JPH0617310B2

JPH0617310B2 - ヒトウロガストロンの製造方法

Info

Publication number: JPH0617310B2
Application number: JP59018965A
Authority: JP
Inventors: 俊則大橋; 良男山崎; 耕平平野; 大祐入江
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1984-02-02
Filing date: 1984-02-02
Publication date: 1994-03-09
Anticipated expiration: 2009-03-09
Also published as: JPS60161923A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒトウロガストロン（以下ヒトＵＧと略す）の
製造方法に関する。

〔発明の背景〕

ヒトＵＧは１９３９年頃から妊婦には消化性潰瘍が少な
いという臨床的観察から尿中にその存在が知られてい
た。１９７５年、エツチ・グレゴリー（Ｈ．Gregory）
は長い精製工程を経て尿中から２種類（β−型、γ−
型）のＵＧの単離に成功し、そのアミノ酸配列を決定し
た（Ｈ．Gregory；ネーチヤー（Nature）２５７巻、３
２５−３２７頁、１９７５年）。グレゴリーはこれらβ
−型及びγ−型のＵＧをそれぞれ次のように同定した。
総アミノ酸数５３及び５２（いずれも１６種のアミノ酸
からなる１本鎖ポリペプチド）、等電点４．５及び４．
３、pH８．９でのアクリルアミドゲル電気泳動のブロム
フエノールブルに対する相対移動度０．５４及び０．６
６、ろ紙クロマトグラフィのＲｆ；０．５９及び０．６
５であり、γ型ＵＧはβ型ＵＧのＣ末端のアルギニン残
基が欠けたものである。このＵＧはコーエン（Cohen）
らがマウスの顎下線から単離した上皮細胞成長因子
〔（Epidermal Growth Factor）；以下ＥＧＦと略
称；エス・コーエン（Ｓ．Cohen）ら；ザ・ジヤーナル
・オブ・バイオケミストリー（The Journal of Bioc
hemistry）、２３７巻、１５５５−１５６２頁、１９６
２年）〕と同一活性を有することから、人尿由来のＥＧ
Ｆと同一とみなされており、胃酸分泌抑制作用や上皮細
胞その他の細胞の成長促進作用があるので医薬品及び組
織培養に用いる添加剤として有用である。

サヴエージ（Savage）らは、マウスのＥＧＦの精製法を
応用して妊婦尿から、２種類のヒトＥＧＦを単離した
〔シー・アール・サヴエージら（Ｃ．Ｒ．Savage et
al）；アナリテイカル・バイオケミストリー（Analytic
al Biochemistry）１１１巻、１９５−２００頁、１９
８１年〕。このヒトＥＧＦは分子量約５５００で１６種
のアミノ酸４９個から成るがその配列順序、純度などは
明らかでない。

ヒトＵＧは唾液、血液、尿などの体液の他顎下腺や消化
管中にその存在が知られている。比較的多いとされる尿
中でもその含量は極めて少なく、５０〜１００μｇ／
程度に過ぎず経済的に回収するのは困難である。ヒト尿
中のヒトＵＧを回収する方法として酸性尿をたん白沈澱
剤で処理する方法が知られる。沈澱剤として安息香酸
〔エンドクリノロジー（Endocrinology）３０巻、１２
９頁（１９４２年）〕、タンニン酸〔ホツペーザイラー
ズ・ツアイトシュリフト・フュア・フィジオロジツシエ
・ヒエミー（Hoppe−Seyler′ｓＺ．Physiol．Che
m.）３５６巻、１７６５頁（１９７５年）〕等が用いら
れる。これらは、タン白一般の沈澱法でヒトＵＧ特異性
に欠ける。その他イオン交換樹脂による吸着法〔ジヤー
ナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド
・メタボリズム（Journal of Clinical Endocrinolo
gy and Metabolism）４８巻６６７頁（１９７９
年）〕も知られている。

これらを更に精製する方法として、グレゴリーは有機溶
媒による分別抽出法、イオン交換法、ゲルろ過等の１１
工程をくり返し、又、サヴエージらはイオン交換法およ
びゲルろ過法を組みあわせて５工程まで短縮して精製し
た。

しかし、以上の方法で得られる胃酸分泌抑制物質は純度
及び収率の点で十分なものとは言い難い。

〔発明の目的〕

本発明はこのような問題点を解決し高精度のヒトＵＧを
収率よく得るために有用であり、他の工程とも組合せる
ことのできる精製工程を提供するものである。

〔発明の構成〕

すなわち、本発明は、下記の１．〜６．に関する。

１．pHが中性でアセトニトリルを１８〜２８容量％含む
水溶液を溶出液とし、逆相分配型液体クロマトグラフィ
ーにより、ヒトウロガストロンを含有する試料から、ヒ
トウロガストロンを多成分に分別し、それぞれを採取す
るヒトウロガストロンの製造方法。

２．逆相分配型液体クロマトグラフィーのカラム剤とし
て疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルを使用する上
記１．のヒトウロガストロンの製造方法。

３．ヒトウロガストロンを含有する試料がヒト尿を由来
とするものである上記１．のヒトウロガストロンの製造
方法。

４．ヒトウロガストロンを含有する試料につき、 (1)pHが中性で、アセトニトリルを１８〜２８容量％含
む水溶液を溶出液として、逆相分配型液体クロマトグラ
フィーにかける工程；及び (2)pHが酸性でアセトニトリルを１８〜２８容量％含む
水溶液を溶出液として、逆相分配型液体クロマトグラフ
ィーにかける工程；の両工程を組み合せて行い、すなわち、工程(1)次いで工程(2)の順に、あるいは、工程(2)次い
で工程(2)の順に行って、ヒトウロガストロンを多成分
に分別し、それぞれを採取するヒトウロガストロンの製
造方法。

５．逆相分配型液体クロマトグラフィーのカラム剤とし
て疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルを使用する上
記４．のヒトウロガストロンの製造方法。

６．ヒトウロガストロンを含有する試料がヒト尿を由来
とするものである上記４．のヒトウロガストロンの製造
方法。

本発明において、ヒトＵＧを含有する試料とは、尿その
もの、尿をセライトろ過したろ液、ヒトＵＧを産生する
組織もしくは細胞からの抽出液、該組織もしくは細胞の
培養液、遺伝子組換えによりヒトＵＧを生産するように
なった細菌もしくは酵母からの抽出液、該細菌もしくは
酵母の培養液、等々から、通常、例えば下記(1)〜(9)に
示すような種々の方法、部分精製したヒトＵＧを含有す
る液のことである。ただし、これらの部分精製をしなく
とも、上記抽出液等に含まれる不純物・妨害物質が少量
である場合は、これらを省略してもよい。

(1)弱酸性吸着剤（ポリアクリル酸系イオン交換樹脂、
ポリメタクリル酸系イオン交換樹脂等）を使用し、吸着
条件として上記試料を酢酸、蟻酸、塩酸等の酸によりpH
３〜４にして吸着させた後、pH３〜５の弱酸性下で洗浄
し、水酸化アンモニウム等により弱アルカリ性にて溶出
させてヒトＵＧを含有する試料としたもの（吸着−溶出
法）。

(2)中性合成吸着剤である巨大網状ポリマー（スチレン
−ジビニルベンゼン系共重合体、アクリル酸エステル系
重合体、メタクリル酸エステル系重合体等）を吸着剤と
し、上記試料そのもの、pH３〜８の間で緩衝化させた上
記試料又は食塩、硫酸ナトリウム等の塩を添加した上記
試料を用いて吸着させた後、水溶性有機溶剤（例えば、
メタノール、アセトニトリル、ｎ−プロパノール等）を
含む水溶液で溶出させてＵＧを含有する試料としたもの
（吸着−溶出法）。

(3)上記試料をセライトろ過して沈渣を除去したろ液を
分画分子量３万の限外ろ過を行ない、そのろ液をさらに
分画分子量１０００の限外ろ過で濃縮して得られたヒト
ＵＧ分画（限外ろ過法）。

(4)上記(1)，(2)及び(3)の工程のうち二工程以上を組合
せて部分精製して得られたヒトＵＧ分画。

(5)上記(1)，(2)，(3)又は(4)で得られた部分精製物を
ゲルろ過（担体として、架橋デキストランゲル、架橋ポ
リアクリルアミドゲル等の親水性ゲルが好ましい）で、
好ましくは０．０２Ｍ以上でpH５〜９の緩衝液（酢酸緩
衝液、リン酸緩衝液等）により展開して得られたヒトＵ
Ｇ分画（ゲルろ過法）。

(6)ジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノ
エチルアガロース等の弱塩基性イオン交換樹脂をカラム
に詰めて０．０５Ｍ以下でpH５〜８．５の緩衝液（酢酸
緩衝液、リン酸緩衝液等）で平衡化したのち、上記
(1)，(2)，(3)，(4)又は(5)で得られたヒトＵＧ分画の
脱塩溶液を負荷して上記樹脂にヒトＵＧを吸着させ、上
記と同様の緩衝液を使用して塩濃度勾配法（塩として
は、塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム等が使用され
る）によって溶出させて得られたヒトＵＧ分画（陰イオ
ン交換クロマトグラフィー）。

(7)カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア
ガロース等の弱酸性イオン交換樹脂を詰めたカラムに上
記(1)，(2)，(3)，(4)又は(5)で得られたヒトＵＧ分画
の脱塩溶液を負荷し０．０１〜０．０５ＭpH３．５〜
４．０の緩衝液（たとえば酢酸緩衝液、ギ酸緩衝液等）
にて塩濃度勾配（塩としてはたとえば塩化ナトリウム、
酢酸アンモニウム等）を用いて溶出させて得られたヒト
ＵＧ分画（陰イオン交換クロマトグラフィー）。

(8)上記(1)，(2)，(3)，(4)又は(5)で得たヒトＵＧ分画
を塩酸等で酸性（pH１〜２）としたのち塩酸等で酸性
（pH１〜２）にして平衡化させた架橋ポリアクリルアミ
ドゲルに負荷し展開させて得られたヒトＵＧ分画（吸着
型クロマトグラフィー）。

(9)上記(1)，(2)，(3)，(4)又は(5)で得たヒトＵＧ分画
の脱塩溶液を上記(6)，(7)および(8)の工程のうち二工
程以上を組合わせて部分精製して得られたヒトＵＧ分
画。

本発明の逆相分配型液体クロマトグラフィーにおいて用
いられる逆相分配型カラムに充填するカラム剤として
は、多孔性のスチレン・ジビニルベンゼン共重合体粒
子、架橋化されたアクリル酸エステル重合体粒子、架橋
化されたメタクリル酸エステル重合体粒子、多孔性シリ
カゲルに疎水性官能基を化学結合したもの等が使用でき
る。特に、疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルが、
分離能及び回収率の点ですぐれている。シリカゲルに導
入される疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、プ
ロピル基、オクチル基、オクタデシル基等のアルキル
基、シアノプロピル基、フエニル基などが例示され、こ
れらはシリカゲルに対して炭素含量で８〜２０重量％含
まれているのが好ましい。細孔の孔径としては６０Å〜
３００Åに孔径を有するものが好ましい。又粒径として
は小さいものが望ましいが実用上５〜７０μｍ程度が良
い。

本発明の逆相分配型液体クロマトグラフィーは、先ず、
試料を有機溶剤を含まない水溶液としてこれをカラムに
負荷してヒトＵＧを樹脂に吸着させたのち溶出液で溶出
させる。ヒトＵＧの溶出液としてはアセトニトリルを含
む水溶液と、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸、トリフルオロ
酢酸、メチル硫酸等の酸またはこれらの酸とアンモニ
ア、苛性ソーダ等のアルカリの塩を混合して得られるpH
１．５〜７の範囲の緩衝液が用いられる。

ここで、上記溶出液のアセトニトリルの濃度は、溶出に
適するように１８〜２８容量％に調整しなければならな
い。

本発明で、アセトニトリルを１８〜２８容量％含む水溶
液とは、１８〜２８容量％の範囲の一定濃度のアセトニ
トリルを含む水溶液であるか、あるいは、ヒトＵＧが溶
出される時の溶出液のアセトニトリル濃度が、１８〜２
８容量％の範囲の濃度となるように設定されたアセトニ
トリル濃度勾配液を意味する。

前者の、１８〜２８容量％の範囲の一定濃度のアセトニ
トリルを含む水溶液である場合の更に好ましいアセトニ
トリル濃度は２０〜２５容量％の範囲である。アセトニ
トリルの濃度が１８容量％未満では、ヒトＵＧは全く溶
出されないか、又は溶出時間が長くなり、２８容量％を
越えると、溶出先端付近に溶出され、精製効果が低下す
る。

後者の、ヒトＵＧが溶出される時の溶出液のアセトニト
リル濃度が、１８〜２８容量％の範囲の濃度となるよう
に設定されたアセトニトリル濃度勾配液である場合は、
溶出液のアセトニトリルの初期濃度を０〜１６容量％と
し、最終濃度を２０〜３０容量％とするとよい。なお、
アセトニトリルの最終濃度は３０容量％を越えても差し
支えない。アセトニトリル濃度勾配液のアセトニトリル
濃度が、１８〜２８容量％、特に２０〜２５容量％の時
にヒトＵＧを溶出させる。以上の溶出は、常圧下で行な
っても高圧下で行なってもよい。

本発明により得られたヒトＵＧ分画は、減圧濃縮により
有機溶媒を留去したのち、ゲルろ過法、限外ろ過法等に
より脱塩することができる。又、溶出液中の塩として酢
酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム等の揮撥性塩および
酸として揮撥性のものを用いた場合はそのまま凍結乾燥
により、塩を含まない乾燥品が得られる。

本発明に係る工程の後、さらに必要に応じて、上記(1)
〜(8)の工程を適宜適用しても良く、本発明に係る工程
を二度以上繰返えしてもよい。

本発明に係る工程は、前記(4)，(5)，(6)又は(8)の工程
と組みあわせるのが好ましい。この場合、本発明の逆相
分配型クロマトグラフィーにおいて、カラム剤としてオ
クタデシル化シリカゲルを用い溶出液としては中性（た
とえば、酢酸アンモニウム、pH７）でアセトニトリル濃
度２０〜２５容量％のものを使用すると尿中のヒトＵＧ
は、まず３種類に分離される。これらをそれぞれ溶出順
にＵＧ−１，ＵＧ−２，ＵＧ−３とする。これらをさら
に本発明の逆相クロマトグラフィーとして、酸性（たと
えば、上記溶出液に酢酸を０．５容量％加える）で行う
とＵＧ−１は溶出順にＵＧ−１−１とＵＧ−１−２の２
種類に、ＵＧ−２はＵＧ−２−１とＵＧ−２−２の２種
類に、並びにＵＧ−３は、溶出順にＵＧ−３−１、ＵＧ
−３−２およびＵＧ−３−３の３種類に分離される。即
ち、このような方法で計７種類の新規なヒトＵＧを分離
できる。

上記７種類のヒトＵＧのうちＵＧ−１−１及びＵＧ−２
−２の２種類を除く５種類のヒトＵＧは各々ＳＤＳ−尿
素−ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動（モノマ
ー濃度１３．８％）で分析するとき、それぞれ単一バン
ドとして認められ、その推定分子量はミオグロビン部分
加水分解物（分子量16949，14404，8159，6214，2512，
1360）の混合物を標準とした分子量マーカーを用いたと
き約６０００に位置する。又、pH勾配（pH４からpH６．
５）を有するポリアクリルアミドゲルプレートを用いた
等電点電気泳動を行うときそれぞれ異なる位置に単一バ
ンドとして認められた。表面電極を用いて測定したこれ
らの等電点は、ＵＧ−１−２は４．４５、ＵＧ−２−１
は４．４０、ＵＧ−３−１は４．６５、ＵＧ−３−２は
４．６０およびＵＧ−３−３は４．４５である。これら
各各をイヌにヒスタミン刺激を１５分毎に与えた後ヒト
ＵＧで０．２５μｇ／kg静脈注射により投与したとこ
ろ、ヒトＵＧ投与前１時間の胃酸分泌量の総量に対し
て、ヒトＵＧ投与後１時間の胃酸分泌量の総量は５０％
以下であつた。

本発明において、ヒトＵＧ分画の確認は、マウスの顎下
線から得たマウスＥＧＦがマウス肝細胞膜上のＥＧＦレ
セプターに対してヒトＵＧと競争的に結合する性質を利
用して測定される。すなわち、ヒトＵＧ又はヒトＵＧを
含む試料、ＥＧＦレセプター及び放射性ヨウ素で標識し
たマウスＥＧＦを水溶液中で混合して反応させ、ＥＧＦ
レセプターとマウスＥＧＦ又はヒトＵＧとの結合物を生
成させ、これを分離して、その放射活性を測定し、検量
線に照らし、ヒトＵＧ濃度を決定する〔以下、この方法
を、ラジオレセプターアツセイ（ＲＲＡと略す）とい
う〕。

（実施例）次に、ヒトＵＧを含む試料の調製剤、次いで、実施例を
示す。なお、以下において、ヒトＵＧ量は、上記ＲＲＡ
法により求めたものであり、比活性は、２８０ｎｍの吸
光度と試料の液量（ml）の積あたりのヒトＵＧ量であ
る。

参考例１男子尿３kl（ヒトＵＧ量１６０mg、比活性１．６×１０
^−３）に４Ｎ塩酸を加えてpH３．０に調整した。これを
予め４Ｎ塩酸でカルボン酸型にしたアクリル酸型カチオ
ン交換樹脂（ＷＫ−２０、三菱化成工業（株）商品名）
を充てんしたカラム（４０）に流速２００／時間で
流した。次いで、カラムを水１００で洗浄し、１００
の酢酸アンモニウム緩衝液（塩化ナトリウム５０kg、
酢酸アンモニウム７．７kgおよびアンモニア水１５．５
に水を加えて１００としたもの）、次いで４８の
４Ｎ苛性ソーダ溶液、更に９０の水で溶出した。溶出
後のpHは溶出時間と共に増大する。このうち、溶出後の
pHが１１以下の分画を集めた。この溶出液中のヒトＵＧ
は６０．４mg（回収率３８％、比活性０．０５）であつ
た。

参考例２参考例１で得た溶出液の２０（pH４．５に調整）にメ
タクリレート系中性吸着樹脂（ＨＰ２０：三菱化成工業
（株）商品名）８００mlを加えて２時間攪拌してヒトＵ
Ｇを吸着、次いで塩酸−メタノール混合液（６Ｎ塩酸：
メタノール＝１：１２．５、容量比）８で溶出した。
これを中和後、減圧濃縮して５００mlとし架橋デキスト
ランゲル（セフアデツクスＧ−２５、フマルマシア・フ
アインケミカル・ＡＢ商品名）に負荷し、０．０１Ｍ酢
酸アンモニウムで展開して塩を含まない部分を採取し
た。次いでpH５．３の０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で
平衡化したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロー
ス（ＤＥ−３２、ワツトマン・ケミカルセパレーシヨン
社商品名）カラムに吸着させた。０．０１Ｍ酢酸アンモ
ニウム液で洗浄後、０．３Ｍ酢酸アンモニウム液で溶出
した。この溶出液中のＵＧ量は１４．４mg（回収率３８
％、比活性１．２）であつた。

参考例３参考例２で得た溶出液を限外ろ過（分画分子量１００
０）により脱塩し、６０mlまで濃縮した後、架橋デキス
トランゲル（セフアデツクスＧ−５０、フアルマシア・
フアイン・ケミカル・ＡＢ商品名）でゲルろ過した。展
開液は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で展開し、ＲＲＡ
活性分画を採取した。この溶出液中のヒトＵＧ量は１０
mg（回収率７０％、比活性５．６）であつた。

参考例４この参考例では、参考例３で得られたヒトＵＧを含む溶
出液をオクタデシルシリル化シリカゲルを充填したカラ
ムを装置した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
で精製した例を示す。

参考例３で得られた溶出液をヒトＵＧ量で１．０mgの量
でオクデシルシリル化シリカゲル（リクロゾルブＲＰ−
１８、メルク社商品名、炭素含量１９．８容量％）を充
填したカラム（８mmφ×２５０mm）（これは、ＨＰＬＣ
装置日立６３５Ａ型、日立製作所製に装着されている）
に注入し、展開液の第１液と第２液の混合比を変化させ
て、グラジエント方式により展開した。第１液は、水と
アセトニトリルを９：１（容量比）に混合した溶液と
し、第２液は塩酸０．０１Ｍを含む０．２Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液とアセトニトリルを２：３（容量比）で混合
した溶液とした。第１液と第２液の混合は第１液１００
mlに第２液が２ml／分の割合で加わるように調整すると
共に、第１液と第２液の混合液が２ml／分の流速でカラ
ム内に送り込まれるように調整した。そのクロマトグラ
ムを第１図に示す。横軸に保持時間、縦軸に２８０ｎｍ
の吸光度を示す。ヒトＵＧは保持時間４２〜５２分の間
に溶出された。この溶出液中のヒトＵＧ量は０．７５mg
（収率７５％、比活性２６０）であつた。これをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると四バンド
が検知できた。また第１図に上記クロマトグラフィーに
おける各分画のＲＲＡ活性値を斜線棒グラフで示す。Ｒ
ＲＡ活性は４２〜４６分及び４６〜５２分の分画に現わ
れ、他の分画には現われなかつた。

上記保持時間４２〜５２分に溶出された溶出液は減圧濃
縮した後、分画分子量１０００の限外ろ過膜（ＹＭ−
２、アミコン（株）商品名）で限外ろ過して脱塩後、凍
結乾燥して、ヒトＵＧの乾燥品を得た。

参考例５参考例３で得られた溶出液をヒトＵＧ量で１．２mgとし
て、オクタデシルシリル化シリカゲルとしては炭素含有
量が２０重量％のもの（デベロジルＯＤＳ、野村化学
（株）商品名）を使用して、参考例４と同様にして溶出
した。ただし、展開液の第１液としては０．０５Ｍの酢
酸アンモニウム水溶液を、第２液にはアセトニトリル水
溶液〔水：アセトニトリル＝１：１（容量比）〕に酢酸
アンモニウム０．０５Ｍを溶解したものを用いた。第１
液と第２液の混合は第１液１００mlに第２液が２ml／分
の割合で流れるように調整すると共に、第１液と第２液
の混合物が２ml／分の流速でカラム内に送り込まれるよ
う流速を調整した。そのクロマトグラムを第２図に示し
た。ヒトＵＧは保持時間３８〜４６分に溶出された。こ
の溶出液中のヒトＵＧ量はＲＲＡ法で測定して０．９mg
（収率７５％、比活性３２）であつた。この溶出液は、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で４バンド
が検知できた。また、第２図に各分画のＲＲＡ活性値を
斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は保持時間３８〜４２
分の分画と４２〜４６分の分画に現われ、他の分画には
現われなかつた。上記保持時間が３８〜４６分の溶出液
を実施例１と同様にしてヒトＵＧ乾燥品を得た。

参考例６別に参考例３と同様の方法で得られた溶出液（比活性
７．６）をヒトＵＧ量で１９mgおよびデベロジルＯＤＳ
（野村化学（株）商品名）を充填したカラム（３６．７
mmφ×５００mm）を使用し、参考例４と同様にして、溶
出した。ただし、展開液の第１液は、０．０５Ｍ酢酸ア
ンモニウム水溶液を、第２液は、アセトニトリル水溶液
（水：アセトニトリル＝３：２、容量比）に酢酸アンモ
ニウム０．０５Ｍを溶解したものを用いた。第１液と第
２液の混合は、第１液６００mlに第２液を２５ml／分で
加わるようにし、混合液が流速２５ml／分でカラムに流
入するようにした。この結果、得られたクロマドグラム
を第３図に示す。ヒトＵＧは保持時間２５〜４５分に溶
出され、このうち、保持時間３０〜４０分の分画を採取
した。この溶出液中のＵＧ量は１６．９mg（収率８９
％、比活性８０）であつた。これをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけると３バンドを検知した。
また、第３図に、各分画のＲＲＡ活性値を斜線棒グラフ
で示す。ＲＲＡ活性は、保持時間２５〜３０分、３０〜
３５分、３５〜４０分および４０〜４５分に現われ、他
の分画には現われなかつた。

実施例１この実施例では参考例６で得られた保持時間３０〜４０
分の溶出液をさらに精製し、三種のＵＧを分離した。

参考例６で得られた溶出液をＵＧ量で２．５mgデベロジ
ルＯＤＳ（野村化学（株）商品名）を充填したカラム
（２０mmφ×５００mm、日立６３５Ａ型に装置）に注入
し、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むアセトニトリル
水溶液（アセトニトリル：水＝１４０：５００、容積
比）を展開液として流速５ml／minで展開し、溶出し
た。このときのクロマトグラムを第４図に示す。横軸に
保持時間、縦軸に２８０ｎｍの吸光度を示す。ヒトＵＧ
は、保持時間が２６〜３０分、３４〜４２分及び４４〜
５０分に溶出した。各保持時間毎に溶出液を採取したと
ころ、ＵＧの比活性は、溶出順に１２００，１７５０，
２２００であり、ヒトＵＧ量は溶出順に１：１：２の割
合で、これらの総ＵＧ量は、２．０mgであつた。また、
第４図に各分画のＲＲＡ活性値を斜線棒グラフで示す。
ＲＲＡ活性は、保持時間２６〜２８分、２８〜３０分、
３０〜３２分、３４〜３６分、３６分〜３８分、３８〜
４０分、４４〜４６分、４６〜４８分及び４８〜５０分
の分画に現われ、他の分画には現われなかつた。

上記三種の溶出液は、それぞれ減圧濃縮した後、凍結乾
燥し、得られた乾燥品を生理食塩水に溶解した。これら
の溶液をインタクト・フィスチユーラ犬に、それぞれ犬
の体重１kg当り、ヒトＵＧ量で０．２５μｇ静脈内注射
したとき、いずれも同等の胃酸分泌抑制効果を示した。

実施例２別に参考例３と同様の方法により得られた溶出液（比活
性４．３）をヒトＵＧ量で１２．３mg及びデベロジルＯ
ＤＳ（野村化学（株）商品名）を充填したカラム（３
６．７mmφ×５００mm）を使用し、参考例４と同様にし
て溶出した。ただし、展開液の第１液には酢酸アンモニ
ウム０．０５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（水：アセ
トニトリル＝５：１、容量比）、第２液には、酢酸アン
モニウム０．０５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（水：
アセトニトリル＝５：１．６、容量比）を用いた。第２
液は第１液１００mlに２５ml／分で流入すると共に、第
１液と第２液の混合液はカラムに２５ml／分で流入する
ようにした。この結果、得られたクロマトグラムを第５
図に示す。

ＲＲＡ法で各溶出分画を測定すると三つの活性分画が現
われ、各分画のヒトＵＧには、それぞれ胃酸分泌抑制作
用が認められた。該活性分画はそれぞれ、保持時間が４
８〜５２分、５４〜６２分及び６２〜６８分に溶出し、
これらの総ヒトＵＧ量は１０．５mg、それぞれの分画の
ヒトＵＧ量は、溶出順に２．４mg、１．９mg及び６．２
mgであり、各ヒトＵＧの比活性は溶出順に１３０，２４
０及び２９０であつた。各分画を減圧濃縮し、凍結乾燥
して乾燥品を得、上記溶出順にＵＧ−１，ＵＧ−２及び
ＵＧ−３とした。ＳＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（モノマー濃度１３．８％、標準物質：ミオ
グロビン部分加水分解物で分子量が16949，14404，815
9，6214，2512及び1360の混合物）によるとＵＧ−１に
ついては、分子量約６０００と約７４００のニバンド、
ＵＧ−２については、分子量約６０００と約7000の二バ
ンド及びＵＧ−３については、分子量約6000の一バンド
が検出された。

これらのＵＧ−１，ＵＧ−２及びＵＧ−３は、それぞ
れ、実施例１において得られた三つの溶出分画のそれぞ
れに溶出順に対応するものであつた。

第５図は、上記の溶出における各分画毎のＲＲＡ活性値
を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は４６〜４８分、４
８〜５０分、５０〜５２分、５４〜５６分、５６〜５８
分、５８〜６０分、６２〜６４分、６４〜６６分及び６
６〜６８分の分画に現われ、他の分画には現われなかつ
た。

実施例３この実施例は、実施例２で得られたＵＧ−１、ＵＧ−２
及びＵＧ−３を各々、再び逆相分配クロマトグラフィー
により精製した例を示す。

ＵＧ−１、ＵＧ−２及びＵＧ−３をＵＧ量で各各５００
μｇ及びデベロジルＯＤＳ（野村化学（株）商品名）を
充填したカラム（８mmφ×２５０mm、日立６３５Ａ型に
装置）に負荷し、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むア
セトニトリル水溶液（アセトニトリル：水＝１４０：５
００、容量比）２００mlに対し、酢酸０．１mlを添加し
たものを溶出液とし、流速１ml／分で溶出した。得られ
たクロマトグラム（横軸に保持時間、縦軸に２８０ｎｍ
吸光度）を、ＵＧ−１について第６図、ＵＧ−２につい
て第７図に示す。第６〜７図には、それぞれ、ＲＲＡ活
性値を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は、ＵＧ−１に
ついては、保持時間２６〜３０分及び４６〜５８分にＵ
Ｇ分画（ＲＲＡ活性を示す分画）が現われ、ＵＧ−２に
ついては、４８〜６０分及び６５〜７７分にＵＧ分画が
現われた。ＵＧ−３については、保持時間８０分までに
溶出されなかつた。

ＵＧ−３については、展開液として、酢酸アンモニウム
０．０５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（アセトニトリ
ル：水＝１７０：５００）２００mlに酢酸１mlを添加し
たものを使用して上記と同様に溶出した。このときのク
ロマトグラムムおよびＲＲＡ活性値を第８図に示す。こ
の結果、ＲＲＡ活性は、ＵＧ−３については、保持時間
２２〜２６分、２７〜３０分及び４９〜５５分のＵＧ分
画が現われた。ＵＧ−３については、280ｎｍの吸光度
ピークとＲＲＡ活性分画とが対応した。

ＵＧ−１について、分離されたＵＧを溶出順にＵＧ−１
−１及びＵＧ−１−２とし、ＵＧ−２について溶出順に
ＵＧ−２−１及びＵＧ−２−２とし、ＵＧ−３について
溶出順にＵＧ−３−１、ＵＧ−３−２及びＵＧ−３−３
とする。

ＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３の収量（ＵＧ量）比は、実
施例２で得られた総ＵＧ量（１０．５mg）について、順
に、０．５：４：４：０．５：８：２：２であつた。こ
のうち、ＵＧ−１−１及びＵＧ−２−２は少量であつ
た。ＵＧ−１−２、ＵＧ−２−１、ＵＧ−３−１、ＵＧ
−３−２及びＵＧ−３−３の比活性は、各々２０３０，
2200，２４５０，２３００及び２４００であり、等電点
電気泳動法による等電点は、各々、４．４５、４．４
０、４．６５、４．６０及び４．４５であつた。又ＳＤ
Ｓ−尿素−ポリアクリルアミドデイスク電気泳動によっ
て、各々単一バンドが表われ、ミオグロビン加水分解物
（分子量16949，14404，8159，6214，2512及び1360の混
合物）を標準物質としたとき、いずれも分子量は約６０
００と推定される。

上記ＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３を含む溶出液は、各々
減圧濃縮し、凍結乾燥してＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３
を得た。

試験例実施例３で得られたＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３の胃酸
分泌抑制作用を示す。

体重１３kgのビーグル犬（雄性）の幽門部から約５cm離
れた胃体部に胃瘻管を取りつけてインタクトフィスチユ
ーラ犬とし、これに、ヒスタミン４〜６μｇ／kg体重を
１５分間隔で皮下注射し、１５分間隔で胃液を胃瘻管か
ら採取した。胃液量がほぼ一定になつた時点で、ＵＧ−
１−１〜ＵＧ−３−３の各々を生理食塩水に溶解してＵ
Ｇ量で０．２５μｇ／kg体重だけ静脈内注射した。胃液
量はいずれの場合も１５〜３０分後から減少し、３０〜
６０分後に胃液量が最も少なくなつた。この結果のう
ち、ＵＧ−１−２、ＵＧ−２−１及びＵＧ−３−２につ
いて、ヒスタミン投与し胃酸分泌量の関係を示す棒グラ
フを各々第９図、第１０図及び第１１図に示す。

また、ＵＧ投与前６０〜０分の間に分泌された胃酸分泌
量(A)に対するＵＧ投与後３０〜９０分の間に抑制され
た胃酸分泌量(B)の割合［胃酸分泌抑制率：（Ｂ／Ａ）
×１００％］を表１に示す。

（発明の効果）以上より明らかなように本発明に係る工程により、ヒト
ＵＧを含む試料から高収量、高比活性でヒトＵＧを得る
ことができ、７種の新規なＵＧ量を採取することもでき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例４におけるグロマトグラフイーの結果を
示すクロマトグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第２図は
参考例５におけるクロマトグラフイーの結果を示すクロ
マトグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第３図は参考例６
におけるクロマトグラフイーの結果を示すクロマトグラ
ム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第４図は実施例１における
グロマトグラフイーの結果を示すクロマトグラム及びＲ
ＲＡ活性棒グラフ、第５図は実施例２におけるクロマト
グラフイーの結果を示すクロマトグラム及びＲＲＡ活性
棒グラフ、第６図は実施例３におけるＵＧ−１に関する
クロマトグラフイーの結果を示すクロマトグラム及びＲ
ＲＡ活性棒グラフ、第７図は実施例３におけるＵＧ−２
に関するクロマトグラフイーの結果を示すクロマトグラ
ム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第８図は実施例３における
ＵＧ−３に関するクロマトグラフイーの結果を示すクロ
マトグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第９図は試験例に
おけるＵＧ−１−２に関する胃酸分泌を示す棒グラフ、
第１０図は試験例におけるＵＧ−２−１に関する胃酸分
泌を示す棒グラフ及び第１１図は試験例におけるＵＧ−
３−２に関する胃酸分泌を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者平野耕平茨城県日立市東町４丁目13番１号日立化成工業株式会社茨城研究所内 (72)発明者入江大祐茨城県日立市東町４丁目13番１号日立化成工業株式会社茨城研究所内 (56)参考文献「蛋白質核酸酵素」Ｖｏｌ．27，Ｎｏ．７，Ｐ．1056〜1068（1982）共立出版株式会社発行

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】pHが中性でアセトニトリルを１８〜２８容
量％含む水溶液を溶出液とし、逆相分配型液体クロマト
グラフィーにより、ヒトウロガストロンを含有する試料
から、ヒトウロガストロンを多成分に分別し、それぞれ
を採取するヒトウロガストロンの製造方法。
【請求項２】逆相分配型液体クロマトグラフィーのカラ
ム剤として疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルを使
用する特許請求の範囲第１項記載のヒトウロガストロン
の製造方法。
【請求項３】ヒトウロガストロンを含有する試料がヒト
尿を由来とするものである特許請求の範囲第１項記載の
ヒトウロガストロンの製造方法。
【請求項４】ヒトウロガストロンを含有する試料につ
き、 (1)pHが中性で、アセトニトリルを１８〜２８容量％含
む水溶液を溶出液として、逆相分配型液体クロマトグラ
フィーにかける工程；及び (2)pHが酸性でアセトニトリルを１８〜２８容量％含む
水溶液を溶出液として、逆相分配型液体クロマトグラフ
ィーにかける工程；の両工程を組み合わせ、ヒトウロガストロンを多成分に
分別し、それぞれを採取するヒトウロガストロンの製造
方法。
【請求項５】逆相分配型液体クロマトグラフィーのカラ
ム剤として疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルを使
用する特許請求の範囲第４項記載のヒトウロガストロン
の製造方法。
【請求項６】ヒトウロガストロンを含有する試料がヒト
尿を由来とするものである特許請求の範囲第４項記載の
ヒトウロガストロンの製造方法。