JPH0614794A

JPH0614794A - 大豆蛋白質起源のペプチドからなる免疫系賦活組成物

Info

Publication number: JPH0614794A
Application number: JP5066201A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yoshikawa; 正明吉川; Hideo Chiba; 英雄千葉
Original assignee: Honen Corp
Current assignee: Honen Corp
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1993-03-02
Publication date: 1994-01-25
Anticipated expiration: 2012-10-08
Also published as: JP2660379B2

Abstract

(57)【要約】【目的】大豆蛋白質起源のペプチドからなる免疫系賦
活組成物を提供する。【構成】次式Ｉ： His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg （式
中、His はヒスチジン、Cys はシステイン、Gln はグル
タミン、Arg はアルギニンおよびPro はプロリンを表
す。）で表されるペプチドまたはその塩を有効成分とす
る免疫系賦活組成物、及び該ペプチドの酵素加水分解法
による製造法。【効果】上記ペプチドは好中球の集積能、活性酸素の
産生能及び腫瘍壊死因子の産生能を高める作用並びに制
癌作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大豆蛋白質起源の生理
活性ペプチドを有効成分とする医薬組成物に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】食品蛋白質起源のペプチドには多様な生
理活性を有するものがあることが知られており、食品起
源で生体に対する安全性が期待できることから種々の研
究がなされている。このうちの一つとして貪食作用（フ
ァゴサイトシス）が知られている。生体内に細菌等の外
的異物が侵入してきた場合、マクロファージや好中球に
よる異物の貪食作用は生体防御の初発反応として重要で
ある。このファゴサイトシスを活性化するペプチドとし
ては、生体内で免疫グロブリンから派生するタフトシン
（ Tuftsin：Thr-Lys-Pro-Arg ）およびリギン（ Rigi
n：Gly-Gln-Pro-Arg ）が知られている。本発明者は先
に、これらに類似の構造を持つ大豆グリシニンＡ_1aサブ
ユニットに含まれているペプチド：Gln-Arg-Pro-Arg が
マクロファージの貪食能を高めることについてその合成
ペプチドを用いて証明し、新規なペプチドとして報告し
た（特開平1-249800号公報）。

【０００３】しかして、食品蛋白質起源の生理活性ペプ
チドは、内因性生理活性ペプチドと比較して意外な構造
−活性相関を示す物質が多いことおよび複数の機能を有
するペプチドが多いことから、ペプチドの構造からその
有する機能については予測できないとされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは食品蛋白
質起源のペプチドについて更に研究を進めた結果、マク
ロファージの貪食能を高める作用を有する他に更に優れ
た生理活性を有するペプチドを見いだして本発明を完成
した。したがって、本発明は該ペプチドの新規な医薬用
途を提供せんとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、次式Ｉ： His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg （Ｉ）（式中、His はヒスチジン、Cys はシステイン、Gln は
グルタミン、Arg はアルギニンおよびPro はプロリンを
表す。）で表されるペプチドまたはその薬学上許容され
る塩を有効成分とする免疫系賦活組成物に関するもので
ある。本発明者らは、大豆タンパク質の酵素分解によっ
て得られた上記式Ｉで示されるペプチドが好中球の集
積、活性酸素の産生および腫瘍壊死因子の産生を高める
とともに、腹水ガンに対する抑制作用を有することを見
いだした。

【０００６】本発明の有効成分であるペプチド：His-Cy
s-Gln-Arg-Pro-Arg （以下、ＨＣＱＲＰＲと略記す
る。）は、従来知られているペプチド化学合成法によっ
て合成することができる。この他、大豆蛋白質などの上
記式Ｉのアミノ酸配列を含む蛋白質より酵素加水分解に
よって得ることもできると考えられるが、その方法につ
いては知られていなかった。本発明者らは酵素加水分解
法による新規な製法を見いだした。それ故、本発明は上
記ペプチドの新規な製造方法をも提供するものである。
本発明の酵素加水分解法は、大豆蛋白質をトリプシンで
消化し、得られた消化物をオクタデシルシリル（ＯＤ
Ｓ）カラムおよびフェニルカラムによる高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分画することを特徴
とする。

【０００７】

【製造例】次に本発明の製造例を示すが、本発明はこれ
らの例に限定されるものではない。

【０００８】製造例１：His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg の化
学合成２ｇのBoc-Arg(Tos)- 樹脂（0.3meq／ｇ，バイオサーチ
社製）をＳＡＭ２（バイオサーチ社製）ペプチド合成装
置の反応容器にセットし、デブロック液（45％トリフル
オロ酢酸、 2.5％アニソール、２％エタンジチオール、
50.5％ジクロロメタン）中で25分間攪拌してBoc 基を除
去した。この樹脂をジクロロメタン、10％ジイソプロピ
ルエチルアミンを含むジクロロメタンおよびジクロロメ
タンにて順次洗浄した後、10mlの 0.4Ｍ Boc-Proのジメ
チルフォルムアミド溶液と10mlのジイソプロピルカルボ
ジイミドの塩化メチレン溶液を加え室温で２時間攪拌し
てBoc-Proとカップルさせ、Boc-Pro-Arg(Tos)−樹脂を
得た。以下同様にBoc-Arg(Tos)、Boc-Gln 、Boc-Cys(MB
zl) およびBoc-His(Tos)を順次カップルさせ、Boc-His
(Tos)-Cys(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos) 樹脂を得
た。なお、Boc-Gln のカップリングに際してはBoc-Gln
のジメチルフォルムアミド液に 0.6Ｍ１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを添加してニトリルの形成を防いだ。

【０００９】上記樹脂を10％のアニソールを含む液体フ
ッ化水素約20ml中で０℃１時間攪拌してペプチドの脱保
護を行った。フッ化水素を減圧除去した後、エーテルに
て樹脂を洗浄し、15％酢酸にてペプチドを抽出し、凍結
乾燥して粗 His-Cys-Gln-Arg-Pro-Argを得た。さらに
0.1％トリフルオロ酢酸の存在下、ＯＤＳカラム（Cosmo
sil ５Ｃ₁₈・ＡＲ，ナカライテスク製）による高速液
体クロマトグラフィーにより 200mgの純品を得た。な
お、上記においてHis はヒスチジン、Cys はシステイ
ン、Gln はグルタミン、Arg はアルギニン、Pro はプロ
リンの各アミノ酸残基を示し、Boc はｔ−ブトキシカル
ボニル基、Toc はトシル基を示す。

【００１０】製造例２：酵素消化によるHis-Cys-Gln-Ar
g-Pro-Arg （ＨＣＱＲＰＲ）の調製以下に調製法の概要を図式で示す。

【００１１】

【００１２】単離工程：大豆タンパク質消化物からのHi
s-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg （ＨＣＱＲＰＲ）の単離分離大豆タンパク質２ｇを32ml水に溶解しpH7.0 に調整
後、3000rpm 30分の遠心により不溶物を除去した。30分
間煮沸の後、16mgのトリプシンを添加し、37℃、５時間
の消化を行った。さらに10分間煮沸の後、10,000rpm.,
10分の遠心上清をトリプシン消化物とした。上記消化物
に１％となるよう２−メルカプトエタノールを添加し、
その50mg蛋白質相当量を 0.1％トリフルオロ酢酸で平衡
化したＯＤＳ−カラム（Cosmosil５Ｃ₁₈、20×250mm 、
ナカライテスク製）にロードし、 0.1％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（１％／10ml
／min ）により展開した。ＨＣＱＲＰＲは16〜17％アセ
トニトリルで溶出した画分に含まれているが、他のペプ
チドも共存するので、さらにフェニルカラム（Cosmosil
５Ph、 4.6× 250mm、ナカライテスク製）、次いでシ
アノプロピルカラム（Cosmosil ５ＣＮ、4.6× 250m
m、ナカライテスク製）により精製し、ＨＣＱＲＰＲを
得た。なお両カラムは 0.1％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（１％／１ml／min ）に
よって展開した。

【００１３】ＨＣＱＲＰＲはフェニルカラムおよびシア
ノプロピルカラムからそれぞれ13％および 4.7％のアセ
トニトリルによって溶出された。分離大豆蛋白質からの
ＨＣＱＲＰＲの収率は0.06％であった。大豆蛋白質トリ
プシン消化物のＯＤＳ−カラムによる分画の吸光度のチ
ャートを図１に、ＯＤＳ−カラム画分のフェニルカラム
による分画のチャートを図２に、そしてフェニルカラム
画分のシアノプロピルカラムによる分画のチャートを図
３に示す。各チャート中にＡで示した画分にＨＣＱＲＰ
Ｒは回収される。

【００１４】

【試験例】以下、本発明のペプチドの各作用について説
明する。試験例１：好中球の集積作用７週令の雄 ddYマウスの腹腔内に３mgのペプチドを投与
し１日後の腹腔内細胞を採取し、ディフクイック（ミド
リ十字製）にて染色後、好中球の割合を顕微鏡により算
定した。結果を表１に示す。

【００１５】

【００１６】試験例２：ファゴサイトシスの測定７週令のddY 雄マウスに３mgのペプチドを腹腔内投与し
３日後に腹腔内細胞を回収し、それにオイルレッドを含
むパラフィンエマルジョンを１／10量加えて反応を開始
し、５分後、氷冷した生理食塩水を加え、反応を止め
る。遠心後、ペレットにパラジオキサンを加え、細胞に
取り込まれた色素を抽出する。その色素量を 524nmと 6
00nmの吸光度から測定し、その差より、ファゴサイトシ
ス量を評価した。なお、 600nmの吸光度は濁度の補正で
ある。

【００１７】

【００１８】試験例３：活性酸素産生能の測定活性酸素産生および測定の仕組みを図式１および２に示
す。活性酸素は、図式１に示すように、食細胞内でＨＭ
Ｐ経路から供給されるＮＡＤＰＨにより酸素が還元さ
れ、作られる。そして、活性酸素は試験管中で、チトク
ロムＣを定量的に還元するので、その還元量を吸光度計
で吸光度（ＯＤ）を測り、活性酸素産生量を決定した。

【００１９】

【表１】

【００２０】

【表２】

【００２１】図式２に示すように、細胞に異物であるザ
イモサン（酵母の細胞壁）をオプソニン化したものと、
チトクロムＣを加えて反応を開始し、15分後氷水中に入
れ、反応を止める。遠心後、上清の 550nmと 468nmの吸
光度を測定し、その差から活性酸素産生量を計算した。
計算式は以下のようになる。［Ｏ₂ ^-］＝Ａ／ε・２×１０^-3・５００／４００［μmol ／２×１０⁶ ・１５min ］ ε＝0.0245より＝１０２・Ａ［nmol／２×１０⁶ ・１５min ］なお、Ａ：吸光度結果を表３に示す。

【００２２】

【００２３】試験例４：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベル
の上昇作用の測定７週令の雄Ｃ３Ｈ／Ｈｃマウスにペプチドを静脈内また
は経口投与し、３時間後に 0.3mgのピシバニール（ＯＫ
−４３２）を静脈内投与した。さらに２時間後に採血
し、血清中のＴＮＦレベルをラジオイムノアッセイによ
り測定した。結果を表４に示す。本発明のペプチドは静
脈内投与において特に効果を示す。

【００２４】

【００２５】試験例５：腹水ガンに対する抑制作用ペプチド３mgと１×10⁵ 個のＬ−1210細胞を６週令の雄
のＤＢＡ／２マウスの腹腔内に投与し、マウスが腹水ガ
ンで死亡するまでの日数を測定した。１群は５または６
匹とした。生存日数を表５に示し、生存率を図４に示
す。

【００２６】コントロール（生理食塩水）との差異はあまり大きくな
いが、腹水ガン抑制作用を持つとされているタフトシン
と同程度の作用を示す。

【００２７】試験例６：免疫増強作用 10匹１群のマウスに生理食塩水に溶解したペプチドを腹
腔内投与し、１時間後にキャンディダ・アルビカンス
（ Candida albicans ）菌を対照群の10日後の致死率が
90〜100 ％になるような菌数を静脈内に接種し、10日後
の生存数で免疫増強作用を判定した。結果を表６に示
す。

【００２８】

【００２９】試験例７：免疫回復作用 10匹１群のマウスに生理食塩水に溶解したペプチドを第
１日、第３日、第５日に腹腔内投与する。さらに免疫抑
制剤シクロホスファミド25mg／Kgを第２日、第４日、第
６日に経口投与する。シクロホスファミドの最後の投与
の１時間後にキャンディダ・アルビカンス（ Candida a
lbicans ）菌を対照群の10日後の致死率が90〜100 ％に
なるような菌数を静脈内に接種し、10日後の生存数で免
疫回復作用を判定した。結果を表７に示す。

【００３０】

【００３１】

【発明の効果】上記の各結果からわかるように、本発明
のペプチドはタフトシンおよびＱＲＰＲと比較して貪食
能、腫瘍壊死因子レベルの上昇作用に優れており、免疫
系賦活作用を有することから種々の疾病の医薬組成物と
して使用できる。また、本発明の酵素加水分解法によれ
ば、得られたペプチドは食品蛋白質を起源とするため安
全性が充分に期待できる。本発明のペプチドは使用に当
たり、それ自体でまたは製薬上使用される担体および助
剤と共に適当な剤形に調製して経口または静脈内投与す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】大豆蛋白質トリプシン消化物のＯＤＳ−カラム
による分画の吸光度のチャート。

【図２】ＯＤＳ−カラム画分のフェニルカラムによる分
画の吸光度のチャート。

【図３】フェニルカラム画分のシアノプロピルカラムに
よる分画の吸光度のチャート。

【図４】腹水ガンに対する抑制作用（生存率）を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式Ｉ： His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg （Ｉ）（式中、His はヒスチジン、Cys はシステイン、Gln は
グルタミン、Arg はアルギニンおよびPro はプロリンを
表す。）で表されるペプチドまたはその塩を有効成分と
する免疫系賦活組成物。
【請求項２】免疫系賦活作用が、好中球の集積能、活
性酸素の産生能および腫瘍壊死因子の産生能を高める作
用である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】免疫系賦活作用が、制癌作用である請求
項１記載の医薬組成物。
【請求項４】大豆蛋白質をトリプシンで消化し、得ら
れた消化物をオクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラムおよ
びフェニルカラムによる高速液体クロマトグラフィーに
よって分画することを特徴とする次式Ｉ： His-Cys-Gln-Arg-Pro-Arg （Ｉ）（式中、His はヒスチジン、Cys はシステイン、Gln は
グルタミン、Arg はアルギニンおよびPro はプロリンを
表す。）で表されるペプチドの製造方法。