JPH06167500A - アミノ酸配列の決定に用いられる装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 必要とされる複数の流体を正確に、再現性良
く供給することが可能であり、更には保全性及び拡張性
においても優れた流路切替えバルブを具備したアミノ酸
配列の決定に用いられる装置の提供。 【構成】 ペプチド等の試料を不動化するための支持
体、支持体を保持する反応部、試料を分解するための試
薬を保持する２以上の試薬容器、試薬との反応により試
料から分離されたアミノ酸残基を分離するための分離手
段、分離手段で分離されたアミノ酸残基を検出するため
の検出器、これらを一体に連結する流体流路及び試薬切
り替えバルブ装置からなるアミノ酸配列の決定に用いら
れる装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペプチドまたは蛋白質
を支持体上に不動化し、段階的分解によりペプチド又は
蛋白質のアミノ酸配列を分離することからなるペプチド
又は蛋白質のアミノ酸配列の決定に用いられる装置に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】ペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列分析
に最も広範に用いられている方法は、一連の化学的工程
によってペプチド又は蛋白質のＮ末端あるいはＣ末端か
らアミノ酸を逐次的に切断および除去する方法である。
ペプチド又は蛋白質のＮ末端からアミノ酸を連続的に切
断及び除去する化学的工程として、例えばエドマン(Edm
an) 分解法が知られている。この方法は、２段階からな
る工程を１サイクルとする一連の化学的工程により、順
次ペプチドのＮ末端からアミノ酸を除去し検出する方法
である。

【０００３】ペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の決定
に用いられる装置として、従来数種の装置が知られてお
り、それらのいくつかは広く一般に使用されているが、
いずれもエドマン(Edman) 分解法にもとづく一連の化学
的工程を自動化したものである。これらの装置において
は、試料ペプチド又は蛋白質を支持体表面に予め不動化
し、この支持体を装置の流体流路中へ充填し、装置内部
で複数の試薬を交互に導入して一連の化学的工程を行う
ものである。

【０００４】支持体としては多孔性膜あるいは粒子など
が用いられるが、これらの表面に試料ペプチド又は蛋白
質を不動化する方法としては、ペプチド又は蛋白質が支
持体表面に疎水的に吸着する性質を利用して固定化する
方法や、ペプチド又は蛋白質を支持体表面に共有結合に
よって固定化する方法がある。この場合のカップリング
反応の至適ｐＨは約９．０であり、ｐＨ９．５以上では
カップリング試薬は急速に水と反応し始め、副生成物
（アニリドおよびジフェニルチオウレア）を形成する。
一方、より高いｐＨ値ではペプチド又はタンパク質の分
解が問題となる。従って、反応物表面のｐＨを効率良く
コントロ−ルしてカップリングを良好に行うためには、
気相の流速、並びにガス雰囲気中の塩基の濃度を正確に
コントロ−ルする必要がある。また、支持体上のペプチ
ドの損失を回避する目的で、ガス状のカップリング塩基
を用いる場合には、液状バッファ−溶液を用いる場合ほ
ど反応をコントロ−ルすることは容易ではない。また、
エドマン法では開裂剤としてトリフルオロ酢酸などの無
水の酸が用いられるが、カップリングしたＮ末端ペプチ
ド結合は他の結合よりも酸加水分解を受け易く、無作為
な開裂も起こり得ることから、気相の流速及び濃度は正
確なコントロ−ルが必要とされる。しかも、トリフルオ
ロ酢酸は極めて腐食性の強い物質として知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来のペプチド又は蛋
白質のアミノ酸配列の分析に用いられる装置では、必要
とされる複数の流体を所定の時刻に所定の時間だけ正確
かつ再現性良く流路に導入する目的で、開閉すべき二つ
の流路の出口及び入口を同一平面上に近接して配置する
とともに、一つのダイアフラムがこの平面に直角方向か
ら圧着されるように配置し、このダイアフラムで平面上
に配置された出口及び入口を同時に塞ぐことによって流
路を閉じる方式のバルブが用いられている。

【０００６】しかしながら、ダイアフラムの移動には電
磁ソレノイドを利用するのが一般的であるが、エドマン
法では前記したように開裂剤として極めて腐食性の強い
トリフルオロ酢酸などの無水の酸が用いられることか
ら、ダイアフラムに直結する電磁ソレノイドが腐食し故
障の原因となるという課題がある。

【０００７】この課題を解決する目的で、電磁ソレノイ
ドの表面に金メッキを施したものも使用されているが、
この処理は高価であり、分析装置において望まれている
一般的要求に反するという新たな課題が生じている。

【０００８】また、前記の方式において、死容積を最小
にする目的で出口及び入口を隣接して配置可能とすべ
く、二つの流路をＶ字型に構成したものがあるが、この
方式ではダイアフラムとして使用する材料の伸縮性に依
存して流路の開閉を行うため、流体を再現性良く流路に
導入するという点では調整が難しい。更にダイアフラム
が出口及び入口を含む平面と接触する部分に小空間を生
じてしまい、空間を洗浄することが不可能であることか
ら、他種類の試薬を使用する分析装置では試薬汚染とい
う課題が生じる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は以上の課題を解
決すべくなされたものであり、その目的は、必要とされ
る複数の流体を正確にかつ再現性良く供給でき、更には
保全性及び拡張性においても優れた流路切替えバルブを
具備したアミノ酸配列の決定に用いられる装置を提供す
るところにある。また本発明は、コンパクトな構成で取
扱い性に優れ、かつ低価格なアミノ酸配列の決定に用い
られる装置を提供することにある。

【００１０】この目的を達成するためになされた本発明
の装置は、ペプチド又は蛋白質試料を不動化するための
支持体、支持体を保持する反応部、試料を分解するため
の試薬を保持する２つ以上の試薬容器、試薬との反応に
より試料から遊離したアミノ酸残基を分離するための分
離手段、分離手段で分離されたアミノ酸残基を検出する
ための検出器、これらを一体に連結する流体流路及び前
記複数の試料容器中の２種以上の試薬を流体流路に導入
するための試薬切り替えバルブからなり、流体流路は試
薬容器と反応部を試薬切り替えバルブを介して連結し反
応部と分離手段を連結し更に分離手段と検出器を連結し
ている、アミノ酸配列の決定に用いられる装置であっ
て、試薬切り替えバルブは２つの部材Ａ及びＢがその一
面において回転自在に密着したものであり、部材Ａは、
それを貫通する３以上の貫通孔であって、少なくとも１
つの貫通孔は流体流路で反応部と連結され、他の貫通孔
は異なる試薬容器と流体流路で連結されており、ここで
反応部と連結された貫通孔と他の貫通孔の間隔は等しい
貫通孔をＢとの密着面に有しており、部材Ｂは、前記部
材Ａと密着する面に少なくとも１つの、部材Ａにおける
反応部と連結された貫通孔と他の貫通孔の間隔に等しい
長さの溝であって、部材ＡとＢを密着させそのいずれか
一方を密着面上の一点を中心に回転させた時に部材Ａの
密着面上の反応部と連結された貫通孔及び他の貫通孔と
を連結し、部材Ａの部材Ｂとの密着面と当該溝により試
薬容器から反応部に至る流体流路を形成し得る溝を有し
ていることを特徴とする、アミノ酸配列の決定に用いら
れる装置、である。以下、本発明を図面に基づき説明す
る。

【００１１】図１は、エドマン分解法にもとづく一連の
化学的工程を自動化した本発明のアミノ酸配列の決定に
用いられる装置の構成図である。試料ペプチド又は蛋白
質をその表面に予め不動化した支持体は、１の反応部に
保持される。支持体としては例えばポリビニリデンジフ
ロライド、ポリエチレン、あるいはガラスなどを基材と
する多孔性膜を使用することができ、また、試料ペプチ
ド又は蛋白質を支持体表面に不動化するのは、疎水的吸
着あるいは共有結合によって固定化する方法によれば良
い。なお図１では、複数の切り替えバルブを有する装置
を具体的に説明しているが、試薬の種類が少ない場合等
は切り替えバルブ１つで対応することが可能である。

【００１２】図１において、２〜７は試薬容器を示して
いる。例えば、エドマン分解法における通常の試薬を使
用する例として、２はイソチオシアン酸フェニルのヘプ
タン溶液、３はトリエチルアミンの水溶液、４はトリフ
ルオロ酢酸、６はトリフルオロ酢酸の水溶液、５は酢酸
エチル及び７はアセトニトリル水溶液を保持する試薬容
器である。なお、２〜５の試薬容器に保持された試薬
は、反応部に供給され、試料ペプチド又は蛋白質の分解
反応に関与するものであり、６及び７に保持された試薬
はＡＴＺアミノ酸からＰＴＨアミノ酸への変換に関与す
る。

【００１３】各試薬の流体流路への導入は、窒素あるい
は希ガスなどの高純度な不活性気体を貯蔵した容器８と
それぞれの試薬容器を図のように連結し、流路に通じる
流路切替えバルブ９を開いて圧送することで非接触状態
で行うことができる。切り替えバルブ９としては通常の
バルブを使用することができる。また、本図では好まし
い例としてガスによる圧送を示したが、ポンプ等を使用
することもできる。

【００１４】図中、１０のバルブは試薬容器２又は３に
保持された試薬を切り替えて反応部に送るためのもの
で、１１のバルブは４又は５に保持された試薬を切り替
えて反応部に送るためのものである。これら流路切替え
バルブとしては、インジェクションバルブ等と一般的に
総称されている液体クロマトグラフィ−用流路切替えバ
ルブを用いることが可能である。インジェクションバル
ブでは、構成部材の密着面は円形をしており、回転円盤
型シ−ルの材質としてテフロン、ポリイミド、セラミッ
クスなどが使用されている。

【００１５】図２には、図１において１０及び１１で示
した切り替えバルブの詳細が示されている。図１の１０
及び１１の切り替えバルブは図２で詳細に示されるよう
に、ａ〜ｄの４つの貫通孔を円形密着面に有する部材Ａ
と、溝ｅを円形密着面に有する部材Ｂから構成されてい
る。部材Ａにおいて、ｄの貫通孔は反応部へ連結された
ものであり、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ図１に示されたよ
うに試薬容器２、３又はガス容器８と連結されている。
貫通孔ａ−ｄ、ｂ−ｄ及びｃ−ｄの距離は溝ｅの長さと
同一であるから、部材Ｂを密着面中心軸ｆを中心に回転
させることで、ａ−ｄ、ｂ−ｄ又はｃ−ｄのいずれかの
貫通孔間に流体経路が形成される。なお図１において１
２及び１８で示した切り替えバルブも、構造的には図２
で示された切り替えバルブと同様である。なお図中ｇ
は、部材ＡとＢを圧着させるためのスプリングである。

【００１６】図３には、図１において１３で示した切り
替えバルブの詳細が示されている。この切り替えバルブ
はｈ〜ｍの６つの貫通孔を円形密着面に有する部材Ａ
と、溝ｎ〜ｐを円形密着面に有する部材Ｂから構成され
ている。ｈ〜ｍの貫通孔は円周上に等間隔に、即ち１つ
の貫通孔とそれに隣接する２つの貫通孔とのそれぞれの
距離が等しくなるように配置されている。一方部材Ｂの
溝ｎ〜ｐは、部材Ａにおいて隣接する貫通孔の距離と同
じ長さを有する溝である。この切り替えバルブでは貫通
孔ｈは図１における切り替えバルブ１０に、ｉはｋに、
ｊは図１の反応部１に、ｌは図１の切り替えバルブ１１
に、ｍは廃液タンク１５に連結している。部材Ｂを密着
面中心軸ｆを中心に回転させることで、ｈ−ｉ、ｊ−
ｋ、ｌ−ｍの貫通孔間に流路が形成され、切り替えバル
ブ１０からの流体はｈ−ｉ−ｋ−ｊを経由して反応部に
導かれる。一方切り替えバルブ１１からの流体は、ｌ−
ｍを経由して廃液タンクに導かれる。部材Ｂが更に回転
すると、ｉ−ｊ、ｋ−ｌ、ｈ−ｍの貫通孔間に流路が形
成され、切り替えバルブ１０からの流体はｈ−ｍを経由
して廃液タンクに導かれる。一方切り替えバルブ１１か
らの流体は、ｌ−ｋ−ｉ−ｊを経由して反応部１に導か
れる。この結果、切り替えバルブ１０又は１１からのい
ずれかの試薬が反応部に導かれることになる。なお、図
１における切り替えバルブ１４、１６および１７の切り
替えバルブは図３に示された切り替えバルブと同様であ
る。

【００１７】次に、更に図１の装置における流体の流れ
について説明する。ガス容器８と試料容器の間の流路に
位置するバルブ９を解放することで、試薬容器中の圧力
が上昇する。その結果、容器中の試薬は切り替えバルブ
１０〜１２のいずれかに圧送される。１０の切り替えバ
ルブでは、試薬容器２又は３のいずれかに保持された試
薬が切り替えバルブ１３へと導入される。１１の切り替
えバルブでは、試薬容器４又は５に保持された試薬が切
り替えバルブ１３へと導入される。１２の切り替えバル
ブでは、試薬容器６又は７に保持された試薬が切り替え
バルブ１４へと導入される。

【００１８】切り替えバルブ１３では、１０又は１１か
ら導入された試薬の一方を反応部１に導入し、他方を廃
液タンク１５に導入する。切り替えバルブ１４では、１
２から導入された試薬をコンバ−ジョンフラスコ１９に
導入するか廃液タンク１５に導入する。このように図１
では、切り替えバルブ１３により、結果的に２〜５の試
薬の一種類を選択的に反応部１に供給する。

【００１９】反応部に導入された試薬は、そこに保持さ
れた支持体表面のペプチド又は蛋白質と反応し、そのＮ
末端を順次分解し、アミノ酸残基を遊離させる。反応部
からの流体は、バルブ１６の働きにより、廃液タンク１
５又は切り替えバルブ１８に導入される。切り替えバル
ブ１８は、コンバ−ジョンフラスコ１９と、切り替えバ
ルブ１７、不活性気体容器８又は反応部１を連結し得る
ものである。このバルブでは、反応部１からの流体をコ
ンバ−ジョンフラスコ１９に導入し、試薬容器５又は７
からの試薬と更に反応させた後、反応液を切り替えバル
ブ１７に導入する。切り替えバルブ１７に導入された反
応液は、これを経由して分離カラム２０に導入され、次
いで検出器２１を経由して廃液タンク１５に行く。

【００２０】図１において、２２及び２３は電磁ソレノ
イドバルブであって、流路の一方向に対する開閉を行う
ように構成されている。即ち、コンバ−ジョンフラスコ
への不活性気体の流れ及びコンバ−ジョンフラスコから
廃液タンク１５への流れは一方通行であって、逆行はし
ないようになっている。

【００２１】図１において、２４及び２５はエア−セン
サ−であって、流路切替えバルブ１３又は１４と廃液タ
ンク１５の間の流路内の流体試薬の有無を検知する。

【００２２】試薬及び反応液の移送における各単位操作
において、図１に示される各流路切替えバルブのポジシ
ョンをより明確に示せば、例えば、試薬容器２からの所
定量の試薬の反応部１への導入においては、切り替えバ
ルブ１０においてこれが切り替えバルブ１３に導入され
るようにし、切り替えバルブ１３のポジションでこれが
廃液タンク１５に導入される状態とすることによって、
例えば窒素ガス等の不活性気体によって加圧されている
試薬容器２中の試薬は切り替えバルブ１０と１３の間に
構成されたル−プへと押し出され、最終的に廃液タンク
１５に導入されるから、エア−センサ−２４で流路内へ
の試薬の流入を確認後、続いて、切り替えバルブ１０を
切り替え、不活性気体が切り替えバルブ１３に導入され
るようにすると共に切り替えバルブ１３を切り替え、反
応部１への流路を形成することによってル−プ内部の試
薬が反応部１に導入される。所定量の試薬を反応部１に
導入した時点で切り替えバルブ１３を切り替えれば、そ
れ以降の試薬は廃液タンク１５に導入される。

【００２３】なお図１では、流路切替えバルブ１０又は
１１と１３、１２と１４の間にル−プを形成することに
よって計量された正確かつ再現性に優れた試薬送液が可
能となっているとともに不活性気体を流路に導入するこ
とによって他の試薬の混入を防ぎ、更に、特に切り替え
バルブから反応部に至るまでの液体流路の体積を反応部
の体積の１／ｎ倍（ｎは自然数）とすることで死容積を
最小とすることができる。切り替えバルブを１つしか使
用しない場合には、当該切り替えバルブと反応部との間
にこのようなル−プを設ければ良い。

【００２４】図１に示した本発明の装置によれば、エド
マン法の一連の化学的工程を実施することができる。す
なわち、先に例示した試薬容器２〜４及び６の試薬は、
エドマン法の第１段階の一連の化学的工程に準じて図１
に示す流路を通じて反応部１へ交互に導入される。すな
わち、カップリング塩基（３）の所定量を流路に導入す
ることによって支持体を塩基性条件下にした後、カップ
リング剤（２）の所定量を流路に導入し支持体に不動化
されたポリペプチドのＮ末端アミノ酸の遊離アミノ基に
カップリング剤を結合し、タンパク質中の他のペプチド
結合よりも酸加水分解を受け易くなる様にする。引き続
き、支持体から過剰のカップリング剤とバッファ−を除
去する目的で（５）の所定量を流路に導入後、開裂剤
（４）３の所定量を流路に導入し支持体に不動化された
ポリペプチドのＮ末端アミノ酸の活性化されたペプチド
結合を加水分解する。引き続き、再び（５）の所定量を
流路に導入し反応部１内部の支持体から加水分解産物で
ある遊離の２−アニリノ−５−チアゾリノン（ＡＴＺ）
アミノ酸を抽出し、その抽出液をコンバ−ジョンフラス
コ１９内部へ導入する。一方、容器６及び７の試薬は、
エドマン法の第２段階の一連の化学的工程に準じ、図１
の反応部１を経由しない流路を通ってコンバ−ジョンフ
ラスコ１９へ交互に導入される。すなわち、上記の最後
の工程によってコンバ−ジョンフラスコ内部へ導入され
たＡＴＺアミノ酸を含む容器５の試薬溶液を蒸発乾固
し、その後容器６の試薬の所定量をコンバ−ジョンフラ
スコ１９に導入してＡＴＺアミノ酸をフェニルチオヒダ
ントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に変換する。引き続き、コ
ンバ−ジョンフラスコ１９内部のＰＴＨアミノ酸を含む
容器６の試薬溶液を蒸発乾固し、その後、容器７の試薬
の所定量をコンバ−ジョンフラスコ１９に導入してＰＴ
Ｈアミノ酸を溶解し、分析用試料とする。ＰＴＨアミノ
酸は、構造中にアミノ酸を特徴付けるアミノ酸側鎖を含
有しているので、高速液体クロマトグラフィなどの分離
・分析手段によって同定される。

【００２５】図１は本発明の一例であって、これを変形
することは容易である。例えば、上記実施例では１０、
１１、１２は４ポ−ト３ポジションの液体クロマトグラ
フィ−用流路切り替えバルブが使用でき、一方１３及び
１４は６ポ−ト２ポジションの液体クロマトグラフィ−
用流路切り替えバルブが使用できるが、流路切り替えバ
ルブ１０、１１又は１２と１３、１４の間にル−プを構
成し、不活性気体を流路に導入することによって他の試
薬の混入を防ぎ、更に死容積を最小とするためには、３
ポ−ト２ポジション、６ポ−ト２ポジッション又は７ポ
−ト６ポジションの液体クロマトグラフィ−用流路切り
替えバルブを組合わせても良い。

【００２６】また、上記実施例はエドマン(Edman) 分解
法にもとづく一連の化学的工程を自動化することからな
るアミノ酸配列の決定に用いられる装置として本発明を
構成した例を示しているが、ペプチドまたは蛋白質を支
持体上に不動化し、ペプチドまたは蛋白質のＣ末端から
アミノ酸を連続的に切断および除去する化学的工程から
なるペプチド又は蛋白質の配列分析法に用いられる装置
であれば、本発明には制限がない。

【００２７】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、必要とされる複数の流体について正確かつ再
現性に優れた流体供給を可能とし且保全性および拡張性
においても優れたアミノ酸配列の決定に用いられる装置
が提供可能となる。

【００２８】また本発明によれば、流路切り替えバルブ
としてスイッチングバルブないしインジェクションバル
ブと一般的に総称されている液体クロマトグラフィ−用
流路切替えバルブを用いることも可能であり、コンパク
トな構成で保全性に優れ、かつ低価格なアミノ酸配列の
決定に用いられる装置が提供可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の一実施例を示ものであり、エド
マン分解法を実施するための装置として構成した本発明
の装置を示している。

【図２】図２は、図１における切り替えバルブ１０、１
１及び１２を詳細に説明するものである。

【図３】図３は、図１における切り替えバルブ１６及び
１７を詳細に説明するものである。

【符号の説明】

１ 反応部 ２〜７ 試薬容器 ８ 不活性気体容器 ９ バルブ １０〜１４ 切り替えバルブ １５ 廃液タンク １６〜１８ 切り替えバルブ １９ コンバ−ジョンフラスコ ２０ 分離カラム ２１ 検出器 ２２、２３ ソノイドバルブ ２４、２５ 液体センサ− Ａ、Ｂ 部材 ａ〜ｄ、ｈ〜ｍ 貫通孔 ｅ、ｎ〜ｐ 溝 ｆ 回転中心 ｇ スプリング

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド又は蛋白質試料を不動化するた
   めの支持体、支持体を保持する反応部、試料を分解する
   ための試薬を保持する２つ以上の試薬容器、試薬との反
   応により試料から遊離したアミノ酸残基を分離するため
   の分離手段、分離手段で分離されたアミノ酸残基を検出
   するための検出器、これらを一体に連結する流体流路及
   び前記複数の試料容器中の２種以上の試薬を流体流路に
   導入するための試薬切り替えバルブからなり、流体流路
   は試薬容器と反応部を試薬切り替えバルブを介して連結
   し反応部と分離手段を連結し更に分離手段と検出器を連
   結している、アミノ酸配列の決定に用いられる装置であ
   って、試薬切り替えバルブは２つの部材Ａ及びＢがその
   一面において回転自在に密着したものであり、部材Ａ
   は、それを貫通する３以上の貫通孔であって、少なくと
   も１つの貫通孔は流体流路で反応部と連結され、他の貫
   通孔は異なる試薬容器と流体流路で連結されており、こ
   こで反応部と連結された貫通孔と他の貫通孔の間隔は等
   しい貫通孔をＢとの密着面に有しており、部材Ｂは、前
   記部材Ａと密着する面に少なくとも１つの、部材Ａにお
   ける反応部と連結された貫通孔と他の貫通孔の間隔に等
   しい長さの溝であって、部材ＡとＢを密着させそのいず
   れか一方を密着面上の一点を中心に回転させた時に部材
   Ａの密着面上の反応部と連結された貫通孔及び他の貫通
   孔とを連結し、部材Ａの部材Ｂとの密着面と当該溝によ
   り試薬容器から反応部に至る流体流路を形成し得る溝を
   有していることを特徴とする、アミノ酸配列の決定に用
   いられる装置。
2. 【請求項２】 切り替えバルブがインジェクションバル
   ブである請求項１のアミノ酸配列の決定に用いられる装
   置。
3. 【請求項３】 切り替えバルブから反応部に至るまでの
   液体流路の体積が反応部の体積の１／ｎ倍（ｎは自然
   数）であることを特徴とする請求項１又は２のアミノ酸
   配列の決定に用いられる装置。