JPH06153958A - 発現ベクターおよび治療学的応用のためのｈｉｖ耐性ヒト細胞の調製におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 発現ベクターおよび治療的応用のためのＨＩ
Ｖ耐性ヒト細胞の調製におけるそれらの使用 【構成】 本発明は、相補的「アンチセンスＲＮＡ」を
発現する、とくに適当な発現系をもつ、形質転換され
た、造血細胞中のウイルス（例えば、ＨＩＶ）の複製の
ためのウイルスのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）
の遺伝情報のターゲッティングしたブロッキングに関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、相補的「アンチセンスＲＮＡ」
（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を発現する、とくに適
当な発現系をもつ、形質転換された、造血細胞の中のウ
イルス（例えば、ＨＩＶ）の複製のためのウイルスのメ
ッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の遺伝子配列の情報
のターゲッティングしたブロッキングに関する。

【０００２】とくに、本発明は、技術水準と対照的に、
遺伝子技術を使用して変更されたヒト細胞において、Ｈ
ＩＶ−１複製の完全な阻害およびＨＩＶ−２複製の明瞭
な阻害を生産する、アンチセンスＲＮＡ配列をコードす
る発現ベクターに関する。発現ベクターのここに記載す
る遺伝子ユニットは、ＨＩＶ誘発細胞変性作用から造血
細胞を保護するので、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの病気の遺伝子
治療にとくに適する。これにより、ＨＩＶ感染したヒト
において免不全は回避することができる。

【０００３】感染したにおけるウイルスの操作はウイル
スのゲノムの遺伝子により調節される。このプロセスに
おいて、ウイルスの操作のための感染のウイルス粒子の
構成のための、調節遺伝子産生物および構造のタンパク
質は、これらのウイルス遺伝子により転写および翻訳に
より形成される。このプロセスのための必須の中間体は
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）であり、これは調
節および構造のタンパク質の形成のための情報を仲介す
る。

【０００４】高度に特定の方法においてメッセンジャー
リボ核酸のブロッキングは、ウイルスのｍＲＮＡの分子
構造の独特性、すなわち、この分子のウイルス特異的ヌ
クレオチド塩基配列、に完全に基づき、相補的塩基配列
のリボ核酸を使用して配列特異的ヌクレオチド塩基対に
より、デオキシリボ核酸について同様な方法で記載され
たように、達成することができ、前に一本鎖のｍＲＮＡ
は二本鎖ＤＮＡにおいて複合化され、そしてヌクレオチ
ド塩基配列の遺伝情報は一部分タンパク質の生合成に利
用できないようになる。遺伝子発現、すなわち、翻訳の
第２段階はこれにより阻害される。相補的リボ核酸はア
ンチセンスＲＮＡと呼ばれる。

【０００５】アンチセンスＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの相
互作用による遺伝子の発現のメカニズムは、複雑であ
り、そして大きい程度に明らかでない。１つの説明は細
胞核の中のＲＮＡのスプライシングおよびＲＮＡのプロ
セシングの阻害である。しかしながら、この点に関する
詳細な研究は知られていない。二本鎖ＤＮＡにおけるア
デノシン→イノシンの交換の証明は発表され、そして翻
訳の阻害はこの交換の結局として示唆された。核周辺の
膜を通るタンパク質生合成の部位へのＲＮＡの輸送およ
び二本鎖ＤＮＡによるリボソーム／ＲＮＡの相互作用の
マスキングは、アンチセンスＲＮＡにより遺伝子の発現
の阻害への寄与をさらに提供することができる。

【０００６】アンチセンスＲＮＡにより代謝プロセスの
阻害は、天然に存在する生物学的系、例えば、バクテリ
アおよびいくつかの真核生物の、多細胞の有機体におい
て〔Ｋ．Ｍ．タカヤマおよびＭ．イノウエ、生化学的お
よび分子生物学における重要な概観（Ｃｒｉｔｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎ
ｄ Ｍｏｌｃｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２５、１
５５（１９９０）〕、ならびに人工的に遺伝子の転移に
より産生されたトランスジェニック有機体において
〔Ｊ．モル（Ｍｏｌ）ら、ＦＥＢＳ レターズ（Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ）２６８、４２７（１９９０）〕記載された。

【０００７】また、植物〔Ｍ．クオッゾ（Ｃｕｏｚｚ
ｏ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）６、５４９（１９８８）〕および動物の細胞
〔Ｔ．ルーデン（Ｒｕｅｄｅｎ）およびＥ．ギルボア
（Ｇｉｌｂｏａ）、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６３、６７７（１９８９）、欧州特許（ＥＰ）第
２５２８４０号〕において、アンチセンスＲＮＡを発現
する遺伝子の導入後に、ウイルス耐性有機体を産生する
試みについての報告が存在する。しかしながら、これら
の刊行物において著者らが述べているように、アンチセ
ンスＲＮＡの発現とウイルス耐性との間の、確信をもて
る、科学的に証明された関係は存在しない。とくに、一
時的発現を伴うアンチセンスＲＮＡを発現するマイクロ
インジェクションしたプラスミドの場合において、抗ウ
イルス活性は弱いか、あるいは結論的に評価することが
できない抗ウイルス作用に導く〔Ｋ．リットナー（Ｒｉ
ｔｔｎｅｒ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１９、１４２１（１９９
１）〕。また、ウイルス耐性細胞を産生するためにアン
チセンスＲＮＡを発現するレトロウイルスのベクターを
使用することについての報告が存在する〔Ｒ．Ｙ−Ｌ．
ト（Ｔｏ）ら、遺伝子の調節：アンチセンスＲＮＡおよ
びＤＮＡの生物学（Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆＡｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａ
ｎｄ ＤＮＡ）、Ｒ．Ｐ．エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｊ．Ｇ．イザント（Ｉｚａｎｔ）編、レイ
ベン・プレス・リミテッド（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ
Ｌｔｄ．）、ニューヨーク、１９９２〕。これらのレト
ロウイルスのベクターは、腫瘍遺伝子様遺伝子を含有す
るので、悪性腫瘍の成長をトリガーする危険を有し、そ
してレトロウイルス依存性腫瘍形成についての多数の証
拠が存在する。

【０００８】ウイルスの複製を抑制のためのアンチセン
スＲＮＡについて発表された研究と対照的に、本発明に
おいて、アンチセンスの向きにおいてウイルスのＤＮＡ
の特別に選択した領域と組み合わせてそれらのプロモー
ターの構成体の特定の性質により区別され、これによ
り、驚くべきかつ従来知られてきている領域をかなり超
越する品質および量のアンチセンスＲＮＡウイルス作用
を提供する、発現構成体を記載する。発現ベクターの組
み合わせ：５’−フランキングＤＮＡ配列、プロモータ
ー、挿入／アンチセンスＤＮＡおよび３’プロセシング
シグナル配列は、レトロウイルスの感染に関して最初
に、アンチセンスＤＮＡを発現するトランスフェクショ
ンされた細胞において非常に顕著なかつ明瞭に実証可能
なウイルス耐性に導いた。対照的に、内因性アンチセン
スＤＮＡの発現およびレトロウイルスの耐性のためのの
ための他の発現系を使用する技術水準は、一時的にのみ
現れる、弱い抗ウイルス作用を生ずる〔例えば、Ｔ．ル
ューデン（Ｒｕｅｄｅｎ）およびＥ．ギルボア（Ｇｉｌ
ｂｏａ）ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、
６３、６７７（１９８９）、欧州特許（ＥＰ）第２５２
９４０号、Ｇ．スザケル（Ｓｃｚａｋｉｅｌ）ら、バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１６９、６４３（１９９
０）、Ｏ．Ｉ．ミロスキニチェンコ（Ｍｉｒｏｓｋｎｉ
ｃｈｅｎｋｏ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）８４、８３（１
９８９）。（Ｔ．シマダら、抗ウイルスの化学および化
学療法（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）２、１３３（１９９
１）；Ｇ．Ｇ．スザケル（Ｓｃｚａｋｉｅｌ）ら、ウイ
ルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６６、５５７６
（１９９２）〕か、あるいは前述の危険（レトロウイル
スの遺伝子の転移）により影響を受けるか、あるいはマ
イクロインジェクションが必要であるので実際的ではな
い。

【０００９】本発明は、ハイブリッドのプロモーターの
遺伝子配列を含有し、そして強い構成的プロモーター活
性あるいは病原体による攻撃の場合において誘発するこ
とができるプロモーター活性を有する、アンチセンスＲ
ＮＡの発現のための発現ベクター構成体に関する。

【００１０】これらは、例えば、アンチセンスＲＮＡの
発現のためのプロモーターのコントロール下に３’→
５’の向き（（＋）−ＤＮＡ鎖のアンチセンスの向き）
に病原性ウイルスのサブゲノム遺伝子配列を含有する発
現ベクター構成体が存在する。本発明の範囲において非
常に適当なものは、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−
１またはＨＩＶ−２からか、あるいは腫瘍ウイルス、例
えば、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩからか、ある
いは腫瘍遺伝子、例えば、ａｂｌ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂ
Ｂ、ｆｍｓ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｒａｓ、ｓｉｓ
およびｓｒｃからのプロウイルスの、サブゲノムＤＮＡ
をアンチセンスの向きに含有するものである。

【００１１】ヌクレオチド７５１４→４７４または５７
８６→４７４または２０９６→４７４または３８２５→
６８１または５７８６→４１５８または５７４６→４６
４８または２３６９→１６３５または３２２７→３００
３または２０９９→６７８または３８２９→２０９９ま
たは４６４７→４１５７または４１５７→３８３０のＨ
ＩＶ−１プロウイルスＤＮＡをアンチセンスの向きに含
有する、アンチセンスＲＮＡの発現のための発現ベクタ
ー構成体は好ましい。

【００１２】また、より短いアンチセンスＲＮＡ転写体
の発現のためのサブジェニック（ｓｕｂｇｅｎｉｃ）プ
ロウイルス遺伝子配列または腫瘍遺伝子配列を３’→
５’向きに含有する発現ベクター構成体を使用すること
ができる。

【００１３】ヌクレオチド６０５→４５５または６７０
→４４０または８２５→５３５または６０７０→５８０
０または５６４０または５０２０または５６００→５０
４０または８６９０→８３００または９１６０→８８０
０のＨＩＶ−１からのプロウイルス遺伝子配列を含有す
る発現ベクター構成体は、述べることのできるこのよう
な発現ベクター構成体である。

【００１４】１つのウイルスからか、あるいは複数のウ
イルスからの２、３またはそれ以上のサブゲノムの遺伝
子配列を含有する発現ベクター構成体は好ましい。

【００１５】本発明は、また、前述の発現ベクターの構
成体を含有する形質転換された細胞に関する。

【００１６】薬物の調製のための前記発現ベクター構成
体の使用、ならびに発現ベクター構成体の１または２以
上を含有する薬物は、また、本発明の範囲内である。

【００１７】ここに記載する発現ベクター構成体を使用
して、ＨＩＶの複製のための抗ウイルス作用は、関係す
るヒト宿主細胞において実証され、ヒト細胞において６
０日を越える間ＨＩＶ−１複製に対する完全な保護を提
供し、そしてさらにＨＩＶ−２複製の有意な阻害を生成
する。

【００１８】本発明において、例として、ヒト免不全ウ
イルス、ＨＩＶ−１遺伝子、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、
ＲＥＶ、ＴＡＴおよびＶＰＵここにおいて使用する、ト
ランスフェクションされた細胞におけるメッセンジャー
リボ核酸の転写体を発現する発現ベクター構成体の構成
および組成物を記載し、これらの転写体は不必要なウイ
ルス遺伝子のｍＲＮＡ配列に対して相補的である〔Ｗ．
Ａ．ヘイセルタイン（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ）ら、サイエ
ンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ）ＵＳＡ、１９８８、３４−４２〕。
さらに、記載するアンチセンスＲＮＡ配列は、遺伝子Ｇ
ＡＧ、ＰＯＬおよびＶＩＦの領域においてＨＩＶ−２に
対して十分に相同性であって〔例えば、分離物ＨＩＶ−
２ Ｄ１９４：ヒトレトロウイルスおよびエイズ（Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤ
Ｓ）、メイアーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）ら編、Ｌｏａ Ａｌ
ａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ．、１９９２、お
よびＥＭＢＬ受け入れ番号Ｘ５２２２３〕ＨＩＶ−２分
離物に対する抗ウイルス作用を同様によく達成する。発
現ベクター構成体は、アンチセンスの向き（３’→
５’）にサブゲノムのＨＩＶ−１のＤＮＡ断片をもつ、
選択したプロモーター配列およびハイブリッドのプロモ
ーター配列（例えば、ＣＭＶ−ＩＥ／メタロチオネイン
Ｉ）の配置の特定の性質により区別され、構成的または
誘発可能な方法でＲＮＡのスプライシングによりいくつ
かのアンチセンスＲＮＡ転写体の転写を生ずる。このよ
うにして形成したアンチセンスＲＮＡ転写体は、驚くべ
き方法において、ヒト細胞においてＨＩＶ−１複製の明
確なまたは完全な阻害を示した（例えば、ＨＵＴ７８、
Ｕ９３７）。ＨＩＶ−２複製の明瞭な阻害は、また、観
察された。ＨＩＶ−２はここに記載する発現ベクター構
成体において十分なＲＮＡ配列の相同性を実証して、ア
ンチセンスＲＮＡによるウイルスの複製の阻害が生ずる
ことを保証する。こうして、本発明は、例としてＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２を使用して、レトロウイルスの複
製を阻害する方法を包含し、この方法は造血細胞、すな
わち、ヒトの細胞仲介免疫応答のために重要な細胞（例
えば、Ｔ細胞、単球）を、細胞障害性および細胞崩壊性
ウイルスの増殖から、抗ウイルス活性のアンチセンスＲ
ＮＡの発現の特定のモードにより、保護するために適当
である。

【００１９】ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の感染から知
られているように、抗ウイルスアンチセンスＲＮＡの発
現により、レトロウイルスの細胞障害性作用に対して抵
抗性の免疫系の細胞をつくるための、実験の手順は次の
通りであった。

【００２０】プロモーター：造血細胞の中で構成的にか
つ強く発現するプロモーター、例えば、サイトメガロウ
イルスＩＥプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）を含有する発
現ベクターを構成した。さらに、ウイルスの攻撃の場合
において増幅された発現を追加的に誘発する、プロモー
ターを、また、核酸配列の融合により構成した。とく
に、これらのハイブリッドのプロモーターの１成分は、
ＣＭＶ−ＩＥメタロチオネインプロモーター断片および
ヌクレオチド２８９−４７４または２８９−５３２のＨ
ＩＶ−１ＬＴＲ核酸断片（ヌクレオチドの番号：ＵＷＧ
ＣＧ ＧＥＮＥＭＢＬ ＤＡＴＡ ＢＡＮＫ ファイ
ル：ＨＩＶＨＸＢ２ＣＧ。ＶＩＲＡＬ、１９８７年９月
２５日）、これは増幅された、必要に応じてトランス活
性化可能な、補助的活性に寄与する、である。

【００２１】アンチセンス核酸断片 さらに、ベクター構成体は、記載するプロモーターコン
トロール下に、アンチセンスの向きにサブゲノムの、プ
ロウイルスのＤＮＡ断片を含有する、すなわち、ＤＮＡ
の（＋）−鎖は３’→５’の方向に転写される。

【００２２】安全性の理由で、レトロウイルスの完全な
プロウイルスのゲノムのＤＮＡ断片は使用しない。しか
しながら、より長いＲＮＡ転写体においてＲＮＡのスプ
ライシングがいっそう起こりやすいので、短い、サブジ
ェニックの、プロウイルスのＤＮＡ断片よりむしろ、よ
り長い、サブゲノムの、プロウイルスのＤＮＡ断片を主
として使用しそして、このようにして、本発明に従いプ
ロウイルスのＤＮＡ断片からより多くのアンチセンスＲ
ＮＡ転写体が期待されそして事実述べる実施例において
見いだされた。（アンチセンスの向きにおいて使用した
ＨＩＶ配列について期待すべき、完全にプロセシングさ
れたアンチセンスｍＲＮＡ転写体の型および数は、決定
的予測を可能とするｍＲＮＡのスプライシングのため
に、十分に正確なコンセンサス配列が存在しないので、
予測可能ではない。）アンチセンスＲＮＡ転写体の数を
増加すると、それらの固有の性質、例えば、核からの輸
出または細胞質中の安定性により、また、効力のある抗
ウイルス活性をもつアンチセンスＲＮＡ転写体を産生す
る確率が増加する。

【００２３】本発明は、さらに、強いプロモーターコン
トロール下に、アンチセンスＲＮＡの転写のための融合
した遺伝子断片を含有する発現ベクターの構成体に関す
る。融合した遺伝子断片は、例えば、ＨＩＶ−１および
ＨＩＶ−２からの、２つの異なるまたはいくつかの異な
る病原性ウイルスからのサブゲノムのＤＮＡ断片から構
成されている。このような融合した遺伝子断片は、異な
るウイルスからのｍＲＮＡ配列領域に対して相補的であ
る、いくつかのアンチセンスＲＮＡ配列領域を順番にを
含有するＲＮＡ転写をエンコードし、これらを使用し
て、より広い抗ウイルス作用をもつ発現ベクターを構成
できる。

【００２４】この原理の有効性は実施例１、４、５、１
０および１２により確証される。例えば、発現ベクター
の構成体ＫＴＸ１１、ｐＳＸＫ１およびｐＳＸＫ２はＨ
ＩＶ−１ ＬＡＶ／ＢＲＵからのアンチセンスＤＮＡ断
片を含有し、それら自体、また、ＨＩＶ−２ Ｄ１９４
からｍＲＮＡに対して相補性である、より短いセグメン
トを含有する（例えば、ヌクレオチド６２０−６６０ま
たは８３７−８９９または４８６８−５０４４）。

【００２５】このようにして、ＫＴＸ１１、ｐＳＸＫ１
およびｐＳＸＫ２からのアンチセンスＲＮＡは、また、
ＨＩＶ−２に対して抗ウイルス性である。

【００２６】これらのベクターのアンチセンスＲＮＡを
エンコードする配列は、さらに、他のウイルス（例え
ば、ＨＩＶ−２分離物、他のＨＩＶ−１分離物）からの
プロウイルスのＤＮＡの断片とアンチセンスの向きに融
合することができるので、他のウイルスの配列に対する
アンチセンスＲＮＡのセグメント的に最適化された相補
性の結果、異なるウイルスの改良されたまたは完全な阻
害を１つの発現ベクターの構成体で同時に達成すること
ができる。

【００２７】アンチセンスＲＮＡ転写体の停止はポリア
デニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０またはウシ成長ホ
ルモンからの）で達成して、高度に安定なｍＲＮＡを発
生させる。さらに、ベクターは適当な選択マーカーの発
現のための完全なオペロンを含有する。表した実施例に
おいて、抗生物質耐性ＴＮＲ５ｎｅｏ（ネオマイシン、
ゲネチシン、Ｇ４１８、カナマイシン）を使用して、転
写後、アンチセンスＲＮＡの発現のための遺伝子構成体
を含有する細胞を選択する。

【００２８】この選択マーカーはヒト造血細胞のために
価値があることが証明された。他の選択マーカー、例え
ば、プロマイシンまたはヒグロマイシンまたはメトトレ
キセートをジヒドロフォレートリダクターゼの遺伝子の
トランスフェクションと組み合わせて、また、使用する
ことができる。

【００２９】アンチセンスヌクレオチド配列としてとく
に適当なものは、ヌクレオチド２１００−５８００の間
のＨＩＶのＰＯＬ／ＶＩＦ遺伝子領域からのものであ
る。とくに、ヌクレオチド５７８６→４１５８のアンチ
センスヌクレオチド配列は例外的な抗ウイルス活性を有
することが示された。この遺伝子領域からの他の断片、
例えば、５７４６→４６４８または４６４７→４１５７
または５８８０→３８８０または５８５０→４１５８ま
たは５１５０→３２００を、また、使用することができ
る。

【００３０】例えば、ＨＩＶ−１に対するアンチセンス
ＲＮＡの抗ウイルス作用を実証するために、ＨＩＶ−１
で感染させることができるヒト細胞系を前述の発現ベク
ターの構成体でトランスフェクションした。この目的
は、ヒト造血細胞の１系列の細胞のタイプにおいて、内
因性アンチセンスＲＮＡの発現がとくに細胞の免疫応答
に参加する細胞においてウイルスの複製の阻害に導くこ
とを実証することであった。エイズの病気の終末期にお
ける免疫系の細胞のこの破壊は、日和見の感染の頻度の
増加、引き続くしばしばの致死的結果と因果的関連性を
有する。この理由で、造血細胞を使用する、およびこれ
に関して、最初に永久的細胞系、例えば、ＨＵＴ７８、
ＭＯＬＴ４、Ｕ９３７、ジャーカット（Ｊｕｒｋａ
ｔ）、ＣＥＭ−ＣＭ３〔すべてはアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリ
イランド州ベセスダ）を使用する研究の目的は、ベクタ
ーのトランスフェクション、細胞系のクローニングおよ
び遺伝学的特性決定に従い、適当なＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２分離物を使用して感染の実験において、これら
のトランスフェクションした細胞系の「ウイルス抵抗
性」を決定することであった。

【００３１】本発明は、これらの細胞における抗ウイル
ス活性のアンチセンスＲＮＡの発現の実証が、血液形成
細胞における発現構成体の有用性および最終的に、ま
た、治療学的目的のために血液形成骨髄組織の細胞の形
質転換のための、それらの使用を示すことであった。治
療学的目的のために、末梢血液リンパ球および骨髄細胞
の中への遺伝子の組み込みは、また、どこかで記載され
ており〔Ｋ．Ｗ．クルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）ら、Ｔｒａ
ｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２３、１７０−１７７（１
９９１）〕そして原理的にはここに述べるアンチセンス
ＲＮＡ発現構成体に応用することができるであろう。

【００３２】実施例 実施例１ 発現ベクターの構成体ＫＴＸ１１ （以下において、特記しない限り、すべてのヌクレオチ
ドの番号はヒト免不全ウイルス１型（ＨＸＢ２）配列に
関する、ＵＷＧＣＧ、ＧＥＮＥＭＢＬ ＤＡＴＢＡＮ
Ｋ、ファイル：ＨＩＶＨＸＢ２ＣＧ．ＶＩＲＡＬ、１９
８７年９月２５日。） ＨＩＶ−１感染可能な細胞のトランスフェクション後の
抗ウイルス活性なアンチセンスＲＮＡの内因性発現のた
めに、次の発現ベクターを構成した：ネズミのメタロチ
オネインＩプロモーター〔１６００塩基対のＥｃｏＲＩ
−ＢｇｌＩＩ断片（Ｎ．グランビレ（ｇｌａｎｖｉｌｌ
ｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９２、２６７−
２６９（１９８２）〕を、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩアダプ
ターの結合後のプロウイルスのＨＩＶ−１のＤＮＡ配列
の３’領域からのＳａｌＩ切断部位（ヌクレオチド５７
８６）と結合して、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩおよびＳａｌ
Ｉ切断部位の修飾を生じた。

【００３３】プロウイルスのＨＩＶ−１のＤＮＡの５’
領域からのＢｇｌＩＩ切断部位（ヌクレオチド４７４）
をＢａｍＨＩ切断部位と結合し、これにＳＶ４０ポリア
デニル化シグナルを接続する（ＵＷＧＣＧ ＧｅｎＥＭ
ＢＬ ファイル ＳＶ４０ＸＸからの配列が欠失したヌ
クレオチド２５６４−４７１３）。ＳＶ４０からのこの
同一のポリアデニル化配列をＴＮＲ５ＮＥＯの停止につ
いて３’→５’方向に使用する〔選択マーカーネオマイ
シン（ホスホトランスアセチラーゼ）、ヌクレオチド１
−１２８６ ＴＮＲ５ＮＥＯ ＢＡＣＴＥＲＩＡ、ＵＷ
ＧＣＧ ＧｅｎＥＭＢＬ〕。ネオマイシン遺伝子の発
現はＳＶ４０の初期のプロモーターにより開始する（ヌ
クレオチド５１７１−３７１、ＵＷＧＣＧ ＧｅｎＥＭ
ＢＬ ＳＶ４０ＸＸ）。そうでなければ、ベクターは、
また、バクテリア由来およびアンピシリン遺伝子をもつ
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（ヌクレオチド２０６７−４３６
３、ＵＷＧＣＧ ＧｅｎＥＭＢＬ ファイルＰＢＲ３２
２）を含有して、それをＥ．ｃｏｌｉおよび動物細胞の
ためのシャトルベクターとして使用できるようにする。
このベクターＫＴＸ１１の遺伝子地図を図１に表す。

【００３４】実施例２ 発現ベクターの構成体ＫＴＸ１２ ＨＩＶ−１アンチセンスＲＮＡ発現ベクターＫＴＸ１２
はベクターＫＴＸ１１（実施例１）と同一の方法で構成
する。しかしながら、それは誘発可能なハイブリッドの
プロモーターを含有し、そしてＨＩＶ−１鋳型ＤＮＡ鎖
はヌクレオチド７５１４→４７４からこのハイブリッド
のプロモーターの背後で３’→５’向きに伸長する。

【００３５】ハイブリッドのプロモーターを得るため
に、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーター断片のヌクレオチ
ド２８９→５３２をメタロチオネインのプロモーターの
ヌクレオチド３６８上に融合した（ＵＷ ＧＣＧ ファ
イル ＭＵＳＭＥＴＩ．ＲＯ）。このベクターＫＴＸ１
２の制限地図を図２に表す。

【００３６】実施例３ 発現ベクターの構成体ＫＴＸ１５ ＨＩＶ−１アンチセンスＲＮＡ発現ベクターＫＴＸ１５
はベクターＫＴＸ１２（実施例２）と同一の方法で構成
する。しかしながら、ＨＩＶ−１鋳型ＤＮＡ鎖（３’→
５’の向き）は実質的に短縮され、ヌクレオチド２０９
６からヌクレオチド４７４に伸長し、これによりＧＡＧ
配列、リーダー配列、Ｕ５配列およびＲ配列の一部分か
らなる。ベクターＫＴＸ１５のそれ以上の重要な性質
は、ＨＩＶ−ＬＴＲハイブリッドのプロモーターの中の
ヌクレオチド４７４−５３２が欠失された、ＴＡＲ配列
の欠失である。結局、なおＨＩＶ感染の場合においてハ
イブリッドのプロモーターを活性化することができるで
あろうが、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質をもたない転
写のＴＡＲによりエンコードされる停止〔Ｓ．Ｙ．カオ
（Ｋａｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３０、４
８９（１９８７）〕は防止されるであろう。これによ
り、このハイブリッドのプロモーターはＨＩＶ−１ Ｌ
ＴＲプロモーター配列のコントロール下に、とくに高い
構成的転写により区別される。このベクターＫＴＸ１５
の制限地図を図３に表す。

【００３７】実施例４ 発現ベクターの構成体ｐＳＸＫ１ ＨＩＶ−１アンチセンスＲＮＡの発現ベクターｐＳＸＫ
１を調製して、他の強い、構成的に発現するプロモータ
ーコントロール下のアンチセンスＤＮＡの発現を示し、
ここにおける実施例はサイトメガロウイルスのプロモー
ターである。ＨＩＶ−１遺伝子断片のヌクレオチド６８
１−３８２５を３’→５’の向きにヌクレオチド８９１
におけるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入した〔ベクター
ｐＲｃ／ＣＭＶ、カタログＮｏ．Ｖ７５０−２０、イン
ビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォル
ニア州９２１２１、サンディエゴから〕。ポリアデニル
化シグナルはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子から来
る。

【００３８】それ以外は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製お
よび選択のためのネオマイシン選択マーカーおよびｐＢ
Ｒ３２２のＤＮＡ断片をもつベクターをベクターＫＴＸ
１１（実施例１）と同一の方法でシャトルベクターとし
て構成する。ベクターｐＳＸＫ１の制限地図を図４に表
す。

【００３９】実施例５ 発現ベクターの構成体ｐＳＸＫ２ ＨＩＶ−１アンチセンスＲＮＡ発現ベクターｐＳＸＫ２
は、メタロチオネインプロモーター（ＵＷＧＣＧ Ｇｅ
ｎＲＭＢＬ ファイル ＭＵＳＭＥＴＩ．ＲＯ）のヌク
レオチド１５０−３６９と融合した、ＣＭＶプロモータ
ー（参照、実施例４）のヌクレオチド２０９−８６５か
らなる融合したプロモーター配列を有することにおいて
ベクターｐＳＸＫ１と異なり、こうしてまたハイブリッ
ドのプロモーターを表す。さらに、ヌクレオチド４１５
８−５７８６のプロウイルスのＤＮＡ配列は、ＣＭＶ／
メタロチオネインのハイブリッドのプロモーターのコン
トロール下に、アンチセンスＲＮＡの発現のための鋳型
として３’→５’の向きに挿入した。ベクターｐＳＸＫ
２の制限地図は図５に再生されている。

【００４０】実施例６ 発現ベクターの構成体ｐＨＴＴ１、４、６、９、１０、
１２および１５ ＨＩＶ−１アンチセンスＲＮＡ発現ベクターｐＨＴＴ
１、４、６、９、１０、１２および１５は、ベクターｐ
ＳＸＫ１（実施例４、図４）と同様な方法において調製
した。ｐＨＴＴベクターの中に挿入されたすべてのＨＩ
Ｖ−１遺伝子断片を、構成的に発現するサイトメガロウ
イルスのプロモーターのコントロール下に、ベクターｐ
Ｒｃ／ＣＭＶ〔インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）、米国カリフォルニア州９２１２１、サンディエゴ
から、カタログＮｏ．Ｖ７５０−２０、１９９１〕の中
に３’→５’の向きにクローニングした。

【００４１】ｐＨＴＴを下に特定する： （ａ）ｐＨＴＴ１：ＨＩＶ−１遺伝子断片（ヌクレオチ
ド４６４８−５７４６）をｐＲｃ／ＣＭＶベクターのＮ
ｏｔＩ切断部位（ヌクレオチド９６６）の中に組み込ん
だ。

【００４２】（ｂ）ｐＨＴＴ４：ＨＩＶ−１遺伝子断片
（ヌクレオチド１６３５−２６３９）をｐＲｃ／ＣＭＶ
ベクターのＸｂａＩ切断部位（ヌクレオチド９８５）の
中に組み込んだ。

【００４３】（ｃ）ｐＨＴＴ６：ＨＩＶ−１遺伝子断片
（ヌクレオチド３００３−３２７７）を（ｂ）に記載す
るようにＸｂａＩ切断部位の中に組み込んだ。

【００４４】（ｄ）ｐＨＴＴ９：ＨＩＶ−１遺伝子断片
（ヌクレオチド６７８−２０９９）を（ｂ）に記載する
ようにＸｂａＩ切断部位の中に組み込んだ。

【００４５】（ｅ）ｐＨＴＴ１０：ＨＩＶ−１遺伝子断
片（ヌクレオチド２０９９−３８２９）を（ｂ）に記載
するようにＸｂａＩ切断部位の中に組み込んだ。

【００４６】（ｆ）ｐＨＴＴ１２：ＨＩＶ−１遺伝子断
片（ヌクレオチド４１５７−４６４７）を（ｂ）に記載
するようにＸｂａＩ切断部位の中に組み込んだ。

【００４７】（ｇ）ｐＨＴＴ１５：ＨＩＶ−１遺伝子断
片（ヌクレオチド３８３０−４１５７）を（ｂ）に記載
するようにＸｂａＩ切断部位の中に組み込んだ。

【００４８】実施例１〜６のベクターの中にアンチセン
スの向き（３’→５’）に含有されるＨＩＶ−１遺伝子
断片の全体的線図を図６に再生されている。

【００４９】実施例７ アンチセンスＲＮＡ発現ベクターをもつヒトリンパ球の
トランスフェクションおよびクローニング 非付着的に成長する単球様細胞系Ｕ９３７および非付着
的に成長するＴ−リンパ球細胞系ＨＵＴ７８を、ＨＩＶ
−１に対して内因的に発現されたアンチセンスＲＮＡの
結果としてウイルス耐性を示す、トランスフェクション
されたヒト造血細胞系の例として選択した。両者の細胞
系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）米国マリイラ
ンド州２０８５２−１７７６、ロックビレ、パークッロ
ーンドライブ１２３０１）から入手した。

【００５０】細胞系をＡＴＣＣにより推奨される培地の
中で培養した。ベクターのトランスフェクションは、最
も有望であると証明されたエレクトロポレイションの種
々の方法で実施した： １、リン酸カルシウム法：ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）
ら、１９７７、細胞（Ｃｅｌｌ）、１１、２２３の方法
の変法。

【００５１】トランスフェクションはＤＮＡのＣａ沈澱
物を使用して実施する。０．０５〜２０μｇの変化する
量のＤＮＡを０．２５ｍｌの２５０ミリモルのＣａＣｌ
₂中に溶解し、そして０．２５ｍｌの２×ＨＥＢＳ緩衝
液の中にピペットでゆっくり入れた。トランスフェクシ
ョンは沈澱混合物の全体を１０ｍｌの細胞培養物に添加
することによって実施した。１５時間後、この培地を吸
引により除去した。次いで、細胞をＤＭＳＯでショック
処理した。

【００５２】１０ｍｌの培養について、３ｍｌの無菌の
ＰＢＳ中の２５％の溶液を添加した。４分後、液体を吸
引により除去し、そして細胞を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し
た。引き続いて、細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭの中に取っ
た。

【００５３】２、ＤＥＡＥ−デキストラン トランスフェクションの１日前に、細胞を３〜４×１０
⁵／ｍｌの培地の密度にサブクローニングした。トラン
スフェクションの２〜４時間前に、細胞を遠心し、そし
て新鮮な培地の中に取った。０．５〜２０μｇのＤＮＡ
を１０７０μｌのＰＢＳと混合し、これに１２０μｌの
１０ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン溶液（トラン
スフェクション溶液）を添加した。トランスフェクショ
ン前に、４０ｍｌの細胞を遠心し、１０ｍｌのＰＢＳの
中に取り、そしてもう一度遠心した。

【００５４】細胞の沈澱物を１．２ｍｌのＰＢＳ−ＤＥ
ＡＥ−デキストラン溶液の中に懸濁させ、そして３０分
間インキュベーションした。引き続いて、細胞を０．８
ｍｌの冷ＤＭＳＯ溶液（ＴＢＳ中の２５％）の添加によ
りショック処理した。３分後、１０ｍｌのＴＢＳを添加
し、そしてこの混合物を遠心した。細胞をＲＰＭＩ成長
培地の中で洗浄し、そして４０ｍｌの同一培地の中に取
った。

【００５５】３、融合〔サナリ−ゴールディン（Ｓａｎ
ａｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎ）法〕 対数成長する細胞（１×１０⁷細胞／ｍｌ）を遠心し、
そしてＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。２ｍｌのＥ．ｃｏ
ｌｉの原形質体の懸濁液（１０％のスクロースおよび１
０ミリモルのＭｇＣｌ₂の中で２×１０³細胞／ｍｌ）を
細胞の沈澱物に添加した。トランスフェクションするプ
ラスミドをもつ原形質体をサナリ−ゴールディン（Ｓａ
ｎａｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎ）らの方法により調製した。８
分間インキュベーションした後、遠心を実施し、次いで
ＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコール４００；ＲＰＭＩ
中の４５％の溶液）２分以内に注意して添加した。１分
間インキュベーションした後、１０ｍｌのＦＣＳを含ま
ないＲＰＭＩ培地を７分以内に添加した。細胞を遠心
し、ＲＰＭＩ培地の中で洗浄し、そして１０ｍｌの中に
取った。

【００５６】４、エレクトロポレイション（ＥＰ）をバ
イオ・ラド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）からの遺伝子パスラー装
置およびコンデンサのエクステンダオを使用して実施し
た。対数成長した細胞を１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密
度に調節し、１×ＰＢＳで洗浄し、そしてＦＣＳを含ま
ない１０ミリモルのデキストロースおよび０．１ミリモ
ルのジチオスレイトールを有するＲＰＭＩ培地の中に再
懸濁させた。

【００５７】０．４ｍｌの細胞懸濁液をＥＰクベットの
中に入れ、そして１０〜２０μｇのＤＮＡを添加した。
ＤＮＡを１μｇのＤＮＡ／１μｌのＴＥの比率で溶解し
た。エレクトロポレイションの条件は次のように変化さ
せた：キャパシタンス：２６０−９６０μＦ；電圧１５
０−３００Ｖ；電極距離０．２／０．４ｃｍ；抵抗１０
０−∞ｏｈｍ。

【００５８】エレクトロポレイションの前および後に、
細胞を室温において１０分間インキュベーションし、次
いで１０ｍｌの成長培地＋１０％のＦＣＳの中に二次培
養物した。

【００５９】トランスフェクション体の選択：トランス
フェクション体の選択は、各場合において、Ｇ４１８に
対する耐性に基づいて実施した。

【００６０】１、トランスフェクションした細胞をまず
Ｇ４１８を含有する遺伝子の中で、それ以上の成長が観
察されなくなるまで、予備インキュベーションした。寒
天（Ｇｉｂｃｏ）またはメチルセルロースを培地の固化
のために使用した。前以て選択した細胞を組織培養プレ
ート（１０ｃｍ）上にまき、そしてこれに１０ｍｌの選
択培地（ＲＰＭＩ＋１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８）および２
ｍｌの２％の液化した寒天溶液に添加した。寒天が冷却
した後、プレートをインキュベーター内で３７℃におい
てインキュベーションした。この実験の変法において、
寒天をメチルセルロースと置換した。

【００６１】２、トラスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）
細胞培養チャンバー〔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ^R、コスター
（Ｃｏｓｔａｒ）から〕の中の引き続くクローニングに
より選択 ４８時間インキュベーションした後、細胞を９６ウェル
マイクロタイタープレート上に１×１０⁵細胞／０．２
ｍｌのウェルの密度でまいた。Ｇ４１８をＵ９３７につ
いて０．７ｍｇ／ｍｌおよびＨＵＴ７８について１．０
ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。培地が使用尽くされると
すくに、各ウェルの１／２体積を新鮮な培地と交換し
た。Ｕ９３７の各場合において、次いでさらに０．５ｍ
ｇ／ｍｌのみのＧ４１８を添加した。

【００６２】耐性細胞が個々のウェルの中で成長し始め
るまで、インキュベーションを続けた。これらの混合し
たクローンをより大きい体積に拡張し、引き続いてクロ
ーニングした。このために、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）
からの特別の成長チャンバー〔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ^R、
カタログＮｏ．３４２５、米国マサチュセッツ州０２１
３９、ケンブリッジ、ブローデウェイ２０５〕を使用し
た。

【００６３】細胞をＧ４１８を有する柔寒天の中で低い
細胞密度（５０〜２００細胞／６ｍｌ）でまき、そして
６ｍｌを中央のチャンバー（上の隔室）に添加した。チ
ャンバーをＵ９３７またはＨＵＴ７８（２００，０００
細胞／ｍｌ）の非常に厚く成長する流体フィーダー培養
物（下の隔室）と膜により分離した。流動性の培地を消
耗後部分的に交換して、さらに細胞が成長するようにし
た。柔寒天の中にＧ４１８耐性コロニーが現れるとすぐ
に、それらをパスツールピペットで分離し、そして拡張
した。

【００６４】このようにして、多少の１０の独立の、ト
ランスフェクションした細胞系を、Ｕ９３７およびＨＵ
Ｔ７８について、ＫＴＸ１１、ＫＴＸ１２、ＫＴＸ１
５、ｐＳＸＫ１およびｐＳＸＫ２の各々を使用してクロ
ーニングし、そしてアンチセンスＲＮＡの発現およびＨ
ＩＶ−１耐性の実証のために処理した。さらに、ＨＵＴ
７８細胞系をベクターｐＨＴＴ１、ｐＨＴＴ４、および
ｐＨＴＴ９およびｐＨＴＴ１０を使用して発生させ、そ
してＨＩＶ感染試験において検査した。

【００６５】実施例８ 発現ベクターＫＴＸ１５を使用する骨髄細胞の形質転換 １例として、マウスのモデルにおける一次骨髄細胞の形
質転換を実証する基本的手順は次の通りであった：一次
骨髄細胞を６〜１０週齢のＣ５７マウスの大腿から分離
した。細胞をＭｃＣｏｙ培地〔フロー（Ｆｌｏｗ）か
ら〕の中に取り、そしてインターリューキン−３および
ＧＭ−ＣＳＦ〔顆粒球−単球コロニー刺激因子；ジーン
ザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）〕、各場合において２．５μ
ｇ／ｍｌの濃度、および寒天〔バクト（Ｂａｃｔｏ）寒
天、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）から；最終濃度０．３％〕
と混合し、そしてペトリ皿の中で毒性抗生物質Ｇ４１８
（ネオマイシン）の存在または不存在下に１×１０⁵細
胞／ｍｌの濃度でプレイティングした。トランスフェク
ションを骨髄細胞の除去後直接実施した後、寒天の中で
プレイティングした。引き続いて、細胞をインキュベー
ターの中で３７℃および７．５％のＣＯ₂において数日
間培養した。種々の時間間隔で、形質転換されたコロニ
ー（少なくとも１０細胞）またはクラスター（１０〜５
０細胞）を各場合において顕微鏡下にカウントした。所
定の実験条件下に、コロニーの大部分を顆粒球／単球ま
たは顆粒球ｎｏコロニーと混合した。赤血球のバースト
が時々観察され、そして血小板生成細胞が１つの場合に
発生した。コロニーの中の細胞の型の同定はメイ−グリ
ューンワルド（Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄ）染色に
より実施した。

【００６６】トランスフェクションの条件を最適化し
た。一次骨髄細胞の首尾よいトランスフェクションは次
の条件下に得られた：８００μｌの骨髄細胞の懸濁液
（実施例７に記載するようにエレクトロポレイション培
地の中の５×１０⁶細胞）、５μｇのＫＴＸ１５、３０
０Ｖ、１００Ω、２５０μＦＤ、６ｍｓにおけるエレク
トロポレイション。

【００６７】エレクトロポレイション〔遺伝子パルサー
装置およびキャパシタンスイクステンダー、バイオ・ラ
ド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）から〕後、細胞を５００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８（ネオマイシン）の存在下に前述の培地の
中で選択した。Ｇ４１８に対する耐性は、増殖可能な一
次骨髄細胞の首尾よいトランスフェクションを示した。

【００６８】実施例９ 完全な発現ベクターの構成体の組み込みの実証およびア
ンチセンスＲＮＡの発現の実証 トランスフェクションされたＵ９３７およびＨＵＴ７８
細胞系の崩壊後、これらの細胞系を標準の方法により塩
化カルシウム密度勾配の遠心により分離した〔Ｌ．Ｇ．
デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、分子生物学における基本的
方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ニューヨーク州エルセビ
アー、（１９８６）〕。アンチセンスＲＮＡの発現のた
めの完全なベクター構成体の組み込みの実証は、ポリメ
ラーゼ連鎖反応〔ＤＮＡ増幅のＰＣＲ技術の原理および
応用（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄ
ＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ヘンリイ（Ｈｅ
ｎｒｙ）Ａ．およびＡ．エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃ
ｈ）、Ｍ．編、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８９）〕により
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施し、これ
はプロモーター配列、インサート配列および停止配列の
オーバーラッピングＤＮＡ断片を増幅した。引き続い
て、増幅したＤＮＡはスロット−ブロット分析〔デイビ
ス（Ｄａｖｉｓ）ら、上を参照〕によりＤＮＡインサー
ト遺伝子プローブを使用して同定した。分析結果の例は
図７、８および９に記載する。例えば、プロモーター配
列からのフランキングプライマー５’−ＣＡＡ ＡＣＣ
ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＣＣ ＣＧ−３’およびポリアデ
ニル化配列からのフランキングプライマー５’−ＴＴＴ
ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣＴＴ−
３’をベクターＫＴＸ１１、ＫＴＸ１２およびＫＴＸ１
５のために使用した。ｐＲｃ−ＣＭＶベクターをもつ発
現ベクターの場合において、例えば、フランキングプラ
イマー５’−ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＴＣＧ
ＴＡＡ ＣＡＡＣＴＣＣ−３’および５’−ＡＴＴ
ＴＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＡＡＴ−
３’を、それぞれ、プロモーター配列および停止配列の
ために使用した。インサート（ＨＩＶ配列）において、
プライマー対の選択に依存して約５００塩基対〜２，１
００塩基対のＰＣＲ産生物を生じたプライマー配列を使
用した。

【００６９】アンチセンスＲＮＡの発現の実証は、クロ
ーニングし、トランスフェクションした細胞系からのＲ
ＮＡのノザンブロット分析〔デイビス（Ｄａｖｉｓ）
ら、上を参照〕により実施した。トランスフェクション
したＵ９３７細胞系の中のＨＩＶ−１アンチセンスＲＮ
Ａの実証についての分析結果の１例を図１０に記載す
る。

【００７０】実施例１０ トランスフェクションし、クローニングした造血細胞系
のウイルス抵抗性の実証 実施例７および９に従い得られそして特性決定された、
クローニングたアンチセンスＲＮＡ発現細胞系を、対照
として出発細胞系ＨＵＴ７８およびＵ９３７と一緒に、
ＨＩＶ−１〔Ｌ．ラーザー（Ｒａｔｈｅｒ）ら、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１３、２７７（１９８５）〕ま
たはＨＩＶ−２ Ｄ１９４〔Ｈ．クーネル（Ｋｕｅｈｎ
ｅｌ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１９９０）１８、６１４０）を使
用する比較感染の研究においてウイルス抵抗性の発現に
ついて検査した。

【００７１】１、ＨＩＶ−１によるＨＵＴ７８およびｕ
８細胞の感染（対照）手順 各場合において、１０ｍｌの細胞懸濁液をＨＵＴ７８／
ＨＩＶ−１培養上澄み液（ＰＢＬ培養物の中の約１０⁴
ＳＦＵ／ｍｌの異なる希釈物、凍結した源溶液６５０，
０００ｃｐｍ／ｍｌのＲＴ活性）で６０分間処理した。
細胞を引き続いて遠心しそして３回洗浄して、結合しな
いウイルス粒子およびウイルスタンパク質を除去した。
最後に、細胞を各場合において１０ｍｌの培地の中に再
懸濁し、そしてインキュベーターの中で培養した。

【００７２】３〜４日毎に、２００μｌの細胞不含培養
懸濁液をＨＩＶ抗原の存在下に試験した。オーガノン・
テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｋａ）からの
抗原捕捉アッセイを使用した。

【００７３】細胞を維持するために、５ｍｌの細胞懸濁
液を各場合において取り出し、そして５ｍｌの培地と置
換した。

【００７４】２、アンチセンスＲＮＡを発現するＨＵＴ
７８細胞およびＵ９３７細胞のＨＩＶによる感染 手順 各場合において、１０ｍｌの細胞懸濁液（約４×１０⁵
細胞／ｍｌ）をＨＵＴ７８／ＨＩＶ−１培養上澄み液
（ＰＢＬ培養物の中の約１０⁴ＳＦＵ／ｍｌの異なる希
釈物、凍結した源溶液６５０，０００ｃｐｍ／ｍｌのＲ
Ｔ活性）で６０分間処理した。源ウイルス溶液の最終の
希釈はＨＵＴ７８細胞について１：１，０００でありそ
してＵ９３７細胞について１：５０であった。細胞を引
き続いて遠心しそして注意して４回洗浄して、結合しな
いウイルス粒子およびウイルスタンパク質を除去した。
最後に、細胞を各場合において１０ｍｌの培地（ＲＰＭ
Ｉ１６４０＋１６％のＦＣＳ）の中に再懸濁し、そして
インキュベーターの中で６０日間培養した。

【００７５】３〜４日毎に、１６０μｌの細胞不含培養
上澄み液をＨＩＶ抗原について試験した。オーガノン・
テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｋａ）からの
抗原捕捉アッセイを付属するマイクロタイタープレート
のフォトメーターとともに使用した。

【００７６】細胞を維持するために、３〜４日毎に５ｍ
ｌの細胞懸濁液を各場合において取り出し、そして５ｍ
ｌの培地と置換した。

【００７７】他のＨＩＶのアンチセンスＲＮＡ発現細胞
系についての代表的な結果として、３つのＨＵＴ７８ト
ランスフェクション体（ＨＵＴＫ１４−ＫＴＸ１１、Ｓ
ＳＨＵＴＫ１６／１−ＳＸＫ１、ＳＳＨＵＴＫ１／１−
ＳＸＫ２）（参照、図１１）および３つのＵ９３７トラ
ンスフェクション体（ｓｓＵＫ２０／４−ＫＴＸ１１
ａ、ｓｓＵＫ３／１−ＳＸＫ２およびｓｓＵＫ２０／１
５−ＫＴＸ１１ｂ）（図１２）を使用する２系列の実験
を述べるすることができ、これらは感染後、逆転写酵素
活性（ＲＴ活性）またはＨＩＶ抗原のいずれをこれらの
細胞培養物において測定しても、発現ベクターｐＳＸＫ
１およびｐＳＸＫ２を収容するこれらのアンチセンスＲ
ＮＡ発現細胞系において６０日までのインキュベーショ
ン期間の間にＨＩＶの増殖を示さない。比較により、Ｈ
ＩＶの増殖は対照細胞系において明瞭に測定可能であ
る。さらに、ウイルスの増殖の遅延した増加は、より弱
く発現する発現ベクターＫＴＸ１１をもつトランスフェ
クション体において観察することができる。結果を図１
１および１２に表す。

【００７８】６０日間のインキュベーション後にＨＩＶ
−１抗原またはＲＴ活性を検出することができなかっ
た、細胞系ＳＳＵＫ３／１−ＳＸＫ２、ＳＳＨＵＴＫ１
６／２−ＳＸＫ１およびＳＳＨＵＴＫ１／１−ＳＸＫ２
において起こったＨＩＶ−１の感染をチェックするため
に、陽性の同定を、例えば、６０日間インキュベーショ
ンしたＳＳＨＵＴＫ１６／２−ＳＸＫ１およびＳＳＨＵ
ＴＫ１／１−ＳＸＫ２の細胞の中のＨＩＶ−１ ＴＡＴ
遺伝子配列およびエンベロープ遺伝子配列のＰＣＲ検出
により実証した（図１３）。この目的で、ＰＣＲプライ
マー５’−ＡＴＧＧＡＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＧＡＴ Ｃ
ＣＴ−３’および５’−ＴＣＴ ＡＣＣＡＴＧ ＴＣＡ
Ｔ−３’を使用して、６９０塩基対の長さのＰＣＲ断片
を発生させた。発現ベクターｐＳＸＫ１およびｐＳＸＫ
２はこれらの配列を含有せず、したがって誤った陽性の
ＰＣＲを産生できなかった。

【００７９】実施例１１ 対照実験 アンチセンスの向きにＨＩＶ−１からのプロウイルスの
ＤＮＡのインサートをもたない実施例１〜６からのベク
ターのトランスフェクションを、細胞系Ｕ９３７および
ＨＵＴ７８において、ウイルスの複製が阻害されなかっ
た細胞系に導かなかった。プロウイルスのＨＩＶ−１の
ＤＮＡ断片がセンス向きに挿入された、実施例１〜６か
らのベクターを使用する対照実験を実施しなかった。な
ぜなら、対応するセンス転写体はＨＩＶ複製の調節タン
パク質、例えば、ＴＡＴおよびＲＥＶと結合し、これに
よりウイルスの複製を競争的に阻害することができ
〔Ｇ．Ｊ．グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、ＰＮＡＳ ８
７、５８１７（１９９０）〕こうして対照実験として不
適当であると思われるからである。

【００８０】実施例１２ アンチセンスＲＮＡを発現するＨＵＴ７８およびＵ９３
７細胞系のＨＩＶ−２による感染 感染の実験を分離物のＨＩＶ−２ Ｄ１９４〔Ｈ．キュ
ーフネル（Ｋｕｅｈｎｅｌ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８（１９９０）６１
４２〕を使用して実施した。２．１４×１０⁵ｃｐｍ／
ｍｌのＲＴ活性および０．２４９ＯＤ_450nmの抗原濃度
（１：１，０００希釈）のウイルス菌株の懸濁液（１６
０μｌの試料）を−８０℃において貯蔵した。５０μｌ
のこのウイルス菌株の懸濁液を４ｍｌの培地中の２×１
０⁶のＨＵＴ７８の感染のために使用し、これを３時間
インキュベーションした。Ｕ９３７細胞の場合におい
て、２×１０⁶細胞を４ｍｌの培地の中で１００μｌの
ウイルス菌株の懸濁液と感染のためにインキュベーショ
ンした。引き続いて、結合しないウイルス粒子を細胞培
養物から洗浄により除去した。

【００８１】３〜４日の間隔において、細胞培養物を維
持し、そして細胞培養物の上澄み液を取り出して、オー
ガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｋ
ａ）からのＨＩＶ抗原の捕捉アッセイによる、付属する
マイクロタイタープレートのフォトメーターを使用する
定量的ＨＩＶ抗原決定にかけた。アンチセンスＲＮＡ発
現ベクターを含有しない、ＨＵＴ７８対照細胞系および
Ｕ９３７対照細胞系におけるＨＩＶ−２ Ｄ１９４の複
製の過程を、図１４および１５において、トランスフェ
クションした細胞系におけるそれと比較し、これらはア
ンチセンスＲＮＡの発現の結果として遅延したＨＩＶ−
２の増殖を実証する。

【００８２】結果 発現ベクターＫＴＸ１１、ＫＴＸ１２、ＫＴＸ１５、ｐ
ＳＸＫ１、ｐＳＸＫ２、ｐＨＴＴ１、ｐＨＴＴ４、ｐＨ
ＴＴ６、ｐＨＴＴ１０、ｐＨＴＴ１２およびｐＨＴＴ１
５（実施例１〜６）を使用して、遺伝子のトランスフェ
クションおよびトランスフェクションした細胞系のクロ
ーニング（実施例７）後、ＨＩＶ−１に対するアンチセ
ンスＲＮＡがヒト血液細胞系において内因的に形成し
（実施例９）そしてその抗ウイルス作用は実証された
（実施例１０、１２）。

【００８３】レトロウイルスのＨＩＶ−１の複製の明瞭
に発現された阻害はトランスフェクションされた細胞系
において実証されたことは驚くべきことである。アンチ
センスＲＮＡを発現する細胞のウイルス抵抗性は、ま
た、同様な方法において、トランスフェクションされた
細胞系に特別に適合したＨＩＶ−１ウイルスで示すこと
ができた（図１１、１２）。アンチセンスＲＮＡのマー
クした抗ウイルス性質は、また、ＨＩＶ−２に対して示
された（図１４、１５）。

【００８４】１例として、これらの結果が示すように、
アンチセンスＲＮＡ分子の発現に適当なプロモーターお
よび当然、また、アンチセンスＲＮＡ配列の性質は、遺
伝的に変更した細胞におけるレトロウイルスの攻撃に対
する抵抗性の発生に導く。実施例９に示すように、３’
→５’の向きのプロウイルスＨＩＶ−１のＤＮＡの
（＋）−鎖のＨＩＶ−１のＲＮＡ転写体の従来未知のス
プライシングのために、抗ウイルス作用に導く、いくつ
かのｍＲＮＡ分子が生ずる。

【００８５】実施例１〜１２に記載した実験により、レ
トロウイルスからのアンチセンスＲＮＡをエンコードす
るＤＮＡ断片をもつ適当な発現ベクターの構成体を使用
して、抗レトロウイルスの性質は細胞の中で生成するこ
とができ、そしてこれらの性質はレトロウイルスの攻撃
に対して保護することが示された。

【００８６】図１１〜１３から明らかなように、細胞系
ＳＳＨＵＴＫ１６／２−ＳＸＫ１およびＳＳＨＵＴＫ１
／ＳＸＫ２は、ＨＩＶ感染後６０日に、ＰＣＲ分析によ
りプロウイルスのＨＩＶ−１のＤＮＡの検出について陽
性であるが、ＨＩＶ抗原の検出に関して陰性である。こ
の結果から結論されるように、プロウイルスのＤＮＡは
ＨＩＶ複製サイクルの第１段階においてトランスフェク
ションされたＨＵＴ７８細胞系において事実なお形成す
るが、プロウイルスのＤＮＡの転写／翻訳はアンチセン
スＲＮＡにより防止され、そしてウイルスの複製のため
のＨＩＶタンパク質は検出可能な量で形成しない。

【００８７】細胞系ＳＳＵＫ３／１−ＳＸＫ２のＤＮＡ
において、ＨＩＶタンパク質またはプロウイルスのＨＩ
ＶのＤＮＡのいずれをも試験試料のいずれにおいても、
それぞれ、抗原試験およびＰＣＲ分析を使用して、ＨＩ
Ｖ−１による感染後６０日に検出することができなかっ
た。この結果が示すように、細胞系ＳＳＵＫ３／１−Ｓ
ＸＫ２において形成したアンチセンスＲＮＡはＨＩＶ複
製サイクルの第２段階（プロウイルスのＤＮＡの転写お
よび翻訳）を抑制するばかりでなく、かつまた複製サイ
クルの第１段階を阻害しさえする。

【００８８】逆転写のプロセスによりゲノムの（＋）−
鎖ＲＮＡからのプロウイルスのＤＮＡの形成は、明らか
なようにアンチセンスＲＮＡにより防止することができ
る。アンチセンスＲＮＡのこの作用は思索的に仮定する
ことができるが、対応して強力な発現ベクターの構成体
が従来発見されてきていないので、従来実証することが
できなかった〔Ｒ．Ｙ．Ｌ．トウ（Ｔｏ）およびＰ．
Ｅ．ネイマン（Ｎｅｉｍａｎ）、遺伝子の調節：アンチ
センスＲＮＡおよびＤＮＡの生物学（ＧｅｎｅＲｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ：Ｂｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓ
ｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ）、Ｒ．Ｐ．エリクソン
（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）およびＪ．Ｇ．イザント（Ｉｚａ
ｎｔ）、レイベン・プレス・リミテッド（Ｒａｖｅｎ
ＰｒｅｓｓＬｔｄ．）、ニューヨーク、１９９２〕。

【００８９】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【００９０】１、ハイブリッドプロモーターの遺伝子配
列を含有し、そして強い構成的プロモーター活性あるい
は病原体による攻撃の場合において誘発することができ
るプロモーター活性を有することを特徴とするアンチセ
ンスＲＮＡの発現のための発現ベクター構成体。

【００９１】２、病原性ウイルスのｍＲＮＡに対して相
補的なヌクレオチド塩基配列を表す、アンチセンスＲＮ
Ａの発現のためのプロモーターのコントロール下に３’
→５’の向き（アンチセンスの向き）に病原性ウイルス
のサブゲノム遺伝子配列を含有することを特徴とする上
記第１項記載の発現ベクター構成体。

【００９２】３、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１
またはＨＩＶ−２からか、あるいは腫瘍ウイルス、例え
ば、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩからか、あるい
は腫瘍遺伝子、例えば、ａｂｌ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢ、
ｆｍｓ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｒａｓ、ｓｉｓおよ
びｓｒｃからのプロウイルスの、サブゲノムのＤＮＡを
アンチセンスの向きに含有することを特徴とする上記第
１および２項記載の発現ベクター構成体。

【００９３】４、プロモーターまたはハイブリッドプロ
モーターの遺伝子配列およびヌクレオチド７５１４→４
７４または５７８６→４７４または２０９６→４７４ま
たは３８２５→６８１または５７８６→４１５８または
５７４６→４６４８または２３６９→１６３５または３
２２７→３００３または２０９９→６７８または３８２
９→２０９９または４６４７→４１５７または４１５７
→３８３０のアンチセンスの向きのＨＩＶ−１プロウイ
ルスＤＮＡを含有することを特徴とする、アンチセンス
ＲＮＡの発現のための発現ベクター構成体。

【００９４】５、より短いアンチセンスＲＮＡ転写体の
発現のためのサブジェニックプロウイルス遺伝子配列ま
たは腫瘍遺伝子配列を３’→５’向きに含有することを
特徴とする上記第１項記載の発現ベクター構成体。

【００９５】６、ヌクレオチド６０５→４５５または６
７０→４４０または８２５→５３５または６０７０→５
８００または５６４０または５０２０または５６００→
５０４０または８６９０→８３００または９１６０→８
８００のＨＩＶ−１からのプロウイルス遺伝子配列を含
有する上記第４項記載の発現ベクター構成体。

【００９６】７、１つのウイルスからか、あるいは複数
のウイルスからの２、３またはそれ以上のサブゲノムの
遺伝子配列を含有することを特徴とする上記第１〜６項
のいずれかに記載の発現ベクター構成体。

【００９７】８、上記第１〜７項のいずれかに記載の発
現ベクター構成体を含有する形質転換された細胞。

【００９８】９、薬物の調製のための上記第１〜７項の
いずれかに記載の発現ベクター構成体の使用。

【００９９】１０、上記第１〜７項のいずれかに記載の
発現ベクター構成体を含有する薬物。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−１のアンチセンスＲＮＡの発現のため
の発現ベクターＫＴＸ１１。メタロチオネインのプロモ
ーター（ＭＴＩプロモーター）はヌクレオチド５７８６
→４７４〔番号：ＵＷＧＣＧ ＧＥＮＥＲＭＢＬ ＤＡ
ＴＡ ＢＡＮＫ ファイル ＨＩＶ ＨＸＢ２ＣＧ．Ｖ
ＩＲＡＬ〕のプロウイルスのＨＩＶ−１のＤＮＡ断片か
らのアンチセンスＲＮＡの転写を推進する。ネオマイシ
ン耐性遺伝子ＴＮＲ５ｎｅｏはＳＶ４０の初期のプロモ
ーターにより転写される。このシャトルベクターは、ま
た、ｐＢＲ３２２由来およびアンピシリン遺伝子（ｐＢ
Ｒ３２２−ａｍｐ）を含有する。それ以上の詳細は実施
例１に記載されている。

【図２】ＨＩＶ−１ ＬＴＲメタロチオネインのハイブ
リッドのプロモーターのコントロール下のＨＩＶ−１の
アンチセンスＲＮＡの発現のための発現ベクターＫＴＸ
１２。このベクターの構成の詳細は実施例２に記載され
ている。

【図３】ＨＩＶ−１ ＬＴＲメタロチオネインのハイブ
リッドのプロモーターのコントロール下のＨＩＶ−１の
アンチセンスＲＮＡの発現のための発現ベクターＫＴＸ
１５、ここでトランスアクチベーターのタンパク質ＴＡ
Ｔの不存在下に最大の発現を達成するためにＨＩＶ−１
ＴＡＲ配列は欠失されている。このベクターの構成の
詳細は実施例３に記載されている。

【図４】サイトメガロウイルスのプロモーター（ＣＭ
Ｖ）のコントロール下のＨＩＶ−１のアンチセンスＲＮ
Ａの発現のための発現ベクターｐＳＸＫ１。このベクタ
ーの構成の詳細は実施例４に記載されている。

【図５】サイトメガロウイルスのプロモーター（ＣＭ
Ｖ）のコントロール下のＨＩＶ−１のアンチセンスＲＮ
Ａの発現のための発現ベクターｐＳＸＫ２。ＨＩＶの中
央のゲノムの領域からのプロウイルスのＨＩＶ−１のＤ
ＮＡ断片は、この実施例において、実施例１〜４におけ
るように、５’領域の配列を含有せず、その代わりＰＯ
Ｌ／ＶＩＦ領域からの配列を含有する。このベクターの
構成の詳細は実施例５に記載されている。

【図６】欄１に記載すると表示するをもつアンチセンス
ＲＮＡ発現ベクターの中に３’→５’アンチセンスの向
き（矢印の方向）に含有される、ＨＩＶ−１遺伝子断片
の調製のための基本的線図。それぞれの発現ベクターの
プロモーターを欄２に示し、そしてＵＷＧＣＧ ＧＥＮ
ＥＲＭＢＬ ＤＡＴＡ ＢＡＮＫ ファイル ＨＩＶ
ＨＸＢ２ＣＧ．ＶＩＲＡＬに従うＨＩＶ配列のヌクレオ
チドの番号を欄３に示す。

【図７】染色体のＤＮＡの中に組み込まれた発現ベクタ
ーｐＳＸＫ１を含有する、クローニングしたＵ９３７転
写体からの染色体のＤＮＡの、ＰＣＲ増幅後の、スロッ
ト−ブロット分析。プロモーター／インサート配列の完
全な性質は、ＰＣＲ産生物の断片の大きさおよび、ＰＣ
Ｒ産生物のプライマー配列を含有しない、ＨＩＶ遺伝子
プローブとのハイブリダイゼーションにより示される。 １ 対照試料のベクター、５’−接合、８８７塩基対の
断片 ２ 対照試料のベクター、３’−接合、７７５塩基対の
断片 ３ 染色体のＤＮＡ、５’−接合、８８７塩基対の断片 ４ 染色体のＤＮＡ、３’−接合、７７５塩基対の断片 それ以上の詳細は実施例９に記載されている。

【図８】ＰＣＲ増幅によるクローニングしたＨＵＴ７８
トランスフェクション体からの染色体のＤＮＡの中のＨ
ＩＶ−１遺伝子断片の検出。ＰＣＲ反応をアガロース−
ＴＡＥゲル上で調製し、そして臭化エチジウムの染色後
の紫外線下に写真撮影した。ＰＣＲ産生物は５６１ｂｐ
を含有しそして、また、ｐＳＸＫ１ベクターの１成分で
ある、ＨＩＶ−１遺伝子断片（ヌクレオチド６９９−１
３０５）に相当する。５６１ｂｐの長さのＰＣＲ産生物
は矢印により示す。 Ｍ＝ＤＮＡの長さの標準、５１６ｂｐおよび１０１８ｂ
ｐが示されている １＝陰性の対照、ＤＮＡをＰＣＲ反応に添加しなかった ２＝Ｕ９３７細胞（野生型）からの染色体のＤＮＡ ３＝ＨＵＴ７８細胞（野生型）からの染色体のＤＮＡ ４＝陰性の対照、ＤＮＡをＰＣＲ反応に添加しなかった ５＝陽性の対照 ６＝ＨＵＴ７８形質転換体（ＳＳＨＵＴ６／１ １０７
−９／１）からの染色体のＤＮＡ ７＝ＨＵＴ７８形質転換体（ＳＳＨＵＴ６／１ １０７
−９／１）からの染色体のＤＮＡ ８＝ＨＵＴ７８形質転換体（ＳＳＨＵＴ６／１ １０７
−９／１）からの染色体のＤＮＡ ９＝ＨＵＴ７８形質転換体（ＳＳＨＵＴ６／１ １０７
−９／１）からの染色体のＤＮＡ

【図９】Ｕ９３７単球細胞およびＨＵＴ７８Ｔ−リンパ
球細胞からの染色体のＤＮＡの中のＨＩＶ−１遺伝子断
片（ヌクレオチド４１５８−５７９２）のＰＣＲ増幅に
よる検出。細胞は前以てｐＳＸＫ２ベクターでトランス
フェクションした。ＰＣＲ反応をアガロース−ＴＡＥゲ
ル上で分離し、そして臭化エチジウムの染色後、紫外線
下に写真撮影した。ＰＣＲ産生物はｐＳＸＫ２（ヌクレ
オチド４１５８−５７９２）の中の全体のＨＩＶ−１遺
伝子断片を含有し、そして１８１１ｂｐの長さである。
１８１１ｂｐの長さのＰＣＲ産生物は矢印により示す。 Ｍ＝ＤＮＡの長さの標準、１６３５ｂｐおよび２０３６
ｂｐの長さの標準を示す １＝陰性の対照、ＤＮＡをＰＣＲ反応に添加しなかった ２＝Ｕ９３７細胞（野生型）からの染色体のＤＮＡ ３＝ＨＵＴ７８細胞（野生型）からの染色体のＤＮＡ ４＝ＨＵＴ７８形質転換体（ＳＳＨＵＴ２／１ １０７
−１２／１）からの染色体のＤＮＡ ５＝Ｕ９３７形質転換体（ＳＳＵＫ３／１ １０７−１
２／１）からの染色体のＤＮＡ

【図１０】細胞系ＳＳＵＫ２０／１５−ＫＴＸ１１ｂの
中の発現ベクターＫＴＸ１１を含有する、形質転換し、
クローニングしたＵ９３７細胞系の中のいくつかのアン
チセンスＲＮＡ転写体を実証するノザンブロット分析。
ベクターＫＴＸ１１のＨＩＶ−１インサートＤＮＡに相
当する遺伝子プローブを使用して、長さが８００ｂｐ、
１，２００ｂｐおよび３，２００ｂｐの少なくとも３つ
のアンチセンスＲＮＡ転写体をウイルス抵抗性細胞系の
ＲＮＡにおいて検出することができる（トラック１）。
トラック２はトランスフェクションしない細胞系Ｕ９３
７（陰性の対照）からのＲＮＡを含有する。トラック３
はＲＮＡ分子量の標準を含有する。

【図１１】ＨＵＴ７８細胞系をＨＩＶ−１ ＬＡＶ／Ｂ
ＲＵ分離物で感染（第０日）後６０日にわたるＨＩＶ−
１抗原の形成の過程。細胞培養物の上澄み液について実
施したＨＩＶのＥＬＩＳＡ試験から得られた４５０ｎｍ
における光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）は縦座標に記載す
る。＞２．０の光学密度において、培養物の上澄み液を
希釈し、そして示したＯＤ値を希釈から計算した。カッ
ト−オフ値はＨＩＶ抗原の決定についての検出の制限を
表す。アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系ＳＳＨＵＴ
Ｋ１６／２−ＳＸＫ１およびＳＳＨＵＴＫ１／１−ＳＸ
Ｋ２において、ＨＩＶの複製は６０日の期間にわたって
完全に阻害される。細胞系ＨＵＴＫ１４−ＫＴＸ１１に
おいて、ＨＩＶ複製の開始はトランスフェクションしな
い野生型細胞系ＨＵＴ７８と比較して遅延される。

【図１２】Ｕ９３７細胞系をＨＩＶ−１ ＬＡＶ／ＢＲ
Ｕ分離物で感染（第０日）後６０日にわたるＨＩＶ−１
抗原の形成の過程。細胞培養物の上澄み液について実施
したＨＩＶのＥＬＩＳＡ試験から得られた４５０ｎｍに
おける光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）は縦座標に記載す
る。＞２．０の光学密度において、培養物の上澄み液を
希釈し、そして示したＯＤ値を希釈から計算した。カッ
ト−オフ値はＨＩＶ抗原の決定についての検出の制限を
表す。アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系ＳＳＵＫ３
／１−ＳＸＫ２において、ＨＩＶの複製は６０日の期間
にわたって完全に阻害される。他の形質転換された細胞
系は野生型細胞系（Ｕ９３７）と比較して遅延されたＨ
ＩＶ複製を示す。

【図１３】アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを含有しか
つＨＩＶ感染後６０日間分析した、細胞系におけるＨＩ
Ｖ−１のＤＮＡを検出するＰＣＲ分析。臭化エチジウム
染色した電気泳動のゲルは、下に示す細胞系の染色体の
ＤＮＡからのＰＣＲ産生物を示す。ＴＡＴ−ＥＮＶ遺伝
子領域からの７０２塩基対の長さのＰＣＲ断片を、ＨＩ
Ｖ感染した細胞において、プライマーの対５’−ＡＴＧ
ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＴＡＧＴＡ ＣＣＴ−３’および
５’−ＴＣＴ ＧＴＴＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＣＡＴ
を使用して増幅した。ＰＣＲの結果との比較のために、
対応する細胞培養物の試料についてのＨＩＶ抗原の結果
を括弧内に記載する。 トラックＭ：分子量の標準、６００ｂｐを示す トラック１：ＨＵＴＫ１４−ＫＴＸ１１の７０２ｂｐの
陽性（抗原試験陽性） トラック２：ＳＳＨＵＴＫ１６／２−ＳＸＫ１の７０２
ｂｐの陽性（抗原陰性） トラック３：トラック２に対する平行の感染の実験から
のＰＣＲ産生物 トラック４：トラック２に対する平行の感染の実験から
のＰＣＲ産生物 トラック５：ＳＳＨＵＴＫ１／１−ＳＸＫ２の７０２ｂ
ｐの陽性（抗原陰性） トラック６：トラック５に対する平行の感染の実験から
のＰＣＲ産生物 トラック７：トラック５に対する平行の感染実験 トラック８：ＨＵＴ７８、陽性の対照 トラック９〜１１：ＳＳＵＫ３／１−ＳＸＫ２培養物；
７０２ｂｐのＰＣＲ産生物は検出できない（抗原試験陰
性）

【図１４】ＨＵＴ７８細胞系をＨＩＶ−２ Ｄ１９４分
離物で感染（第０日）後３０日にわたるＨＩＶ−１抗原
の形成の過程。細胞培養物の上澄み液について実施した
ＨＩＶのＥＬＩＳＡ試験から得られた４５０ｎｍにおけ
る光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）は縦座標に記載する。＞
２．０の光学密度において、培養物の上澄み液を希釈
し、そして示したＯＤ値を希釈から計算した。カット−
オフ値はＨＩＶ抗原の決定についての検出の制限を表
す。アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系ＳＳＨＵＴＫ
１／１−ＳＸＫ２において、ＨＩＶの複製は１４日の期
間にわたって完全に阻害される。他の形質転換された細
胞系は野生型細胞系（ＨＵＴ７８）と比較して遅延され
たＨＩＶ複製を示す。

【図１５】Ｕ９３７細胞系をＨＩＶ−２ Ｄ１９４分離
物で感染（第０日）後３０日にわたるＨＩＶ−１抗原の
形成の過程。細胞培養物の上澄み液について実施したＨ
ＩＶのＥＬＩＳＡ試験から得られた４５０ｎｍにおける
光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）は縦座標に記載する。＞
２．０の光学密度において、培養物の上澄み液を希釈
し、そして示したＯＤ値を希釈から計算した。カット−
オフ値はＨＩＶ抗原の決定についての検出の制限を表
す。アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系ＳＳＨＵＴＫ
３／１−ＳＸＫ２において、ＨＩＶの複製は３０日の期
間にわたって完全に阻害される。他の形質転換された細
胞系は野生型細胞系（Ｕ９３７）と比較して遅延された
ＨＩＶ複製を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 48/00 8314−4Ｃ (72)発明者 ホルスト−ペーター・アントニチエク ドイツ連邦共和国デー5060ベルギツシユグ ラートバツハ・ブラームシユトラーセ２ア ー (72)発明者 イエルク・バウムガルテン ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール １・ヘンゼルベーク13 (72)発明者 アントニウス・レバーデイング ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール １・アムローム105 (72)発明者 ブルクハルト・ミールケ ドイツ連邦共和国デー5090レーフエルクー ゼン１・ハイスターバツハシユトラーセ４ (72)発明者 ボルフガング・シユプリンガー ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル・カテルンベルガーシユルベーク31 (72)発明者 ウド・シユトロツプ ドイツ連邦共和国デー5657ハーン・ブライ デンホーフアーシユトラーセ12 (72)発明者 マルク−ミヒヤエル・シユトルク スイス・シーエイチ3013ベルン・ライター −シユトラーセ５アー (72)発明者 ロター・ビーゼルト ドイツ連邦共和国デー6000フランクフルト 50・エツシヤースハイマーラントシユトラ ーセ576 (72)発明者 ヘルガ・リユプザメン−バイクマン ドイツ連邦共和国デー6232バトゾーデン・ ケニヒスシユタイナーシユトラーセ113 (72)発明者 ハリー・ズハルトノ ドイツ連邦共和国デー6000フランクフルト 50・ゲルハルト−ハウプトマン−リング 262 (72)発明者 トーマス−ペーター・ハウスナー ドイツ連邦共和国デー5000ケルン80・ピユ ツツラツハシユトラーセ91

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハイブリッドプロモーターの遺伝子配列
   を含有し、そして強い構成的プロモーター活性あるいは
   病原体による攻撃の場合において誘発することができる
   プロモーター活性を有することを特徴とするアンチセン
   スＲＮＡの発現のための発現ベクター構成体。
2. 【請求項２】 プロモーターまたはハイブリッドプロモ
   ーターの遺伝子配列およびヌクレオチド７５１４→４７
   ４または５７８６→４７４または２０９６→４７４また
   は３８２５→６８１または５７８６→４１５８または５
   ７４６→４６４８または２３６９→１６３５または３２
   ２７→３００３または２０９９→６７８または３８２９
   →２０９９または４６４７→４１５７または４１５７→
   ３８３０のアンチセンスの向きのＨＩＶ−１プロウイル
   スＤＮＡを含有することを特徴とするアンチセンスＲＮ
   Ａの発現のための発現ベクター構成体。
3. 【請求項３】 薬物の調製のための請求項１の発現ベク
   ター構成体の使用。