JPH06169775A - ＡＭＰＡ結合性ヒトＧｌｕＲ４受容体 - Google Patents
ＡＭＰＡ結合性ヒトＧｌｕＲ４受容体Info
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- JPH06169775A JPH06169775A JP5212342A JP21234293A JPH06169775A JP H06169775 A JPH06169775 A JP H06169775A JP 5212342 A JP5212342 A JP 5212342A JP 21234293 A JP21234293 A JP 21234293A JP H06169775 A JPH06169775 A JP H06169775A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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-
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体と称するＡＭＰＡ型ヒ
トＣＮＳ受容体をコードする単離ポリヌクレオチド。本
発明では前記受容体の構造的特徴を明らかにし、該受容
体を発現する細胞系（特にリガンドスクリーニング用）
も開示している。 【効果】ヒトのＣＮＳ障害を治療するための化合物のス
クリーニング等に有用である。
トＣＮＳ受容体をコードする単離ポリヌクレオチド。本
発明では前記受容体の構造的特徴を明らかにし、該受容
体を発現する細胞系（特にリガンドスクリーニング用）
も開示している。 【効果】ヒトのＣＮＳ障害を治療するための化合物のス
クリーニング等に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、神経生物学分野での組
換えＤＮＡ技術の適用に関する。本発明はより特定的に
は、興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）受容体、特にヒトＥＡＡ
受容体をコードするＤＮＡのクローニング及び発現に関
する。
換えＤＮＡ技術の適用に関する。本発明はより特定的に
は、興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）受容体、特にヒトＥＡＡ
受容体をコードするＤＮＡのクローニング及び発現に関
する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】哺乳動
物の中枢神経系（ＣＮＳ）では、インパルス（ｎｅｒｖ
ｅ ｉｍｐｕｌｓｅ）の伝達が、「送出（ｓｅｎｄｉｎ
ｇ）」ニューロンによって放出され「受容（ｒｅｃｅｉ
ｖｉｎｇ）」ニューロン上の表面受容体に結合してその
興奮をひき起こす神経伝達物質とその受容体との間の相
互作用によって制御される。Ｌ−グルタメートはＣＮＳ
中に最も豊富に存在する神経伝達物質であり、脊椎動物
の主要興奮経路を仲介する。そのためグルタメートは興
奮性アミノ酸と呼ばれ、これに応答する受容体はグルタ
メート受容体として様々な呼称を有し、又はより一般的
にはＥＡＡ受容体と呼ばれる。
物の中枢神経系（ＣＮＳ）では、インパルス（ｎｅｒｖ
ｅ ｉｍｐｕｌｓｅ）の伝達が、「送出（ｓｅｎｄｉｎ
ｇ）」ニューロンによって放出され「受容（ｒｅｃｅｉ
ｖｉｎｇ）」ニューロン上の表面受容体に結合してその
興奮をひき起こす神経伝達物質とその受容体との間の相
互作用によって制御される。Ｌ−グルタメートはＣＮＳ
中に最も豊富に存在する神経伝達物質であり、脊椎動物
の主要興奮経路を仲介する。そのためグルタメートは興
奮性アミノ酸と呼ばれ、これに応答する受容体はグルタ
メート受容体として様々な呼称を有し、又はより一般的
にはＥＡＡ受容体と呼ばれる。
【０００３】哺乳動物の脳から単離した組織と種々の合
成ＥＡＡ受容体アゴニストとの使用によって、ＥＡＡ受
容体薬理学の知識はある程度向上してきた。前記ＥＡＡ
受容体類に属する受容体は現在、前述のようなアゴニス
トへの示差的結合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎ
ｄｉｎｇ）に基づいて３つの主要タイプに類別されてい
る。そのうちの１つのタイプのＥＡＡ受容体は、グルタ
メートの他にアゴニストＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−ア
スパルテート）にも結合し、ＮＭＤＡ型ＥＡＡ受容体と
称する。他の２つのグルタメート結合タイプのＥＡＡ受
容体はＮＭＤＡには結合せず、別の２つのＥＡＡ受容体
アゴニスト、即ちＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキ
シ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネー
ト）及びカイネート（２−カルボキシ−４−（１−メチ
ルエテニル）−３−ピロリジンアセテート）に対する結
合の優先度に従って命名されている。特に、グルタメー
トには結合するがＮＭＤＡには結合せず、且つＡＭＰＡ
よりカイネートに対してより大きい親和性を示して結合
する受容体は、カイネート型ＥＡＡ受容体と称する。同
様にして、グルタメートには結合するがＮＭＤＡには結
合せず、且つカイネートよりＡＭＰＡに対してより大き
い親和性を示して結合するＥＡＡ受容体はＡＭＰＡ型Ｅ
ＡＡ受容体と称する。
成ＥＡＡ受容体アゴニストとの使用によって、ＥＡＡ受
容体薬理学の知識はある程度向上してきた。前記ＥＡＡ
受容体類に属する受容体は現在、前述のようなアゴニス
トへの示差的結合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎ
ｄｉｎｇ）に基づいて３つの主要タイプに類別されてい
る。そのうちの１つのタイプのＥＡＡ受容体は、グルタ
メートの他にアゴニストＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−ア
スパルテート）にも結合し、ＮＭＤＡ型ＥＡＡ受容体と
称する。他の２つのグルタメート結合タイプのＥＡＡ受
容体はＮＭＤＡには結合せず、別の２つのＥＡＡ受容体
アゴニスト、即ちＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキ
シ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネー
ト）及びカイネート（２−カルボキシ−４−（１−メチ
ルエテニル）−３−ピロリジンアセテート）に対する結
合の優先度に従って命名されている。特に、グルタメー
トには結合するがＮＭＤＡには結合せず、且つＡＭＰＡ
よりカイネートに対してより大きい親和性を示して結合
する受容体は、カイネート型ＥＡＡ受容体と称する。同
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合せず、且つカイネートよりＡＭＰＡに対してより大き
い親和性を示して結合するＥＡＡ受容体はＡＭＰＡ型Ｅ
ＡＡ受容体と称する。
【０００４】グルタメート結合性ＥＡＡ受容体類は生理
学的及び医学的重要性が高い。グルタメートは、多くの
長期増強作用（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ）アスペクト（学習及び記憶）、シナプス塑性
（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）の進展、
てんかんの発作、脳卒中又は他の低酸素症の発生に続く
貧血によって生じるニューロンの損傷、並びに他の形態
の神経変性プロセス（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）に関係している。しかしなが
ら、これらのプロセスを調節する治療法の開発は、ＥＡ
Ａ受容体の界面で特異的に作用する選択的結合性薬剤分
子の発見に使用できる均質な受容体材料源が存在しなか
ったために、極めて困難であった。可能性のある（ｃａ
ｎｄｉｄａｔｅ）薬剤をスクリーニングするために現在
使用されている脳由来組織は不均質な受容体源であり、
所期のＥＡＡ受容体／リガンド界面の研究を妨害する多
くの受容体タイプを表面に有する。ヒトの治療の研究
は、ヒト由来脳組織の入手が限られているために更に複
雑である。従って、所期の受容体だけを産生するように
遺伝子工学的に作られた細胞の取得が望まれる。クロー
ン化受容体遺伝子を発現する細胞系を用いると、薬剤ス
クリーニングプログラム用に、所望の均質な受容体基体
（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が得られる。
学的及び医学的重要性が高い。グルタメートは、多くの
長期増強作用（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ）アスペクト（学習及び記憶）、シナプス塑性
（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）の進展、
てんかんの発作、脳卒中又は他の低酸素症の発生に続く
貧血によって生じるニューロンの損傷、並びに他の形態
の神経変性プロセス（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）に関係している。しかしなが
ら、これらのプロセスを調節する治療法の開発は、ＥＡ
Ａ受容体の界面で特異的に作用する選択的結合性薬剤分
子の発見に使用できる均質な受容体材料源が存在しなか
ったために、極めて困難であった。可能性のある（ｃａ
ｎｄｉｄａｔｅ）薬剤をスクリーニングするために現在
使用されている脳由来組織は不均質な受容体源であり、
所期のＥＡＡ受容体／リガンド界面の研究を妨害する多
くの受容体タイプを表面に有する。ヒトの治療の研究
は、ヒト由来脳組織の入手が限られているために更に複
雑である。従って、所期の受容体だけを産生するように
遺伝子工学的に作られた細胞の取得が望まれる。クロー
ン化受容体遺伝子を発現する細胞系を用いると、薬剤ス
クリーニングプログラム用に、所望の均質な受容体基体
（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が得られる。
【０００５】最近になって、ヒト以外の由来源、特にラ
ットに由来するＥＡＡ受容体の置換ポリペプチド（ｓｕ
ｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコー
ドする遺伝子が発見された。ＨｏｌｌｍａｎｎらはＮａ
ｔｕｒｅ ３４２：６４３，１９８９に、ＧｌｕＲ−Ｋ
１と称する（現在は単にＧｌｕＲ１と呼ばれている）遺
伝子をラットから単離したと記述している。該遺伝子は
ラットＥＡＡ受容体類に属する受容体をコードし、最初
はカイネート型であると考えられていた。Ｋｅｉｎａｎ
ｅｎらのその後の研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：５５
６，１９９０）で、やはりラットの遺伝子であって実際
には先に単離されたＧｌｕＲ１と同じものである遺伝子
ＧｌｕＲ−Ａが、実際にはカイネート型ではなくＡＭＰ
Ａ型の受容体をコードすることが明らかにされた。これ
ら２つのグループの研究者達はその後、ラット源から単
離した関連遺伝子を５つも報告している。Ｂｏｕｌｔｅ
ｒらはＳｃｉｅｎｃｅ ２４９：１０３３，１９９０
で、ラットがＧｌｕＲ１以外に３つの関連遺伝子を有す
ることを明らかにし、これらの遺伝子をＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３及びＧｌｕＲ４と命名した。またＢｅｔｔｌｅ
ｒらは、Ｎｅｕｒｏｎ５：５８３，１９９０で、Ｇｌｕ
Ｒ５を開示した。前出のＫｅｉｎａｎｅｎらは、Ｇｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ４にそれぞ
れ正確に対応する遺伝子ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、
ＧｌｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄについて記述している。
ＳｏｍｍｅｒらはＳｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５８０，
１９９０で、ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−
Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄに関して、各遺伝子毎に、異なる方
法でスプライシングした形態（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ
ｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ）が２つあることを明
らかにした。これらの著者及びＭｏｎｙｅｒら、Ｎｅｕ
ｒｏｎ ６：７９９，１９９１は、前述の遺伝子を異な
る方法でスプライシングしたものがラットの脳に示差的
に発現されることを立証した。
ットに由来するＥＡＡ受容体の置換ポリペプチド（ｓｕ
ｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコー
ドする遺伝子が発見された。ＨｏｌｌｍａｎｎらはＮａ
ｔｕｒｅ ３４２：６４３，１９８９に、ＧｌｕＲ−Ｋ
１と称する（現在は単にＧｌｕＲ１と呼ばれている）遺
伝子をラットから単離したと記述している。該遺伝子は
ラットＥＡＡ受容体類に属する受容体をコードし、最初
はカイネート型であると考えられていた。Ｋｅｉｎａｎ
ｅｎらのその後の研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：５５
６，１９９０）で、やはりラットの遺伝子であって実際
には先に単離されたＧｌｕＲ１と同じものである遺伝子
ＧｌｕＲ−Ａが、実際にはカイネート型ではなくＡＭＰ
Ａ型の受容体をコードすることが明らかにされた。これ
ら２つのグループの研究者達はその後、ラット源から単
離した関連遺伝子を５つも報告している。Ｂｏｕｌｔｅ
ｒらはＳｃｉｅｎｃｅ ２４９：１０３３，１９９０
で、ラットがＧｌｕＲ１以外に３つの関連遺伝子を有す
ることを明らかにし、これらの遺伝子をＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３及びＧｌｕＲ４と命名した。またＢｅｔｔｌｅ
ｒらは、Ｎｅｕｒｏｎ５：５８３，１９９０で、Ｇｌｕ
Ｒ５を開示した。前出のＫｅｉｎａｎｅｎらは、Ｇｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ４にそれぞ
れ正確に対応する遺伝子ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、
ＧｌｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄについて記述している。
ＳｏｍｍｅｒらはＳｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５８０，
１９９０で、ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−
Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄに関して、各遺伝子毎に、異なる方
法でスプライシングした形態（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ
ｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ）が２つあることを明
らかにした。これらの著者及びＭｏｎｙｅｒら、Ｎｅｕ
ｒｏｎ ６：７９９，１９９１は、前述の遺伝子を異な
る方法でスプライシングしたものがラットの脳に示差的
に発現されることを立証した。
【０００６】これらの分子クローニングの発達によっ
て、ラットの脳に存在している時のＥＡＡ受容体及びそ
のサブユニットの構造的特徴がより良く解明されるに至
った。現在のＥＡＡ受容体構造のモデルによれば、各受
容体は構造的にはヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｍｅｒｉ
ｃ）あり、個々の膜結合サブユニットからなり、各々が
４つのトランスメンブラン領域と、リガンド結合特性を
ある程度まで支配し且つ受容体複合体によって使用され
るイオンゲート制御機能（ｉｏｎ ｇａｔｉｎｇｆｕｎ
ｃｔｉｏｎ）に貢献する細胞外ドメインとを有する。前
出のＫｅｉｎａｎｅｎらは、例えば、ＧｌｕＲ−Ａ、Ｇ
ｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄを含むラッ
トＧｌｕＲ受容体の各サブユニットが、単独状態（ｕｎ
ｉｔａｒｙ ｓｔａｔｅ）で、グルタメート、ＡＭＰＡ
及びカイネートによりゲート制御されるカチオンチャン
ネル活性を示すことを明らかにした。しかしながら、例
えばＧｌｕＲ−ＡとＧｌｕＲ−Ｂとの組合わせのような
組合わせ状態で発現されると、前述の場合よりも著しく
大きい電流でゲート制御されるイオンチャンネル（ｇａ
ｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）が宿主哺乳動物細胞
によって形成される。
て、ラットの脳に存在している時のＥＡＡ受容体及びそ
のサブユニットの構造的特徴がより良く解明されるに至
った。現在のＥＡＡ受容体構造のモデルによれば、各受
容体は構造的にはヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｍｅｒｉ
ｃ）あり、個々の膜結合サブユニットからなり、各々が
４つのトランスメンブラン領域と、リガンド結合特性を
ある程度まで支配し且つ受容体複合体によって使用され
るイオンゲート制御機能（ｉｏｎ ｇａｔｉｎｇｆｕｎ
ｃｔｉｏｎ）に貢献する細胞外ドメインとを有する。前
出のＫｅｉｎａｎｅｎらは、例えば、ＧｌｕＲ−Ａ、Ｇ
ｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄを含むラッ
トＧｌｕＲ受容体の各サブユニットが、単独状態（ｕｎ
ｉｔａｒｙ ｓｔａｔｅ）で、グルタメート、ＡＭＰＡ
及びカイネートによりゲート制御されるカチオンチャン
ネル活性を示すことを明らかにした。しかしながら、例
えばＧｌｕＲ−ＡとＧｌｕＲ−Ｂとの組合わせのような
組合わせ状態で発現されると、前述の場合よりも著しく
大きい電流でゲート制御されるイオンチャンネル（ｇａ
ｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）が宿主哺乳動物細胞
によって形成される。
【０００７】ヒトのＣＮＳ障害の治療に有用な治療法の
研究では、勿論、これまでに単離されたラット受容体を
用いた時よりも十分にヒトの状態を表すことができるよ
うな化合物のためのスクリーンを得ることが極めて望ま
しい。ヒト治療化合物用の適当なスクリーンを形成する
ためには、ヒト受容体をコードするクローン化遺伝子
と、該遺伝子を発現する細胞系とを得ることが特に望ま
れる。そこで本発明は、これらの遺伝子及び細胞系を提
供する。
研究では、勿論、これまでに単離されたラット受容体を
用いた時よりも十分にヒトの状態を表すことができるよ
うな化合物のためのスクリーンを得ることが極めて望ま
しい。ヒト治療化合物用の適当なスクリーンを形成する
ためには、ヒト受容体をコードするクローン化遺伝子
と、該遺伝子を発現する細胞系とを得ることが特に望ま
れる。そこで本発明は、これらの遺伝子及び細胞系を提
供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】ヒトの脳にとって内因性
の或るＥＡＡ受容体類をコードする遺伝子が同定され、
特性が明らかにされた。本明細書では前記ＥＡＡ受容体
類をＧｌｕＲ４受容体類（ＧｌｕＲ４ ｆａｍｉｌｙ
ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）と称する。このヒトＥＡＡ
受容体類に属する代表的な受容体はヒトＧｌｕＲ４Ｂと
称し、ＥＡＡ受容体の典型的な親和性をもってグルタメ
ートに結合すると共にＡＭＰＡ型ＥＡＡ受容体に特有の
リガンド結合特性も示す受容体タンパク質をコードす
る。本発明は、ヒトが生来もっているＣＮＳ受容体を特
異的にコードするポリヌクレオチドを提供することによ
って、ヒト神経系を評価する手段、特にＡＭＰＡ結合性
ヒトＥＡＡ受容体と選択した天然及び合成リガンドとの
間の潜在的治療相互作用（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を評
価する手段を提供する。
の或るＥＡＡ受容体類をコードする遺伝子が同定され、
特性が明らかにされた。本明細書では前記ＥＡＡ受容体
類をＧｌｕＲ４受容体類（ＧｌｕＲ４ ｆａｍｉｌｙ
ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）と称する。このヒトＥＡＡ
受容体類に属する代表的な受容体はヒトＧｌｕＲ４Ｂと
称し、ＥＡＡ受容体の典型的な親和性をもってグルタメ
ートに結合すると共にＡＭＰＡ型ＥＡＡ受容体に特有の
リガンド結合特性も示す受容体タンパク質をコードす
る。本発明は、ヒトが生来もっているＣＮＳ受容体を特
異的にコードするポリヌクレオチドを提供することによ
って、ヒト神経系を評価する手段、特にＡＭＰＡ結合性
ヒトＥＡＡ受容体と選択した天然及び合成リガンドとの
間の潜在的治療相互作用（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を評
価する手段を提供する。
【０００９】即ち、本発明はその態様の１つとして、本
明細書でヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体と称するヒトＥＡＡ受
容体をコードする領域を含む単離ポリヌクレオチドを提
供する。前記ポリヌクレオチドは、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受
容体のＡＭＰＡ結合性フラグメント、又はヒトＧｌｕＲ
４Ｂ受容体のＡＭＰＡ結合性変異体をコードするもので
あってもよい。本発明の種々の特定実施態様では、前記
ポリヌクレオチドがＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、又はＲＮ
Ａ、例えばメッセンジャーＲＮＡからなる。本発明の別
の実施態様では、前記ポリヌクレオチドを、ヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体組織分布のオートラジオグラフィー検査で
使用できるように、放射性標識のようなリポーター分子
に結合し得る。本発明の更に別の実施態様では、放射性
標識したポリヌクレオチドも含む本発明のポリヌクレオ
チドのフラグメントを、グルタメート受容体コーディン
グポリヌクレオチド（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ）を検出するためのプローブか、生物学的試料中に
存在する前述のようなポリヌクレオチドを増幅するのに
適したプライマーか、又はヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体、該
受容体のＡＭＰＡ結合性フラグメントもしくは変異体を
発現するための鋳型として使用し得る。
明細書でヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体と称するヒトＥＡＡ受
容体をコードする領域を含む単離ポリヌクレオチドを提
供する。前記ポリヌクレオチドは、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受
容体のＡＭＰＡ結合性フラグメント、又はヒトＧｌｕＲ
４Ｂ受容体のＡＭＰＡ結合性変異体をコードするもので
あってもよい。本発明の種々の特定実施態様では、前記
ポリヌクレオチドがＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、又はＲＮ
Ａ、例えばメッセンジャーＲＮＡからなる。本発明の別
の実施態様では、前記ポリヌクレオチドを、ヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体組織分布のオートラジオグラフィー検査で
使用できるように、放射性標識のようなリポーター分子
に結合し得る。本発明の更に別の実施態様では、放射性
標識したポリヌクレオチドも含む本発明のポリヌクレオ
チドのフラグメントを、グルタメート受容体コーディン
グポリヌクレオチド（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ）を検出するためのプローブか、生物学的試料中に
存在する前述のようなポリヌクレオチドを増幅するのに
適したプライマーか、又はヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体、該
受容体のＡＭＰＡ結合性フラグメントもしくは変異体を
発現するための鋳型として使用し得る。
【００１０】本発明の別の態様は、発現可能なように包
含させた本発明のポリヌクレオチドを有する細胞宿主を
提供することにある。本発明の実施態様では前記ポリヌ
クレオチドがＤＮＡ分子であり、発現及び分泌のために
細胞宿主に包含されて、機能性メンブラン結合ヒトＧｌ
ｕＲ４Ｂ受容体、又はヒトＧｌｕＲ４ＢのＡＭＰＡ結合
性フラグメントもしくは変異体を産生せしめる。本発明
の別の実施態様では前記ポリヌクレオチドが、細胞宿主
に包含されてヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体を機能性メンブラ
ン結合翻訳産物として産生せしめるＲＮＡ分子である。
含させた本発明のポリヌクレオチドを有する細胞宿主を
提供することにある。本発明の実施態様では前記ポリヌ
クレオチドがＤＮＡ分子であり、発現及び分泌のために
細胞宿主に包含されて、機能性メンブラン結合ヒトＧｌ
ｕＲ４Ｂ受容体、又はヒトＧｌｕＲ４ＢのＡＭＰＡ結合
性フラグメントもしくは変異体を産生せしめる。本発明
の別の実施態様では前記ポリヌクレオチドが、細胞宿主
に包含されてヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体を機能性メンブラ
ン結合翻訳産物として産生せしめるＲＮＡ分子である。
【００１１】本発明の別の態様は、リガンド結合アッセ
イの実施に有用な実質的に均質なヒトＥＡＡ受容体源を
得るための方法を提供することにある。該方法は、遺伝
子工学的に製造した本発明の細胞宿主を培養し、次いで
培養細胞を回収するステップを含む。場合によっては、
リガンド結合アッセイで使用するための細胞膜調製物を
得るために前記培養細胞を処理し得る。
イの実施に有用な実質的に均質なヒトＥＡＡ受容体源を
得るための方法を提供することにある。該方法は、遺伝
子工学的に製造した本発明の細胞宿主を培養し、次いで
培養細胞を回収するステップを含む。場合によっては、
リガンド結合アッセイで使用するための細胞膜調製物を
得るために前記培養細胞を処理し得る。
【００１２】本発明の別の態様は、検査リガンドとヒト
ＣＮＳ受容体との間の相互作用の評価方法を提供するこ
とにある。該方法は、受容体結合に適した条件下で、検
査リガンドをヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体源、即ち本発明の
細胞宿主又は該細胞宿主に由来する膜調製物と共にイン
キュベートし、次いで検査リガンドと受容体源との間の
結合度を測定するか、又は細胞膜を通るリガンド誘導電
流を測定するステップを含む。
ＣＮＳ受容体との間の相互作用の評価方法を提供するこ
とにある。該方法は、受容体結合に適した条件下で、検
査リガンドをヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体源、即ち本発明の
細胞宿主又は該細胞宿主に由来する膜調製物と共にイン
キュベートし、次いで検査リガンドと受容体源との間の
結合度を測定するか、又は細胞膜を通るリガンド誘導電
流を測定するステップを含む。
【００１３】ここで、添付図面を参照しながら、本発明
の前述の態様及び他の態様をより詳細に説明する。
の前述の態様及び他の態様をより詳細に説明する。
【００１４】詳細な説明及び好まし い実施態様 本発明は、ＡＭＰＡ結合型のヒトＣＮＳ受容体に関する
ものであり、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体
のフラグメント及び変異体を含むＧｌｕＲ４受容体類に
属する受容体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供
する。従って本明細書で使用する「ＧｌｕＲ４受容体」
という用語には、ＧｌｕＲ４Ｂ、そのフラグメント及び
変異体が含まれる。「単離」という用語は、本明細書で
は、通常約４，０００ヌクレオチド以下の長さを有し、
別のヒトタンパク質をコードするＤＮＡから単離した完
全ポリヌクレオチドに対して使用されている。
ものであり、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体
のフラグメント及び変異体を含むＧｌｕＲ４受容体類に
属する受容体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供
する。従って本明細書で使用する「ＧｌｕＲ４受容体」
という用語には、ＧｌｕＲ４Ｂ、そのフラグメント及び
変異体が含まれる。「単離」という用語は、本明細書で
は、通常約４，０００ヌクレオチド以下の長さを有し、
別のヒトタンパク質をコードするＤＮＡから単離した完
全ポリヌクレオチドに対して使用されている。
【００１５】本明細書に記載の情況では、ＡＭＰＡ結合
型ヒトＣＮＳ受容体は、グルタメート及びＡＭＰＡ結合
を明らかにする特徴的リガンド結合プロフィルを示す。
従って、本明細書でＧｌｕＲ４Ｂ受容体のフラグメント
及び変異体に関して使用されている「ＡＭＰＡ結合性
（ＡＭＰＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、本明細
書に記載のような一般的な設計のアッセイを用いて測定
した場合に、ＡＭＰＡに対する結合親和性がグルタメー
ト、カイネートもしくはＮＭＤＡに対する結合親和性よ
り大きいフラグメント及び変異体か、又はこれらフラグ
メント及び変異体の密接に関連した類似体にかかわる。
型ヒトＣＮＳ受容体は、グルタメート及びＡＭＰＡ結合
を明らかにする特徴的リガンド結合プロフィルを示す。
従って、本明細書でＧｌｕＲ４Ｂ受容体のフラグメント
及び変異体に関して使用されている「ＡＭＰＡ結合性
（ＡＭＰＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、本明細
書に記載のような一般的な設計のアッセイを用いて測定
した場合に、ＡＭＰＡに対する結合親和性がグルタメー
ト、カイネートもしくはＮＭＤＡに対する結合親和性よ
り大きいフラグメント及び変異体か、又はこれらフラグ
メント及び変異体の密接に関連した類似体にかかわる。
【００１６】本明細書では、ＡＭＰＡ結合性受容体を産
生する細胞宿主がＡＭＰＡに適当に暴露された時に、例
えば前出のＨｏｌｌｍａｎらによって記述されている確
立された電気生理学的アッセイ又は細胞膜を横切るコン
ダクタンスの検出に適した別の任意のアッセイでの測定
で前記ＡＭＰＡ結合性受容体が新たなチャンネル活性を
示せば、該受容体は「機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ）」であるという。
生する細胞宿主がＡＭＰＡに適当に暴露された時に、例
えば前出のＨｏｌｌｍａｎらによって記述されている確
立された電気生理学的アッセイ又は細胞膜を横切るコン
ダクタンスの検出に適した別の任意のアッセイでの測定
で前記ＡＭＰＡ結合性受容体が新たなチャンネル活性を
示せば、該受容体は「機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ）」であるという。
【００１７】本発明のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体はＥＡＡ
受容体全般に特有の構造的特徴を有し、細胞外Ｎ−及び
Ｃ−末端領域、並びに細胞表面膜内に受容体を固定する
のに使用される４つの内部疎水性ドメインを含む。より
特定的には、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体は、まず２１アミノ酸
残基Ｎ末端シグナルペプチドを有する前駆体の形態で産
生され、前記シグナルペプチドを欠失し、図１に一文字
コードで示した配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ １及び
２）中の８８１個のアミノ酸からなる成熟した形態で細
胞表面に輸送される単一ポリペプチド鎖であるという構
造的特徴を有するタンパク質である。特に説明がない限
り、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体という用語は成熟した形態
の前記受容体を意味し、従ってヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体
のアミノ酸残基は成熟タンパク質配列に基づいて番号付
けされている。
受容体全般に特有の構造的特徴を有し、細胞外Ｎ−及び
Ｃ−末端領域、並びに細胞表面膜内に受容体を固定する
のに使用される４つの内部疎水性ドメインを含む。より
特定的には、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体は、まず２１アミノ酸
残基Ｎ末端シグナルペプチドを有する前駆体の形態で産
生され、前記シグナルペプチドを欠失し、図１に一文字
コードで示した配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ １及び
２）中の８８１個のアミノ酸からなる成熟した形態で細
胞表面に輸送される単一ポリペプチド鎖であるという構
造的特徴を有するタンパク質である。特に説明がない限
り、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体という用語は成熟した形態
の前記受容体を意味し、従ってヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体
のアミノ酸残基は成熟タンパク質配列に基づいて番号付
けされている。
【００１８】受容体の構造的ドメインについては、ヒド
ロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙａｎａｌｙｓｉｓ）に
よって、４つの推定上のトランスメンブランドメイン、
即ち残基５２６〜５４５の全部にわたる第１のドメイン
（ＴＭ−１）、残基５７２〜５９０にわたる第２のドメ
イン（ＴＭ−２）、残基６０１〜６１９にわたる第３の
ドメイン（ＴＭ−３）、及び残基７９３〜８１３にわた
る第４のドメイン（ＴＭ−４）が明らかにされた。この
割当てに基づけば、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の構造は、
天然の膜結合形態では、５２５アミノ酸Ｎ末端細胞外ド
メインと、これに続く領域であって、４つのトランスメ
ンブランドメイン及び細胞外６８アミノ酸Ｃ末端ドメイ
ンを含む疎水性領域とからなると考えられる。
ロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙａｎａｌｙｓｉｓ）に
よって、４つの推定上のトランスメンブランドメイン、
即ち残基５２６〜５４５の全部にわたる第１のドメイン
（ＴＭ−１）、残基５７２〜５９０にわたる第２のドメ
イン（ＴＭ−２）、残基６０１〜６１９にわたる第３の
ドメイン（ＴＭ−３）、及び残基７９３〜８１３にわた
る第４のドメイン（ＴＭ−４）が明らかにされた。この
割当てに基づけば、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の構造は、
天然の膜結合形態では、５２５アミノ酸Ｎ末端細胞外ド
メインと、これに続く領域であって、４つのトランスメ
ンブランドメイン及び細胞外６８アミノ酸Ｃ末端ドメイ
ンを含む疎水性領域とからなると考えられる。
【００１９】種々のリガンドと、ヒトＧｌｕＲ４受容体
を膜結合形態で産生するために遺伝子工学的に製造した
哺乳動物細胞に由来する膜調製物とを用いて行った結合
アッセイでは、ＧｌｕＲ４受容体が、特にカイネート及
びＮＭＤＡと比較して、ＡＭＰＡに選択的に結合するこ
とが判明した。この特徴を、ＡＭＰＡ型受容体と神経学
的障害及び疾患との間の医学的に有意な関係と結び付け
て考えれば、本発明の受容体とそのＡＭＰＡ結合性フラ
グメント及び変異体とが、この種の受容体とその天然の
リガンドであるグルタメートとの間のｉｎ ｖｉｖｏの
相互作用を調節するのに有用なリガンドのスクリーニン
グ及び発見において有効なツールとして使用できること
は明らかである。従って、本発明の重要な態様は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏのリガンド結合及び／又はチャンネル活性
化アッセイでそのまま使用できる均質な受容体源として
使用されるヒトＧｌｕＲ４受容体を産生するために遺伝
子工学的に作られる細胞の構築にある。
を膜結合形態で産生するために遺伝子工学的に製造した
哺乳動物細胞に由来する膜調製物とを用いて行った結合
アッセイでは、ＧｌｕＲ４受容体が、特にカイネート及
びＮＭＤＡと比較して、ＡＭＰＡに選択的に結合するこ
とが判明した。この特徴を、ＡＭＰＡ型受容体と神経学
的障害及び疾患との間の医学的に有意な関係と結び付け
て考えれば、本発明の受容体とそのＡＭＰＡ結合性フラ
グメント及び変異体とが、この種の受容体とその天然の
リガンドであるグルタメートとの間のｉｎ ｖｉｖｏの
相互作用を調節するのに有用なリガンドのスクリーニン
グ及び発見において有効なツールとして使用できること
は明らかである。従って、本発明の重要な態様は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏのリガンド結合及び／又はチャンネル活性
化アッセイでそのまま使用できる均質な受容体源として
使用されるヒトＧｌｕＲ４受容体を産生するために遺伝
子工学的に作られる細胞の構築にある。
【００２０】リガンド結合アッセイで使用する場合は、
ヒトＧｌｕＲ４受容体を異種の膜結合産物として産生す
る宿主細胞を、遺伝子工学技術の適用によって構築する
のが望ましい。このような工学的に作られる細胞の構築
は、分泌可能形態のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体、即ち天然
のシグナルペプチドもしくは該ペプチドの機能性異種等
価物を有する形態の前記受容体をコードするＤＮＡが、
選択した宿主細胞内で機能して前記受容体コーディング
ＤＮＡの発現を生起し、それによって受容体タンパク質
を所望の成熟した膜結合形態で作り出す発現制御エレメ
ントに機能的に結合している組換えＤＮＡ分泌構築物
を、選択した宿主細胞内に導入することによって達成さ
れる。この種の細胞は、本明細書では、「発現可能に
（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｙ）」包含された受容体コーデ
ィングＤＮＡを有すると特徴付けられる。受容体コーデ
ィングＤＮＡは、特定の宿主内に天然に存在しない場合
には、特定の細胞宿主に対して「異種（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）」であるという。
ヒトＧｌｕＲ４受容体を異種の膜結合産物として産生す
る宿主細胞を、遺伝子工学技術の適用によって構築する
のが望ましい。このような工学的に作られる細胞の構築
は、分泌可能形態のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体、即ち天然
のシグナルペプチドもしくは該ペプチドの機能性異種等
価物を有する形態の前記受容体をコードするＤＮＡが、
選択した宿主細胞内で機能して前記受容体コーディング
ＤＮＡの発現を生起し、それによって受容体タンパク質
を所望の成熟した膜結合形態で作り出す発現制御エレメ
ントに機能的に結合している組換えＤＮＡ分泌構築物
を、選択した宿主細胞内に導入することによって達成さ
れる。この種の細胞は、本明細書では、「発現可能に
（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｙ）」包含された受容体コーデ
ィングＤＮＡを有すると特徴付けられる。受容体コーデ
ィングＤＮＡは、特定の宿主内に天然に存在しない場合
には、特定の細胞宿主に対して「異種（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）」であるという。
【００２１】ヒトＧｌｕＲ４受容体を産生するための宿
主として使用すべく選択される特定細胞タイプは、原核
細胞及び真核細胞の両方を含めて現在当業界で入手でき
る幾つかの細胞タイプのうちの任意のものであってよい
が、当然のことながら、天然の状態で、興奮性アミノ酸
に結合し得従って工学的に製造した細胞系の所期のアッ
セイ結果を混乱させ得る表面受容体を作り出す細胞タイ
プであってはならない。このような問題は通常、非ニュ
ーロン細胞タイプを宿主として選択することにより回避
され、通常のようにヒト以外の細胞系を使用すればより
良く防止することができる。但し、ニューロンタイプ及
びヒトタイプの細胞は、アッセイの結果で検査リガンド
への「バックグラウンド」結合の説明が可能であれば、
発現宿主として使用し得る。
主として使用すべく選択される特定細胞タイプは、原核
細胞及び真核細胞の両方を含めて現在当業界で入手でき
る幾つかの細胞タイプのうちの任意のものであってよい
が、当然のことながら、天然の状態で、興奮性アミノ酸
に結合し得従って工学的に製造した細胞系の所期のアッ
セイ結果を混乱させ得る表面受容体を作り出す細胞タイ
プであってはならない。このような問題は通常、非ニュ
ーロン細胞タイプを宿主として選択することにより回避
され、通常のようにヒト以外の細胞系を使用すればより
良く防止することができる。但し、ニューロンタイプ及
びヒトタイプの細胞は、アッセイの結果で検査リガンド
への「バックグラウンド」結合の説明が可能であれば、
発現宿主として使用し得る。
【００２２】本発明の実施態様の１つでは、ヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体を産生するための宿主として使用すべく選
択される細胞系が哺乳動物細胞である。この種の細胞系
は現在幾つかのタイプが遺伝子工学操作用に入手可能で
あり、その中には、例えばＰｒｏ５変異体（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １２８１）を含むＫ１系統（ｌｉｎｅａｇｅ）
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）のチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＶ−１系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）、ＣＯＳ−１系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）及びＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５
１）のＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎臓由来繊
維芽細胞様細胞、マウスＬ細胞、マウス３Ｔ３細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、マウスＣ１２７細胞、２
９３系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）のヒト胚性腎
細胞、ＨｅＬａ系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）の細胞を
含むヒト癌腫細胞、並びに系ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １２７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ
１０）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １
１）の神経芽腫細胞等がある。
Ｒ４Ｂ受容体を産生するための宿主として使用すべく選
択される細胞系が哺乳動物細胞である。この種の細胞系
は現在幾つかのタイプが遺伝子工学操作用に入手可能で
あり、その中には、例えばＰｒｏ５変異体（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １２８１）を含むＫ１系統（ｌｉｎｅａｇｅ）
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）のチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＶ−１系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）、ＣＯＳ−１系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）及びＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５
１）のＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎臓由来繊
維芽細胞様細胞、マウスＬ細胞、マウス３Ｔ３細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、マウスＣ１２７細胞、２
９３系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）のヒト胚性腎
細胞、ＨｅＬａ系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）の細胞を
含むヒト癌腫細胞、並びに系ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １２７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ
１０）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １
１）の神経芽腫細胞等がある。
【００２３】種々の遺伝子発現系が前述の宿主との使用
に合わせて開発されており、市販されている。受容体コ
ーディングＤＮＡの発現を生起するためには、これらの
系のうちの任意のものを選択し得る。これらの系は通常
はプラスミドベクターの形態で入手でき、宿主によって
認識され且つ受容体コードＤＮＡの５’に結合された時
に該ＤＮＡの発現を可能にする発現制御配列を構成する
ＤＮＡを含有する機能成分を含む発現カセットを包含し
ている。前記系は更に、受容体コーディング領域の３’
に結合した時に発現を終了させるＤＮＡ配列も含んでい
る。従って、選択した哺乳動物細胞宿主における発現の
場合には、宿主によって認識される発現制御ＤＮＡ配列
に分泌可能形態の受容体をコードするＤＮＡが結合して
いる組換えＤＮＡ発現構築体であって、発現を生起する
受容体コーディングＤＮＡの５’領域と発現を終了させ
る３’領域とを含む組換えＤＮＡ発現構築体が産生され
る。組換えＤＮＡ発現構築体を有するプラスミドベクタ
ーは通常、別の成分、例えば発現宿主中でのプラスミド
の複製を可能にし、望ましくは大腸菌のような細菌宿主
中でのプラスミドの増幅も可能にし、通常はウイルスに
由来する複製起点のような別の成分を含む。安定に形質
転換された組換え細胞の選択を可能にするマーカーを提
供するため、ベクターは、生存上有利な特性を形質転換
体に与える遺伝子、例えばネオマイシン耐性をコードす
る遺伝子をも含む。ネオマイシン耐性を与える場合に
は、ネオマイシンを添加した培地に形質転換体をプレー
ティングする。
に合わせて開発されており、市販されている。受容体コ
ーディングＤＮＡの発現を生起するためには、これらの
系のうちの任意のものを選択し得る。これらの系は通常
はプラスミドベクターの形態で入手でき、宿主によって
認識され且つ受容体コードＤＮＡの５’に結合された時
に該ＤＮＡの発現を可能にする発現制御配列を構成する
ＤＮＡを含有する機能成分を含む発現カセットを包含し
ている。前記系は更に、受容体コーディング領域の３’
に結合した時に発現を終了させるＤＮＡ配列も含んでい
る。従って、選択した哺乳動物細胞宿主における発現の
場合には、宿主によって認識される発現制御ＤＮＡ配列
に分泌可能形態の受容体をコードするＤＮＡが結合して
いる組換えＤＮＡ発現構築体であって、発現を生起する
受容体コーディングＤＮＡの５’領域と発現を終了させ
る３’領域とを含む組換えＤＮＡ発現構築体が産生され
る。組換えＤＮＡ発現構築体を有するプラスミドベクタ
ーは通常、別の成分、例えば発現宿主中でのプラスミド
の複製を可能にし、望ましくは大腸菌のような細菌宿主
中でのプラスミドの増幅も可能にし、通常はウイルスに
由来する複製起点のような別の成分を含む。安定に形質
転換された組換え細胞の選択を可能にするマーカーを提
供するため、ベクターは、生存上有利な特性を形質転換
体に与える遺伝子、例えばネオマイシン耐性をコードす
る遺伝子をも含む。ネオマイシン耐性を与える場合に
は、ネオマイシンを添加した培地に形質転換体をプレー
ティングする。
【００２４】受容体コーディングＤＮＡの哺乳動物細胞
発現を達成するのに使用し得る種々の組換えＤＮＡ発現
系には、哺乳動物細胞に感染するウイルスのプロモータ
ー、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）、ネ
ズミ乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）等のプロモーターがあ
る。発現の生起に有用なものとしてはその他に、レトロ
ウイルスのＬＴＲのようなプロモーター、昆虫細胞プロ
モーター、例えば温度によって調節され且つショウジョ
ウバエから単離されるプロモーター、並びに哺乳動物遺
伝子プロモーター、例えば重金属によって調節されるも
の、即ちメタロチオネイン遺伝子プロモーター及び他の
ステロイド誘導性プロモーターが挙げられる。
発現を達成するのに使用し得る種々の組換えＤＮＡ発現
系には、哺乳動物細胞に感染するウイルスのプロモータ
ー、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）、ネ
ズミ乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）等のプロモーターがあ
る。発現の生起に有用なものとしてはその他に、レトロ
ウイルスのＬＴＲのようなプロモーター、昆虫細胞プロ
モーター、例えば温度によって調節され且つショウジョ
ウバエから単離されるプロモーター、並びに哺乳動物遺
伝子プロモーター、例えば重金属によって調節されるも
の、即ちメタロチオネイン遺伝子プロモーター及び他の
ステロイド誘導性プロモーターが挙げられる。
【００２５】組換えＤＮＡ発現ベクター中に包含させる
場合は、選択した遺伝子単離又は遺伝子合成技術を用い
て、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体又はそのＡＭＰＡ結合性フ
ラグメントもしくは変異体をコードするＤＮＡを得るこ
とができる。後述の実施例で詳述するように、ヒトＧｌ
ｕＲ４Ｂ受容体は、ヒト脳組織のゲノム内でコードされ
るため、一般的な遺伝子単離及びクローニング技術を注
意深く適用することによってヒトＤＮＡライブラリーか
ら得ることができる。この操作は通常、新鮮なヒト脳組
織源、好ましくは小脳又は海馬組織源からの完全メッセ
ンジャーＲＮＡの抽出と、これに次ぐメッセージからｃ
ＤＮＡへの変換と、例えば細菌プラスミド中、より一般
的にはバクテリオファージ中でのライブラリーの形成と
を含む。ヒトＤＮＡのフラグメントを有する前述のよう
なバクテリオファージは通常、個々のファージプラーク
又はコロニーを単離できるように、感染しやすい大腸菌
のローン（ｌａｗｎ）上にプレーティングすることによ
って増殖させる。次いで、ファージコロニーに担持され
ているＤＮＡを通常はニトロセルロース又はナイロンベ
ースのハイブリダイゼーション膜上に固定し、その後、
入念に調整した条件下で、放射性（又は他の）標識を付
けた適当な配列のオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズして、受容体コーディングＤＮＡ又はそのフラ
グメントを有する特定のファージコロニーを同定する。
通常は、このようにして同定した遺伝子又はその一部分
をプラスミドベクター中にサブクローン化して核酸配列
分析を行う。
場合は、選択した遺伝子単離又は遺伝子合成技術を用い
て、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体又はそのＡＭＰＡ結合性フ
ラグメントもしくは変異体をコードするＤＮＡを得るこ
とができる。後述の実施例で詳述するように、ヒトＧｌ
ｕＲ４Ｂ受容体は、ヒト脳組織のゲノム内でコードされ
るため、一般的な遺伝子単離及びクローニング技術を注
意深く適用することによってヒトＤＮＡライブラリーか
ら得ることができる。この操作は通常、新鮮なヒト脳組
織源、好ましくは小脳又は海馬組織源からの完全メッセ
ンジャーＲＮＡの抽出と、これに次ぐメッセージからｃ
ＤＮＡへの変換と、例えば細菌プラスミド中、より一般
的にはバクテリオファージ中でのライブラリーの形成と
を含む。ヒトＤＮＡのフラグメントを有する前述のよう
なバクテリオファージは通常、個々のファージプラーク
又はコロニーを単離できるように、感染しやすい大腸菌
のローン（ｌａｗｎ）上にプレーティングすることによ
って増殖させる。次いで、ファージコロニーに担持され
ているＤＮＡを通常はニトロセルロース又はナイロンベ
ースのハイブリダイゼーション膜上に固定し、その後、
入念に調整した条件下で、放射性（又は他の）標識を付
けた適当な配列のオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズして、受容体コーディングＤＮＡ又はそのフラ
グメントを有する特定のファージコロニーを同定する。
通常は、このようにして同定した遺伝子又はその一部分
をプラスミドベクター中にサブクローン化して核酸配列
分析を行う。
【００２６】本発明の特定実施態様の１つでは、Ｇｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体を図１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）でコードする。選択した受容体をコードするＤ
ＮＡ配列は、図示のＤＮＡ配列の縮重コドン等価物（ｄ
ｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ）を含んでいてもよい。
Ｒ４Ｂ受容体を図１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）でコードする。選択した受容体をコードするＤ
ＮＡ配列は、図示のＤＮＡ配列の縮重コドン等価物（ｄ
ｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ）を含んでいてもよい。
【００２７】図示のＤＮＡ配列は、本明細書に記載の方
法によりヒト脳ｃＤＮＡライブラリーで同定したｃＤＮ
Ａ配列からなる。しかしながら、本発明ではヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体のヌクレオチド配列が提示されているた
め、前述の受容体をコードするポリヌクレオチドは別の
方法で得ることもできる。前記受容体をコードするＤＮ
Ａを形成するためには、自動化された遺伝子合成及び／
又は増幅技術を使用し得る。ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体コ
ードＤＮＡの長さに鑑みて、自動化合成技術の適用に
は、段階的遺伝子構築、即ち長さ約３００ヌクレオチド
以下の遺伝子の領域を個々に合成し、これらの領域を張
出し相補性（ｏｖｅｒｈａｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｉｔｙ）により正確な順序で連結して最終的集合体
を得る方法が必要であり得る。個々に合成した遺伝子領
域は、合体の前に、確立されたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）技術を用いて増幅することができる。
法によりヒト脳ｃＤＮＡライブラリーで同定したｃＤＮ
Ａ配列からなる。しかしながら、本発明ではヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂ受容体のヌクレオチド配列が提示されているた
め、前述の受容体をコードするポリヌクレオチドは別の
方法で得ることもできる。前記受容体をコードするＤＮ
Ａを形成するためには、自動化された遺伝子合成及び／
又は増幅技術を使用し得る。ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体コ
ードＤＮＡの長さに鑑みて、自動化合成技術の適用に
は、段階的遺伝子構築、即ち長さ約３００ヌクレオチド
以下の遺伝子の領域を個々に合成し、これらの領域を張
出し相補性（ｏｖｅｒｈａｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｉｔｙ）により正確な順序で連結して最終的集合体
を得る方法が必要であり得る。個々に合成した遺伝子領
域は、合体の前に、確立されたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）技術を用いて増幅することができる。
【００２８】自動化された遺伝子合成技術を適用する
と、天然のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の変異体をコードす
るポリヌクレオチドを産生する好機が得られる。例え
ば、本発明で同定された天然のポリヌクレオチド配列中
に示されているコドンを同義コドン（ｓｙｎｏｎｙｍｏ
ｕｓ ｃｏｄｏｎ）で置換することによって、前記受容
体をコードするポリヌクレオチドを産生することができ
る。また、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の変異体をコードす
るポリヌクレオチドを、例えば１つ以上、例えば１〜１
０個の単一アミノ酸の置換、欠失又は付加を含むように
産生できる。通常は、スクリーニングの目的で受容体の
天然のリガンド結合プロフィルを保持することが望まし
いため、アミノ酸置換を、例えば、同様の電荷（ｃｈａ
ｒｇｅ）のアミノ酸を置換する保存性置換（ｃｏｎｓｅ
ｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に限定し、
且つ置換を、受容体の活性にとって余り重要ではない部
位、例えば成熟受容体の最初の約２０個のＮ末端残基の
範囲内、及び受容体ドメインのマッピング時に解明され
るような別の領域に限定するのが望ましい。
と、天然のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の変異体をコードす
るポリヌクレオチドを産生する好機が得られる。例え
ば、本発明で同定された天然のポリヌクレオチド配列中
に示されているコドンを同義コドン（ｓｙｎｏｎｙｍｏ
ｕｓ ｃｏｄｏｎ）で置換することによって、前記受容
体をコードするポリヌクレオチドを産生することができ
る。また、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の変異体をコードす
るポリヌクレオチドを、例えば１つ以上、例えば１〜１
０個の単一アミノ酸の置換、欠失又は付加を含むように
産生できる。通常は、スクリーニングの目的で受容体の
天然のリガンド結合プロフィルを保持することが望まし
いため、アミノ酸置換を、例えば、同様の電荷（ｃｈａ
ｒｇｅ）のアミノ酸を置換する保存性置換（ｃｏｎｓｅ
ｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に限定し、
且つ置換を、受容体の活性にとって余り重要ではない部
位、例えば成熟受容体の最初の約２０個のＮ末端残基の
範囲内、及び受容体ドメインのマッピング時に解明され
るような別の領域に限定するのが望ましい。
【００２９】適当な鋳型ＤＮＡがあれば、最終遺伝子の
全体又は一部分を直接形成するためにＰＣＲ増幅技術を
使用することもできる。その場合は、単一体か又は互い
に連結し得る複数の部分の形態を有する最終産物のＰＣ
Ｒ増幅を開始させる（ｐｒｉｍｅ）プライマーを合成す
る。この操作は、ブラントエンドを有する増幅したＤＮ
Ａフラグメントの段階的連結か、又は好ましくは、天然
の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するフラグメントの
段階的連結によって実施し得る。ここでは、ｃＤＮＡ又
はゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型として使用できる。
ｃＤＮＡを使用する場合は、海馬及び小脳を含む種々の
ヒト脳組織の市販の又は自分で構築したｃＤＮＡライブ
ラリーからｃＤＮＡ鋳型を得ることができる。
全体又は一部分を直接形成するためにＰＣＲ増幅技術を
使用することもできる。その場合は、単一体か又は互い
に連結し得る複数の部分の形態を有する最終産物のＰＣ
Ｒ増幅を開始させる（ｐｒｉｍｅ）プライマーを合成す
る。この操作は、ブラントエンドを有する増幅したＤＮ
Ａフラグメントの段階的連結か、又は好ましくは、天然
の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するフラグメントの
段階的連結によって実施し得る。ここでは、ｃＤＮＡ又
はゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型として使用できる。
ｃＤＮＡを使用する場合は、海馬及び小脳を含む種々の
ヒト脳組織の市販の又は自分で構築したｃＤＮＡライブ
ラリーからｃＤＮＡ鋳型を得ることができる。
【００３０】受容体コーディングＤＮＡが得られたら、
これを発現のために任意の適当な発現ベクター中に導入
し、ＤＮＡ仲介形質転換、エレクトロポレーション又は
パーティクルガン（ｐｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）形質転換
のような一般的な手法を用いて宿主細胞を前記ベクター
でトランスフェクションする。発現ベクターは、受容体
コーディングＤＮＡを過渡的に又は安定的に発現する形
質転換細胞系が得られるように選択し得る。過渡的発現
の場合は、哺乳動物細胞中で機能する複製起点を有する
発現ベクターで宿主細胞を形質転換するのが普通であ
る。安定な発現の場合には前述のような複製起点は不要
であるが、選択を可能にするために、ベクターは通常、
生存に有利な特性を形質転換体に与える産物をコードす
る遺伝子を含む。前述のような選択可能なマーカーをコ
ードする遺伝子としては、マイコフェノール酸耐性を付
与する大腸菌ｇｐｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオ
マイシンに対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５
由来ｎｅｏ遺伝子、ＤＨＦＲ−細胞の表現型をＤＨＦＲ
＋細胞に変化させるネズミ細胞又は大腸菌由来のｄｈｆ
ｒ配列、並びにＴＫ−細胞を表現型的にＴＫ＋細胞にす
る単純ヘルペスウイルスのｔｋ遺伝子が挙げられる。過
渡的発現でも安定な発現でも、リガンドスクリーニング
アッセイで使用するための形質転換細胞系と該細胞系由
来の膜調製物とを得ることができる。
これを発現のために任意の適当な発現ベクター中に導入
し、ＤＮＡ仲介形質転換、エレクトロポレーション又は
パーティクルガン（ｐｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）形質転換
のような一般的な手法を用いて宿主細胞を前記ベクター
でトランスフェクションする。発現ベクターは、受容体
コーディングＤＮＡを過渡的に又は安定的に発現する形
質転換細胞系が得られるように選択し得る。過渡的発現
の場合は、哺乳動物細胞中で機能する複製起点を有する
発現ベクターで宿主細胞を形質転換するのが普通であ
る。安定な発現の場合には前述のような複製起点は不要
であるが、選択を可能にするために、ベクターは通常、
生存に有利な特性を形質転換体に与える産物をコードす
る遺伝子を含む。前述のような選択可能なマーカーをコ
ードする遺伝子としては、マイコフェノール酸耐性を付
与する大腸菌ｇｐｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオ
マイシンに対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５
由来ｎｅｏ遺伝子、ＤＨＦＲ−細胞の表現型をＤＨＦＲ
＋細胞に変化させるネズミ細胞又は大腸菌由来のｄｈｆ
ｒ配列、並びにＴＫ−細胞を表現型的にＴＫ＋細胞にす
る単純ヘルペスウイルスのｔｋ遺伝子が挙げられる。過
渡的発現でも安定な発現でも、リガンドスクリーニング
アッセイで使用するための形質転換細胞系と該細胞系由
来の膜調製物とを得ることができる。
【００３１】受容体コーディングＤＮＡを過渡的に発現
する細胞は、後の使用、即ちスクリーニングアッセイで
の使用のために凍結して貯蔵できるが、迅速なプラスミ
ド複製によって結局細胞が通常は数日で死滅するため、
形質転換した細胞はできるだけ早く使用する方がよい。
スクリーニングアッセイは、完全細胞か又は該細胞に由
来する膜調製物を用いて実施し得る。通常は膜調製物の
方がリガンド結合実験により適した基体を提供するた
め、結合物質として好んで使用される。スクリーニン
グ、即ちリガンド結合実験のための膜調製物を調製する
ためには、凍結完全細胞を冷水懸濁状態で均質化し、遠
心分離後に膜ペレットを回収する。次いで前記ペレット
を冷水で洗浄し、透析にかけて、グルタメートのような
内因性ＥＡＡリガンドを除去する。前記リガンドはこの
種のアッセイで結合に関して競合するからである。透析
した膜は、リガンド結合アッセイでそのまま使用する
か、又は凍結乾燥状態で貯蔵した後に使用し得る。ある
いは、過渡的トランスフェクションの２日後、又は安定
にトランスフェクションした細胞のプレーティングから
ほぼ同じ日数が経過した後に回収した新鮮な完全細胞
を、膜調製物の場合と同じ方法でリガンド結合アッセイ
に使用してもよい。細胞を使用する場合は、細胞を損傷
しないように、より穏やかな遠心分離によって細胞を回
収しなければならず、また、浸透圧ショックと細胞の破
壊とを防止するために、リン酸塩緩衝食塩水のような緩
衝培地で総ての洗浄を実施しなければならない。
する細胞は、後の使用、即ちスクリーニングアッセイで
の使用のために凍結して貯蔵できるが、迅速なプラスミ
ド複製によって結局細胞が通常は数日で死滅するため、
形質転換した細胞はできるだけ早く使用する方がよい。
スクリーニングアッセイは、完全細胞か又は該細胞に由
来する膜調製物を用いて実施し得る。通常は膜調製物の
方がリガンド結合実験により適した基体を提供するた
め、結合物質として好んで使用される。スクリーニン
グ、即ちリガンド結合実験のための膜調製物を調製する
ためには、凍結完全細胞を冷水懸濁状態で均質化し、遠
心分離後に膜ペレットを回収する。次いで前記ペレット
を冷水で洗浄し、透析にかけて、グルタメートのような
内因性ＥＡＡリガンドを除去する。前記リガンドはこの
種のアッセイで結合に関して競合するからである。透析
した膜は、リガンド結合アッセイでそのまま使用する
か、又は凍結乾燥状態で貯蔵した後に使用し得る。ある
いは、過渡的トランスフェクションの２日後、又は安定
にトランスフェクションした細胞のプレーティングから
ほぼ同じ日数が経過した後に回収した新鮮な完全細胞
を、膜調製物の場合と同じ方法でリガンド結合アッセイ
に使用してもよい。細胞を使用する場合は、細胞を損傷
しないように、より穏やかな遠心分離によって細胞を回
収しなければならず、また、浸透圧ショックと細胞の破
壊とを防止するために、リン酸塩緩衝食塩水のような緩
衝培地で総ての洗浄を実施しなければならない。
【００３２】本発明のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体への物質
の結合、即ち可能性のあるリガンドの結合は、通常約２
５μｇ〜１００μｇの所定量の細胞由来膜（例えばタン
パク質の決定によって測定する）を用いて評価するのが
一般的である。ＡＭＰＡと比べた検査化合物の親和性の
評価には通常、競合結合アッセイが有用である。該競合
結合アッセイは、膜調製物を、種々の濃度で加えた無標
識の検査化合物の存在下で、放射性標識したＡＭＰＡ例
えば［３Ｈ］−ＡＭＰＡと共にインキュベートすること
により実施し得る。インキュベーション後に、排除され
た（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）又は結合した放射性標識ＡＭ
ＰＡを回収し測定すれば、基体として使用した特定受容
体に対する検査化合物及びＡＭＰＡの相対的結合親和性
を決定することができる。このようにして、ＡＭＰＡ結
合性ヒトＣＮＳ受容体に対する種々の化合物の親和性を
測定することができる。あるいは、放射性標識したＡＭ
ＰＡの代わりに、放射性標識したグルタメート類似体を
競合リガンドとして使用してもよい。
の結合、即ち可能性のあるリガンドの結合は、通常約２
５μｇ〜１００μｇの所定量の細胞由来膜（例えばタン
パク質の決定によって測定する）を用いて評価するのが
一般的である。ＡＭＰＡと比べた検査化合物の親和性の
評価には通常、競合結合アッセイが有用である。該競合
結合アッセイは、膜調製物を、種々の濃度で加えた無標
識の検査化合物の存在下で、放射性標識したＡＭＰＡ例
えば［３Ｈ］−ＡＭＰＡと共にインキュベートすること
により実施し得る。インキュベーション後に、排除され
た（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）又は結合した放射性標識ＡＭ
ＰＡを回収し測定すれば、基体として使用した特定受容
体に対する検査化合物及びＡＭＰＡの相対的結合親和性
を決定することができる。このようにして、ＡＭＰＡ結
合性ヒトＣＮＳ受容体に対する種々の化合物の親和性を
測定することができる。あるいは、放射性標識したＡＭ
ＰＡの代わりに、放射性標識したグルタメート類似体を
競合リガンドとして使用してもよい。
【００３３】本発明のＧｌｕＲ４受容体は電気生理学的
情況で機能的であるため、イオンチャンネル活性を変化
させる能力に関する検査リガンドのスクリーニングを確
立された方法によって行う場合に有用である。従って本
発明は、リガンドスクリーニング技術として、検査リガ
ンドとヒトＣＮＳ受容体との間の相互作用を検出する方
法も提供する。該方法は、検査リガンドを本発明のヒト
ＧｌｕＲ４受容体産生細胞か又は該細胞に由来する膜調
製物と共にインキュベートし、次いで前記細胞又は膜を
通るリガンド誘導電流を測定するステップを含む。
情況で機能的であるため、イオンチャンネル活性を変化
させる能力に関する検査リガンドのスクリーニングを確
立された方法によって行う場合に有用である。従って本
発明は、リガンドスクリーニング技術として、検査リガ
ンドとヒトＣＮＳ受容体との間の相互作用を検出する方
法も提供する。該方法は、検査リガンドを本発明のヒト
ＧｌｕＲ４受容体産生細胞か又は該細胞に由来する膜調
製物と共にインキュベートし、次いで前記細胞又は膜を
通るリガンド誘導電流を測定するステップを含む。
【００３４】受容体コーディングＤＮＡを発現する細胞
を使用する代わりに、ＧｌｕＲ４受容体をコードするメ
ッセンジャーＲＮＡの導入後に機能性膜結合受容体を産
生する細胞、例えばＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いて、
結合又はイオンチャンネル形成を介するリガンドの特徴
解明を実施してもよい。その場合は、導入された遺伝子
がプラスミドベクターによって供給された隣接ＲＮＡ転
写プロモーター、例えばＴ３又はＴ７バクテリオファー
ジプロモーターを介してＲＮＡ中に容易に転写され得る
ように、本発明のＧｌｕＲ４受容体遺伝子を通常はプラ
スミドベクターにサブクローン化する。次いでＲＮＡを
ｉｎ ｖｉｔｒｏで挿入遺伝子から転写する。次いで該
ＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中に注入し得る。ｎＬ
容量のＲＮＡ溶液の注入後に前記卵母細胞を数日インキ
ュベートし、その後、水浴溶液（ｂａｔｈｉｎｇ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）中に含まれている特定リガンド分子に応
答する能力について検査する。機能性ＥＡＡ受容体の作
用の一部分は、イオンが選択的に通過し得る膜チャネル
を操作することによって生起するため、水浴溶液中の特
定リガンド分子に応答して生じる前記受容体の機能は通
常、細胞中に挿入した、又は細胞由来膜調製物のいずれ
かの側面に配置したマイクロ電極を用いて、いわゆる
「パッチクランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）」技術に
より、電流として測定し得る。本明細書の特定実施例で
詳述するように、本発明のＧｌｕＲ４受容体をコードす
るＤＮＡでトランスフェクションした哺乳動物細胞は、
特定リガンドによって誘発されるイオンチャンネル活性
を調節するために使用し得る。
を使用する代わりに、ＧｌｕＲ４受容体をコードするメ
ッセンジャーＲＮＡの導入後に機能性膜結合受容体を産
生する細胞、例えばＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いて、
結合又はイオンチャンネル形成を介するリガンドの特徴
解明を実施してもよい。その場合は、導入された遺伝子
がプラスミドベクターによって供給された隣接ＲＮＡ転
写プロモーター、例えばＴ３又はＴ７バクテリオファー
ジプロモーターを介してＲＮＡ中に容易に転写され得る
ように、本発明のＧｌｕＲ４受容体遺伝子を通常はプラ
スミドベクターにサブクローン化する。次いでＲＮＡを
ｉｎ ｖｉｔｒｏで挿入遺伝子から転写する。次いで該
ＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中に注入し得る。ｎＬ
容量のＲＮＡ溶液の注入後に前記卵母細胞を数日インキ
ュベートし、その後、水浴溶液（ｂａｔｈｉｎｇ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）中に含まれている特定リガンド分子に応
答する能力について検査する。機能性ＥＡＡ受容体の作
用の一部分は、イオンが選択的に通過し得る膜チャネル
を操作することによって生起するため、水浴溶液中の特
定リガンド分子に応答して生じる前記受容体の機能は通
常、細胞中に挿入した、又は細胞由来膜調製物のいずれ
かの側面に配置したマイクロ電極を用いて、いわゆる
「パッチクランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）」技術に
より、電流として測定し得る。本明細書の特定実施例で
詳述するように、本発明のＧｌｕＲ４受容体をコードす
るＤＮＡでトランスフェクションした哺乳動物細胞は、
特定リガンドによって誘発されるイオンチャンネル活性
を調節するために使用し得る。
【００３５】リガンドのスクリーニングに有用な細胞系
の構築に受容体コーディングＤＮＡを使用する他に、本
発明の別の特徴として、ＤＮＡの発現は、構造研究、抗
体の産生及び他の実験的使用のために受容体のフラグメ
ントを可溶形状で産生するように実施し得る。ＡＭＰＡ
結合に関与するヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の部分は細胞の
外側に存在する。即ち、細胞外部分である。従って、第
１の例として、前記細胞外リガンド結合性ドメインを単
離形態で、即ち受容体の残部を含まない状態で多量与え
ることにより、受容体−リガンド相互作用の特徴解明を
容易化することが望ましい。そのためには、翻訳終結コ
ドンを第１のトランスメンブランドメイン（ＴＭ１）の
直前で、即ち図１に示すように（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）残基５２６の前で細胞外Ｎ末端領域中に導入すべ
く、完全な長さのヒトＧｌｕＲ４受容体コーディングＤ
ＮＡを部位特異的突然変位誘発によって変化させ得る。
膜中に受容体を「固定（ａｎｃｈｏｒ）」するためのト
ランスメンブランドメインはもはや産生されないため、
修飾遺伝子の発現の結果、細胞外リガンド結合性ドメイ
ンのみが可溶状態で分泌されることになる。次いで、前
述のように産生された細胞外ドメインへのしかるべき化
合物の結合度を確かめるために、標準的リガンド結合ア
ッセイを実施し得る。勿論、単離ドメインへのリガンド
結合度を最適化するためには、部位特異的突然変位誘発
を用いて、幾つかの異なるバージョンの細胞外領域を産
生することが必要である。
の構築に受容体コーディングＤＮＡを使用する他に、本
発明の別の特徴として、ＤＮＡの発現は、構造研究、抗
体の産生及び他の実験的使用のために受容体のフラグメ
ントを可溶形状で産生するように実施し得る。ＡＭＰＡ
結合に関与するヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の部分は細胞の
外側に存在する。即ち、細胞外部分である。従って、第
１の例として、前記細胞外リガンド結合性ドメインを単
離形態で、即ち受容体の残部を含まない状態で多量与え
ることにより、受容体−リガンド相互作用の特徴解明を
容易化することが望ましい。そのためには、翻訳終結コ
ドンを第１のトランスメンブランドメイン（ＴＭ１）の
直前で、即ち図１に示すように（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）残基５２６の前で細胞外Ｎ末端領域中に導入すべ
く、完全な長さのヒトＧｌｕＲ４受容体コーディングＤ
ＮＡを部位特異的突然変位誘発によって変化させ得る。
膜中に受容体を「固定（ａｎｃｈｏｒ）」するためのト
ランスメンブランドメインはもはや産生されないため、
修飾遺伝子の発現の結果、細胞外リガンド結合性ドメイ
ンのみが可溶状態で分泌されることになる。次いで、前
述のように産生された細胞外ドメインへのしかるべき化
合物の結合度を確かめるために、標準的リガンド結合ア
ッセイを実施し得る。勿論、単離ドメインへのリガンド
結合度を最適化するためには、部位特異的突然変位誘発
を用いて、幾つかの異なるバージョンの細胞外領域を産
生することが必要である。
【００３６】本発明のリガンド結合アッセイで使用する
場合は、受容体のＡＭＰＡ結合性フラグメントを、任意
の方法で、まず固体支持体に固定する。ある方法では、
受容体ペプチドフラグメントのＣ末端を、例えば架橋ポ
リスチレン又はポリアミド樹脂のような誘導体化不溶性
ポリマー支持体に結合し得る。固体支持体に固定された
前記フラグメントは、受容体結合親和性に関するしかる
べきリガンドのスクリーニングに有用である。該スクリ
ーニングには通常、完全な長さの受容体を使用する前述
の競合型リガンド結合アッセイを使用する。固体支持体
に固定されたフラグメントは、しかるべきリガンドの存
在下で、天然リガンド即ちＡＭＰＡと結合する。ＡＭＰ
Ａ又はしかるべきリガンドのいずれか一方を例えば放射
性標識で標識し、適当な時間にわたるインキュベーショ
ンの後で、結合又は非結合標識の量を測定することによ
りＡＭＰＡ置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の程度を
調べる。
場合は、受容体のＡＭＰＡ結合性フラグメントを、任意
の方法で、まず固体支持体に固定する。ある方法では、
受容体ペプチドフラグメントのＣ末端を、例えば架橋ポ
リスチレン又はポリアミド樹脂のような誘導体化不溶性
ポリマー支持体に結合し得る。固体支持体に固定された
前記フラグメントは、受容体結合親和性に関するしかる
べきリガンドのスクリーニングに有用である。該スクリ
ーニングには通常、完全な長さの受容体を使用する前述
の競合型リガンド結合アッセイを使用する。固体支持体
に固定されたフラグメントは、しかるべきリガンドの存
在下で、天然リガンド即ちＡＭＰＡと結合する。ＡＭＰ
Ａ又はしかるべきリガンドのいずれか一方を例えば放射
性標識で標識し、適当な時間にわたるインキュベーショ
ンの後で、結合又は非結合標識の量を測定することによ
りＡＭＰＡ置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の程度を
調べる。
【００３７】あるいは、成熟タンパク質のアミノ末端で
はなくカルボキシ末端に由来する受容体の細胞外ドメイ
ン、例えば第４のトランスメンブランドメイン（ＴＭ
４）、即ちアミノ酸残基８１４〜８８１全部にわたるド
メイン（図１、ＳＥＱ ＩＤＮＯＳ １及び２）の直後
のドメインを産生することが望ましいこともある。その
場合は、所期の受容体ドメインをコードする遺伝子の規
定されたフラグメントを得るために、部位特異的突然変
異誘発及び／又はＰＣＲベース増幅技術を簡単に使用し
得る。このようなＤＮＡ配列は、所望の受容体フラグメ
ントの発現を細胞内で又は分泌式に生起させるのに使用
し得る。但しその場合は、前記遺伝子フラグメントをコ
ードするＤＮＡを発現ベクターによって与えられた翻訳
開始コドンに隣接させて挿入し、必要な翻訳読取り枠を
注意深く保存しなければならない。
はなくカルボキシ末端に由来する受容体の細胞外ドメイ
ン、例えば第４のトランスメンブランドメイン（ＴＭ
４）、即ちアミノ酸残基８１４〜８８１全部にわたるド
メイン（図１、ＳＥＱ ＩＤＮＯＳ １及び２）の直後
のドメインを産生することが望ましいこともある。その
場合は、所期の受容体ドメインをコードする遺伝子の規
定されたフラグメントを得るために、部位特異的突然変
異誘発及び／又はＰＣＲベース増幅技術を簡単に使用し
得る。このようなＤＮＡ配列は、所望の受容体フラグメ
ントの発現を細胞内で又は分泌式に生起させるのに使用
し得る。但しその場合は、前記遺伝子フラグメントをコ
ードするＤＮＡを発現ベクターによって与えられた翻訳
開始コドンに隣接させて挿入し、必要な翻訳読取り枠を
注意深く保存しなければならない。
【００３８】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の前述のようなＡ
ＭＰＡ結合性フラグメントの産生は明らかに種々の宿主
細胞中で達成し得る。そのためには、ＣＨＯ細胞のよう
な哺乳動物細胞を使用し、その場合は発現が通常、高度
の発現が可能な発現プロモーター、例えばＣＭＶ（サイ
トメガロウイルス）プロモーターによって誘起される。
あるいは、哺乳動物以外の細胞、例えば昆虫Ｓｆ９（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を使用
することもでき、その場合は発現が通常はバキュロウイ
ルスの発現プロモーター、例えば強力な後期ポリヘドリ
ンタンパク質プロモーターによって誘起される。ＥＡＡ
受容体の前述のような細胞外ドメインを多量に分泌する
ために、糸状菌発現系を使用することもできる。例えば
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓはこの種の
許容し得る系を構成し、その場合は発現がａｌｃＡプロ
モーターによって誘起される。このような発現宿主の他
に、異種遺伝子又は遺伝子フラグメントを細胞内的又は
細胞外的に発現できる原核細胞又は別の真核細胞発現系
も勿論許容し得るものである。
ＭＰＡ結合性フラグメントの産生は明らかに種々の宿主
細胞中で達成し得る。そのためには、ＣＨＯ細胞のよう
な哺乳動物細胞を使用し、その場合は発現が通常、高度
の発現が可能な発現プロモーター、例えばＣＭＶ（サイ
トメガロウイルス）プロモーターによって誘起される。
あるいは、哺乳動物以外の細胞、例えば昆虫Ｓｆ９（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を使用
することもでき、その場合は発現が通常はバキュロウイ
ルスの発現プロモーター、例えば強力な後期ポリヘドリ
ンタンパク質プロモーターによって誘起される。ＥＡＡ
受容体の前述のような細胞外ドメインを多量に分泌する
ために、糸状菌発現系を使用することもできる。例えば
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓはこの種の
許容し得る系を構成し、その場合は発現がａｌｃＡプロ
モーターによって誘起される。このような発現宿主の他
に、異種遺伝子又は遺伝子フラグメントを細胞内的又は
細胞外的に発現できる原核細胞又は別の真核細胞発現系
も勿論許容し得るものである。
【００３９】本発明は別の態様として、特にヒトＧｌｕ
Ｒ４Ｂの存在及び／又は位置を例えば脳組織中で検出す
るために使用するものとして、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体
に対する標識した抗体を提供する。この種の抗体を産生
するためには、前述の方法又は標準的ペプチド合成技術
によって微生物又は哺乳動物細胞宿主中で産生した完全
な可溶性受容体か又はその免疫原性フラグメント、即ち
免疫応答を誘起し得るフラグメントを免疫原として使用
し得る。免疫原性フラグメントとして使用するのに特に
適したヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の領域としては、配列中
で受容体の細胞外領域又は細胞外領域の一部分に対応す
る領域、例えば残基１〜５２５からなるペプチド、又は
残基を約１０個以上有する前記ペプチドのフラグメン
ト、特に残基１７３〜１８８又は４７４〜５１７を含む
フラグメント、並びにトランスメンブランＴＭ−２とＴ
Ｍ−３との間の領域に対応するペプチド、例えば残基５
９１〜６００からなるペプチドが挙げられる。Ｃ末端ド
メイン（残基８１４〜８８１）又はそのフラグメントも
抗体の産生に使用し得る。
Ｒ４Ｂの存在及び／又は位置を例えば脳組織中で検出す
るために使用するものとして、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体
に対する標識した抗体を提供する。この種の抗体を産生
するためには、前述の方法又は標準的ペプチド合成技術
によって微生物又は哺乳動物細胞宿主中で産生した完全
な可溶性受容体か又はその免疫原性フラグメント、即ち
免疫応答を誘起し得るフラグメントを免疫原として使用
し得る。免疫原性フラグメントとして使用するのに特に
適したヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の領域としては、配列中
で受容体の細胞外領域又は細胞外領域の一部分に対応す
る領域、例えば残基１〜５２５からなるペプチド、又は
残基を約１０個以上有する前記ペプチドのフラグメン
ト、特に残基１７３〜１８８又は４７４〜５１７を含む
フラグメント、並びにトランスメンブランＴＭ−２とＴ
Ｍ−３との間の領域に対応するペプチド、例えば残基５
９１〜６００からなるペプチドが挙げられる。Ｃ末端ド
メイン（残基８１４〜８８１）又はそのフラグメントも
抗体の産生に使用し得る。
【００４０】選択したヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体又は免疫
原性フラグメントに対する抗体の産生は、ポリクローナ
ル抗体の産生の場合には、一般的な設計の免疫プロトコ
ルと、例えばヒツジ、ヤギ及びウサギといった種々の哺
乳動物宿主のうちの任意のものとを使用して実施し得
る。あるいは、モノクローナル抗体の産生の場合には、
免疫した動物から脾臓細胞のような免疫細胞を採取し、
ハイブリドーマ技術を用いて骨髄腫細胞に融合し得る。
次いで、選択培地での培養によって融合産物をスクリー
ニングし、抗体産生細胞を回収して継続的に増殖させ、
抗体を回収する。回収した抗体は、そのために確立され
たリンカー技術を用いて、放射性標識、酵素標識、蛍光
標識等のような検出可能標識に共有結合し得る。
原性フラグメントに対する抗体の産生は、ポリクローナ
ル抗体の産生の場合には、一般的な設計の免疫プロトコ
ルと、例えばヒツジ、ヤギ及びウサギといった種々の哺
乳動物宿主のうちの任意のものとを使用して実施し得
る。あるいは、モノクローナル抗体の産生の場合には、
免疫した動物から脾臓細胞のような免疫細胞を採取し、
ハイブリドーマ技術を用いて骨髄腫細胞に融合し得る。
次いで、選択培地での培養によって融合産物をスクリー
ニングし、抗体産生細胞を回収して継続的に増殖させ、
抗体を回収する。回収した抗体は、そのために確立され
たリンカー技術を用いて、放射性標識、酵素標識、蛍光
標識等のような検出可能標識に共有結合し得る。
【００４１】本発明の別の特徴として、ヒトＧｌｕＲ４
Ｂ受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ及びその選択し
た領域を、検出可能なように標識した状態、例えば放射
性標識した状態で、例えばヒト又は他の哺乳動物のゲノ
ム（又はｃＤＮＡライブラリー）中に存在する配列関連
遺伝子を同定するための、又は脳組織のような物質中で
のヒトＧｌｕＲ４ＢコーディングＤＮＡの位置を調べる
ためのハイブリダイゼーションプローブとして使用する
こともできる。これは、放射性標識、例えば32Ｐで標識
したヌクレオチドを包含させた完全なコーディング領域
又はそのフラグメントを用いて実施し得る。ある物質中
でヒトＧｌｕＲ４ＢコードＤＮＡを同定するためには、
前記受容体をコードする完全な長さのｃＤＮＡ又は前記
受容体にとって一意的なフラグメントを使用するのが望
ましい。図１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に基づいて説
明すれば、このようなヌクレオチドフラグメントには、
約１７以上の核酸を含み、配列中で前記受容体の細胞外
Ｎ末端領域又はＣ末端領域をコードする領域に対応する
か、又は前記受容体の５’非翻訳領域もしくは３’非翻
訳領域を表すものがある。この種のオリゴヌクレオチド
配列及びその完全遺伝子は勿論、標準的ハイブリダイゼ
ーション技術によって、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ関連ヒト遺伝
子、特に該遺伝子のｃＤＮＡ等価物をクローン化するの
に使用することもできる。
Ｂ受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ及びその選択し
た領域を、検出可能なように標識した状態、例えば放射
性標識した状態で、例えばヒト又は他の哺乳動物のゲノ
ム（又はｃＤＮＡライブラリー）中に存在する配列関連
遺伝子を同定するための、又は脳組織のような物質中で
のヒトＧｌｕＲ４ＢコーディングＤＮＡの位置を調べる
ためのハイブリダイゼーションプローブとして使用する
こともできる。これは、放射性標識、例えば32Ｐで標識
したヌクレオチドを包含させた完全なコーディング領域
又はそのフラグメントを用いて実施し得る。ある物質中
でヒトＧｌｕＲ４ＢコードＤＮＡを同定するためには、
前記受容体をコードする完全な長さのｃＤＮＡ又は前記
受容体にとって一意的なフラグメントを使用するのが望
ましい。図１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に基づいて説
明すれば、このようなヌクレオチドフラグメントには、
約１７以上の核酸を含み、配列中で前記受容体の細胞外
Ｎ末端領域又はＣ末端領域をコードする領域に対応する
か、又は前記受容体の５’非翻訳領域もしくは３’非翻
訳領域を表すものがある。この種のオリゴヌクレオチド
配列及びその完全遺伝子は勿論、標準的ハイブリダイゼ
ーション技術によって、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ関連ヒト遺伝
子、特に該遺伝子のｃＤＮＡ等価物をクローン化するの
に使用することもできる。
【００４２】
【実施例】以下に非限定的実施例を挙げて、本発明をよ
り詳細に説明する。
り詳細に説明する。
【００４３】実施例１ − ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体を
コードするＤＮＡの単離 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするｃＤＮＡを、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
（米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）からＥｃｏ
ＲＩベースラムダファージライブラリー（ラムダＺＡ
Ｐ）として入手したヒト胎児脳ｃＤＮＡをプローブする
ことによって同定した。前記ｃＤＮＡライブラリーを、
前出のＫｅｉｎａｎｅｎらによって報告されているラッ
トＧｌｕＲ４受容体配列にアニーリングすることができ
る２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリー
ニングした。32Ｐ標識したプローブの特異的配列を下に
示す： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： ５’−ＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡ
ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡ−３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： ５’−ＡＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＴＧ
ＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣ−３’ 前記胎児脳ｃＤＮＡライブラリーは下記のハイブリダイ
ゼーション条件下でスクリーニングした：６×ＳＳＣ、
２５％ホルムアミド、５％Ｄｅｒｎｈａｒｄｔ溶液、
０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ、４２℃。フィルターを、０．５％ＳＤＳ含有２×Ｓ
ＳＣで２５℃で５分間洗浄し、次いで０．５％ＳＤＳ含
有２×ＳＳＣで５０℃で１５分間洗浄した。最終洗浄を
０．５％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣで５０℃で１５分間行っ
た。フィルターをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に一晩暴
露した。スクリーニングした１０6のクローンのうち、
２つのｃＤＮＡ挿入体が同定された。１つは約２．４ｋ
ｂであり、ＲＫＣＳＦＧ４３と命名し、もう１つは約
４．２ｋｂであり、ＲＫＣＳＦＧ１０２と命名した。配
列決定のために’４３及び’１０２ファージをプラーク
精製し、次いで製造業者の規定に従いファージミド（ｐ
ｈａｇｅｍｉｄ）として切断して、ファージミドベクタ
ーの挿入体担持Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ変異体を形
成した。配列全体にわたる’４３クローンの配列決定の
結果、推定上のＡＴＧ開始コドンが約４３塩基の５’の
非コーディング領域及び２．４ｋｂのコーディング領域
と共に解明された。’１０２挿入体の全体に及ぶ配列決
定では、’４３挿入体との有意なオーバーラップが明ら
かにされると共に、終結コドン及び約４３８塩基の３’
非翻訳配列が明らかにされた。
コードするＤＮＡの単離 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするｃＤＮＡを、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
（米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）からＥｃｏ
ＲＩベースラムダファージライブラリー（ラムダＺＡ
Ｐ）として入手したヒト胎児脳ｃＤＮＡをプローブする
ことによって同定した。前記ｃＤＮＡライブラリーを、
前出のＫｅｉｎａｎｅｎらによって報告されているラッ
トＧｌｕＲ４受容体配列にアニーリングすることができ
る２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリー
ニングした。32Ｐ標識したプローブの特異的配列を下に
示す： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： ５’−ＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡ
ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡ−３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： ５’−ＡＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＴＧ
ＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣ−３’ 前記胎児脳ｃＤＮＡライブラリーは下記のハイブリダイ
ゼーション条件下でスクリーニングした：６×ＳＳＣ、
２５％ホルムアミド、５％Ｄｅｒｎｈａｒｄｔ溶液、
０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ、４２℃。フィルターを、０．５％ＳＤＳ含有２×Ｓ
ＳＣで２５℃で５分間洗浄し、次いで０．５％ＳＤＳ含
有２×ＳＳＣで５０℃で１５分間洗浄した。最終洗浄を
０．５％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣで５０℃で１５分間行っ
た。フィルターをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に一晩暴
露した。スクリーニングした１０6のクローンのうち、
２つのｃＤＮＡ挿入体が同定された。１つは約２．４ｋ
ｂであり、ＲＫＣＳＦＧ４３と命名し、もう１つは約
４．２ｋｂであり、ＲＫＣＳＦＧ１０２と命名した。配
列決定のために’４３及び’１０２ファージをプラーク
精製し、次いで製造業者の規定に従いファージミド（ｐ
ｈａｇｅｍｉｄ）として切断して、ファージミドベクタ
ーの挿入体担持Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ変異体を形
成した。配列全体にわたる’４３クローンの配列決定の
結果、推定上のＡＴＧ開始コドンが約４３塩基の５’の
非コーディング領域及び２．４ｋｂのコーディング領域
と共に解明された。’１０２挿入体の全体に及ぶ配列決
定では、’４３挿入体との有意なオーバーラップが明ら
かにされると共に、終結コドン及び約４３８塩基の３’
非翻訳配列が明らかにされた。
【００４４】コーディング領域全体を完全なクローンと
して得るために、図２に示す方法を使用して、ヒトＧｌ
ｕＲ４ＢコーディングＤＮＡを３．０ｋｂ Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ−ＳＫファージミドバックグラウンドへの
４．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体として
有するファージミドｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ４Ｂを形成
した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体の全体的配列
を図１に示す（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）。
して得るために、図２に示す方法を使用して、ヒトＧｌ
ｕＲ４ＢコーディングＤＮＡを３．０ｋｂ Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ−ＳＫファージミドバックグラウンドへの
４．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体として
有するファージミドｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ４Ｂを形成
した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体の全体的配列
を図１に示す（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）。
【００４５】前記ファージミドｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ
４Ｂは、ブダペスト条約に従って、１９９２年７月２１
日に米国メリーランド州ＲｏｃｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託した。受託番号はＡＴＣＣ７５２７９であ
る。
４Ｂは、ブダペスト条約に従って、１９９２年７月２１
日に米国メリーランド州ＲｏｃｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託した。受託番号はＡＴＣＣ７５２７９であ
る。
【００４６】実施例２ − ヒトＧｌｕＲ４Ｂを産生す
る遺伝子工学的細胞の構築 哺乳動物細胞中での過渡的発現のために、ヒトＧｌｕＲ
４Ｂ受容体をコードするｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクタ
ーｐｃＤＮＡ１中に導入した。前記ベクターはＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されて
いる（米国カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番
号Ｖ４９０−２０）。これは、真核細胞系でのｃＤＮＡ
発現と、原核細胞中でのｃＤＮＡ分析とのために設計さ
れた多機能４．２ｋｂプラスミドベクターである。該ベ
クターには、ＣＭＶプロモーター及びエンハンサーと、
スプライスセグメント及びポリアデニル化シグナルと、
ＳＶ４０及びポリオーマウイルス複製起点と、配列決定
及び突然変異誘起のために一本鎖ＤＮＡを取り出す（ｒ
ｅｓｃｕｅ）ためのＭ１３起点と、センス及びアンチセ
ンスＲＮＡ転写体を産生するためのＳｐ６及びＴ７ Ｒ
ＮＡプロモーターと、Ｃｏｌ Ｅ１様ハイコピープラス
ミド起点とが包含されている。ＣＭＶプロモーター（及
びＴ７プロモーターの３’）の下流にはポリリンカーが
的確に配置されている。
る遺伝子工学的細胞の構築 哺乳動物細胞中での過渡的発現のために、ヒトＧｌｕＲ
４Ｂ受容体をコードするｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクタ
ーｐｃＤＮＡ１中に導入した。前記ベクターはＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されて
いる（米国カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番
号Ｖ４９０−２０）。これは、真核細胞系でのｃＤＮＡ
発現と、原核細胞中でのｃＤＮＡ分析とのために設計さ
れた多機能４．２ｋｂプラスミドベクターである。該ベ
クターには、ＣＭＶプロモーター及びエンハンサーと、
スプライスセグメント及びポリアデニル化シグナルと、
ＳＶ４０及びポリオーマウイルス複製起点と、配列決定
及び突然変異誘起のために一本鎖ＤＮＡを取り出す（ｒ
ｅｓｃｕｅ）ためのＭ１３起点と、センス及びアンチセ
ンスＲＮＡ転写体を産生するためのＳｐ６及びＴ７ Ｒ
ＮＡプロモーターと、Ｃｏｌ Ｅ１様ハイコピープラス
ミド起点とが包含されている。ＣＭＶプロモーター（及
びＴ７プロモーターの３’）の下流にはポリリンカーが
的確に配置されている。
【００４７】発現ベクターへのＧｌｕＲ４Ｂ受容体コー
ディングｃＤＮＡの導入を容易にするために、図３の方
法を使用した。まずｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ４Ｂからｃ
ＤＮＡ挿入体を２．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｌ１３
６ＩＩフラグメントとして取出し、これをｐｃＤＮＡＩ
ポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ部位に導
入した。結合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通って配列決定
を行い、ｐｃＤＮＡＩ中の適切な挿入方向を確認した。
得られたプラスミドをｐｃＤＮＡＩ／ｈｕｍＧｌｕＲ４
Ｂと名付け、これを過渡的発現のために、選択した哺乳
動物細胞宿主、この場合はサルに由来するＣＯＳ−１系
統の繊維芽様細胞（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎから、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０と
して入手可能）中に導入した。
ディングｃＤＮＡの導入を容易にするために、図３の方
法を使用した。まずｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ４Ｂからｃ
ＤＮＡ挿入体を２．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｌ１３
６ＩＩフラグメントとして取出し、これをｐｃＤＮＡＩ
ポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ部位に導
入した。結合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通って配列決定
を行い、ｐｃＤＮＡＩ中の適切な挿入方向を確認した。
得られたプラスミドをｐｃＤＮＡＩ／ｈｕｍＧｌｕＲ４
Ｂと名付け、これを過渡的発現のために、選択した哺乳
動物細胞宿主、この場合はサルに由来するＣＯＳ−１系
統の繊維芽様細胞（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎから、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０と
して入手可能）中に導入した。
【００４８】ＧｌｕＲ４ＢコーディングＤＮＡの過渡的
発現のために、ＤＥＡＥ仲介ＤＮＡトランスフェクショ
ンによってＣＯＳ−１細胞を１０6ＣＯＳ細胞当たり約
８μｇのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ２Ｂ）
でトランスフェクションし、前出のＭａｎｉａｔｉｓら
の方法に従ってクロロキンで処理した。要約すれば、Ｃ
ＯＳ−１細胞を５×１０6細胞／皿の密度でプレーティ
ングし、次いでＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４
時間増殖させた。培地を除去し、細胞をＰＢＳ及び培地
で順次洗浄した。その後、ＤＥＡＥデキストラン（０．
４ｍｇ／ｍｌ）と１００μＭクロロキンと１０％ＮｕＳ
ｅｒｕｍとＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＤＮＡ（０．４ｍ
ｇ／ｍｌ）とを含むトランスフェクション溶液を前記細
胞に１０ｍｌ適用した。３７℃で３時間インキュベート
した後、細胞を前述のようにＰＢＳ及び培地で順次洗浄
し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１０％ＤＭＳＯで１
分間ショックにかけた。細胞を１０％ＦＢＳ添加培地で
２〜３日間増殖させ、インキュベーションの終わりに皿
を氷上に配置し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、掻取り（ｓｃｒ
ａｐｉｎｇ）によって除去した。次いで、１０００ｒｐ
ｍで１０分間の遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレ
ットを後でリガンド結合アッセイで使用するために液体
窒素中で凍結した。凍結細胞の融解アリコートのノーザ
ンブロット分析で、貯蔵下の細胞の受容体コーディング
ｃＤＮＡの発現を確認した。
発現のために、ＤＥＡＥ仲介ＤＮＡトランスフェクショ
ンによってＣＯＳ−１細胞を１０6ＣＯＳ細胞当たり約
８μｇのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ２Ｂ）
でトランスフェクションし、前出のＭａｎｉａｔｉｓら
の方法に従ってクロロキンで処理した。要約すれば、Ｃ
ＯＳ−１細胞を５×１０6細胞／皿の密度でプレーティ
ングし、次いでＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４
時間増殖させた。培地を除去し、細胞をＰＢＳ及び培地
で順次洗浄した。その後、ＤＥＡＥデキストラン（０．
４ｍｇ／ｍｌ）と１００μＭクロロキンと１０％ＮｕＳ
ｅｒｕｍとＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＤＮＡ（０．４ｍ
ｇ／ｍｌ）とを含むトランスフェクション溶液を前記細
胞に１０ｍｌ適用した。３７℃で３時間インキュベート
した後、細胞を前述のようにＰＢＳ及び培地で順次洗浄
し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１０％ＤＭＳＯで１
分間ショックにかけた。細胞を１０％ＦＢＳ添加培地で
２〜３日間増殖させ、インキュベーションの終わりに皿
を氷上に配置し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、掻取り（ｓｃｒ
ａｐｉｎｇ）によって除去した。次いで、１０００ｒｐ
ｍで１０分間の遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレ
ットを後でリガンド結合アッセイで使用するために液体
窒素中で凍結した。凍結細胞の融解アリコートのノーザ
ンブロット分析で、貯蔵下の細胞の受容体コーディング
ｃＤＮＡの発現を確認した。
【００４９】同様の方法で、２つの異なる細胞タイプＣ
ＨＯ Ｋ１及びＣＨＯ Ｐｒｏ５を宿主として使用し
て、安定にトランスフェクションした細胞系を調製する
こともできる。この種の細胞系を構築するためには、ヒ
トＧｌｕＲ４ＢをコードするｃＤＮＡを、安定な発現を
可能にする哺乳動物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入する。ｃＤＮＡは前記部位へ
の挿入により、サイトメガロウイルスプロモーターの発
現制御下で、ポリアデニル化部位及びウシ成長ホルモン
遺伝子のターミネーターの上流で、ネオマイシン耐性遺
伝子（ＳＶ４０初期プロモーターによって制御される）
を選択可能なマーカーとして含むベクターバックグラウ
ンド中に配置された。
ＨＯ Ｋ１及びＣＨＯ Ｐｒｏ５を宿主として使用し
て、安定にトランスフェクションした細胞系を調製する
こともできる。この種の細胞系を構築するためには、ヒ
トＧｌｕＲ４ＢをコードするｃＤＮＡを、安定な発現を
可能にする哺乳動物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入する。ｃＤＮＡは前記部位へ
の挿入により、サイトメガロウイルスプロモーターの発
現制御下で、ポリアデニル化部位及びウシ成長ホルモン
遺伝子のターミネーターの上流で、ネオマイシン耐性遺
伝子（ＳＶ４０初期プロモーターによって制御される）
を選択可能なマーカーとして含むベクターバックグラウ
ンド中に配置された。
【００５０】前述のように構築したプラスミドを導入す
るためには、宿主ＣＨＯ細胞をまず１０％ＦＢＳ添加Ｍ
ＥＭ培地中に密度５×１０5で接種する。２４時間増殖
させた後、皿に新鮮な培地を加え、３時間後に、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ同時沈降法（前出のＭａｎｉａｔｉ
ｓら）を用いて細胞をトランスフェクションする。要約
すれば、３μｇのＤＮＡを混入し、緩衝カルシウム溶液
と共に室温で１０分間インキュベートする。等量の緩衝
リン酸塩溶液を加え、得られた懸濁液を室温で１５分間
インキュベートする。次いで、インキュベートした懸濁
液を細胞に４時間適用し、除去し、１５％グリセロール
含有培地で細胞にショックを与える。３分後、細胞を培
地で洗浄し、通常の増殖条件で２４時間インキュベート
する。ネオマイシン耐性を有する細胞を、Ｇ４１８（１
ｍｇ／ｍｌ）含有１０％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭ培地中で
選択する。約２〜３週間後にＧ４１８耐性細胞の個々の
コロニーを単離し、クローン発生的に（ｃｌｏｎａｌｌ
ｙ）選択し、アッセイの目的で増殖させる。
るためには、宿主ＣＨＯ細胞をまず１０％ＦＢＳ添加Ｍ
ＥＭ培地中に密度５×１０5で接種する。２４時間増殖
させた後、皿に新鮮な培地を加え、３時間後に、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ同時沈降法（前出のＭａｎｉａｔｉ
ｓら）を用いて細胞をトランスフェクションする。要約
すれば、３μｇのＤＮＡを混入し、緩衝カルシウム溶液
と共に室温で１０分間インキュベートする。等量の緩衝
リン酸塩溶液を加え、得られた懸濁液を室温で１５分間
インキュベートする。次いで、インキュベートした懸濁
液を細胞に４時間適用し、除去し、１５％グリセロール
含有培地で細胞にショックを与える。３分後、細胞を培
地で洗浄し、通常の増殖条件で２４時間インキュベート
する。ネオマイシン耐性を有する細胞を、Ｇ４１８（１
ｍｇ／ｍｌ）含有１０％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭ培地中で
選択する。約２〜３週間後にＧ４１８耐性細胞の個々の
コロニーを単離し、クローン発生的に（ｃｌｏｎａｌｌ
ｙ）選択し、アッセイの目的で増殖させる。
【００５１】実施例３ − リガンド結合アッセイ 凍結状態のトランスフェクションした細胞をハンドホモ
ジナイザーを用いて氷冷蒸留水中に再懸濁し、５秒間音
波処理し、次いで５０，０００ｇで２０分間遠心分離し
た。上清を捨て、細胞膜ペレットを−７０℃で凍結貯蔵
した。
ジナイザーを用いて氷冷蒸留水中に再懸濁し、５秒間音
波処理し、次いで５０，０００ｇで２０分間遠心分離し
た。上清を捨て、細胞膜ペレットを−７０℃で凍結貯蔵
した。
【００５２】ＣＯＳ細胞膜ペレットを氷冷５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５、５℃）に懸濁し、結合に関
して競合する内因性グルタメートを除去するために再び
５０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを氷
冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５）緩衝液に再
懸濁し、得られた膜調製物を後述の結合実験のための組
織源として使用した。タンパク質は、標準としてＰｉｅ
ｒｃｅ ＲｅａｇｅｎｔをＢＳＡと共に使用して決定し
た。
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５、５℃）に懸濁し、結合に関
して競合する内因性グルタメートを除去するために再び
５０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを氷
冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５）緩衝液に再
懸濁し、得られた膜調製物を後述の結合実験のための組
織源として使用した。タンパク質は、標準としてＰｉｅ
ｒｃｅ ＲｅａｇｅｎｔをＢＳＡと共に使用して決定し
た。
【００５３】次いで、タンパク質の決定と選択した放射
性標識付きリガンドとによって判断して２５μｇ〜１０
０μｇに等しい量のＣＯＳ由来膜を用いて結合アッセイ
を行った。特に、ＡＭＰＡ結合アッセイの場合には、イ
ンキュベーション混合物を、１ｍｌの最終量中に０．１
Ｍ ＫＳＣＮ及び２．５ｍＭ ＣａＣｌ2が含まれるよ
うに、２５〜１００μｇの組織タンパク質と、Ｄ，Ｌ−
α−［５−メチル−３Ｈ］アミノ−３−ヒドロキシ−５
−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸（３Ｈ−Ａ
ＭＰＡ、２７．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ、最終濃度１０ｎＭ）
とで調製した。非特異的結合を１ｍＭ Ｌ−グルタメー
トの存在下で調べた。試料をプラスチック製ミニバイア
ル中で６０分間にわたり氷上でインキュベートし、結合
リガンド及び遊離リガンドを５０，０００ｇで３０分間
の遠心分離により分離した。ペレットを４ｍｌの低温イ
ンキュベーション緩衝液で２回洗浄し、次いで計数のた
めに５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｐｌｕｓシンチレーションカクテルを加えた。
性標識付きリガンドとによって判断して２５μｇ〜１０
０μｇに等しい量のＣＯＳ由来膜を用いて結合アッセイ
を行った。特に、ＡＭＰＡ結合アッセイの場合には、イ
ンキュベーション混合物を、１ｍｌの最終量中に０．１
Ｍ ＫＳＣＮ及び２．５ｍＭ ＣａＣｌ2が含まれるよ
うに、２５〜１００μｇの組織タンパク質と、Ｄ，Ｌ−
α−［５−メチル−３Ｈ］アミノ−３−ヒドロキシ−５
−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸（３Ｈ−Ａ
ＭＰＡ、２７．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ、最終濃度１０ｎＭ）
とで調製した。非特異的結合を１ｍＭ Ｌ−グルタメー
トの存在下で調べた。試料をプラスチック製ミニバイア
ル中で６０分間にわたり氷上でインキュベートし、結合
リガンド及び遊離リガンドを５０，０００ｇで３０分間
の遠心分離により分離した。ペレットを４ｍｌの低温イ
ンキュベーション緩衝液で２回洗浄し、次いで計数のた
めに５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｐｌｕｓシンチレーションカクテルを加えた。
【００５４】カイネート結合アッセイの場合は、インキ
ュベーション混合物を、最終量１ｍｌで低温インキュベ
ーション緩衝液中２５〜１００μｇの組織タンパク質と
［ビニリデン−３Ｈ］カイニン酸（５８Ｃｉ／ｍｍｏｌ
ｅ、最終濃度５ｎＭ）とで調製した。非特異的結合を１
ｍＭのＬ−グルタメートの存在下で調べた。試料をＡＭ
ＰＡ結合アッセイの場合と同様にインキュベートし、Ｂ
ｒａｎｄｅｌ細胞ハーベスターと、予め氷冷０．３％ポ
リエチレンイミンを含浸させたＧＦ／Ｂフィルターとを
用いて、高速濾過により、結合リガンド及び遊離リガン
ドを分離した。フィルターを６ｍｌの低温インキュベー
ション緩衝液で２回洗浄し、次いで計数のために５ｍｌ
のＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｌ
ｕｓシンチレーションカクテルと共にシンチレーション
バイアル内に配置した。
ュベーション混合物を、最終量１ｍｌで低温インキュベ
ーション緩衝液中２５〜１００μｇの組織タンパク質と
［ビニリデン−３Ｈ］カイニン酸（５８Ｃｉ／ｍｍｏｌ
ｅ、最終濃度５ｎＭ）とで調製した。非特異的結合を１
ｍＭのＬ−グルタメートの存在下で調べた。試料をＡＭ
ＰＡ結合アッセイの場合と同様にインキュベートし、Ｂ
ｒａｎｄｅｌ細胞ハーベスターと、予め氷冷０．３％ポ
リエチレンイミンを含浸させたＧＦ／Ｂフィルターとを
用いて、高速濾過により、結合リガンド及び遊離リガン
ドを分離した。フィルターを６ｍｌの低温インキュベー
ション緩衝液で２回洗浄し、次いで計数のために５ｍｌ
のＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｌ
ｕｓシンチレーションカクテルと共にシンチレーション
バイアル内に配置した。
【００５５】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体産生ＣＯＳ細胞に
由来する膜調製物を用いて前述のように実施したアッセ
イの結果、２００ｎＭ［３Ｈ］−ＡＭＰＡで約９２ｆｍ
ｏｌｅ／ｍｇタンパク質の特異的結合が明らかにされた
（図４）。偽トランスフェクション細胞は、検査した総
てのリガンドについて特異的結合を示さなかった。
由来する膜調製物を用いて前述のように実施したアッセ
イの結果、２００ｎＭ［３Ｈ］−ＡＭＰＡで約９２ｆｍ
ｏｌｅ／ｍｇタンパク質の特異的結合が明らかにされた
（図４）。偽トランスフェクション細胞は、検査した総
てのリガンドについて特異的結合を示さなかった。
【００５６】Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析の結果、組換えに
よって発現したヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体は単一種類の［
3Ｈ］標識したＡＭＰＡ結合部位を約５６±１．０ｎＭ
の解離定数（Ｋd）で含んでいることが判明した（図
５）。また、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体の最大ＡＭＰＡ結合
（Ｂmax）は５３３±６３ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質で
あった。
よって発現したヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体は単一種類の［
3Ｈ］標識したＡＭＰＡ結合部位を約５６±１．０ｎＭ
の解離定数（Ｋd）で含んでいることが判明した（図
５）。また、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体の最大ＡＭＰＡ結合
（Ｂmax）は５３３±６３ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質で
あった。
【００５７】これらの結果は、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体
が特異性をもってＡＭＰＡに結合することを明白に示し
ている。この活性を、カイネート又はＮＭＤＡの検出可
能な結合が殆ど又は全く見られないという事実と組合わ
せて考えれば、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体がＡＭＰＡ型Ｅ
ＡＡ受容体であることは明白である。また、この結合プ
ロフィルは、前記受容体が信頼できる方法で結合してお
り、そのため、前記受容体の同類でヒト脳に由来する非
組換え受容体のリガンド結合「サイン（ｓｉｇｎａｔｕ
ｒｅ）」を信頼性をもって予言できることを示してい
る。組換え受容体は前述のような特徴を有するため、受
容体に結合するリガンド化合物の選択及び特徴解明、及
び／又は別のリガンドを受容体から排除することにより
作用し得る化合物の選択及び特徴解明において特に有用
である。従って、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体遺伝子を、単一の
均質な受容体として発現できる実質的に純粋な状態で単
離すれば、リガンド結合アッセイには、ヒト及び他の哺
乳動物の脳に由来する複雑で不均質な受容体調製物を用
いて前述のような特徴付けを試みた場合に見られる正確
さの欠如は存在しない。
が特異性をもってＡＭＰＡに結合することを明白に示し
ている。この活性を、カイネート又はＮＭＤＡの検出可
能な結合が殆ど又は全く見られないという事実と組合わ
せて考えれば、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体がＡＭＰＡ型Ｅ
ＡＡ受容体であることは明白である。また、この結合プ
ロフィルは、前記受容体が信頼できる方法で結合してお
り、そのため、前記受容体の同類でヒト脳に由来する非
組換え受容体のリガンド結合「サイン（ｓｉｇｎａｔｕ
ｒｅ）」を信頼性をもって予言できることを示してい
る。組換え受容体は前述のような特徴を有するため、受
容体に結合するリガンド化合物の選択及び特徴解明、及
び／又は別のリガンドを受容体から排除することにより
作用し得る化合物の選択及び特徴解明において特に有用
である。従って、ＧｌｕＲ４Ｂ受容体遺伝子を、単一の
均質な受容体として発現できる実質的に純粋な状態で単
離すれば、リガンド結合アッセイには、ヒト及び他の哺
乳動物の脳に由来する複雑で不均質な受容体調製物を用
いて前述のような特徴付けを試みた場合に見られる正確
さの欠如は存在しない。
【００５８】実施例４ − チャンネル活性アッセイ ヒト腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
５７３）をトランスフェクションの前にトリプシン（Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ）で分解させた。分解した細胞を集密
性約２５％の濃度で３５ｍｍ皿にプレーティングし、プ
レーティングの１２〜２４時間後に細胞を無血清ＭＥＭ
で１５分間洗浄した。
５７３）をトランスフェクションの前にトリプシン（Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ）で分解させた。分解した細胞を集密
性約２５％の濃度で３５ｍｍ皿にプレーティングし、プ
レーティングの１２〜２４時間後に細胞を無血清ＭＥＭ
で１５分間洗浄した。
【００５９】静かに混合しながら、無血清ＭＥＭ１００
μｌに２μｇの受容体ＤＮＡを加えた。１００μｌのＭ
ＥＭ（無血清）に５μｌのリポフェクチン試薬（ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ）を静かに混合しながら加え、等量のＤＮＡと前記リ
ポフェクチン混合物とを一緒にして、室温で１５分間イ
ンキュベートした。該インキュベーションの最後の５分
の間に、細胞が懸濁している溶液を除去し、代わりに
１．５ｍｌの新鮮な溶液を加えた。１５分間インキュベ
ートしたＤＮＡ／リポフェクチン混合物２００μｌをプ
レーティングした細胞にゆっくり加え、該細胞を３７℃
で２４時間インキュベートした。細胞からＤＮＡ／リポ
フェクチン混合物を除去し、代わりに血清含有ＭＥＭを
加えた。細胞を使用時まで３６〜４８時間インキュベー
トした。
μｌに２μｇの受容体ＤＮＡを加えた。１００μｌのＭ
ＥＭ（無血清）に５μｌのリポフェクチン試薬（ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ）を静かに混合しながら加え、等量のＤＮＡと前記リ
ポフェクチン混合物とを一緒にして、室温で１５分間イ
ンキュベートした。該インキュベーションの最後の５分
の間に、細胞が懸濁している溶液を除去し、代わりに
１．５ｍｌの新鮮な溶液を加えた。１５分間インキュベ
ートしたＤＮＡ／リポフェクチン混合物２００μｌをプ
レーティングした細胞にゆっくり加え、該細胞を３７℃
で２４時間インキュベートした。細胞からＤＮＡ／リポ
フェクチン混合物を除去し、代わりに血清含有ＭＥＭを
加えた。細胞を使用時まで３６〜４８時間インキュベー
トした。
【００６０】標準的細胞外記録溶液（ｓｔａｎｄａｒｄ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍ
ＭＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．３ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、浸透度３００ｍＯｓｍまで
のグルコース、ｐＨはＮａＯＨで７．２に調整）中で、
トランスフェクションした細胞から完全細胞ボルテージ
クランプ記録を作成した。使用電極は、１〜２μｍポイ
ントの薄いホウケイ酸ガラスを使用し、ＣｓＣｌベース
の細胞内溶液を充填して形成した。これらの電極は、強
度の大きいシールが形成されるまで穏やかな吸引を用い
て細胞膜に融合させた。更に負の圧力を用いて電極の先
端の下に存在する膜パッチを除去し、Ａｘｏｐａｔｃｈ
１Ｂを使用して電極にクランプした。
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍ
ＭＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．３ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、浸透度３００ｍＯｓｍまで
のグルコース、ｐＨはＮａＯＨで７．２に調整）中で、
トランスフェクションした細胞から完全細胞ボルテージ
クランプ記録を作成した。使用電極は、１〜２μｍポイ
ントの薄いホウケイ酸ガラスを使用し、ＣｓＣｌベース
の細胞内溶液を充填して形成した。これらの電極は、強
度の大きいシールが形成されるまで穏やかな吸引を用い
て細胞膜に融合させた。更に負の圧力を用いて電極の先
端の下に存在する膜パッチを除去し、Ａｘｏｐａｔｃｈ
１Ｂを使用して電極にクランプした。
【００６１】６０ｍＶの膜保持電位で、カイネート、Ｌ
−グルタメート及びＡＭＰＡに関する容量−応答曲線を
プロットした（図５）。各々のＥＣ50はそれぞれ１４５
μＭ、３２μＭ及び１０μＭであった。
−グルタメート及びＡＭＰＡに関する容量−応答曲線を
プロットした（図５）。各々のＥＣ50はそれぞれ１４５
μＭ、３２μＭ及び１０μＭであった。
【００６２】図６はＬ−グルタメートの種々の濃度に対
する電気生理学的応答を示している。この場合の保持電
位は−６０ｍＶであった。
する電気生理学的応答を示している。この場合の保持電
位は−６０ｍＶであった。
【００６３】ＧｌｕＲ４Ｂ ＤＮＡでトランスフェクシ
ョンしたヒト細胞を用いて観察した電気生理学的特性、
及び観察されたリガンド結合薬理学的プロフィルは、天
然に存在し得る別の受容体複合成分が存在しなくても、
ＧｌｕＲ４Ｂ受容体だけで、活性受容体／イオンチャン
ネル複合体を形成するのに十分であることを示してい
る。
ョンしたヒト細胞を用いて観察した電気生理学的特性、
及び観察されたリガンド結合薬理学的プロフィルは、天
然に存在し得る別の受容体複合成分が存在しなくても、
ＧｌｕＲ４Ｂ受容体だけで、活性受容体／イオンチャン
ネル複合体を形成するのに十分であることを示してい
る。
【００６４】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の前述の電気生理
学的及び薬理学的特性は、受容体イオンチャンネル複合
体が信頼できる方法で機能し、従って、前記受容体と同
類で完全ヒト脳に由来する非組換え受容体の電気生理学
的特性及びリガンド結合サインを信頼性をもって予言で
きることを示すものである。組換え受容体は前述のよう
な特徴を有するため、前記受容体のイオンチャンネル応
答を調節するか又は実現することができる機能性リガン
ド化合物の選択及び特徴付けにおいて特に有用である。
また、前記受容体／イオンチャンネル複合体は、イオン
チャンネル機能をブロックし得る検査リガンドの同定及
び特徴付けにも使用できる。従って、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ
受容体遺伝子を、単一の均質な受容体／イオンチャンネ
ル複合体として発現できる純粋な状態で単離すれば、ヒ
ト脳及びラットのような哺乳動物系モデルに由来する複
雑で不均質な受容体調製物を用いて前述のような特徴付
けを試みた場合に見られる正確さの欠如が機能性リガン
ドアッセイでは排除される。
学的及び薬理学的特性は、受容体イオンチャンネル複合
体が信頼できる方法で機能し、従って、前記受容体と同
類で完全ヒト脳に由来する非組換え受容体の電気生理学
的特性及びリガンド結合サインを信頼性をもって予言で
きることを示すものである。組換え受容体は前述のよう
な特徴を有するため、前記受容体のイオンチャンネル応
答を調節するか又は実現することができる機能性リガン
ド化合物の選択及び特徴付けにおいて特に有用である。
また、前記受容体／イオンチャンネル複合体は、イオン
チャンネル機能をブロックし得る検査リガンドの同定及
び特徴付けにも使用できる。従って、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ
受容体遺伝子を、単一の均質な受容体／イオンチャンネ
ル複合体として発現できる純粋な状態で単離すれば、ヒ
ト脳及びラットのような哺乳動物系モデルに由来する複
雑で不均質な受容体調製物を用いて前述のような特徴付
けを試みた場合に見られる正確さの欠如が機能性リガン
ドアッセイでは排除される。
【００６５】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：３９８１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４４．．１０６ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０７．．２７５２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４４．．２７５２ 配列
【００６６】
【化１】
【００６７】
【化２】
【００６８】
【化３】
【００６９】
【化４】
【００７０】
【化５】 配列番号：２ 配列の長さ：９０２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００７１】
【化６】
【００７２】
【化７】
【００７３】
【化８】 配列番号：３ 配列の長さ：４０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００７４】
【化９】 配列の番号：４ 配列の長さ：４０塩基対 配列の数：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００７５】
【化１０】
【図１Ａ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｂ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｃ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｄ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｅ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｆ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図１Ｇ】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードするＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそのアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の説明図である。
【図２】図１のＤＮＡ配列のクローニングに使用される
方法の説明図である。
方法の説明図である。
【図３】図１のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体コーディングＤ
ＮＡが組み込まれた組換えＤＮＡ発現構築体の形成に使
用される方法の説明図である。
ＮＡが組み込まれた組換えＤＮＡ発現構築体の形成に使
用される方法の説明図である。
【図４】ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体のＡＭＰＡ結合特性を
示す説明図である。
示す説明図である。
【図５】ＧｌｕＲ４Ｂ受容体のチャンネル活性化特性を
示す説明図である。
示す説明図である。
【図６】ＧｌｕＲ４Ｂ受容体のチャンネル活性化特性を
示す説明図である。
示す説明図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/566 9015−2Ｊ (71)出願人 593137299 ステイーブン・エル・ナツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・ ２・エル・２ 、エトビコーク、バーリン トン・ストリート・74、アパ ートメン ト・ナンバー・１ (72)発明者 ラジエンダー・カンボイ カナダ国、オンタリオ・エル・５・エヌ・ １・アール・４、ミシソウガ、アービダ・ サークル・2869 (72)発明者 カンダス・エリオツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・ ２・エル・２、エトビコーク、バーリント ン・ストリート・74、アパートメント・ナ ンバー・１ (72)発明者 ステイーブン・エル・ナツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・ ２・エル・２、エトビコーク、バーリント ン・ストリート・74、アパートメント・ナ ンバー・１
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体、該ＧｌｕＲ４
Ｂ受容体のＡＭＰＡ結合性フラグメント又は該ＧｌｕＲ
４Ｂ受容体の変異体をコードする領域を含む単離ポリヌ
クレオチド。 - 【請求項２】 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコードする領
域を含む請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１又２に記載のポリヌクレオチド
を包含している組換えＤＮＡ構築体。 - 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、細胞宿主内で
の前記受容体の発現及び分泌を可能にするＤＮＡと操作
可能なように結合している請求項３に記載の組換えＤＮ
Ａ構築体。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載の異種ポリヌクレ
オチドを包含している細胞宿主。 - 【請求項６】 哺乳動物細胞である請求項５に記載の細
胞宿主。 - 【請求項７】 請求項５に記載の細胞宿主に由来する膜
調製物。 - 【請求項８】 実質的に均質のヒトＥＡＡ受容体源を得
るための方法であって、ヒＧｌｕＲ４Ｂ受容体をコード
する領域を含むポリヌクレオチドを発現可能なように包
含している細胞宿主を培養し、培養した細胞を回収する
ステップを含む方法。 - 【請求項９】 培養した細胞から膜調製物を得る後続の
ステップも含む請求項８に記載の実質的に均質なヒトＥ
ＡＡ受容体源を得るための方法。 - 【請求項１０】 検査リガンドとヒトＣＮＳ受容体との
間の相互作用を分析する方法であって、検査リガンドを
適当な条件下で請求項６から８のいずれか一項に記載の
細胞宿主又は該細胞宿主に由来する膜調製物と共にイン
キュベートし、ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体と検査リガンド
との間の結合度を測定するか、又は前記細胞もしくは膜
を通るリガンド誘導電流を測定するステップを含む方
法。 - 【請求項１１】 ヒト由来の別のタンパク質を本質的に
含まない形態のヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体。 - 【請求項１２】 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体のＡＭＰＡ結
合性フラグメント。 - 【請求項１３】 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体に結合する抗
体。 - 【請求項１４】 ヒトＧｌｕＲ４Ｂ受容体の免疫原性フ
ラグメント。 - 【請求項１５】 請求項１又は２に記載のポリヌクレオ
チドとハイブリダイズする少なくとも約１７核酸からな
るオリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92455392A | 1992-08-05 | 1992-08-05 | |
| US924553 | 1992-08-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169775A true JPH06169775A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=25450359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5212342A Pending JPH06169775A (ja) | 1992-08-05 | 1993-08-04 | ＡＭＰＡ結合性ヒトＧｌｕＲ４受容体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5643785A (ja) |
| EP (1) | EP0583917B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06169775A (ja) |
| AT (1) | ATE240393T1 (ja) |
| CA (1) | CA2101586A1 (ja) |
| DE (1) | DE69332972T2 (ja) |
| MX (1) | MX9304715A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI772701B (zh) * | 2018-10-30 | 2022-08-01 | 日商日本製鐵股份有限公司 | 材料的製造方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6441155B1 (en) * | 1992-06-10 | 2002-08-27 | Nps Allelix Corp. | Ampa-binding human GluR2 receptors |
| CA2101586A1 (en) * | 1992-08-05 | 1994-02-06 | Rajender Kamboj | Ampa-binding human glur4 receptors |
| EP1065215A1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-03 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Homomeric and heteromeric AMPA receptors |
| CA2421912A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-14 | Pe Corporation (Ny) | Isolated human transporter proteins, nucleic acid molecules encoding human transporter proteins, and uses thereof |
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|---|---|---|---|---|
| WO1991006648A1 (en) * | 1989-10-27 | 1991-05-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Glutamate receptor compositions and methods |
| SE468134B (sv) * | 1990-12-07 | 1992-11-09 | Flaekt Ab | Rengoeringsanordning foer flaekthjul, innefattande aatminstone en tryckluftskanon foer att rikta skott i form av tryckluftspulser mot flaekthjulet |
| NZ240921A (en) | 1990-12-12 | 1994-06-27 | Zymogenetics Inc | G protein coupled glutamate receptor (neurotransmitters), recombinant production |
| CA2094987A1 (en) * | 1992-05-01 | 1993-11-02 | James P. Burnett, Jr. | Human glutamate receptor proteins and associated dna compounds |
| MX9303444A (es) * | 1992-06-10 | 1994-07-29 | Rajender Kamboj | Polinucleotidos aislados que codifican para una familia de receptores del sistema nervioso central humano. |
| US6406868B1 (en) * | 1992-06-10 | 2002-06-18 | Nps Allelix Corporation | AMPA-binding human GluR1 receptors |
| CA2101586A1 (en) * | 1992-08-05 | 1994-02-06 | Rajender Kamboj | Ampa-binding human glur4 receptors |
-
1993
- 1993-07-29 CA CA002101586A patent/CA2101586A1/en not_active Abandoned
- 1993-08-04 AT AT93306157T patent/ATE240393T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 EP EP93306157A patent/EP0583917B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-04 JP JP5212342A patent/JPH06169775A/ja active Pending
- 1993-08-04 DE DE69332972T patent/DE69332972T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-08-04 MX MX9304715A patent/MX9304715A/es active IP Right Grant
-
1994
- 1994-06-13 US US08/259,164 patent/US5643785A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-14 US US08/403,663 patent/US6358693B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/473,204 patent/US6372488B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-04-15 US US10/121,675 patent/US7071306B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI772701B (zh) * | 2018-10-30 | 2022-08-01 | 日商日本製鐵股份有限公司 | 材料的製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US6372488B1 (en) | 2002-04-16 |
| MX9304715A (es) | 1994-05-31 |
| DE69332972T2 (de) | 2004-05-19 |
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| US20030053993A1 (en) | 2003-03-20 |
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