ以上で行うが，その
増加方式としては例えば，大豆トリプシンインヒビター
活性を保持する各成分を分離して回収する場合には連続
濃度勾配を用いることができ，一括して回収する場合に
おいては段階的濃度増加を用いることができる。

【００２１】本発明において、陰イオン交換体より得ら
れる活性画分の蛋白質当たりの大豆トリプシンインヒビ
ター含有率は８０％以上が適当である。

【００２２】回収した大豆トリプシンインヒビターは用
途に応じ，液状または乾燥して用いうるが，更に，限外
濾過による濃縮並びに脱塩工程や膜濾過による除菌等の
工程を組み合わせて用いることも出来る。尚、カラムの
殺菌洗浄再生においては，カラム担体に依存するもので
ある。通常，多糖類系担体においては，アルカリ溶液，
アルカリを含有するところの温水等が用いられるが，用
途に応じて設定することができる。

【００２３】尚、本発明において大豆トリプシンインヒ
ビターの活性測定はＫａｋａｄｅらの方法に準じて行
い，活性単位は１分間に１マイクロモルのｐ−ｎｉｔｒ
ｏａｎｉｌｉｎｅの生成するトリプシン活性を１トリプ
シン単位とし，２単位のトリプシン活性を５０％阻害す
る量を１トリプシン阻害単位（ｕｎｉｔ）とした。ま
た，蛋白量の測定はミクロケルダール法及び２８０ｎｍ
における吸光度を用いた。純度検定においては，ＳＤＳ
─電気泳動法及びＴＳＫ３０００ＰＷＸＬカラムを用い
たゲル濾過法を用いた。

【００２４】

【実施例】以下実施例により本発明の実施態様を説明す
る。 実施例１ 大豆ホエー２１ｋｇ（総トリプシンインヒビター活性３
１２００ｕｎｉｔ，粗蛋白含有量１６．１％（乾物当た
り））を中空糸限外濾過膜モジュール（ダイセル化学株
式会社製 ＨＳ３（分画分子量２００００，糸内径０．
８ｍｍ，面積0.２８平方ｍ））を用いて，ｐＨ６．０，
温度２０°Ｃで２０倍に濃縮し，次いで，３倍希釈し３
倍濃縮する工程を３回繰り返して，濃縮洗浄ホエー１ｋ
ｇを得た。２４８００ｕｎｉｔの活性が回収され，活性
回収率は８０％であった。粗蛋白含有量９４．８％〔乾
物当たり〕であった。透過流束は２０倍濃縮時で１０リ
ットル／平方ｍ・ h ，平均流束は２０リットル／平方ｍ
・ h であった。濃縮洗浄ホエー９００ｇは８０００ｒｐ
ｍ１０分間遠心し，得た上澄み液に２０％苛性ソーダ溶
液を加えて，ｐＨを７．２に調節し，１０ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ７．２にて平衡化したファルマシア社
製Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗイオン
交換体５００ミリリットルを充填した内径５ｃｍ高さ３
０ｃｍのカラムに２５ｃｍ／ｈｒで添加した。サンプル
添加終了後に線速１００ｃｍ／ｈｒで最初に１５００ミ
リリットルの０．０７５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７．２を通液し，ついで，１５００
ミリリットルの０．３０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７．０を通液し，更に１５００ミリ
リットルの０．５０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ７．２を通液した。蛋白質の溶出状態を
紫外吸収度を測定することによりモニターした。トリプ
シンインヒビター活性を含有する蛋白のピークは０．３
０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．２を５００ミリリットル添加した時点から溶出さ
れ，活性画分として９００ミリリットルを採取した。得
られた活性は１９０００ｕｎｉｔで，回収率はクロマト
工程においては８５．１％，大豆ホエーからの回収率は
６７．７％であった。ＳＤＳ電気泳動による純度分析で
はＫｕｎｉｔｚ型及びＢＢＩ型を併せて，蛋白質中の９
０％であった。

【００２５】実施例２ 実施例１で用いたと同様の大豆ホエー２５ｋｇをｐＨ
６．０に調整し，中空糸濾過膜モジュール（ダイセル化
学株式会社製 ＨＳ５（孔径０．４０マイクロｍ，糸内
径１．５ｍｍ，面積０．２平方ｍ））を用いて，濾過滅
菌し，その濾液２１．２ｋｇ（総トリプシンインヒビタ
ー活性４５６００ｕｎｉｔ，粗蛋白含有量１５．５％
〔乾物当たり〕）を中空糸限外濾過膜モジュール（ダイ
セル化学株式会社製 ＨＳ４（分画分子量２００００，
糸内径１．０ｍｍ，面積０．２８ 平方ｍ））を用い
て，ｐＨ６．０，温度摂氏２０度で２０倍に濃縮し，次
いで，３倍希釈し３倍濃縮する工程を３回繰り返して，
濃縮洗浄ホエー１ｋｇを得た。２４０００ｕｎｉｔの活
性が回収され，活性回収率は５２．６％であった。粗蛋
白含有量８７．８％（乾物当たり）であった。

【００２６】実施例３ 実施例１と同様にして得た濃縮洗浄ホエー２００ミリリ
ットルを８０００ｒｐｍ１０分間遠心し，得た上澄み液
（活性５１００ｕｎｉｔ含有）に苛性ソーダをくわえ，
ｐＨを７．０に調節し，１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．０にて平衡化したファルマシア社製Ｑ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗイオン交換体１００
ミリリットルを充填した内径２．２ｃｍ高さ２５ｃｍの
カラムに８０ｃｍ／ｈｒで添加した。サンプル添加終了
後に線速１００ｃｍ／ｈｒで最初に３００ミリリットル
の０．０５０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．０を通液し，ついで，３００ミリリットル
の０．０５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７．０と３００ミリリットルの０．２５Ｍの食塩
を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０により
直線濃度勾配を作成して通液し，更に１００ミリリット
ルの０．５０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．０を通液した。蛋白質の溶出状態は紫外吸
収度を測定することによりモニターした。トリプシンイ
ンヒビター活性を含有する蛋白のピーク２００ミリリッ
トルを採取した。得られた活性は３４００ｕｎｉｔで回
収率は６７％であり，ＳＤＳ電気泳動による純度分析で
はＫｕｎｉｔｚ型及びＢＢＩ型を併せて，蛋白質中の９
５％であった。

【００２７】実施例４ 実施例１と同様にして得た濃縮洗浄ホエー２００ミリリ
ットルを８０００ｒｐｍ１０分間遠心し，得た上澄み液
１９０ミリリットル（活性６６１０ｕｎｉｔ含有）に苛
性ソーダを加え，ｐＨを７．０に調節し，１０ｍＭ燐酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０にて平衡化したファルマシ
ア社製ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗイオン交換体１００ミリリットルを充填した内径
２．２ｃｍ高さ２５ｃｍのカラムに４０ｃｍ／ｈｒで添
加した。サンプル添加終了後に線速１００ｃｍ／ｈｒで
最初に３００ミリリットルの０．０５０Ｍの食塩を含む
１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を通液し，つ
いで，３００ミリリットルの０．０５Ｍの食塩を含む１
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０と３００ミリリ
ットルの０．２５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ７．０により直線濃度勾配を作成して通液
し，更に１００ミリリットルの０．５０Ｍの食塩を含む
１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を通液した。
蛋白質の溶出状態は紫外吸収度を測定することによりモ
ニターした。トリプシンインヒビター活性を含有する蛋
白のピーク２００ミリリットルを採取した。得られた活
性は３８６０ｕｎｉｔで回収率は５８％であり，ＳＤＳ
電気泳動による純度分析ではＫｕｎｉｔｚ型及びＢＢＩ
型を併せて，蛋白質中の９５％であった。

【００２８】実施例５ 実施例１と同様にして得た濃縮洗浄ホエー２００ミリリ
ットルを８０００ｒｐｍ１０分間遠心し，得た上澄み液
１９０ミリリットル（活性５４００ｕｎｉｔ含有）に苛
性ソーダを加え，ｐＨを７．０に調節し，１０ｍＭ燐酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０にて平衡化した生化学工業
社製ＤＥＡＥ−ＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＤＥ型イオン交
換体１００ミリリットルを充填した内径２．２ｃｍ高さ
２５ｃｍのカラムに９０ｃｍ／ｈｒで添加した。サンプ
ル添加終了後に線速１１０ｃｍ／ｈｒで最初に３００ミ
リリットルの０．０５０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７．０を通液し，ついで，３００ミ
リリットルの０．０５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ７．０と３００ミリリットルの０．２
５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．０により直線濃度勾配を作成して通液し，更に１０
０ミリリットルの０．２５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を通液した。蛋白質の溶出
状態は紫外吸収度を測定することによりモニターした。
トリプシンインヒビター活性を含有する蛋白のピーク２
００ミリリットルを採取した。得られた活性は３５５０
ｕｎｉｔで回収率は６６％であり，ＳＤＳ電気泳動によ
る純度分析ではＫｕｎｉｔｚ型及びＢＢＩ型を併せて，
蛋白質中の９７％であった。

【００２９】実施例６ 実施例１と同様にして得た濃縮洗浄ホエー２００ミリリ
ットルを８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し，得た上澄み
液１９０ミリリットル（活性４５００ｕｎｉｔ含有）に
苛性ソーダをくわえ，ｐＨを７．０に調節し，１０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５にて平衡化したファル
マシア社製Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗイオン交換体１００ミリリットルを充填した内径２．
２ｃｍ、高さ２５ｃｍのカラムに４０ｃｍ／ｈｒで添加
した。サンプル添加終了後に線速６０ｃｍ／ｈｒで最初
に３００ミリリットルの０．０５０Ｍの食塩を含む１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を通液し，つい
で，３００ミリリットルの０．０５Ｍの食塩を含む１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０と３００ミリリッ
トルの０．２５Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ６．５により直線濃度勾配を作成して通液
し，更に１００ミリリットルの０．５０Ｍの食塩を含む
１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を通液した。
蛋白質の溶出状態は紫外吸収度を測定することにより
モニターした。トリプシンインヒビター活性を含有する
蛋白のピーク２００ミリリットルを採取した。 得られ
た活性は３４３０ｕｎｉｔで回収率は７６％であり，Ｓ
ＤＳ電気泳動による純度分析ではＫｕｎｉｔｚ型及びＢ
ＢＩ型を併せて，蛋白質中の８２％であった。

【００３０】実施例７ 濃縮洗浄ホエー２００ミリリットルは８０００ｒｐｍ１
０分間遠心し，得た上澄み液１９０ミリリットル（活性
４３９０ｕｎｉｔ含有）に２０％苛性ソーダ溶液を加え
て，ｐＨを７．０に調節し，１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．０にて平衡化したファルマシア社製Ｑ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗイオン交換体１
００ミリリットルを充填した内径２．２ｃｍ高さ２５ｃ
ｍのカラムに５０ｃｍ／ｈｒで添加した。サンプル添加
終了後に線速１００ｃｍ／ｈｒで最初に３００ミリリッ
トルの０．１０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７．０を通液し，ついで，３００ミリリット
ルの０．３０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．０を通液し，更に３００ミリリットルの
０．５０Ｍの食塩を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．０を通液した。得られた活性は３３８０ｕｎｉ
ｔで，回収率はクロマト工程においては７７％であっ
た。ＳＤＳ電気泳動による純度分析ではＫｕｎｉｔｚ型
及びＢＢＩ型を併せて，蛋白質中の９０％であった。

【００３１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明により、大
豆トリプシンインヒビターを高収率で且つ高純度で工業
的に生産可能な製造方法が可能になったものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 熊見和久 大阪府堺市浜寺南町２丁目140−１ (72)発明者 松本吉正 兵庫県揖保群御津町朝臣851

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大豆ホエーをｐＨ５．０〜８．５に調整
   し，５０°Ｃ以下の温度において，分画分子量１０００
   ０〜４００００の限外濾過膜を用いて，濃縮および透析
   濾過し，粗蛋白含有量を８０％以上とした濃縮洗浄液を
   得る第１工程と，該濃縮洗浄液を陰イオン交換体に添加
   し，トリプシンインヒビター活性を吸着せしめ，塩濃度
   ０．１０Ｍ以下にて不純物を洗浄除去したのち塩濃度を
   ０．１Ｍ以上にあげて活性画分を得る第２工程を含む大
   豆トリプシンインヒビターの製造方法。