JPH06167496A - 分離型吸収層を有する乾式イムノアッセイ要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は薄膜イムノアッセイにおいて液体試
料中の分析物を測定するための新規乾式分析要素を提供
することを目的とする。 【構成】 本発明の分析要素は、支持部材13、前記支持
部材上に担持された少なくとも１つの多孔質材料の層か
ら成り読取り領域15を含む試薬マトリックス14、前記マ
トリックスと接触している吸収材料16、および前記吸収
材料に一体化されそして／または前記吸収材料と前記読
取り領域の間に置かれた吸光または反射手段であって、
洗浄され除去された未結合標識および読取り領域の外側
からの他の干渉物質により生じるバックグラウンドシグ
ナルを、それが読取り領域中に逆戻りする前に吸収また
は遮断するための吸光または反射手段を含んで成る。本
発明の分析要素は実施するイムノアッセイの型に応じて
カバー17を含んで成ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は薄膜イムノアッセイにお
いて使用される乾式分析要素に関する。

【０００２】

【従来の技術】イムノアッセイは、抗体と抗原の定量ま
たは定性アッセイのための公知の技術である。全てのイ
ムノアッセイ技術の基礎は、特異抗体が特異抗原を認識
しそしてそれに結合するようなユニークな免疫学的現象
である。免疫化学的技術は、特異抗原に対する抗体の高
親和力ゆえに、アッセイ感度の見地から利点を提供す
る。従って、多くの場合において、イムノアッセイは伝
統的な化学技術や酵素技術には低すぎるような微量で存
在する生体化合物の検出を可能にした。

【０００３】一般に、イムノアッセイ技術は、特異抗
原、特異抗体または特異抗原−抗体複合体のいずれかの
存在および／または濃度の測定に備えることができる。
例えば、既知量の抗体（または抗原）が与えられれば、
それに対応する抗原（または抗体、しばしば補体とよば
れる）のレベルを決定することができる。抗原（または
抗体）の濃度が直接測定には小さすぎる場合、標識（後
述するような検出可能な種）を既知の割合の抗原（また
は抗体）に取り付けることができる。必要な濃度で存在
し且つ測定可能であるこの標識は、未知の抗原（または
抗体）とそれの抗体（または抗原）との間の抗体／抗原
結合の程度のマーカーとして機能する。次いで、結合し
た抗原（または抗体）と未結合の抗原（または抗体）と
の間の標識の分配を使って、液体試験試料中に存在した
未知の量を算出することができる。

【０００４】一般にサンドイッチアッセイと呼ばれる別
の型の免疫アッセイでは、抗体および／または抗原を分
析物含有試料と接触させ、分析物を抗体に結合させる。
次いでこの複合体を、結合した分析物と反応する標識抗
体および／または抗原の溶液と接触させる。かくして、
結合した標識抗体および／または抗原の量は、結合した
分析物の量に正比例する。

【０００５】乾式分析要素を使った現在のイムノアッセ
イ技術は、試験試料中にわずかナノモル濃度で存在する
血清成分の検出に向けられている。多数の診断上重要な
血清ホルモンおよび癌マーカーの検出には、ピコモル濃
度での検出が要求される。ピコモル濃度で血清中に存在
する医学上重要なホルモンの中には、アルドステロン、
インスリン、ＴＳＨ、アンギオテンシン、オシトシン、
上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン、ＡＣＴＨ
およびバソプレッシンがある。ピコモル濃度で存在する
血清分析物についてのイムノアッセイを実施するために
は、蛍光または化学発光のような高感度検出化学が必要
である。この型の検出化学は高感度であるがゆえに、血
清試料中に存在する未結合の標識や化学的干渉物質によ
るバックグラウンドを徹底的に取り除かなければならな
い。これは、抗体と抗原との結合反応が起こった後で徹
底的な洗浄段階を行うことによって達成される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】課題は、現在の薄膜形
式の液体容量（典型的には10〜20μl の洗浄容量）が１
ナノモルよりずっと低濃度での分析物のイムノアッセイ
を可能にするのには十分でないことである。化学発光ま
たは蛍光イムノアッセイにおいて従来の乾式分析要素を
使うことに関連するもう１つの課題は、光伝送の課題で
ある。光伝送は、除去された（洗浄された）標識からの
シグナルが読取り領域中に逆戻りする時に起こる。この
現象はアッセイの高感度の読みを実質的に減少させる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、流体試
料中に存在する分析物の測定のための薄膜イムノアッセ
イで使用する、増加された洗浄容量を有する乾式分析要
素を提供することである。この目的は、請求項１に記載
の乾式イムノアッセイ要素により達成される。

【０００８】

【具体的な態様】本発明の分析要素を使ってイムノアッ
セイを実施する上での１つの例示的実施態様によれば、
血清または他の液体の試料を試薬マトリックス上にスポ
ットする。化学的反応（すなわち競合アッセイまたはサ
ンドイッチアッセイ）が起こるようなインキュベーショ
ン期間の後、試薬マトリックスの読取り領域（これは分
析物濃度についてモニタリングする予定の領域である）
を、250 μl までの洗浄液で、好ましくは10μl ／秒以
下、最も好ましくは１μl ／秒の計量速度で洗浄する。
検出溶液を洗浄液として使用するのが好ましい。しかし
ながら、洗浄段階の後で別個の流体としてシグナル生成
性基質を添加することができる。湿潤と同時に、該要素
の吸収材料は、試薬マトリックスの読取り領域から離れ
たところで可溶性干渉物質および未結合の標識を含む洗
浄液を吸収し、それによって読取り領域からのバックグ
ラウンド干渉を減少させる。更に、吸収材料と提携した
吸光または反射手段は、洗浄して除去された標識や読取
り領域の外側からの他の干渉物質により生じるバックグ
ラウンドシグナルを吸収または遮断し、それによってバ
ックグラウンドが読取り領域中に逆戻りしないようにす
る。これによりイムノアッセイの効率および感度が増加
する。その後で、検出シグナル（すなわち化学発光、蛍
光または比色定量）を測定して分析物濃度を決定する。

【０００９】本発明は、薄膜イムノアッセイにおいて水
性液体中の化学的または生物学的物質（本明細書中では
「分析物」と称する）の測定用の新規乾式分析要素を提
供する。本明細書中で使用する「測定」なる用語は、分
析物の定量または定性測定を称する。特に、本発明は、
限定されるものではないが、全血、血漿、血清、リン
パ、胆汁、尿、脊髄液、唾液、汗等並びに糞便分泌物を
包含する、動物またはヒトの生物学的流体をアッセイす
るのに用いることができる。骨格筋、心臓、腎臓、肺、
脳、骨髄、皮膚等といったヒトまたは動物組織の流体調
製物、血清ホルモン、薬物、酵素および癌マーカー、並
びに微生物およびそのような生物体に対する抗体をアッ
セイすることも可能である。同様に、イムノアッセイ
は、食料品、環境上の流体、またはイムノアッセイを基
にした任意の診断法に用いることができる。

【００１０】本発明の分析要素は１mlまでの改善された
洗浄容量を有する。よって、低レベルの分析物の検出の
際の偽陽性または偽陰性結果が最少になる。本明細書中
で使用する時、「読取り領域」と「反応区画」なる用語
は相互に交換可能に使用され、そして分析物濃度につい
てモニタリングする予定である該要素の部分のことをを
称する。

【００１１】ここで図１および２について説明する。本
発明の乾式分析要素の例示的態様が総括的に10に示され
ている。該分析要素は、ベース12；支持部材13上に担持
されており読取り領域15を有する試薬マトリックス14；
一態様では、読取り領域15の周囲の少なくとも一部分に
隣接して置かれている、マトリックス14と接触している
吸収材料16；および吸収材料と接触している吸光または
反射手段、を含んで成る。吸光または反射手段は、図２
においてフランジ19により示されるように、吸収材料16
と読取り領域15の間に置かれた別ユニットであることが
できる。あるいは、吸光または反射手段は、図１に示す
ように、一体部分として吸収材料の少なくとも一部分か
ら成ることができる。所望により、吸収材料16の上にカ
バー17を置くことができる。新規分析要素を使うことに
より、薄膜イムノアッセイを実施する際の洗浄容量を実
質的に増加させることが可能になった。これは、読取り
領域から未結合標識および可溶性干渉物質を除去するこ
とによりアッセイの感度を増加させる。

【００１２】好ましい態様では、分析要素10の試薬マト
リックス14は少なくとも１つの多孔質展開区画または層
を含んで成り、該多孔質展開区画または層は、着目の分
析物と反応することができる固定化された結合剤と、該
区画上に塗布された結合剤の結合部位を目当てに分析物
と競争するかまたは結合剤−分析物複合体と結合してイ
ムノサンドイッチを形成することができる標識（例えば
既知の方法で供給される）とを含有する。展開区画は等
方性的多孔質であることが望ましく、これは、粒子、繊
維または重合体鎖の間の連続空間または細孔により生じ
る多孔度が該区画の各方向で同じであることを意味す
る。マトリックスの多孔度は、分析物を閉じ込め、それ
によって分析物をその隙間内部に効率的に固定するのに
十分な程細かいだろう。あるいは、着目の分析物の物理
的大きさが効率的な物理的閉じ込めには小さすぎ、従っ
て分析物を不活性マトリックス内部に固定化する場合、
そのような微小な粒子を結合する適当な物質（即ち、抗
体）で該マトリックスを感作することができる。

【００１３】展開区画は、同一層中にまたは積層として
２以上の別個の区画を有することができる。該区画は、
当業界で既知であるような試薬区画、捕捉区画または表
示区画、追加の展開区画、放射線遮断またはフィルター
区画、下塗区画、ゲル区画、バリヤー区画等であること
ができる。該区画は一般に互いに流体接触状態にあり、
これは、流体、試薬および反応生成物（例えば色素）が
隣接区画の積層領域の間を通過または輸送できることを
意味する。２以上の区画が単層であることができるが、
好ましくは、前記区画は別々に塗布された層である。

【００１４】前記区画は自立性である（即ち、それの完
全性を維持するのに十分な程硬質な材料から成る）こと
ができるが、好ましくは別の支持部材13上に担持され
る。支持体13は、寸法的に安定な、そして好ましくは非
孔質で且つ 200〜900 nmの波長の電磁輻射線を透過する
透明の（即ち輻射線透過性の）、任意の適当な材料であ
ることができる。特定のマトリックスのためのえり抜き
の支持体は、意図する検出モード（即ち、反射分光法の
分光透過度）と適合できなければならない。有用な支持
体は紙、金属ホイル、ポリスチレン、ポリエステル〔例
えば、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボ
ネート、セルロースエステル（例えば酢酸セルロース）
および当業界で既知の他のものから調製することができ
る。トップまたはカバー17とベース12は、支持体13と類
似のまたは同じ材料から構成される。例えば、熱可塑性
ポリマー、例えばポリオレフィンおよびオレフィンのコ
ポリマー、並びに好ましくはポリスチレン、ポリエチレ
ン、ポリプロピレンおよびエチレン酢酸ビニルと共重合
したそれらのものを包含する任意のプラスチックポリマ
ーである。しかしながら、ベースおよび／またはトップ
形材は、上記材料の幾つかを組み合わせることによって
製造することもできる。ベース、トップおよび／または
分析要素を、例えば接着剤、テープまたは超音波によ
り、互いに結合させることができる。

【００１５】しかしながら、支持体はまた、典型的に
は、上述した区画の少なくとも１つを支持体上にコーテ
ィングする前に下塗りされゲル洗浄されたポリ（エチレ
ンテレフタレート）支持体である。支持体上の最初の下
塗りは、好ましくは、典型的には当業界で写真用支持体
に使われておりそして米国特許第 3,143,421号、同第
3,271,345号および第 2,943,937号明細書（これらの開
示は参考として本明細書中に組み込まれる）に開示され
ているような塩化ビニリデンコポリマーである。

【００１６】多孔質展開区画は、任意の適当な繊維材料
もしくは非繊維材料または前記の片方もしくは両方の混
合物から調製することができる。この区画の間隙容量お
よび平均の気孔の大きさは、意図する用途に応じて変え
ることができる。有用な展開区画は、米国特許第 4,29
2,272号明細書（1981年 9月29日発行）（この開示は参
考として本明細書中に組み込まれる）に記載されたよう
な、適当な結合材料と混合されたまたは織物に織られた
繊維材料を使って調製することができる。あるいはまた
好ましくは、展開区画は、米国特許第 3,992,158号（19
76年11月16日発行）、同第 4,258,001号（1981年 3月24
日発行）および同第 4,430,436号（1984年2月 7日発
行）明細書並びに特開昭57(1982)-101760 号公報（1982
年 6月24日公開）（これらの開示は参考として本明細書
中に組み込まれる）に記載されたような、ポリマー組成
物（例えば白化ポリマー）または粒状材料から調製され
る。

【００１７】水不溶性接着剤を使って有機ポリマー粒子
を互いに接着し、展開区画の密集三次元構造を提供する
ことができる。接着剤は展開区画中に含まれる特定のポ
リマーとは異なる有機ポリマーから成るが、かなり一般
的に接着剤は、展開区画のポリマー組成物中に存在する
反復単位の幾つかと同一のまたは類似した多数の反復単
位を含むポリマーを表す。本発明において使用される好
ましい水不溶性接着剤は、付加ホモポリマーおよびコポ
リマー、特に付加重合可能なモノマーのブレンドから調
製された付加コポリマーであるが、当業界で既知の任意
の接着剤を本発明において使用することができる。例え
ば、米国特許第 4,258,001号明細書（この開示は参考と
して本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。

【００１８】ロイコ色素を展開区画および／または他の
区画中に含浸させることもできる。それが標識の存在下
で酸化された時に検出可能な色素を提供することができ
る限り、任意の適当なロイコ色素を本発明の実施に使用
することができる。有用なロイコ色素の例としては、イ
ミダゾール誘導体、例えば米国特許第 4,089,747号明細
書およびその中に引用された参考文献、欧州特許出願公
開第122,641 号明細書（1984年10月24日公開）および特
開昭58(1983)-045,557号公報に記載されたもの、並びに
例えば米国特許第 4,670,385号明細書に記載されたトリ
アリールメタンが挙げられるが、それらに限定されな
い。ここで前記開示は参考として本明細書中に組み込ま
れる。同様に、本発明において任意の蛍光または化学発
光生成材料を使用することができる。

【００１９】緩衝剤を展開区画および／または他の区画
中に含浸させることもできる。緩衝剤はアッセイのpHを
9.0 以下、好ましくは6.0 〜9.0 に維持する。緩衝剤が
アッセイ中pHを9.0 以下に維持することができる限り、
任意の緩衝剤または緩衝剤の混合物を本発明において使
用することができる。特に好ましい緩衝剤としては、限
定するものではないが、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸塩、グリシルグリシン、Ｎ−〔トリス
（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸が挙げられ、Ｎ−
〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエ
タンスルホン酸が最も好ましいが、当業界における任意
の緩衝剤標準物を使用してもよい。例えば、Good他、Bi
ochem, 5(2), 1966, 467-477頁を参照のこと。緩衝剤は
特定の緩衝剤に応じて適当量で存在し、その量は臨床化
学技術者により容易に決定することができる。

【００２０】電子伝達剤を展開区画および／または他の
区画中に含浸させることもできる。当業界で既知の任意
の電子伝達剤を本発明において使用することができる
が、電子伝達剤として作用するフェノール類またはアニ
リン類が好ましい。本発明において有用な代表的フェノ
ール類としては、ｐ，ｐ′−ビフェノール、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（４′−ＨＡ）、ｐ−メトキシフ
ェノール、クロロフェノールレッド、ｐ−クレゾール、
ｍ−メトキシフェノール、バニリン、４−クロロ−３，
５−ビス（ジメチルアミノ）フェノール、ホモバニリン
酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸、ｏ−メトキシフェノール、フェノール、レゾルシ
ノールおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルが挙げられ
る。有用なアニリン類としては、ｐ−アニシジン、４′
−アミノアセトアニリド、ｐ−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアニリンおよびｏ−フェニレンジアミンが挙げら
れる。ｐ，ｐ′−ビフェノール、４′−ヒドロキシアセ
トアニリド、ｐ−メトキシフェノール、ｐ−アニシジン
および４′−アミノアセトアニリドから成る群より選ば
れたフェノール類およびアニリン類がより好ましく、
４′−ヒドロキシアセトアニリドが最も好ましい。電子
伝達剤は特定の剤に応じて適当量で存在し、その量は臨
床化学技術者により容易に決定することができる。

【００２１】より好ましい態様では、本発明の分析要素
は、対応する反応体と特異的に複合体形成するであろう
物質である免疫学的に反応性のリガンドの測定に有用で
ある。本明細書中で使用する時、「リガンド」なる用語
は分析物と相互交換可能に用いられる。そのようなリガ
ンドとしては、抗原、ハプテン、抗体、毒素、ホルモ
ン、治療薬、天然および合成ステロイド、タンパク質、
ウイルス、細菌、ペプチド、ヌクレオチド等が挙げられ
るが、それらに限定されない。測定しようとするリガン
ド（分析物）および対応する標識リガンド類似体は、固
定量の結合剤を目当てに競争するか、または固定量の結
合剤とサンドイッチを形成する。

【００２２】リガンド類似体は適当な標識に共有結合し
たリガンドを含むことができる。標識の目的は、試料中
に存在する分析物の量を測定するための間接手段を提供
することである。標識化合物は、マトリックス内に閉じ
込められた分析物に免疫化学的に結合するようにデザイ
ンされる。本発明の方法において有用である標識化合物
の合成は、公知の合成プロトコールによって行うことが
できる。本発明において有用な標識リガンド類似体は、
任意のシグナル生成性標識と当業者に既知の適当な技術
を使って調製することができる。例えば、常用の標識と
しては、酵素、例えばペルオキシダーゼ、例えば西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ以外の酵素、
例えばグルコースオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ等、放射性標識、発色
団、蛍光団、並びに酵素補因子およびエフェクターが挙
げられる。酵素は、標識されたリガンドを基質と反応せ
しめることにより測定することができる。基質は、酵素
の作用により、常用技術により測定することができるか
または分析物濃度に比例した強度で光を発する化学発光
物質を活性化する色素生成または蛍光生成物質を放出す
る。酵素補因子またはエフェクターで標識されたリガン
ドは、基質への酵素作用に対するそれらの効果により同
様に検出することができる。発色団、蛍光化合物および
化学発光化合物で標識されたリガンドは、例えば蛍光
法、紫外分光法または他の分光手段により、直接測定す
ることができる。例示目的での、好ましい検出化学は次
の反応式に従った増強化学発光である：

【００２３】

【化１】

【００２４】ここでＥＴＡ（電子伝達剤）はアニリンま
たはフェノール、例えば４−ヒドロキシアセトアニリド
（４′−ＨＡ）であり、そしてＨＲＰは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。

【００２５】標識されたリガンド類似体およびアッセイ
しようとするリガンドを特異的に認識する対応する結合
剤は、使用前に展開区画中に含めることができ、または
アッセイの時点で添加することもできる。好ましくは、
両方とも使用前に展開区画中に含浸される。より詳細に
は、結合剤は、担体材料、例えばガラスもしくはポリマ
ービーズまたは他の粒子、樹脂、繊維等の上の多孔質展
開区画の内部に固定化することができる。あるいは、結
合剤は中間層または展開区画から離れた層に含浸せしめ
ることができる。更に、標識されたリガンド類似体は、
それを反応体から隔離するために別個の水溶性区画また
は層中に含浸せしめることができる。

【００２６】展開区画または代わりの中間層もしくは区
画中に固定化された結合剤は、当業界で既知の任意の結
合剤、例えばホスホリルコリン、アビジン、ビオチン、
チロキシン、チロキシン結合グロブリン、多糖、抗原、
抗体、エストロゲン受容体、または着目の分析物（リガ
ンド）と特異的に結合しそしてそれを捕捉するように選
択された他の任意の受容体を含んで成ることができる。
捕捉剤として働くためには、結合剤は不溶性担体、例え
ばガラスもしくはポリマービーズ、または他の粒子、樹
脂、繊維等に吸着または共有結合により固定化される。

【００２７】試薬マトリックスは、任意の所望の幅を有
する細長いテープ、シート、スライドまたは好ましくは
チップを包含する様々な形に形造ることができる。更
に、アッセイは手動または自動であることができる。一
般に、本発明の分析要素を使用する場合、分析物（リガ
ンド）の測定は、供給ロール、チップパケットまたは他
の供給源から試薬マトリックスを取り、それをスライド
形式、即ち、ベース、カバーおよび吸収／吸光材料の中
に置き、そして試料とマトリックス内の試薬とが混合さ
れた状態になるように、試薬マトリックスを分析物を含
む疑いのある試料（例えば１〜200 μl 、好ましくは10
μl ）と物理的に接触せしめることにより行われる。そ
のような接触は、任意の適当な方法で、例えば、好まし
くは、適当な計量分配手段を使って手動または機械によ
り試料の液滴を該要素にスポットすることにより、達成
することができる。

【００２８】試料の適用後、リガンドとリガンド類似体
と結合剤とで複合体を形成する試験結果の獲得を加速す
るかまたは他の方法で容易にすることが望ましいであろ
ういずれかのコンディショニング、例えばインキュベー
ション、加熱等、に該要素を暴露する。未結合の標識化
合物並びに干渉性血清成分は、モニタリング段階の前に
読取り領域（反応区画）から明確に分離されなければな
らない。この分離は、反応区画から未結合物質を分離す
るのに十分な容量で洗浄液の流れを反応区画に適用する
ことによって達成することができる。好ましくは、洗浄
液は、例えば10μl ／秒まで、最も好ましくは１μl ／
秒の連続計量速度で適用されるが、断続適用を使うこと
もできる。アッセイの展開層上に全く「水たまり」が形
成しない限り任意の適用方法および速度を使用すること
ができると理解されるが、ただし適用速度は展開層中へ
の洗浄液の吸収速度にほぼ等しい。しかしながら、もし
水たまりが生じるならば、下記に更に記載するように読
取り領域にすぐ隣接した領域に水不透性材料を置くこと
ができる。溶剤（洗浄液）が適用地点から外側に移動す
るにつれて、未結合の反応体はその中に溶解し、結合し
た反応体から分離する。

【００２９】洗浄液は、当業界において洗浄用に使用さ
れている任意の既知の溶液、例えばそのような未結合の
化合物が好都合に溶解するような緩衝液または蒸留水を
含んで成ることができ、ある態様では、緩衝剤並びに所
望により電子伝達剤、過酸化物、キレート化剤および／
または界面活性剤を含有する緩衝液が好ましい。好まし
くは、洗浄液は、別の洗浄液を添加する追加の段階を排
除するような検出（標識）用化学物質を含有する。

【００３０】現在の薄膜イムノアッセイは、典型的に
は、10〜20μl の洗浄容量を有する。本発明の要素の１
つの新規観点は、該要素がその厚さに依存して１mlに至
るまでの増加された洗浄容量を有することである。この
ことは、多量の洗浄容量が実質的に全ての未結合標識お
よび血清成分を読取り領域から洗い流し、それによって
より高感度のイムノアッセイを提供するという理由で重
要である。図３に関して言えば、洗浄容量18（斜線によ
り表示）はピペット、皮下注射器または他の計量分配装
置20を用いて反応区画15に都合良く適用することができ
る。本発明のアッセイの実施の際にマトリックスに適用
される液体の容量は、着目の分析物のモニタリング用の
反応区画の内部に本質的に均質な領域を生じるのに十分
な量であると理解される。これは、該要素中の吸収材料
がそのような液体の全部を完全に該材料中に保持できる
ために達成される。

【００３１】図４に示されるように、吸収材料16は、読
取り領域15から離れたところに、可溶性干渉物質および
未結合の標識を含む洗浄液22を吸収する。図１および図
２に関しては、吸収材料16はマトリックス14と接触して
置かれ、そして一態様では、読取り領域15の周囲の少な
くとも一部分に隣接して置かれる。理解されるように、
「中心外 (off-center) 」洗浄イムノアッセイ用には、
吸収材料は洗浄液適用位置に隣接したマトリックス上に
置かれるだろう。吸収材料16は、該材料が液体を吸収す
ることができる限りにおいて、ガラス微小繊維、紙、ス
ポンジ、織物、プラスチック等のような材料から成るこ
とができる。液体を吸収する能力は、吸収材料を例えば
追加の吸収増強剤、例えば湿潤剤で前処理することによ
り、または官能基の導入により、影響され得る。所望に
より、読取り領域のすぐ近隣の領域の周りの吸収材料を
パラフィンまたは他の水不透性材料（図４中の24）でシ
ールすることができる。これは、マトリックスへの浸透
の前に流体が吸収されないようにすることによって、洗
浄効率を増加させることを可能にする。

【００３２】該要素は吸光または反射手段を更に含んで
成り、この吸光または反射手段は、吸収材料と読取り領
域の間に置かれるかまたは吸収材料の少なくとも一部分
に一体化成形される別ユニットを含んで成ることができ
る。図１に関して、吸光または反射手段は、吸収材料の
少なくとも一部分に一体化している吸光または反射材料
を含んで成る。即ち、吸収材料は、吸光もしくは反射材
料または色素、例えば、黒色もしくは着色ポリビニルア
ルコール、黒色もしくは着色プラスチック、黒色もしく
は着色セルロース、化学物質または当業界で既知の他の
任意の吸光もしくは反射材料からもっぱら成ることがで
き、あるいは洗浄された標識または読取り領域の外側か
らの他の干渉物質によって生じるシグナルを吸収または
遮断しそれによってこのバックグラウンドが読取り領域
中に逆戻りしないようにするために、前記のような材料
から部分的に成ることができる。

【００３３】あるいはまた、図２に関連して、吸光また
は反射手段は、吸収材料と読取り領域の間に置かれそし
て好ましくは読取り領域の周囲に隣接して置かれた、不
透明の光遮断フランジ等を含んで成ることができる。こ
のフランジは、洗浄された標識や読取り領域の外側から
の他の干渉物質により生成されるシグナルをそれが読取
り領域に再び入る前にそれらを吸収または遮断するため
に、好ましくは上記に挙げた吸光または反射材料のうち
の少なくとも１つ、または当業界で既知である他の材料
から成る。このフランジを使う時、吸収材料もまた上述
の吸光または反射材料から成ることができる。明らかな
ように、吸収材料／吸光または反射手段が含むどんな態
様またはその組合せであっても、吸光または反射材料
は、洗浄された標識または読取り領域の外側からの他の
干渉物質によって生じるシグナルをそれが読取り領域中
に逆戻りする前に吸収または遮断するような形式で該要
素中に含まれるべきであると理解される。

【００３４】吸収材料による読取り領域中からの未結合
の標識および血清成分の免疫化学的反応および吸収の完
了と同時に、適当な機器を使って読取り領域をモニタリ
ングし、標識化合物により生じたシグナルの大きさを測
定する。読取り領域（通常直径 6〜12 mm ）は、閉じ込
められた分析物および結合した標識化合物が内部に存在
するマトリックスの部分に限られる。もちろん、使用す
る機器の型は、実施するイムノアッセイの型および使用
する標識に依存するだろう。既に述べたように、そして
本明細書中のどこかに記載したように、当業界で既知で
ある任意の標識および検出方法を使うことができる。本
発明を次の実施例により更に説明する。

【００３５】

【実施例】実施例１ ：洗浄操作後に読取り領域中に残っている残余
ＨＲＰ イムノアッセイにおいて標識として汎用されている酵素
である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、大容
量の洗浄段階にかけられる本発明の分析要素を使った薄
膜イムノアッセイにおいてはバックグラウンドに洗い流
すことができるが、従来の洗浄形式の容量を使うと洗い
流すことはできない。再結晶ルミノール、過酸化水素お
よび４′−ヒドロキシアセトアニリドを基剤とした高感
度化学発光検出化学を使って残余ＨＲＰを検出した。緩
衝液１は0.1 Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Tris）, pH 8, 10^-5Ｍジエチレントリアミン五酢酸
（DTPA）および 0.1％臭化セチルトリメチルアンモニウ
ム（CTAB）を含んだ。4 mM再結晶ルミノール、600 μM
４′−ＨＡおよび8mM H₂O₂を緩衝液１に混合することに
より、化学発光反応混合物（４×）を調製した。全ての
測定を、10μl 試料の自動スポット装置上で行った。こ
の装置は10μl のスポット適用を自動化し、10 〜20μl
洗浄を行い、読み取り（読取り領域 8 mm ）そして薄
膜の化学発光シグナルを記録する。使用する試薬マトリ
ックスは、抗体または検出化学物質を全く含まないビー
ズ状展開層を含んだ。吸収層はExello Companyから入手
した合成プラスチックスポンジであった。

【００３６】図５に関連して、試薬ブランクのシグナル
の測定のために、化学発光試薬の１×希釈液 10 μl を
試薬マトリックス上にスポットし、化学発光を記録し
た。陽性の試薬対照（グラフ線、「2.5 ×10^-9Ｍ ＨＲ
Ｐ」）は、シグナル試薬中の2.5 ×10^-9Ｍ ＨＲＰをマ
トリックス上にスポットすることから得られた化学発光
シグナルを示す。スポット前に100 μl の４×化学発光
反応混合物、300 μl の緩衝液１および10μl の１×10
^-7Ｍ ＨＲＰ（最終濃度2.5 ×10^-9Ｍ ＨＲＰ）をエッ
ペンドルフ試験管中で混合した。「20μl 洗浄」と表示
されたグラフ中の線については、上記の通り調製した化
学発光混合物中の2.5 ×10^-9Ｍ ＨＲＰ溶液 10 μl を
マトリックス上にスポットし、次いで１×化学発光反応
混合物の20μl パルス洗浄を行った。「20μl パルス洗
浄、300 μl 洗浄」と表示されたグラフ線では、化学発
光混合物中の2.5 ×10^-9Ｍ ＨＲＰ溶液 10 μl をマト
リックス上にスポットし、次いで1 ×化学発光反応混合
物を使って20μl パルス洗浄を行った。次いで、熱パラ
フィンにより予め周囲がシールされている吸収スポンジ
を該要素の読取り領域の周りに且つ読取り領域と直接接
触させて置き、そして合計300 μl をピペットで手動で
分配した１×化学発光試薬の10〜20μl パルス洗浄を加
えた。

【００３７】化学発光シグナルが対数目盛で与えられて
いる図５に示されるように、20μl洗浄を使った時でさ
えも非常に大きなＨＲＰシグナルが存在する。対比し
て、本発明の要素を使って洗浄容量を増加させると、バ
ックグラウンドが事実上化学発光試薬のみで観察される
レベルにまで減少する。図６に関しては、本発明の要素
を使って上記実験を繰り返したものが示される。この実
験でもまた、バックグラウンドが化学発光試薬のみで観
察されるレベルにまで減少する。

【００３８】実施例２：西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）の洗浄の評価 これは、イムノアッセイにおいて酵素標識として汎用さ
れているＨＲＰの洗浄の一例である。10μl の緩衝液
（0.1 M トリス, pH 8）中の0, 10, 100, 1000および1
0,000アトモルのＨＲＰを、表１に示すように構成され
た試薬マトリックス上にスポットした。吸収材料はWhat
man により供給されたGF/B吸収剤であった。シグナル試
薬〔トリス（0.1M, pH 8.0）、ルミノール（1 mM）、
４′−ＨＡ（150 μM ）、H₂O₂（2 mM）、DTPA（10μM
）およびCTAB（0.1 ％）〕を含んで成る洗浄液100 μl
を、計量ポンプを含む洗浄場により0.63μl ／秒で計
量分配した。洗浄時間は約160 秒であった。洗浄が終了
した後、支持ベースから取り外した試薬マトリックス
を、Turner Luminometer TD20E上で37℃にて５分間化学
発光について読み取った。図７に関連して、この方法を
使って10,000アトモルのＨＲＰがバックグランンドと10
0 アトモルＨＲＰの間（この試薬塗膜の検出限界）に洗
浄され、そして100 μl 洗浄後に試薬マトリックスの窪
みやしわの発生は全く観察されなかった。

【００３９】

【表１】

【００４０】 上記試薬マトリックスに次の定義を適用する。 Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液。 ポリマービーズ：ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリ
ル酸ビーズ）。 結合剤：ポリ（アクリル酸メチル−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
メタクリル酸２−アセトアセトキシエチル）。 Zonyl FSN ：duPont de Nemours により販売されている
フッ素化界面活性剤。 TX-100：Rohm and Haas Co. により販売されているオク
チルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤であ
るTriton X-100。

【００４１】実施例３ ：血清中の10,000アトモルのＨＲＰの洗浄 試験試料中に10,000アトモルのＨＲＰを使用したこと以
外は、実施例２に記載した通りに分析要素を調製した。
特定の洗浄時間および洗浄速度についての結果を図８に
示す。血清中の10,000アトモルのＨＲＰが３×バックグ
ラウンドに洗浄できたことが示されている。1.28μl ／
秒の速度における50μl 容量での洗浄（洗浄時間40秒）
が、この塗布要素に最適であった。

【００４２】実施例４：パラフィンシール 分析要素を実施例２に記載の通り調製した。ただし、パ
ラフィンシールを持たない対照と比較してパラフィンの
存在が100 または200 μl の洗浄液を2.45μl／秒の速
度で使う洗浄（試験血清試料＝10,000アトモルのＨＲＰ
を含む10μl ）を改善するかどうかを決定するために、
吸収層の縁、読取り領域の周囲およびスライドの上にパ
ラフィンシールを適用した。先端にコットンが付いた塗
布棒を使って融解パラフィンを塗布した。この実験は、
シールの無いスライドに洗浄液を適用するとにわかに、
洗浄液が洗浄を行う機会を持つ前に吸収剤がその縁を通
して新鮮な洗浄液を吸い込むことが判明したために実施
した。これは記載したようなワックスシールを適用する
ことによって防ぐことができることも更にわかった。よ
って、この実験の目的は、スライドを全洗浄容量の１回
のパルスで浸水させるよりもむしろ、より長い時間に渡
るパルス洗浄を使うことにより、ワックスシールを使わ
ずに適当な洗浄が獲得できるかどうかを決定することで
あった。結果を下記の表２に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】パラフィンシールは有意に洗浄を改善しな
いようであり、よってそのようなパルス洗浄を使用する
時は選択自由である。しかしながら、別の実験におい
て、手動で適用する滴下洗浄を使用する時にはパラフィ
ンシールが望ましいことが証明された。

【００４５】実施例５ ：ＨＲＰを除去する際の洗浄容量の変更の効果 この実験は、表３に示されるような構成の試薬マトリッ
クスを有する本発明の要素においてＨＲＰを除去する際
の洗浄容量の変更の効果を調べた。

【００４６】

【表３】

【００４７】 上記試薬マトリックスに次の定義を適用する。 Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液。 ポリマービーズ：ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリ
ル酸ビーズ）。 結合剤：ポリ（アクリル酸メチル−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
メタクリル酸２−アセトアセトキシエチル）。 Zonyl FSN ：duPont de Nemours により販売されている
フッ素化界面活性剤。 TX-100：Rohn and Haas Co. により販売されているオク
チルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤であ
るTriton X-100。

【００４８】10,000アトモルの西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）を含む10μl のヤギ血清を上記試薬マト
リックス上にスポットし、それをWhatman GB/F吸収剤を
含むスライド形式において固定した。このスライドを37
℃にて５分間インキュベートし、次いでルミノール／電
子伝達剤／H₂O₂洗浄液／シグナル試薬で洗浄した。0.8
μl ／秒の洗浄速度および10, 50, 75, 100 または150
μl のいずれかの洗浄容量を使用した。試薬マトリック
スをスライドから取り出し、Turner Luminometer, Mode
TD20E上で37℃にて５分間読み取った。

【００４９】各値について二重反復測定の結果を図１０
に示す。この結果は、増加された洗浄容量によって塗膜
中のＨＲＰの除去が改善されたことを示す。この実験に
おいて使った要素は250 μl までの洗浄液を収容した
が、吸収剤を持たない従来の形式である試薬マトリック
スのみではわずか10〜20μl の洗浄液しか収容できなか
った。

【００５０】実施例６：除去された西洋ワサビペルオキ
シダーゼを含む吸収剤からのシグナルの光伝送を減少さ
せるための黒色フランジおよび／または黒色吸収剤の使
用 前の実施例では、読み取り前にスライド検鏡板から被覆
要素を取り出したので、化学発光測定の最中、洗浄され
た西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む吸収剤
は存在しなかった。本実験では、吸収剤を適所に有する
スライドそのものを読み取ることができるように発光計
を改造した。

【００５１】10,000アトモルのＨＲＰを含む血清 10 μ
l をスライド／白色吸収剤形式上にスポットした。スラ
イドを37℃で５分間インキュベートし、次いで75μl の
ルミノール／電子伝達剤／H₂O₂シグナル試薬／洗浄液で
１μl ／秒の速度で洗浄した。表４中の形式１に示され
るように、吸収剤が存在する状態のスライドを読み取っ
た時には56,509相対化学発光（ＲＣＬ）単位のシグナル
が得られた。しかし、読み取り前に吸収剤を除去する
と、 4811 ＲＣＬ単位のシグナルが測定された。

【００５２】次の実験は、このシグナルの差が吸収剤中
に存在する洗浄されたＨＲＰからの光伝送によるもので
あるかもしれないことを確かめるために実施した。表４
に示されるように、吸光性スライドと吸収剤の幾つかの
異なる組合せ、並びに光遮断フランジを有するように設
計されたスライドを光伝送について評価した。上記の通
り各スライドにスポットし、それをインキュベートし、
洗浄し、次いで吸収剤が存在している状態と無い状態で
発光計上で読み取った。

【００５３】二重反復測定の結果を表４に示す。この結
果は、黒色スライドおよび／または黒色吸収剤の存在
が、吸収剤中の洗浄されたＨＲＰによって生じる光伝送
を排除するのに有効であることを実証する。

【００５４】

【表４】

【００５５】実施例７ ：ピコモル分析物のための薄膜イムノアッセイ この実験は、本発明の要素と化学発光検出を使ったピコ
モル濃度の分析物を検出することができる実用的イムノ
アッセイを証明した。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈ
ｃＧ）を検出するモデルコーティングを使用した。試薬
マトリックスは下の表５に示されるような形式を有す
る。

【００５６】

【表５】

【００５７】 上記試薬マトリックスに次の定義を適用する。 DTPA：Sigma Chemical Co.により販売されているキレー
ト化剤であるジエチレントリアミン五酢酸。 Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液。 ポリマービーズ：ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリ
ル酸ビーズ）。 結合剤：ポリ（アクリル酸メチル−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
メタクリル酸２−アセトアセトキシエチル）。 Zonyl FSN ：duPont de Nemours により販売されている
フッ素化界面活性剤。 TX-100：Rohn and Haas Co. により販売されているオク
チルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤であ
るTriton X-100。

【００５８】ｈｃＧはSigma Chemical Co.から入手し
た。Yoshitake 他、1979年、Eur. J.Biochem. 第 101
巻、395-399 頁（この開示は参考として本明細書中に組
み込まれる）に記載された変法により抗体−ＨＲＰ接合
体を調製した。使用した要素は図１に示されたものであ
り、Whatman GF/B吸収剤を含んだ。ｈｃＧと抗体−ＨＲ
Ｐ接合体を混合し、７％ウシ血清アルブミン／リン酸緩
衝溶液中で１〜３時間インキュベートした後、該要素の
試薬マトリックス上に10μl をスポットした。インキュ
ベーション、洗浄および読み取り操作は実施例５に従っ
て行った。洗浄容量および洗浄速度はそれぞれ75μl お
よび１μl ／秒であった。図１１に関して、結果が示す
ところによれば、本発明の要素を使って薄膜形式におい
てピコモル濃度のｈｃＧを検出することが可能であっ
た。

【００５９】

【他の実施態様】

２．洗浄された未結合の標識および読取り領域の外側か
らの他の干渉物質により生じるバックグラウンドシグナ
ルが読取り領域中に逆戻りする前にそれを吸収または遮
断するために、前記吸光または反射手段が前記材料の層
と前記読取り領域との間に置かれる、請求項１に記載の
要素。 ３．前記イムノアッセイ定量段階が化学発光、蛍光およ
び比色イムノアッセイから成る群より選ばれる、請求項
１または２に記載の要素。 ４．前記要素が吸収材料の上に置かれたカバーを更に含
んで成る、請求項１または２に記載の要素。 ５．前記吸収材料がガラス微小繊維、紙、スポンジ、織
物およびプラスチックから成る群より選ばれた材料から
成る、請求項１または２に記載の要素。 ６．前記吸光または反射手段が、着色ポリビニルアルコ
ール、黒色プラスチック、化学物質および黒色セルロー
スから成る群より選ばれた材料から成る、請求項１また
は２に記載の要素。 ７．前記吸収材料が、液体が塗布要素と接触する前に吸
収されないようにすることによって洗浄効率を増加させ
るために、前記吸収材料の周囲に水不透性材料を更に含
んで成る、請求項１または２に記載の要素。 ８．前記分離型吸収層が１mlまでの洗浄容量を有する、
請求項１または２に記載の要素。 ９．前記吸光または反射手段が不透明の光遮断フランジ
である、請求項１または２に記載の要素。 本発明をそれらのある好ましい態様に関して特に詳細に
記載してきたが、本発明の精神および範囲内で変更及び
修正が可能であることは理解されるだろう。

【００６０】

【発明の効果】本発明の分析要素は、現存の要素に比べ
て、１mlまでの増加された洗浄容量を提供する。更に、
本要素は、洗浄され除去された標識によるバックグラウ
ンドを吸収または遮断するための吸光または反射手段を
提供する。結果として、未結合標識および干渉性血清成
分が、低レベルの分析物のイムノアッセイに要求される
程度に実質的に減少される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の分析要素の一態様の横断面図
である。

【図２】図２は、本発明の分析要素の別の一態様の横断
面図である。

【図３】図３は、洗浄液を上に適用した状態の本発明の
分析要素の横断面図である。

【図４】図４は、洗浄液を上に適用した状態の本発明の
分析要素の横断面図である。

【図５】図５は、洗浄操作後の対数目盛におけるＨＲＰ
の化学発光シグナルを表す。

【図６】図６は、洗浄操作後の対数目盛におけるＨＲＰ
の化学発光シグナルを表す。

【図７】図７は、10,000アトモルのＨＲＰに対する0.62
8 μl ／秒の速度での100 μl洗浄の効果を示すグラフ
である。

【図８】図８は、10,000アトモルのＨＲＰ／血清に対す
る洗浄速度と洗浄容量の効果を示すグラフである。

【図９】図９は、化学発光シグナルに対する中心外洗浄
の効果を比較するグラフである。

【図１０】図１０は、10,000アトモルのＨＲＰ／血清に
対する洗浄速度と洗浄容量の効果を示すグラフである。

【図１１】図１１は、化学発光検出法を使ったｈｃＧア
ッセイの結果を表すグラフである。

【符号の説明】

１０…乾式分析要素 １２…ベース １３…支持部材 １４…試薬マトリックス １５…読取り領域 １６…吸収材料 １７…カバー １８…洗浄容量 １９…フランジ ２０…計量分配装置 ２２…洗浄液 ２４…水不透性材料

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャロライン アードリッチ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14450, フェアポート，キングス レイシィ ウェ イ 49 (72)発明者 モーリス エー．キルダル アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，セバーン リッジ 1189

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 薄膜イムノアッセイにおいて流体試料中
   の分析物を測定するための乾式分析要素であって、 (a) 支持部材； (b) 前記支持部材により担持された少なくとも１つの多
   孔質材料の層から成る試薬マトリックスであって、読取
   り領域を含んで成る試薬マトリックス； (c) 分離型吸収材料層であって、 (i) 試薬マトリックスと接触している層； (ii)試薬マトリックスの読取り領域の周囲に隣接して置
   かれる層；および (iii) 前記読取り領域から離れて可溶性干渉物質と未結
   合標識を含む洗浄液を吸収する層から成る分離型吸収材
   料層；並びに (d) 前記吸収材料の少なくとも一部分と一体化した吸光
   または反射手段であって、洗浄された未結合標識および
   読取り領域の外側からの他の干渉物質により生じるバッ
   クグラウンドシグナルを、それが読取り領域中に逆戻り
   する前に吸収または遮断するための吸光または反射手段
   を含んで成る乾式分析要素。
2. 【請求項２】 プラスチックまたは他の材料から成る支
   持部材、および前記支持部材により担持された少なくと
   も１つの多孔質材料の層から成る試薬マトリックスであ
   って読取り領域を含む試薬マトリックス、を有する乾式
   分析要素を使った型の薄膜イムノアッセイにおいて洗浄
   容量を増加させる方法であって、 (i) 試薬マトリックスと接触している層； (ii)試薬マトリックスの読取り領域の周囲に隣接して置
   かれる層；および (iii) 前記読取り領域から離れて可溶性干渉物質と未結
   合標識を含む洗浄液を吸収する層から成る分離型吸収材
   料層を配置し；そして前記吸収材料の少なくとも一部分
   と一体化した吸光または反射手段であって、洗浄された
   未結合標識および読取り領域の外側からの他の干渉物質
   により生じるバックグラウンドシグナルを、それが読取
   り領域中に逆戻りする前に吸収または遮断するための吸
   光または反射手段を提供することを含んで成る方法。