JPH06169793A

JPH06169793A - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH06169793A
Application number: JP4349842A
Authority: JP
Inventors: Toshio Imai; 利夫今井; Yasuhiro Takahama; 康弘高浜; Hiroshige Itakura; 弘重板倉; Takeyoshi Urata; 武義浦田
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1992-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 1994-06-21

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】脂質転送蛋白（ＬＴＰ）に対する複数の新規な
モノクローナル抗体、その製造法、産生ハイブリドー
マ、免疫原ペプチド、並びにこのモノクローナル抗体に
よるＬＴＰの免疫学的検定法を提供する。【構成】本発明は、次のアミノ酸配列を持つペプチド上
の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体、ならびに
その用途を提供する。また本発明は、このアミノ酸配列
を持つペプチドと、その用途を提供するものである。配列１:CSKGTSHEAGIVCRITKPALLVLNHETA 配列２:MADFVQTRAASIL 配列３:MLYFWFSERVFHSL 配列４:MGDEFKAVLETWGFNTNQEI 配列５:MVKFLFPRPDQ 【効果】本発明によって、ＬＴＰを認識する複数のモノ
クローナル抗体が得られる。複数のモノクローナル抗体
を提供することにより、免疫学的手法によるＬＴＰの研
究に貢献する。また本発明によって提供されるペプチド
は容易に合成することができるので、原料供給の面でも
有利である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体と
その製造技術に関するものである。具体的には、ヒト脂
質転送蛋白を認識するモノクローナル抗体、ならびにそ
の製造法、産生ハイブリドーマ、製造用免疫原ペプチ
ド、それらの用途等に関するものである。

【０００２】ヒト脂質転送蛋白（Lipid Transfer Prote
in:以下ＬＴＰと省略する）は、血中リポ蛋白と内皮細
胞の脂質との間で脂質のやりとりに関与するとされる蛋
白である。現在のところＬＴＰには、ＬＴＰ−ＩとＬＴ
Ｐ−ＩＩの存在が知られている。ＬＴＰ−Ｉはコレステ
リルエステル、トリグリセリド、そしてリン脂質の５０
%について、ＬＴＰ−ＩＩはリン脂質の残りの５０%の転
送をつかさどっている(臨床検査,35-2,135;1991)。本発
明はこれらＬＴＰのうち、特にＬＴＰ−Ｉ（Cholestery
l Ester Transfer Protein:ＣＥＴＰとも呼ばれる）に
関するものである。以下特にことわらない限り、ＬＴＰ
とはＬＴＰ−Ｉを指すものとする。前にも述べたとお
り、ＬＴＰは動脈硬化巣の原因となる末梢細胞の脂質と
血中で脂質を運搬するリポ蛋白との間で脂質の転送に関
与する蛋白である。したがって生体内の脂質の挙動と密
接な関連を持つ動脈硬化症の研究や診断において、ＬＴ
Ｐは重要な意義を持つ物質の一つであると考えられる。

【０００３】

【従来技術の問題点】生体内物質の研究を進める上で、
免疫学的な手法は不可欠である。ことに研究対象となる
物質を特異的に認識するモノクローナル抗体は、物質の
分離・精製、検出、同定等を行うための強力なツールの
一つである。

【０００４】ＬＴＰについては、わずかにそのＣ末端付
近の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体（J.Bio
l.Chem.,263,5020;1988）が知られているのみである。
しかし免疫学的手法による物質の分析等においては、１
種のモノクローナル抗体では不十分なことが予想され
る。例えばサンドイッチ法と呼ばれる免疫学的検出系を
構成するためには、少なくとも２つの重複しない抗原決
定基に対して強い結合性を示すモノクローナル抗体を用
意する必要がある。

【０００５】ＬＴＰの場合も例外ではなく、４７６個の
アミノ酸で構成されるＬＴＰ分子には多くの抗原決定基
が存在するものと考えられる。したがって、より高感度
でより特異的な検出系を確立するためには、なるべくた
くさんの抗原決定基の組合せについて検討することが望
まれる。ここにより多くのモノクローナル抗体を提供す
る意義が存在する。またＬＴＰの構造と活性の関係を分
析する場合にも、ＬＴＰ上の様々な位置に対して特異的
に結合する数多くのモノクローナル抗体の提供が望まれ
る。このようにＬＴＰに対する複数種のモノクローナル
抗体の提供が望まれているのにもかかわらず、現実には
前記１種のモノクローナル抗体が知られているにすぎな
い。

【０００６】更に前記モノクローナル抗体の作製に用い
られた免疫原は、ＬＴＰ分子そのものである。このよう
な作製法を採った場合、得られるモノクローナル抗体の
認識部位を予測することは困難である。また非常に多用
性に富む抗体産生細胞が出現する可能性が高く、クロー
ニング操作の負担が大きい。加えて従来利用されていた
ＬＴＰ分子は、ヒト血清から精製されたものであり産業
的に利用するには原料供給の面で問題があると言える。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＬＴＰの新
たな抗原決定基抗原決定基を認識するモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体の製造法、ハイブリドー
マ、免疫原に有用なペプチド、並びに本発明で得られる
モノクローナルによるＬＴＰの免疫学的検定法の提供を
課題としている。本発明はＬＴＰの抗原決定基を認識す
る新しい複数のモノクローナル抗体を提供し、ＬＴＰの
研究や動脈硬化症の診断に寄与することを目的とするも
のである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の第一の課題は、
ＬＴＰを認識するモノクローナル抗体であって、次の群
から選択されるアミノ酸配列を持つペプチドの抗原決定
基を認識することを特徴とするモノクローナル抗体によ
って解決される。配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln

【０００９】ここで、これらのアミノ酸配列は次のよう
に表記することもできる。また、続けて各アミノ酸表記
がどのアミノ酸と対応しているのかを明記する。配列１:CSKGTSHEAGIVCRITKPALLVLNHETA 配列２:MADFVQTRAASIL 配列３:MLYFWFSERVFHSL 配列４:MGDEFKAVLETWGFNTNQEI 配列５:MVKFLFPRPDQ

【００１０】アミノ酸表記の対応アラニン Ala または A アルギニン Arg または R アスパラギン Asn または N アスパラギン酸 Asp または D システイン Cys または C グルタミン Gln または Q グルタミン酸 Glu または E グリシン Gly または G ヒスチジン His または H イソロイシン Ile または I ロイシン Leu または L リジン Lys または K メチオニン Met または M フェニルアラニン Phe または F プロリン Pro または P セリン Ser または S トレオニン Thr または T トリプトファン Trp または W チロシン Tyr または Y バリン Val または V

【００１１】本発明のモノクローナル抗体が認識する抗
原決定基は、前記ペプチドのいずれかに存在するもので
ある。本発明によって提供されるモノクローナル抗体
は、後に述べるＬＴＰの免疫学的検定法の他、ＬＴＰの
イムアフィニティクロマトグラフィーによる精製、ＬＴ
Ｐの生理活性の解析等、多くの分野に応用することが可
能である。ＬＴＰの活性をブロックすることによる、治
療用途への応用も考えられる。これらのモノクローナル
抗体は、以下に述べる本発明の第二の課題を解決するこ
とによって得ることができる。

【００１２】すなわち本発明の第二の課題は、ＬＴＰを
認識するモノクローナル抗体の製造法であって、前記ア
ミノ酸配列を持つペプチドを免疫原として用いることを
特徴とするモノクローナル抗体の製造法によって解決さ
れる。本発明のモノクローナル抗体の製造法において、
免疫原として前記ペプチドを用いる他は公知の技術を応
用することができる。たとえばin vivo免疫法(化学と生
物・実験ライン８，単クローン抗体,p69;1990)、あるい
はin vitro免疫法(J.Cell.Biol.,96,1149;1983)等が一
般的なモノクローナル抗体の製造法として知られてい
る。in vivo免疫法とは、免疫動物を前記アミノ酸配列
を持つペプチドをアジュバント等と混合したたもので免
疫し、抗体価が上昇した時点で脾臓を摘出し、ミエロー
マ細胞等と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得る方
法である。一方in vitro免疫法は、予め摘出した免疫動
物の脾細胞を生体外で前記ペプチドを含む免疫原と接触
させた後、ミエローマと細胞融合させる方法である。免
疫原となるペプチドそのものは、後に述べるような方法
により得ることができる。

【００１３】本発明の第三の課題は、ＬＴＰを認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであっ
て、前記アミノ酸配列を持つペプチドの抗原決定基を認
識することを特徴とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマの提供により解決される。本発明による
ＬＴＰを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマは、前記のモノクローナル抗体を得る工程の中
で確立される。

【００１４】本発明によるモノクローナル抗体の製造法
において必要な免疫原は、本発明の第四の課題を解決す
ることにより提供される。すなわち本発明の第四の課題
は、ＬＴＰの部分ペプチドであって前記アミノ酸配列１
から５を持つペプチドの提供である。本発明によるペプ
チドは、公知のペプチド合成法によって得ることができ
る。合成には、市販のペプチドシンセサイザーを利用す
れば便利である。本発明のペプチドは、適当なアジュバ
ント等と混合して、あるいは更にキーホールリンペット
ヘモシアニンのような担体蛋白と結合させたうえで免疫
原とすることができる。また後に述べる免疫学的検定法
において、標準品として利用することもできる。あるい
は前記モノクローナル抗体の製造工程において、モノク
ローナル抗体のスクリーニングに用いることができる。

【００１５】本発明の第五の課題は、ＬＴＰの免疫学的
検定法であって前記アミノ酸配列を持つペプチドの抗原
決定基を認識するモノクローナル抗体を利用することを
特徴とする免疫学的検定法によって解決される。

【００１６】本発明では複数の新規なモノクローナル抗
体が提供されるので、従来にない様々な構成の免疫学的
検定法を実施することが可能となる。具体的には、サン
ドイッチ法、ラテックス凝集反応法等のような複数の抗
原決定基を利用した免疫学的検定法を例示することがで
きる。サンドイッチ法を適用する場合には、本発明のモ
ノクローナル抗体をラジオアイソトープ、酵素、蛍光物
質等で標識して用いることができる。また必要に応じて
固相化しておくことも可能である。

【００１７】

【作用】本発明における前記アミノ酸配列は公知のＬＴ
Ｐのアミノ酸配列(NATURE,237-18,632;Jun.1987)から選
択されたものであるが、本発明によって提供されるペプ
チドは新規なペプチドである。本発明によるペプチドが
ＬＴＰのアミノ酸配列のどの部分に相当しているかを図
１に示した。本発明ではこの新規なペプチドを免疫原に
利用することによって、ＬＴＰに対する複数種の特異的
なモノクローナル抗体、その製造法、ならびに産生ハイ
ブリドーマの提供に成功したのである。

【００１８】更に本発明におけるアミノ酸配列１から５
で示されたペプチドは、ＬＴＰ上の一定の範囲内に存在
する抗原決定基のみを認識するモノクローナル抗体の産
生を可能とする。この作用により、予めモノクローナル
抗体の認識部位をある程度予測することが可能となるの
で作業効率が向上する。本発明のペプチドは容易に合成
することができるので、原料供給の面でも有利である。

【００１９】一方本発明によって提供されるＬＴＰに特
異的な複数種のモノクローナル抗体は、ＬＴＰ分子上の
様々な位置を認識する。サンドイッチ法等の検討に当た
っては、検出対象となる分子のどの抗原決定基を選択す
るかが感度や特異性を大きく左右するが、本発明によっ
て提供される複数のモノクローナル抗体はこの抗原決定
基の選択の幅を広くするものである。

【００２０】また本発明は、これら複数のモノクローナ
ルによって、従来は不可能であったＬＴＰのモノクロー
ナル抗体を用いた免疫学的検定法を実現するものであ
る。以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。

【００２１】

【実施例】

１．本発明ペプチド（５種）の合成以下のアミノ酸配列１から５を持つ本発明のペプチドを
合成した。配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln

【００２２】試薬類は以下のものを使用した。各種アミノ酸カートリッジ、ピペリジン、メタノール、
ジクロロメタン、Ｎ−メチルモルトリンおよび１−ヒド
ロベンゾール：ミリジェンバイオサーチ社製ジメチルフォルムアミド：アプライドバイオシステムズ
社製トリフルオロ酢酸、トリメチルブロモシランおよびエタ
ンジチオール：渡辺化学工業製チオアニソール：東京化成製エチルエーテル：ナカライテスク製ｍ−クレゾール、酢酸アセトニトリル、リン酸水素二ナ
トリウム、リン酸水素一カリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、過酸化水素水、２−メルカプトエタノール
（以下２ＭＥと省略する）、およびグルタールアルデヒ
ド：和光純薬工業製フロイント完全アジュバント、アミノプテリン、チミジ
ン、ヒポキサンチン、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ
−２０、ポリ−Ｌ−リジン（以下ＰＬＬと省略する）
、および２，２’−アジノジ−［３−エチルベンズチ
アゾリン−６−スルホン酸］（以下ＡＢＴＳと省略す
る）：Ｓｉｇｍａ製ロスウェルパークメモリアルインスティテュート−１６
４０（以下ＲＰＭＩと省略する）、ミニマムエッセンシ
ャルメディウム（以下ＭＥＭと省略する）、およびＬ
−グルタミン：日水製薬製ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと省略する）−４
０００：メルク製牛胎児血清（以下ＦＢＳと省略する）：バイオセル製牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）：ＩＢＬ製ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンズ（Ａ
／Ｇ／Ｍ、以下ＰＯＤ標識Ｉｇ’ｓと省略する）：Ｚｙ
ｍｅｄ製

【００２３】本発明による５種類のペプチドの合成は、
ペプチドシンセサイザー（ミリジェンバイオサーチ社
製、エクセル型）を用いて行った。すなわち表１から５
に示す各種アミノ酸カートリッジを用い、Fmoc-PACレジ
ンをＣ末端部に固定しFmoc法（文献１）により合成を行
った。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【００２４】合成終了後、レジンを切り出し、図２の方
法に従い脱保護（文献２）を行った。次いでＨＰＬＣ
（μBondaspher C18 5μm,100A、19.0x150mm:ウォータ
ーズ社製600E型ソルベントシステム）を用いてそれぞれ
のペプチドを精製（文献３−５）後、ＨＰＬＣ（Aquapo
re-RP300 C8 7μm、2.1IDx220mm:ＡＢＩ社製140AμＨＰ
ＬＣシステム）で純度を確認（文献６−８）した。ＨＰ
ＬＣ操作については表６に示した。このときのＨＰＬＣ
像から、ペプチド２およびペプチド４は比較的親水性で
あるのに対し、ペプチド１およびペプチド３は相対的に
やや疎水性のペプチドであることが示された。図３にペ
プチド２の精製時のＨＰＬＣ像を、また図４に純度確認
時のＨＰＬＣ像を例示した。また得られた合成ペプチド
の純度（合成収率）を算出し、表７に示した。

【表７】それぞれの純度（収率）はペプチド１が９８．８%（６
８．４%）、ペプチド２が９９．１%（５６．６%）、ペ
プチド３が９４．７%（５１．１%）、ペプチド４が９
５．８%（４６．３%）、そしてペプチド５が９８．３%
（４３．１%）であり、いずれのペプチドでもほぼ満足
する結果が得られた。

【００２５】また得られた合成ペプチドについて、アミ
ノ酸シークエンサー（ＡＢＩ社製４７３Ａ型）を用いて
目的のペプチドが合成できているかどうかを確認した。
結果の一部を図４に示した。ペプチド２のアミノ酸配列
は図５に示したようにＮ末端側より、Met-Ala-Asp-Phe-
Val-Gln-Thr-Arg-Ala-Ala-Ser-Ile-Leuとなり目的のペ
プチドであることを確認した。他のペプチドついても同
じように分析し、それぞれ目的とするペプチドが合成さ
れていることを確認した。このようにＬＴＰのドメイン
ペプチドをペプチドシンセサイザーを用いて合成後ＨＰ
ＬＣで精製した結果、高収率で純度の高いペプチドが得
られた。

【００２６】２．モノクローナル抗体の作製１で合成したペプチドを免疫原とし、ＬＴＰに対するモ
ノクローナル抗体を作製した。免疫法としては、in vit
ro免疫法（文献９）およびin vivo免疫法（文献１０、
１１）を用いた。

【００２７】in vitro免疫法の操作は次のとおりであ
る。まずＢａｌｂ／Ｃマウス（４週令、雌）の胸腺を無
菌的に摘出し、１０%ＦＢＳ／ＲＰＭＩを加えて細切
後、ステンレスメッシュに通して胸腺細胞を採集した。
これをＲＰＭＩで２回洗浄後、リンホサイト培養液中で
７日間炭酸ガス培養した。リンホサイト培養液は、ＲＰ
ＭＩに対して５０μMの２ＭＥ、２mMのグルタミン、１m
Mのピルビン酸ナトリウム、１００U/mlのペニシリン、
１００μg/mlのストレプトマイシンを加えたものであ
る。次いで同じマウスの脾臓を無菌的に摘出し、赤血球
を除去後胸腺と同様の操作により脾細胞を採集した。こ
れを抗原として１００ng/mlの各合成ペプチド（ペプチ
ド１から４）、およびアジュバントとして５０μg/mlの
N-acethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamineとともに前
記胸腺培養物に加え、４日間炭酸ガス培養を行った。一
方マウスミエローマ細胞株（Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６．
５．３）は、１０%ＦＢＳ／ＲＰＭＩで培養し、２代継
代して２．０ｘ１０⁸個程度まで増殖後、細胞融合に用
いた。

【００２８】培養後の脾細胞をあらかじめ培養しておい
たマウスミエローマ細胞株と３：１に混合し、高圧蒸気
滅菌した２．０gのＰＥＧ４０００（２mlのＲＰＭＩ、
０．３mlのジメチルスルホキシドを添加）を徐々に加え
て細胞融合させた。更に１０mlのＲＰＭＩを加え１００
０rpmで５分間遠心後、上清を除去してＨＡＴ培地で１
ウエル当り５．０ｘ１０⁶個（脾細胞）となるように調
製し２００μlずつ９６穴マイクロタイタープレートに
アプライした。５日おきに培養液を交換して培養を続け
たところ、１４日後にハイブリドーマコロニーの形成を
確認した。培養上清について各合成ペプチドを用いたＥ
ＬＩＳＡ（文献９）によりスクリーニングした。なおＥ
ＬＩＳＡの操作は次のとおりである。

【００２９】ＥＬＩＳＡに用いた試薬を次に示す。ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２０、以下ＰＢＳと省略す
る）：Na₂HPO₄・H₂Oを２．９g、KH₂PO₄・2H₂Oを０．２g、
KClを０．２g、NaClを８．０g、精製水で１０００mlに
メスアップ２％ＢＳＡ／ＰＢＳ０．１%ＰＬＬ／ＰＢＳ０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（以下Ｔ−ＰＢＳと
省略する）０．２５%グルタールアルデヒド／ＰＢＳ４mMＡＢＴＳ／１００mMＰＢＳ（ｐＨ６．００）１．６mM過酸化水素／１００mMＰＢＳ（ｐＨ６．００）９６穴マイクロタイタープレート（コーニング社製）の
各ウエルに５０μlの０．１%ＰＬＬ／ＰＢＳを分注し、
４℃で一晩放置した。上清液を除去後、各合成ペプチド
（５０μg/ml）を５０μl加えて室温で４時間放置し
た。更に０．２５%グルタールアルデヒド溶液２００μl
を加えて室温下で５分間反応させた。反応後ウエル内の
溶液を除去し、２%のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を２００μl加
えて３７℃で２時間放置しブロックした。ウエル内の溶
液を除きＴ−ＰＢＳで３回洗浄後、５０μlのハイブリ
ドーマ培養上清を各ウエルに加えて３７℃で９０分間反
応させた。反応液を除去し０．０５%のＴ−ＰＢＳで５
回洗浄した後、各ウエルにＴ−ＰＢＳで１０００倍希釈
したＰＯＤ標識抗マウスＩｇ’ｓを５０μl加え３７℃
で６０分間反応させた。反応液を除去しＴ−ＰＢＳで７
回洗浄した後、４mMＡＢＴＳ／１００mMＰＢＳと１．６
mM過酸化水素／１００mMＰＢＳを等量混合した基質液を
５０μl分注して３７℃で１５分間反応させ、イムノリ
ーダー（丸善石油化学社製）で４１５nmにおける吸光度
を測定した。

【００３０】一方、in vivo免疫法ではＢａｌｂ／Ｃマ
ウス（６週令、雌）の皮下に抗原エマルジョン（フロイ
ント完全アジュバント１００μlに５０μg/mlの各合成
ペプチドを等量混合）を０．２５ml投与した。３週間後
に同じエマルジョン０．２５mlで皮下免疫し、更に３週
間後に同じエマルジョン０．２５mlを脾臓に追加免疫し
た。追加免疫の６日後にマウス尾静脈より採血して得た
血清について、各合成ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ
により抗体価を確認した。ＥＬＩＳＡの操作は、培養上
清に代えて血清を用いる以外in vitro免疫法と同じであ
る。高い抗体価を示したマウスに対して、２回目の追加
免疫の３週間後に各合成ペプチドの５０μg/１００μl
溶液を脾臓に投与し最終免疫した。最終免疫から５日後
に脾臓を摘出し、in vitro免疫法と同様に細胞融合させ
た。ハイブリドーマコロニーを形成したウエルの培養上
清について、順次合成ペプチドを抗原としてスクリーニ
ングした。

【００３１】３．抗体のスクリーニング２で得られたハイブリドーマの培養上清について、対応
する合成ペプチドに対する反応性をもとに抗体のスクリ
ーニングを行った。スクリーニングは２で述べたＥＬＩ
ＳＡと同じ操作で行った。in vitro免疫法で作製したハ
イブリドーマでは、ペプチド３および５に対する抗体価
がペプチド２および４に比べて高く、また比較的安定し
た継代能力を有していたので、これらについては一次ク
ローニングを行った。さらに同様にして得られたペプチ
ド２およびペプチド４についてもハイブリドーマを作製
後、一次クローニングを試みた。in vivo免疫法で得ら
れたそれぞれのモノクローナル抗体についても、対応す
る抗原ペプチドによりin vitroで行った方法と同じＥＬ
ＩＳＡを行ってスクリーニングを行った。このようなス
クリーニングにより、表８に示すような、ＬＴＰに対す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ・クロ
ーンを確立した。

【００３２】表８のクローン中、最も高い抗体価を示し
たものについては表９にその測定値を示した。モノクロ
ーナル抗体の抗体価はスクリーニングと同じＥＬＩＳＡ
によって確認し、表中の数値は４１５nmにおける吸光度
を示す。また抗血清の抗体価は、マウス尾静脈採血した
血清の希釈系列を試料とし発色が確認された最大希釈倍
率を示す。

【表８】

【表９】

【００３３】以上のように、５種類の本発明ペプチドに
対するモノクローナル抗体を作製した結果、それぞれin
vitro系およびin vivo系共に目的のモノクローナル抗
体が得られ、その抗体価も免疫測定法を確立する上で十
分なことが確認された。

【００３４】４．ＬＴＰの免疫学的検定法３で得たモノクローナル抗体を用い、ＬＴＰのＥＬＩＳ
Ａによる免疫学的検定法を試みた。モノクローナル抗体
としては、２Ａ４（ペプチド１）、３Ａ６（ペプチド
２）、３Ｃ１２（ペプチド３）、１Ｆ８（ペプチド
４）、２Ｃ７（ペプチド５）を用いた。各モノクローナ
ル抗体は、ハイブリドーマの培養上清を飽和硫酸アンモ
ニウムで塩析後、ＰＢＳに溶解して脱塩カラム（バイオ
ラッド社製、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ）に通し、ＰＢＳで１
０００倍に希釈して用いた。具体的な操作は次のとおり
である。９６穴マイクロタイタープレートの各ウエル
に、５０μlの０．１%ＰＬＬ／ＰＢＳを分注し４℃で一
晩放置した。ＰＬＬ溶液を除去してＴ−ＰＢＳで３回洗
浄し、サンプル血清を等量のＰＢＳで希釈して５０μl
分注した。室温で２時間放置後、２００μlの０．２５%
グルタールアルデヒド／ＰＢＳを加えて５分間静置し、
反応液を除去してＴ−ＰＢＳで３回洗浄した。次いで各
ウエルに２００μlの２%ＢＳＡ／ＰＢＳを分注し、３７
℃で２時間放置した。この操作によって血清中のＬＴＰ
は、非特異的にウエル内壁に捕捉される。サンプル血清
としては、高脂血症患者の血清１２検体（ＨＤＬコレス
テロール値１４−２１mg/dl）を用いた。上清を除去し
Ｔ−ＰＢＳで１０００倍に希釈した各モノクローナル抗
体５０μlを加え、３７℃で９０分間反応させた。反応
後、上清を除去してＴ−ＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳで
１０００倍に希釈したＰＯＤ標識抗Ｉｇ’ｓを５０μl
加えて３７℃で４５分間反応させた。以上の操作によっ
て、ウエル内壁にはＰＬＬ：ＬＴＰ：モノクローナル抗
体：ＰＯＤ標識抗体という構成の複合体が形成される。
反応後、上清を除去してＴ−ＰＢＳで７回洗浄し、２と
同じ基質液を５０μl分注して３７℃、１５分間の反応
後４１５nmにおける吸光度をイムノリーダーで測定し
た。結果は表１０に示すとおりである。本発明によるモ
ノクローナル抗体が、ＬＴＰの免疫学的検定法に利用し
うることが確認された。また表には示していないが、健
常者の血清ではいずれのモノクローナル抗体も前記１２
検体よりも低い吸光度であった。

【表１０】

【００３５】５．ＬＴＰの免疫学的検定法２本発明によるＬＴＰの免疫学的検定法の直線性を調査し
た。試料としては高脂血症患者血清（ＨＤＬ−Ｃ高値血
清）を用い、検定原理は２種のモノクローナル抗体によ
るサンドイッチ法を採用した。２Ａ４（ペプチド１）
と、１Ｆ８（ペプチド４）の２種のモノクローナル抗体
のいずれかを固相抗体に、もう一方を標識抗体に用い
た。なお各モノクローナル抗体は、３で得たハイブリド
ーマ・クローンをＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せて腹水を得、プロテインＡカラムで精製後、透析した
ものを用いた。検定操作は次のとおりである。

【００３６】９６穴マイクロタイタープレートのウエル
に、透析後０．０５M炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０
００倍に希釈したモノクローナル抗体（２Ａ４または１
Ｆ８）５０μlを分注し、４℃で一晩放置した。溶液を
除去し、２００μlの５%ＦＢＳ−２%ＢＳＡ／Ｔ−ＰＢ
Ｓを分注して３７℃で２時間放置後、溶液を除去し０．
１%Ｔ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄して固相抗体
とした。血清試料は、同量のＴ−ＰＢＳを加え９５℃で
５分間加熱して用いた。加熱後Ｔ−ＰＢＳで限界希釈法
により希釈した試料５０μlを、各ウエル（固相抗体）
に分注し室温で２時間反応させた。反応後８００rpmで
２０分間遠心し、固相抗体とＬＴＰが十分に接触するよ
うにした。反応液を除去してＴ−ＰＢＳで１回洗浄し、
ＰＯＤ標識モノクローナル抗体（１Ｆ８または２Ａ４）
５０μlを分注した。ＰＯＤ標識モノクローナル抗体
は、前記透析後の各モノクローナル抗体をＳｕｌｆｏ−
ＳＭＣＣによりＰＯＤ標識し、精製後０．２%ＢＳＡ／
Ｔ−ＰＢＳで２５０倍に希釈したものを用いた。３７℃
で６０分間反応後、反応液を除去してＴ−ＰＢＳで５回
洗浄し２と同じ基質液を５０μl分注した。３７℃で１
５分間反応させた後、４１５nmにおける吸光度をイムノ
リーダーで読み取った。結果は図６に示すとおりであ
る。２Ａ４と１Ｆ８のいずれを固相抗体、あるいは標識
抗体とした場合にも良好な直線性を得られることが確認
された。

【００３７】引用文献：１）泉屋信夫、他；ペプチド合成の基礎と実験丸善
（１９８５）２）MilliGen Bioserch,Optical Handbook.Division of
MILLIPORE(1990) ３）C.A.Browne,H.P.J.Bennett,S.Solomon;Anal.Bioche
m.,124,201(1982) ４）木村定雄；タンパク質，ペプチドの高速液体クロマ
トグラフィー102,p127,化学同人(1984) ５）榊原俊平；生化学実験講座１タンパク質の化学IV,
p401,日本生化学会編、東京化学同人(1977) ６）相本三郎；タンパク質,ペプチドの高速液体クロマ
トグラフィーII,p173,化学同人(1990) ７）P.Matsudaira.;J.Biol.Chem.,262.10035(1987) ８）岩沢明彦、他；一次構造（新基礎生化学実験法
４）,p61,丸善(1989) ９）R.L.Pardue,et al;J.Cell.Biol.,96.1149(1983) １０）D.M.Weir;Handbook of Experimentalimmunology,
3rd ed.Blackwell,Oxford,(1978) １１）長宗秀明、他；化学と生物実験ライン８，単ク
ローン抗体，p69,広川(1990) １２）G.Buttin,et al;Lymphocyto hybridoma.Curr.Top
ics Microbiol.Immunol.,81,27(1976) １３）P.Tijssen;Practis and Theory of Emzyme Immun
oassays,Laboratory Techniques in Biochemistry and
Moleculer Biology Vol.15(H.R.Burdon and VanKnippen
-)

【００３８】

【発明の効果】本発明によって、ＬＴＰを特異的に認識
する複数種のモノクローナル抗体が提供される。本発明
のモノクローナル抗体はＬＴＰ分子上の様々な位置を認
識するものであり、ＬＴＰの免疫学的手法を利用した分
析の強力なツールとなる。

【００３９】本発明によって、複数種のモノクローナル
抗体をＬＴＰの免疫検定に用いることが可能となる。そ
の結果、サンドイッチ法やラテックス凝集反応法のよう
な複数のモノクローナル抗体を必要とする免疫学的検定
法が可能となる。また単にこれらの検定法を可能とする
ばかりでなく、どの抗原決定基に対するモノクローナル
抗体を選択すれば特異性や感度の点でより有利となるか
という研究を可能とするものである。

【００４０】本発明はまた、ＬＴＰの免疫原として有用
な新規なペプチドを提供するものである。本発明のペプ
チドにより、ＬＴＰに対する複数種のモノクローナル抗
体、ならびに産生ハイブリドーマの提供が可能となる。
本発明のペプチドは化学的に合成することができるの
で、血清からＬＴＰを精製することに比べ原料供給の面
で非常に有利である。また限られた範囲の抗原決定基に
対してモノクローナル抗体を作製することができるので
作業効率の向上につながるものと考えられる。

【００４１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ヒト脂質転送蛋白（ＬＴＰ）のドメインペプ
チド配列 Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile 5 10 15 Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu Asn His Glu Thr Ala 20 25

【００４２】配列番号：２配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ヒト脂質転送蛋白（ＬＴＰ）のドメインペプ
チド配列 Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser Ile Leu 5 10

【００４３】配列番号：３配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ヒト脂質転送蛋白（ＬＴＰ）のドメインペプ
チド配列 Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe His Ser Leu 5 10

【００４４】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ヒト脂質転送蛋白（ＬＴＰ）のドメインペプ
チド配列 Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn 5 10 15 Thr Asn Gln Glu Ile 20

【００４５】配列番号：５配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ヒト脂質転送蛋白（ＬＴＰ）のドメインペプ
チド

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるペプチドのアミノ酸配列
がＬＴＰ分子上でどの位置に相当しているのかを示す配
列図である。矢印でペプチドの番号を示した。

【図２】図２は、実施例１における合成ペプチドの脱保
護操作を説明するフローチャートである。

【図３】図３は、合成したペプチド２の精製時のＨＰＬ
Ｃ像である。縦軸は２２０nmにおける吸収を、横軸は溶
出時間（分）を示す。

【図４】図４は、合成したペプチド２の純度確認時のＨ
ＰＬＣ像である。縦軸は２２０nmにおける吸収を、横軸
は溶出時間（分）を示す。

【図５】図５は、合成したペプチド２のアミノ酸シーク
エンサーによる分析結果を示すグラフである。縦軸はア
ミノ酸のモル数（pM）を、横軸は反応サイクル数を示
す。

【図６】図６は、ＬＴＰの免疫検定法（サンドイッチ
法）の結果を示すグラフである。縦軸は４１５nmにおけ
る吸光度を、横軸は希釈倍数の対数値を示す。

【表６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims

【整理番号】Ｐ−０００２６９【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト脂質転送蛋白を認識するモノクローナ
ル抗体であって、次の群から選択されるアミノ酸配列を
持つペプチドの抗原決定基を認識することを特徴とする
モノクローナル抗体配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln
【請求項２】ヒト脂質転送蛋白を認識するモノクローナ
ル抗体の製造法であって、次の群から選択されるアミノ
酸配列を持つペプチドを免疫原として用いることを特徴
とするモノクローナル抗体の製造法配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln
【請求項３】ヒト脂質転送蛋白を認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマであって、次の群から
選択されるアミノ酸配列を持つペプチドの抗原決定基を
認識することを特徴とするモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln
【請求項４】ヒト脂質転送蛋白の部分ペプチドであっ
て、次の群から選択されるアミノ酸配列を持つペプチド配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln
【請求項５】ヒト脂質転送蛋白の免疫学的検定法であっ
て、次の群から選択されるアミノ酸配列を持つペプチド
の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を利用する
ことを特徴とする免疫学的検定法配列１:Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile
Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu A
sn His Glu Thr Ala 配列２:Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser
Ile Leu 配列３:Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe
His Ser Leu 配列４:Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr
Trp Gly Phe Asn Thr Asn Gln Glu Ile 配列５:Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln