JPH0614945A - 豚の繁殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】豚の受精卵の８−細胞期から桑実期までの胚か
ら得られる分離割球を未受精卵から除いて得られる受容
体卵細胞に移植し、豚卵管に一次移植するか、豚卵丘細
胞と共培養させて第一次成長させ、このようにして成長
させた核移植胚を仮親に移植して豚を繁殖させる。 【効果】遺伝的に同一の形質を有する多数の産仔を一度
に増殖できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、８−細胞期から桑実期
胚（１６−細胞期）までの胚から得られる分離割球（単
一細胞）を供与（ドナー）核とする、豚の核移植胚を作
出し、一卵性の８仔から一卵性の１６仔まで効率的に生
産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】実験動物または家畜の受精卵の初期胚を
微小なメスなどで二つに切断し、この切断二分した胚の
ペアを仮親の子宮内に移植する方法によって実験動物ま
たは家畜の一卵性双生子を作出する方法はこれまでにマ
ウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
シなどで行なわれて成功している。

【０００３】すなわち二細胞期胚から分離された二個の
割球はそれぞれが１個体に発達する能力を有し、これら
を借腹雌に移植することで一卵性双生子が得られるわけ
であるが、同様に４−細胞期胚を４分割しまた８−細胞
期胚を８分割してこれを移植して一卵性の４仔または８
仔を作出する試みもなされ、いくつかの哺乳動物種では
成功している。すなわち、例えばウサギの４−細胞期
胚、８−細胞期胚の割球は単独でも個体に発達しうる潜
在能力を有することが明らかにされている。

【０００４】この切断二分胚、四分胚または八分胚から
個体発生を可能にしているのは哺乳動物胚に備わった
「全能性」と「調整能」という二つの特性である。哺乳
動物初期胚の割球は発生段階の或る時期までは未分化な
状態を保っていて後の発生段階においてどのような役割
でも果すことができる。この能力を「全能性」という。
もう一方の「調整能」は初期発生過程において一部分の
細胞を失ってもその後の発達に異常をきたすことなく残
りの細胞が欠落を補償して「調整」する能力のことであ
る。

【０００５】ところで、胚細胞は受精直後の１−細胞期
から２−細胞期、４−細胞期、８−細胞期へと細胞分裂
を繰返すに従い娘細胞は１／２、１／４、１／８の大き
さになり、そのため仮に１個の胚を８等分した場合に得
られる胚断片は１−細胞期の胚の１／８の大きさしかな
い胚となる。このような小型の胚では前述の調整能が限
界に近く、或いは種によっては限界を超えてしまい、個
体への発生能力は低い。

【０００６】しかしながら、このような胚断片または分
離割球からの一卵性多胎作出の困難性は核移植の手法の
導入によって大きく解消されることになったのである。
すなわち、例えば１個の８−細胞期の受精卵から得られ
る８個の核（割球）を８個のあらかじめ核を抜き取った
未受精卵の細胞質中へ移植することにより８個の新たな
同一の遺伝的特質を有する受精卵を作り出すことが可能
となる。これまでに細胞膜によって包囲されている核で
構成されるカリオプラストを受容体卵細胞質と不活性セ
ンダイウィルスで融合させる方法としてマウスで最初に
確立され（Ｊ．ＭｃＧｒａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖ
ｏｌ．２２０，１３００〜１３０２（１９８３））、そ
の後半（Ｓ．Ｍ．Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ
ｖｏｌ．３２０，６３〜６５（１９８６））、牛（Ｊ．
Ｍ．Ｒｏｂｌら、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．１９８７，６
４：６４２〜６４７）、兎（ＳｔｉｃｅおよびＲｏｂ
ｌ，１９８９）の８〜１６細胞期胚および豚（Ｐｒａｔ
ｈｅｒら、１９８９）の４−細胞期胚の割球を受容体卵
細胞質と電気的融合後に仮親に移植することによって夫
々の動物種で産仔が得られている。

【０００７】すなわち、羊、牛、兎の８〜１６細胞期の
細胞核を受容体卵細胞質に移植して得られる融合胚から
産仔が得られることは融合核の初期化の証明であり、一
方豚の場合４−細胞期胚の核をドナー核として供与した
時のみ融合胚から産仔が得られるに止っていたのであ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述のように豚の場合
これまでの技術では８−細胞期から桑実期胚（１６−細
胞期）までの胚の核から一卵性の８仔、１６仔が得られ
るかどうかは不明であった。その理由の１つに、豚の１
−細胞胚および２−細胞胚は体外において発生が極めて
困難であることが挙げられ、一般にそれらの胚は４−細
胞期で発生をストップしてしまう４−セルブロック現象
を起し、そして融合胚の場合についても同様でこれを体
外で発生させるためには特別の工夫が必要となるのであ
る。

【０００９】従って、豚の８−仔から１６−仔の一卵性
双生子を作出するためには、８−細胞期から桑実期の胚
の細胞核をドナー核として用いたときに融合核に初期化
が起るかどうかを確認することと、それらの融合胚を高
率に４−細胞期以降の段階に発生させるための培養条件
の解明が解決されねばならない大きな課題があった。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記した課
題解決のために鋭意研究の結果、豚の受精卵の８−細胞
期および桑実期（１６−細胞期）までの胚から得られる
細胞核と受容体卵細胞質とを電気パルスによって融合さ
せ、得られた融合胚を生体内培養法によって一時的に成
長を促進させるか、または得られた融合胚を卵丘細胞と
共培養する生体外培養法によって成長させ、これらの融
合胚の４−細胞期以降への発生を可能とし、このように
して得られた核移植胚は仮親に移植することが可能で、
かくして豚の８−仔から１６−仔の一卵性双生子を作出
しうることを見出して本発明を完成したのである。

【００１１】すなわち、本発明は、豚の受精卵の８−細
胞期から桑実期までの胚から得られる分離割球を未受精
卵から核を除いて得られた受容体卵細胞に移植し、この
割球が移植された受容体卵細胞に電気パルスを加えて移
植された割球と脱核された受容体卵細胞とを融合させ、
得られた核移植胚を寒天に包埋して豚卵管に一次移植す
るか、またはこの核移植胚を豚卵丘細胞と共培養するこ
とによって成長させ、このようにして成長させた核移植
胚を仮親に移植することによって豚を繁殖させる方法に
ある。

【００１２】本発明の方法では豚の８−細胞期または桑
実期の受精卵は発情終了後３〜４日目のドナー雌豚から
取り出し、これを分離して単一の割球（ドナー細胞）に
分離する。

【００１３】一方、過排卵誘起処置された雌豚の卵巣よ
り排卵誘起剤投与後２４時間目に注射針で卵胞液を吸引
し卵丘細胞に包まれた受容体卵母細胞を取り出す。この
卵母細胞を第二成熟分裂中期まで発達させる。極体を放
出したこの卵母細胞を顕微鏡下に操作して極体および極
体直下の染色体を含む細胞質を摘出する。このようにし
て核を除いた受容体卵細胞の囲卵腔に上記のようにして
用意したドナー細胞を挿入する。

【００１４】次いで受容体卵細胞とドナー細胞の膜融合
を誘起するために電気パルスを加える。この電気パルス
は例えばＧＣＡ／Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ社製チンマーマン細胞融合装置のよ
うな装置を用い、１００〜１２０Ｖの直流電気を１０〜
５０マイクロ秒のパルス間隔で１〜３回通電することで
行なわれる。

【００１５】このようにして膜融合された細胞はサイト
カラシン（７．５μｇ／ｍｌ）を含有する修正ＫＲＢ液
に移され３９℃で１時間培養される。融合が確認された
細胞は次いで第一次成長のために寒天小片中に二重包埋
される。第二の包埋によって長さ２ｍｍ、直径５００μ
ｍの円筒状のチップとされ、このように寒天で包埋され
た胚は結紮した雌豚の卵管内に移され、４〜５日間置い
て発達させ、卵管を洗浄して寒天チップを回収し中の胚
を取り出す。このようにして核移植胚は生体内培養によ
って一時的に成長させられる。

【００１６】上記した生体内培養の他に本発明の方法で
は体外培養法によって核移植胚を第一次成長させること
もできる。すなわち、融合が確認された細胞を卵丘細胞
と共培養して第一次成長させるのである。この卵丘細胞
とは、雌豚の卵胞内卵子周囲に付着した顆粒膜およびコ
ロナ細胞を指す。これを牛胎児血清（ＦＣＳ）１５％添
加のＴＣＭ１９９またはＭＥＭ液で３７〜３９℃の条件
下で３〜７日間培養し、培養皿の底に一層のシートを形
成させたのち融合胚との共培養に供せられる。このよう
にして核移植胚は体外培養法によっても第一次成長させ
ることができる。

【００１７】このようにして第一次成長させた核移植胚
は仮親に移植され、複数の同一の遺伝的特徴を有する一
卵性の豚の個体をうることができた。次に本発明の方法
を実施例によって具体的に説明することにする。

【００１８】

【実施例】過排卵誘起処置されたドナー雌豚の卵巣より
ｈＣＧ投与後２４時間目に注射針で卵胞液を吸引するこ
とにより卵丘細胞に包まれた受容体卵母細胞を集める。
これら卵母細胞はＦＣＳ １５％添加ＴＣＭ １９９液
で２４時間３９℃の条件で培養し、第二成熟分裂中期に
まで発達させる。極体を放出した受容体卵細胞は顕微操
作により極体及び極体直下の染色体を含む細胞質を全体
の１／３程度摘出する。一方発情終了後３〜４日目のド
ナー雌豚より８細胞から１６細胞期の胚を得、単一の割
球（ドナー細胞）に分離する。受容体卵母細胞の囲卵腔
にドナー細胞を挿入し、卵母細胞とドナー細胞との膜融
合を誘起するために電気融合を施す。融合条件は３０マ
イクロ秒のパルス間隔で１２５Ｖの直流電流を２回通電
する。融合パルスの後、全ての胚をサイトカラシン
（７．５μｇ／ｍｌ）とコルセミド（０．１μｇ／ｍ
ｌ）含有の修正ＫＲＢ液に移し、３９℃で１時間培養し
た。 ｉ） 融合が確認された胚は豚卵丘細胞と共培養され
る。共培養用の卵丘細胞は予めＦＣＳ １５％添加ＴＣ
Ｍ １９９液或いはＭＥＭ液で培養し、培養皿の底に一
層のシート状に増殖させる。融合胚と共培養させる一日
前にＴＣＭ１９９液或いはＭＥＭ液は羊血清１０％添加
修正ＫＲＢと置き換えられる。

【００１９】このようにして次の表１で示される結果を
得た。

【表１】 ｉｉ） また融合胚は３〜４個を１組として、第一次成
長のため豚卵管に移植する前に二重包埋した。第二の包
埋は長さ２ｍｍ、直径５００μｍの円筒状のチップで形
成した。寒天で包埋された胚は結紮した雌豚の卵管に移
し、４〜５日後卵管を洗浄し寒天チップを回収し、中の
胚を注射針で取り出す。

【００２０】このようにして次の表２で示される結果を
得た。

【表２】

【００２１】

【発明の効果】本発明による豚胚の複製（クローニン
グ）は、経済的価値の高い個体の遺伝的に同一の形質を
有する多数の産仔を一度に多数増殖出来、また遺伝的欠
陥を調べるためのプローブ、性判別のための細胞核の提
供、遺伝子導入胚のクローニングなどに応用出来、産業
振興の戦略上極めて重要な意義を持つ。そして発達の進
んだ８−細胞、桑実期胚をドナー核として用いることで
初期胚を使う場合より一層効率的な複製が可能となっ
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 豚の受精卵の８−細胞期から桑実期まで
   の胚から得られる分離割球を未受精卵から核を除いて得
   られた受容体卵細胞に移植し、この割球が移植された受
   容体卵細胞に電気パルスを加えて移植された割球と脱核
   された受容体卵細胞とを融合させ、得られた核移植胚を
   寒天に包埋して豚卵管に一次移植するか、またはこの核
   移植胚を豚卵丘細胞と共培養することによって成長さ
   せ、このようにして成長させた核移植胚を仮親に移植す
   ることを特徴とする豚の繁殖方法。