JPH0614870B2 - ガラクトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ビフィドバクテリウム菌増殖促進作用を有す
るオリゴ糖を製造する方法に関するものである。

従来の技術 乳糖のβ−ガラクトシル転移反応等により生成するガラ
クトース−グルコース系のオリゴ糖は母乳オリゴ糖の主
要構成成分であり、且つヒト腸内に生息する有用細菌・
ビフィドバクテリウム菌の増殖促進因子として有用なも
のである（特公昭５８−２０２６６号公報等）。

一般式Gal-(Gal)n-Glc（但し式中Galはガラストース残
基、Glcはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を、それ
ぞれ表わす）で示されるこのオリゴ糖（この明細書で
は、これをガラクトオリゴ糖ともいう）は、その後、発
酵乳や乳児用粉乳へ添加されるなど、種々の分野で利用
されるようになった。

乳糖からガラクトオリゴ糖を生成させる方法としては、
乳糖にアスペルギルス・オリゼのβ−ガラクトシダーゼ
を作用させる方法（前出公報）、クリプトコッカス属酵
母を利用する方法（特開昭６０−２５１８９６号公報）
などがあるが、いずれの方法によっても、乳糖のすべて
をガラクトオリゴ糖に変換することはできず、得られる
ものは２０〜６０％程度のガラクトオリゴ糖のほかに未
反応の乳糖を主体とする二糖類と副生するグルコース、
ガラクトース等の単糖類とを含有する糖混合物の溶液
（この溶液を、本明細書では糖液という）である。そこ
でビフィドバクテリウム菌増殖促進因子としての活性の
高いガラクトオリゴ糖製品を得るためには、糖液の精
製、すなわち該糖液中のガラクトオリゴ糖と他の糖類と
を分離し、なるべく純度の高いガラクトオリゴ糖を得る
ことが必要になる。

そのための従来の精製法としては、まず活性炭法があっ
た（前出公報）。この方法は、活性炭カラムに糖液を流
してその中の糖類をカラムに吸着させ、次いで水または
低濃度のエタノールで単糖類および乳糖を溶出させて除
き、その後、高濃度のエタノールでガラクトオリゴ糖を
溶出させて溶出液からガラクトオリゴ糖を得るもので、
主たる分離モードは吸着分配である。しかしながら、こ
の方法は分子サイズによる糖の分離が不充分であって、
高純度のガラクトオリゴ糖を得ようとすると収率がきわ
めて悪いという欠点がある。また、エタノールを使用す
るため、エタノール代、エタノールの回収費、蒸留装置
建設費等がかさみ、精製コストが高いのも問題である。

三次元架橋結合を形成させたデキストラン、セルロー
ス、ポリアクリルアミド等を基材とするゲル濾過剤を用
いて分子サイズによる分離を行うゲル濾過法もあった
が、これは、ゲル濾過剤の寿命が短いこと、単位樹脂量
当りの適正負荷量が小さく過負荷状態では分離能が極端
に悪くなること、にもかかわらずかなり高価であるこ
と、などにより、実験室規模でしか実施することができ
ない。

その他、一般的なオリゴ糖の分離法としては、イオン交
換基を持たない多孔性ポリマーからなる合成吸着剤を用
いる方法がある（特開昭６１−１３０２９７号公報
等）。この方法は、合成吸着剤を充填したカラムに被処
理液を供給し、吸着された糖類を水または水とアルコー
ルの濃度勾配により溶出させるもので、糖と吸着剤の間
の親和力の差により糖が分子量の小さい順に溶出し、分
離が行われる。しかしながら、この方法を糖液の精製に
適用しても、水だけでの溶出では三糖類以上のガラクト
オリゴ糖の回収に時間がかかりすぎ、回収率も満足でき
るものではなく、しかも回収糖濃度がきわめて低いこと
がわかった。溶出にアルコール水溶液を用いればガラク
トオリゴ糖の回収率は上がるが、次の糖液を負荷する前
にカラム内を水で平衡化しなければならないので連続的
な分離ができないし、アルコール代も必要になる。要す
るこの方法も、能率が悪いうえにコストが高く、実際的
ではない。

一方、糖液には前述のようにかなりの未反応乳糖が含ま
れているから、これを効率よく回収し、原料乳糖として
再利用することがガラクトオリゴ糖の製造コストを下げ
るために望ましい。しかしながら、回収乳糖の再利用に
は、その乳糖がグルコースやガラクトースなどの単糖類
を含有するとβ−ガラクトシダーゼを作用させたとき転
移二糖類を生じ、結果としてガラクトオリゴ糖の正成量
が低下するだけでなく、ガラクトースにより酵素反応が
阻害されて反応の進行が遅くなるという問題がある。し
たがって、再利用する回収乳糖はできるだけ単糖類含有
率の低いものでなければならないが、従来のガラクトオ
リゴ糖分離精製法によっては、β−ガラクトシダーゼ処
理に再利用可能な程度に単糖含有率の低い乳糖を同時に
得ることは困難であった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上述のような現状に鑑み、糖液から従
来よりも効率よく高純度のガラクトオリゴ糖を回収し得
る精製工程を含む高品質ガラクトオリゴ糖の製造法を提
供することにある。

本発明の他の目的は、高純度のガラクトオリゴ糖ととも
に（β−ガラクトシダーゼを用いる場合にも使用可能な
程度に）単糖含有率の低い乳糖を回収し回収乳糖を原料
乳糖として再利用することにより安価に高品質ガラクト
オリゴ糖を得ることができる、従来よりも有利なガラク
トオリゴ糖の製法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 上記目的を達成した本発明は、乳糖からガラクトオリゴ
糖への転移反応を生起させることのできる任意の酵素ま
たは微生物を乳糖に作用させてガラクトオリゴ糖を含有
する糖液を得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用いる
カラムクロマトグラフィーにより上記糖液中の糖成分の
分離を行い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含有
画分を採取することを特徴とする第一の発明と、上記第
一発明の製法においてさらにカラム溶出液より乳糖高含
有画分を採取しこれを原料乳糖の一部として再利用する
ことを特徴とする第二の発明との二発明からなる。

本発明の製法においては、まず任意の方法により乳糖か
らガラクトオリゴ糖を生成させる。すなわち、乳糖から
ガラクトオリゴ糖への転移反応を生起させることのでき
る酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）または微生物
（たとえばクリプトコッカス酵母）を乳糖に作用させ
て、ガラクトオリゴ糖を含有する糖液を得る。

酵素を用いる代表的な処理法について述べると、たとえ
ばアスペルギルス・オリゼのβ−ガラクトシダーゼを用
いて、乳糖濃度１０〜９０重量％、酵素濃度１〜１００
単位／mlで、pH約３〜８、温度約２０℃以上において酵
素処理を行う。反応が進むにつれてグルコース、ガラク
トース等の単糖とガラクトオリゴ糖がほぼ直線的に増加
するが、その後はやや複雑な変化を示し、オリゴ糖はあ
る時点から徐々に減少する傾向を示す。したがって、通
常は最高のオリゴ糖収率を与える時点で反応を打切る。
酵素反応は、処理液を約９０℃以上に５〜１０分間加熱
すれば停止させることができる。

微生物を利用する場合は、乳糖を含有する培地でその微
生物を培養し、培養液中にガラクトオリゴ糖を生成させ
たのち微生物を除去して糖液を得る。

転移反応に酵素を用いた場合も微生物を用いた場合も、
得られた糖液は、必要に応じて粉炭による脱色処理やイ
オン交換樹脂による脱塩処理などの予備的精製を施し、
糖濃度が低い場合はさらに減圧下に濃縮するなどしてか
ら、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーによる精製を行う。

糖類の分離精製に用いる強酸性陽イオン交換樹脂は、ク
ロマトグラフィー用の、なるべく粒径の均一度が高いも
のであることが望ましい。さらに、その中でも、スチレ
ンジビニルベンゼン共重合体を基体とし−ＳＯ_{3 -}基を交
換基とするもののNa形、Ｋ形またはCa形のものが適当で
ある。Na形のものは特に糖類分離能にすぐれており、最
も好ましい。本発明の製法において特に好ましい強酸性
陽イオン交換樹脂の具体例としては、ユニビーズＵＢＫ
−１０１Ｌ、同ＵＢＫ−５３０（いずれも三菱化成株式
会社製品）がある。

上述のようなイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーは、樹脂カラム、被処理糖液および溶出用の水
の温度を約５０〜９０℃、望ましくは約６０〜８０℃の
範囲で、できるだけ一定に保って実施することが、良好
な分離を達成するために必要である。カラムに供給する
糖液の糖濃度は３０〜６５％(w／w)程度が適当で、これ
よりも濃度が高いと分離パターンに乱れを生じる。

強酸性陽イオン交換樹脂を用いて行うクロマトグラフィ
ーによる糖液構成成分の分離は、分子サイズ排除効果
（架橋樹脂内へ浸透し得ない大きな分子サイズの糖から
先に溶出させる効果）による。

分離操作は、基本的には次のようにして行う。

カラムに糖液を供給して樹脂に糖類を吸着させる。
その量は、樹脂量の約２〜２０％v/vが適当である。

カラムにＳＶ約０．１〜２／Hrで水を流して糖類を
溶出させる。

溶出液より、最初に溶出するガラクトオリゴ糖高含
有画分を採取し、以下、順次溶出するガラクトオリゴ糖
・乳糖画分（両成分混在画分）、乳糖高含有画分、乳糖
・単糖類画分（両成分混在画分）および単糖類高含有画
分を採取する（必要がなければ、ガラクトオリゴ糖を含
まない溶出液の分画は省略する）。

大量の糖液を連続的に処理して高純度のガラクトオリゴ
糖を得ようとする場合は、第１図に示したような直列接
続の二つのカラム・Ｃ−１，Ｃ−２を用いて次のような
６ステップ１サイクルの循環操作法を採用するのが有利
である（第１図中の数字はステップ番号を示す）。

ステップ１：糖液Ｓを上部カラムＣ−１に注入する。こ
のとき下部カラムＣ−２の出口からは、前回注入した糖
液Ｓより分離された乳糖高含有画分Ｌが溶出する。

ステップ２：上部カラムＣ−１と下部カラムＣ−２との
連結部より下部カラムＣ−２に水Ｗを注入し、下部カラ
ムＣ−２出口からの乳糖高含有画分Ｌの溶出を終わらせ
る。

ステップ３：乳糖高含有画分Ｌに続いて下部カラムＣ−
２出口より溶出して来る乳糖・単糖類画分Ｌ・Ｍ（前回
注入した糖液Ｓから分離されたもの）を上部カラムＣ−
１に戻す。

ステップ４：上部カラムＣ−１入口より水Ｗを注入し、
下部カラムＣ−２の出口より単糖類高含有画分Ｍ（前回
注入した糖液Ｓから分離されたもの）を溶出させる。

ステップ５：上部カラムＣ−１の入口より水Ｗを注入
し、ステップ１で供給した糖液Ｓから分離されたガラク
トオリゴ糖高含有画分Ｏを下部カラムＣ−２の出口より
溶出させる。

ステップ６：ガラクトオリゴ糖高含有画分Ｏに続いて下
部カラムＣ−２の出口より溶出して来るガラクトオリゴ
糖・乳糖画分Ｏ・Ｌを上部カラムＣ−１に戻す。

この方法によれば、高純度のガラクトオリゴ糖、乳糖お
よび単糖類を、いずれも回収容易な高濃度溶出液の形で
半連続的に得ることができ、ガラクトオリゴ糖の精製損
失もほとんどない。

そしてステップ１，２で得た乳糖高含有画分は、第二発
明の製法においてそのままガラクトオリゴ糖調製原料と
して再利用することができる。なおガラクトオリゴ糖調
製法が前述のように単糖類の存在を嫌うβ−ガラクトシ
ダーゼ法の場合は、回収乳糖中の単糖類の量が問題にな
るが、単糖類含有率が充分低くなるように分画条件を選
ぶことにより、また新たに仕込まれる乳糖と混合して使
用することにより、転移反応に支障がない程度に単糖含
有率の低い反応原料を調製することは容易である。しか
しながら、必要ならば乳糖高含有画分は濃縮して乳糖を
晶出させるなどの方法によりさらに単糖類を除いてから
再利用してもよい。

発明の効果 本発明のガラクトオリゴ糖製造法は、従来の製造法と比
べると下記のように多くの点で有利なものである。

（１）きわめて高純度の、したがってビフィドバクテリ
ウム菌増殖促進因子としての活性の高いガラクトオリゴ
糖を、容易に製造することができる。また、単糖類およ
び乳糖の含有率の低い製品が得られることによって、甘
味やカロリーが使用上の障害になったり乳糖不耐症体質
者が下痢を起こしたりするといった問題も無くなり、さ
らに、凍結乾燥法または噴霧乾燥法により取扱い容易な
粉末化することも容易になる。以上により、ガラクトオ
リゴ糖のすぐれた性質を従来よりも広い範囲で活用する
ことが可能になる。

（２）クロマトグラフィーに用いる強酸性陽イオン交換
樹脂は耐圧縮性、耐久性、操作性にすぐれており、しか
も安価であるから、工業的な大規模実施に適している。

（３）強酸性陽イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ
ィーは、イオン交換基を持たない吸着樹脂や活性炭を使
用する方法と違って有機溶媒を必要とせず、水だけで溶
出でき、１サイクル終わるたびにカラムを水で平衡化す
る必要もない。したがって、連続的な精製操作を容易に
且つきわめて能率よく行うことができ、ガラクトオリゴ
糖や乳糖の純度および回収率も高い。そして有機溶媒使
用にともなう回収費その他の費用も不要であるから、ラ
ンニングコストがきわめて低い。

（４）回収される乳糖が高純度であり、多くの場合その
まま反応原料として再利用できる品質を持つ。したがっ
て、これを再利用することによりきわめて高い収率でガ
ラクトオリゴ糖を製造することが可能である。

（５）上記（２）〜（４）により、きわめて安価にガラ
クトオリゴ糖を提供することが可能である。

（６）回収される単糖類高含有画分は甘味シロップとし
て飲食品製造にそのまま利用でき、また甘味料原料とし
て利用することもできる。

実施例 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例１ 局方乳糖５００ｇを１の温水に溶解し、これにpH４．
５の緩衝液およびβ−ガラクトシダーゼ１万単位を加
え、４０℃で５時間反応させた。次いで反応液を９５℃
に加熱して酵素を失活させ、ろ過後、強酸性陽イオン交
換樹脂・ダイヤイオンＳＫ１Ｂと強塩基性陰イオン交換
樹脂・ダイヤイオンＰＡ３０８との混床樹脂塔を通して
脱塩処理し、さらに減圧下に濃縮して糖濃度を４３％w/
wにした。得られた糖液の糖組成は、ガラクトオリゴ糖
２４．２％、乳糖４３．６％、グルコース２３．５％、
ガラクトース８．７％であった。

この糖液を、６０℃に加熱したクロマトグラフィー用強
酸性陽イオン交換樹脂カラム（内径１０mm、長さ１００
０mmのジャケット付カラム；使用樹脂：ユニビーズＵＢ
Ｋ−１０１Ｌ，Na形）に樹脂量の５％加えたのち、６０
℃の温水で溶出した。糖液および温水の注入速度（Ｓ
Ｖ）は０．５／Hrとした。

カラムからの溶出液を２mlずつ分取して、糖組成を高速
液体クロマトグラフィーで分析した。その結果を第２図
に示す。

実施例２ 食品グレードの乳糖４kgを２．３の温水に溶解し、実
施例１で用いたものと同じ酵素を８万単位加えて６７℃
で２時間反応させた。その後、反応液を９５℃に１０分
間加熱して酵素を失活させ、粉炭とセライトを加えてろ
過し、イオン交換樹脂を用いてろ液を脱塩処理した。得
られた糖液（全糖濃度６２．５％；糖組成：ガラクトオ
リゴ糖２９．５％、乳糖４５．２％、単糖類２５．３
％）を、６０℃に加熱したクロマトグラフィー用強酸性
陽イオン交換樹脂カラム（内径３５．５mm、長さ９１０
mmのステンレス鋼製カラム２本を直列に連結したもの；
使用樹脂：ユニビーズＵＢＫ−５３０，Na形，１８１０
ml）を用いる前述の６ステップ１サイクルの循環操作法
により３６サイクル、連続的に処理した。なお、１回の
糖液仕込量は１２０ml、溶出用温水の温度は６０℃、糖
液および温水の注入速度（ＳＶ）は０．２５４／Hrとし
た。

これにより得られた各糖画分の組成は次のとおりであっ
た。

ガラクトオリゴ糖高含有画分（約９）は減圧濃縮し、
更に凍結乾燥して、白色の粉末状ガラクトオリゴ糖８０
０ｇを得た。

実施例３ 実施例１と同様にして乳糖にアスペルギルス・オリゼの
β−ガラクトシダーゼを作用させて、糖組成がガラクト
オリゴ糖３０．１％、乳糖５０．０％、単糖類１９．９
％の糖液を得た。これをイオン交換樹脂で脱塩脱色して
得られた全糖濃度５５％w/wの糖液２０を、実施例１
の場合と同じイオン交換樹脂を充填したカラム（内径１
５cm、長さ１２０cmのステンレス製カラム２本を直列に
連結したもの）を用いる前述の循環操作法により処理し
た。但し糖液仕込量は１．８７／サイクルとし、カラ
ム溶出液のうちガラクトオリゴ糖高含有画分、乳糖高含
有画分および単糖類高含有画分はそれぞれ１１サイクル
分をまとめて濃縮した。

乳糖高含有画分の濃縮液（固形分量８．１２kg；糖組
成：ガラクトオリゴ糖１３．５％、乳糖８１．９％、単
糖類４．６％）は、乳糖５．８８kgを混合してから、上
記と同様の酵素反応、予備的精製および糖分離処理に付
した。

このような酵素処理と糖分離処理を１０回繰返し、得ら
れたガラクトオリゴ糖高含有画分の濃縮液を脱色用イオ
ン交換樹脂カラムに通してわずかな着色を除き、糖濃度
５０％w/wの透明溶液６６を得た。これを噴霧乾燥し
たところ、流動性のよい白色粉末（ガラクトオリゴ糖純
度９０％）３２kgが得られた。

また単糖類高含有画分の濃縮液（濃度７０％w/w、単糖
類純度９９％、グルコース／ガラクトース＝３／１）２
６が得られ、これはそのままマイルドな甘味シロップ
として利用可能なものであった。

【図面の簡単な説明】

第１図：本発明の製造法における糖分離処理のための循
環操作法の説明図 第２図：実施例１における糖分離処理の結果を示すグラ
フ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】乳糖から一般式Gal-(Gal)n-Glc（但し、式
   中Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、ｎは
   １〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるオリゴ糖
   への転移反応を生起させることのできる酵素または微生
   物を乳糖に作用させて上記オリゴ糖を含有する糖液を
   得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
   マトグラフィーにより上記糖液中の糖成分の分離を行
   い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含有画分を採
   取することを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造法。
2. 【請求項２】β−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させて
   オリゴ糖を生成させる特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。
3. 【請求項３】スチレンジビニルベンゼン共重合体を基体
   とし−ＳＯ₃ ^-を交換基とする強酸性陽イオン交換樹脂の
   Na形のものをカラムクロマトグラフィーに用いる特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。
4. 【請求項４】乳糖から一般式Gal-(Gal)n-Glc（但し、式
   中Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、ｎは
   １〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるオリゴ糖
   への転移反応を生起させることのできる酵素または微生
   物を乳糖に作用させて上記オリゴ糖を含有する糖液を
   得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
   マトグラフィーにより上記糖液中の糖成分の分離を行
   い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含有画分を採
   取すること、およびカラム溶出液より乳糖高含有画分を
   採取し該画分を原料乳糖の一部として再利用することを
   特徴とするガラクトオリゴ糖の製造法。
5. 【請求項５】β−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させて
   オリゴ糖を生成させる特許請求の範囲第４項記載の製造
   法。
6. 【請求項６】スチレンジビニルベンゼン共重合体を基体
   とし−ＳＯ₃ ^-を交換基とする強酸性陽イオン交換樹脂の
   Na形のものをカラムクロマトグラフィーに用いる特許請
   求の範囲第５項記載の製造法。