JPH0618412A

JPH0618412A - 走査型屈折率顕微鏡

Info

Publication number: JPH0618412A
Application number: JP17544692A
Authority: JP
Inventors: Toshihito Kimura; 俊仁木村
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1992-07-02
Filing date: 1992-07-02
Publication date: 1994-01-25

Abstract

(57)【要約】【目的】試料の透過率や反射率の影響を排除して、そ
の屈折率分布を正しく可視化できる走査型顕微鏡を得
る。【構成】試料23からの透過光11’を集光レンズ27で点
像Ｑに結像させ、この結像位置近辺に配したピンホール
板28を介して光検出器29により透過光11’の光量を検出
する。またピンホール板28および光検出器29をピエゾ素
子51により光軸方向（ｚ方向）に移動させ、この移動に
ともなって変化する各画素毎の光量データＩが最大値を
取るときのピンホール板28の位置を、コンピュータ55に
より各画素毎に求める。そしてコンピュータ55により、
上記ピンホール板28の位置から所定式に基づいて各画素
毎の試料屈折率を演算する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は走査型顕微鏡、特に詳細
には、試料の屈折率分布を可視化する走査型屈折率顕微
鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、照明光を微小な光点に収束さ
せ、この光点を試料上において２次元的に走査させ、そ
の際該試料を透過した光あるいはそこで反射した光、さ
らには試料から発せられた蛍光を光検出器で検出して、
試料の拡大像を担持する電気信号を得るようにした光学
式走査型顕微鏡が公知となっている。

【０００３】この光学式走査型顕微鏡は基本的に、試料
が載置される試料台と、照明光を発する光源と、この照
明光を試料上において微小な光点として結像させる送光
光学系と、上記試料からの光束（透過光、反射光あるい
は蛍光）を集光して点像に結像させる受光光学系と、こ
の点像を検出する光検出器と、上記光点を試料上におい
て２次元的に走査させる走査手段とから構成されるもの
である。なお特開昭62-217218 号公報には、この光学式
走査型顕微鏡の一例が示されている。

【０００４】一方従来より、透明な物体の屈折率分布を
観察するための顕微鏡の一つとして、位相差顕微鏡が提
供されている。この位相差顕微鏡は基本的に、試料をは
さんで互いに反対側に配されたλ／４板等の位相板とリ
ング絞りとを有し、試料で回折した照明光と、試料を透
過あるいはそこで反射した非回折照明光の一方のみに位
相遅れを与えた上で干渉させ、それにより、試料の屈折
率分布を明暗に変換するようにしたものである。また、
特開平4-156507号公報に示されるように、走査型の位相
差顕微鏡も既に提案されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述のような
位相差顕微鏡においては、試料からの透過光あるいは反
射光の光量が、試料の屈折率とは別にその透過率あるい
は反射率によっても変化してしまうので、試料の純粋な
屈折率分布を正しく観察できないことも有り得る。

【０００６】本発明は上記のような事情に鑑みてなされ
たものであり、試料の屈折率分布を正確に可視像化でき
る走査型屈折率顕微鏡を提供することを目的とするもの
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明による走査型屈折
率顕微鏡は、前述のような試料台と、光源と、送光光学
系と、光点の２次元走査手段と、試料からの透過光を点
像に結像させる受光光学系と、上記点像を検出する光検
出器とからなる走査型顕微鏡において、上記点像の結像
位置近辺に配された絞りと、上記光検出器の出力信号を
画素分割して、試料上の各画素毎の光量信号を得る手段
と、上記絞りを光軸方向に移動させる手段と、この絞り
の移動にともなって変化する各画素毎の光量信号が最大
値を取るときの絞り位置を、各画素毎に求める絞り位置
検出手段と、この絞り位置検出手段が求めた絞り位置に
基づいて各画素毎の試料屈折率を求める演算手段とが設
けられてなるものである。

【０００８】

【作用および発明の効果】一例として、図５に示す系を
考える。この系において照明光11は、送光光学系の一部
を構成する対物レンズ17の作用で試料23中で光点Ｐに収
束する。試料23を透過した透過光11’は、受光光学系を
構成する対物レンズ19および集光レンズ27により、点像
Ｑに結像せしめられる。そしてこの点像Ｑの光量が、絞
りとしてのピンホール板28を介して光検出器29によって
検出される。

【０００９】ここで、光点Ｐが照射する部分の試料23の
屈折率がｎ₀のとき、透過光11’は同図(1) に示すよう
に対物レンズ19から平行光状態で出射するものとする。
この場合は、ピンホール板28が図中Ｆ₃’の位置つまり
集光レンズ27の後側焦点にあるとき、光検出器29の検出
光量が最大となる。次に光点Ｐの部分の試料23の屈折率
が上記ｎ₀と異なるｎ₁であるとき、透過光11’の光路
が同図(2) のように変化したとする。この場合は、点像
Ｑが上記後側焦点Ｆ₃’からｚ₃’離れた位置で結像す
るので、この位置にピンホール板28があるときに、光検
出器29の検出光量が最大となる（なお好ましくは、この
ピンホール板28と一体的に光検出器29も移動させる）。
ここで上記の距離ｚ₃’は、ｎ₀およびｎ₁によって定
まる関係に従って変化するので、予め基準試料を使用し
てその屈折率ｎ₀を調べておけば、このｚ₃’の量に基
づいて屈折率ｎ₁が分かることになる。

【００１０】以下、上記の関係について説明する。図５
の系の各条件を図６のように示す。すなわち、対物レン
ズ19の前側、後側の媒質の屈折率をそれぞれｎ₂、
ｎ₂’、同様に集光レンズ27の前側、後側の媒質の屈折
率をそれぞれｎ₃（＝ｎ₂’）、ｎ₃’、対物レンズ19
および集光レンズ27の焦点距離を各々ｆ₂、ｆ₃、対物
レンズ19の前側および後側焦点をそれぞれＦ₂、
Ｆ₂’、集光レンズ27の前側および後側焦点を各々Ｆ₃
およびＦ₃’、対物レンズ19の前側焦点Ｆ₂と光点Ｐと
の距離をｚ₂、また前述のように集光レンズ27の後側焦
点Ｆ₃’と点像Ｑとの距離をｚ₃’とし、そして焦点Ｆ
₂’とＦ₃との距離をＬとする。また対物レンズ19によ
る結像位置を考え、この結像位置と対物レンズ19の後側
焦点Ｆ₂’との距離をｚ₂’、この結像位置と集光レン
ズ27の前側焦点Ｆ₃との距離をｚ₃とすると、ニュート
ンの公式より、

【００１１】

【数１】

【００１２】となる。また試料23の厚さをｄとすると

【００１３】

【数２】

【００１４】であるから、上記(1) 式にこれを代入し、
また特にＬ＝０とし、そして空気中使用としてｎ₂＝ｎ
₂’＝ｎ₃＝ｎ₃’＝１とすれば、

【００１５】

【数３】

【００１６】となる。以上より、試料厚さｄと焦点距離
ｆ₂およびｆ₃が既知であれば、上記(2) 式に基づいて
距離ｚ₃’から試料屈折率ｎ₁が分かることになる。

【００１７】なおＬ＝０とすれば上述の通り好都合であ
るが、特にそのようにしなくてもよい。しかしＬ≠０の
場合は、上記(1) 式が示すｚ₂とｚ₃’との関係は概ね
図７に示すものとなり、もしｚ₂の変化範囲が例えば同
図のＷの範囲となるような場合は、ｚ₂とｚ₃’とが一
義的に対応しないことになる。これは結局、ｚ₃’と試
料屈折率ｎ₁とが一義的に対応しないことを意味する。
そのようなことを避けるためには、想定されるｚ₂の最
大絶対値をΔｚとしたとき、

【００１８】

【数４】

【００１９】を満たすようにＬを定めておけばよい。

【００２０】以上説明した通り本発明の走査型屈折率顕
微鏡は、透過光の光量そのものではなく、試料の屈折率
の違いによる透過光の結像位置変化に基づいて試料屈折
率を可視像化する構成となっているので、試料の光透過
率や反射率等の影響を受けないで、試料の純粋な屈折率
情報を得ることが可能となる。

【００２１】

【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。図１は、本発明の一実施例による共焦
点走査型屈折率顕微鏡を示すものであり、また図２はそ
のII−II線矢視図である。なおこの実施例の走査型屈折
率顕微鏡は、試料拡大像を撮像する通常の走査型顕微鏡
としても使用可能に形成されたものである。まず、通常
の走査型顕微鏡としての構成について説明する。

【００２２】図示されるように、例えばＡｒレーザ等の
単色光レーザ10からは、照明光としてのレーザビーム11
が射出される。この照明光11はレンズ12ａおよび12ｂか
らなるコリメート光学系12で平行光化され、矢印Ｘ方向
すなわち水平方向に進行し、移動台15に固定されたミラ
ー16に入射する。

【００２３】上記ミラー16は移動台15において、Ｘ方向
に対して45°の角度をなして固定されており、照明光11
は該ミラー16から真下に向かって（つまりＺ方向に）射
出する。移動台15には、上記コリメート光学系12ととも
に送光光学系を構成する対物レンズ（コンデンサーレン
ズ）17が保持されている。また移動台15には、受光光学
系の一部を構成する対物レンズ19が保持されている。上
記２つのレンズ17、19は、互いに光軸を一致させて固定
されている。また両レンズ17、19の間には、移動台15と
別体とされた試料台22が配されている。そして移動台15
には、レンズ光軸に対して45°傾斜する状態にして、ミ
ラー20が固定されている。このミラー20は、試料台22に
載置された試料23を透過した透過光11’をＸ方向（上記
とは逆向きの方向）に反射させる。

【００２４】平行光状態の照明光11は対物レンズ17によ
って集光され、試料台22に載置された試料23上（表面あ
るいは内部）で微小な光点（ビームスポット）Ｐに収束
する。試料23を透過した透過光11’の光束は対物レンズ
19によって平行光あるいはそれに近い状態とされ、一部
はミラー20を透過した後、集光レンズ24によって集光さ
れて点像Ｑ１に結像する。この点像Ｑ１の光量は、コン
フォーカルピンホール板26を介して光電子増倍管等の光
検出器25によって検出され、そこからはこの光量を示す
透過光検出信号Ｓ１が出力される。

【００２５】次に、照明光光点Ｐの２次元走査について
説明する。上記移動台15と架台36との間には、主走査用
積層ピエゾ素子37が介装されている。この積層ピエゾ素
子37はピエゾ素子駆動回路38から駆動電力を受けて駆動
し、移動台15をレンズ17、19の光軸と直交するＸ方向に
高速で往復移動させる。一方試料台22と架台36との間に
は、積層ピエゾ素子40、41が介装されている。積層ピエ
ゾ素子40はピエゾ素子駆動回路42から駆動電力を受けて
駆動し、試料台22をＹ方向に高速で往復移動させる。そ
れにより試料台22は移動台15に対して相対移動され、前
記光点Ｐが試料23上を、主走査方向Ｘと直交するＹ方向
に副走査する。以上のようにして照明光光点Ｐが試料23
上を２次元的に走査することにより、該試料23の２次元
拡大像を担持する信号Ｓ１が得られる。

【００２６】この信号Ｓ１を所定のピクセルクロックに
基づいてサンプリング、量子化した後、それをＣＲＴ表
示装置等の表示装置や、光走査記録装置等の画像再生装
置65に入力すれば、該信号Ｓ１が担持する顕微鏡像を再
生して観察可能となる。

【００２７】また、上端に上記副走査用積層ピエゾ素子
40を固定し、下端が粗動ステージ44を介して架台36に取
り付けられた積層ピエゾ素子41は、ピエゾ素子駆動回路
43から駆動電力を受けて駆動し、試料台22を保持した積
層ピエゾ素子40を、主、副走査方向Ｘ、Ｙと直交するＺ
方向、（レンズ17、19の光軸方向）に移動させる。それ
によりフォーカシング調整が可能となる。

【００２８】なおピエゾ素子駆動回路38および42には、
制御回路45から同期信号が入力され、それにより、光点
Ｐの主走査および副走査の同期が取られる。また粗動ス
テージ44は手動で、あるいは駆動手段を用いてＹ方向に
大きく移動可能であり、こうして試料台22を動かすこと
により、試料23の交換を容易に行なうことができる。

【００２９】次に、この走査型顕微鏡の屈折率顕微鏡と
しての構成について説明する。透過光11’の一部はミラ
ー20で反射して、移動台15外に出射する。この透過光1
1’は対物レンズ19とともに受光光学系を構成する集光
レンズ27によって集光されて、点像Ｑに結像する。この
点像Ｑの光量は、コンフォーカルピンホール板28を介し
て、光電子増倍管等の光検出器29によって検出され、そ
こからはこの光量を示す光量信号Ｓが出力される。

【００３０】上記ピンホール板28と光検出器29とは、一
体的に移動ステージ50に保持されている。この移動ステ
ージ50はピエゾ素子51により、ｚ方向つまり集光レンズ
27の光軸方向に移動可能となっている。また移動ステー
ジ50の変位、すなわちピンホール板28の移動位置は変位
計52によって検出され、その変位出力Ｓｚはアンプ53で
増幅されてからフィードバック制御回路54に入力され
る。なおこの変位は、集光レンズ27の後側焦点Ｆ₃’
（図５参照）とピンホール板28との距離として規定され
る。

【００３１】上記フィードバック制御回路54は、コンピ
ュータ55から入力された変位指定信号Ｍｚに応じた駆動
信号Ｍｐを出力する。この駆動信号Ｍｐはアンプ56で増
幅されてからピエゾ素子51に入力され、この駆動信号Ｍ
ｐに基づいてピエゾ素子51が駆動される。フィードバッ
ク制御回路54は、そこに入力される変位出力Ｓｚが示す
移動ステージ50の実際の変位が、上記変位指定信号Ｍｚ
が示す目標変位と一致するように駆動信号Ｍｐを制御す
る。

【００３２】次に、コンピュータ55による試料屈折率像
の構成について説明する。光検出器29が出力する光量信
号Ｓは、アンプ57で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器により
サンプリング、量子化されて、デジタルの光量データＩ
に変換される。この光量データＩはコンピュータ55に入
力される。本実施例においては一例として、主走査方向
が512 画素、副走査方向が480 画素の像が構成される。
すなわち、主走査方向第ｍ番目で副走査方向第ｎ番目の
画素についての光量データをＩ（ｍ，ｎ）と表わすと、
コンピュータ55にはＩ（１，１）、Ｉ（２，１）、Ｉ
（３，１）……Ｉ（512 ，１）、Ｉ（１，２）、Ｉ
（２，２）……Ｉ（512 ，480 ）の順で光量データが入
力される。

【００３３】そしてコンピュータ55は、主走査１ライン
分の512 の光量データＩを一時的に記憶するラインバッ
ファメモリ60と、１画像分すなわち512 ×480 の光量デ
ータＩを記憶する第１メモリ61と、同じく１画像分512
×480 の移動ステージ変位データを記憶する第２メモリ
62とを有している。

【００３４】次に、コンピュータ55による試料屈折率デ
ータの形成について、その処理の基本的な流れを示す図
３を参照して説明する。コンピュータ55はこの処理がス
タートするとまずステップＰ１において、移動ステージ
50の位置決めを行なう。この移動ステージ50は、ｚ方向
の初期位置ｚ_pから最終位置ｚ_eまで、所定の微小ピッ
チずつずらして移動されるようになっており、最初は上
記初期位置ｚ_pに位置決めされる。このコンピュータ55
による位置決め操作は、具体的には、前述の変位指定信
号Ｍｚの出力である。

【００３５】次にコンピュータ55はステップＰ２におい
て、照明光光点Ｐの主、副走査を開始させる。この走査
開始の指令は具体的には、前記制御回路45へピエゾ素子
駆動開始信号を入力する操作である。次にコンピュータ
55はステップＰ３において、第１主走査ライン分の512
画素についての各光量データＩnew を記憶させる。次に
ステップＰ４においては、前記第１メモリ61に記憶され
ている第１主走査ライン分の512 画素についての各光量
データＩold と上記新規の光量データＩnew とが、第
１、第２、第３…第512 画素の順で、共通画素について
のデータ毎に比較される。ここで第１メモリ61には当初
512 ×480 個の光量データＩold として、光量ゼロを示
すデータが格納されているので、１主走査ライン分の51
2 個の画素すべてに関して必ずＩold ＜Ｉnew となり、
処理はステップＰ５に移る。

【００３６】ステップＰ５においては、第１メモリ61に
記憶されていた各画素についての光量データＩold と入
れ替えて、それよりも大の当該画素についての新規デー
タＩnew が記憶されるとともに、そのときコンピュータ
55が指定している移動ステージ50の位置ｚが第２メモリ
62の当該画素用のアドレスに記憶される。

【００３７】次にステップＰ６においては、このステッ
プＰ６に処理が流れて来た回数ｍが512 に達したか否か
が判別され、達していなければ処理の流れはステップＰ
４に戻る。以上のようにして、第１主走査ラインに関す
る512 個の新規光量データＩnew がすべて第１メモリ61
に記憶される。

【００３８】ステップＰ６においてｍ＝512 と判別され
ると処理の流れはステップＰ７に移る。このステップＰ
７においては、このステップＰ７に処理が流れて来た回
数ｎが480 に達したか否かが判別され、達していなけれ
ば処理の流れはステップＰ３に戻る。以上のようにし
て、第１主走査ラインから第480 主走査ラインに関する
512 ×480 個の新規光量データＩnew がすべて第１メモ
リ61に記憶される。

【００３９】ステップＰ７においてｎ＝480 と判別され
ると、次にステップＰ８において、移動ステージ50の位
置ｚが最終位置ｚ_eに達したか否かが判別され、達して
いなければステップ９において移動ステージ50の位置ｚ
が最終位置ｚ_e側に所定ピッチ変更された上で、処理の
流れはステップＰ１に戻る。このようにして、移動ステ
ージ50の位置ｚを変更する毎に、上述したステップＰ１
からステップＰ７までの処理がなされる。

【００４０】そして、一度ステップ９において移動ステ
ージ50の位置ｚが変更された後は、つまり第２番目以降
の画像に関しては、ステップ４においてＩold ＜Ｉnew
ではないと判別されることも当然あり得る。その場合、
処理の流れはステップＰ６に移る。つまりこの場合は、
第１メモリ61に記憶されている光量データＩold がその
まま残される。以上の処理が、ステップＰ８においてｚ
＝ｚ_eと判別されるまでなされると、第２メモリ62に
は、512 ×480 個の各画素毎に最大光量データＩが得ら
れた際のｚ位置が記憶されることになる。

【００４１】コンピュータ55は、ステップＰ８において
ｚ＝ｚ_eと判別されると、ステップＰ10において、第２
メモリ62に蓄えられたｚ位置データに基づいて各画素毎
の試料屈折率ｎ₁を演算する。すなわち、上記の最大光
量データＩが得られるのは、図５の点像Ｑの結像位置に
ちょうどピンホール板28が位置したときであり、このと
きのｚ位置がすなわち図５のｚ₃’位置である。そこで
コンピュータ55は前述した(2) 式に基づいて、上記
ｚ₃’の値から試料屈折率ｎ₁を演算する。ここで、予
め屈折率ｎ₀が分かっている基準試料を用いて、その厚
さｄを測定するとともに、焦点距離ｆ₂およびｆ₃を測
定しておき、

【００４２】

【数５】

【００４３】とおけば、(2) 式より、

【００４４】

【数６】

【００４５】として試料23の屈折率ｎ₁が求められる。

【００４６】なお、屈折率ｎ₀およびｋは定数であるか
ら、上式のｚ₃’とｎ₁との関係は概ね図４に示すよう
なものとなる。この図から明らか通り、ｚ₃’の値に従
って屈折率ｎ₀が一義的に求められ得る。

【００４７】コンピュータ55は、以上のようにして512
×480 個の各画素毎に屈折率ｎ₁を求め、その屈折率ｎ
₁の値を濃度値に変換してなる画像データＳｎを出力す
る。この画像データＳｎを例えばＣＲＴ表示装置や光走
査記録装置等の画像再生装置65に入力すれば、屈折率分
布が濃度変化で示される試料23の拡大像を再生すること
ができる。

【００４８】なお本実施例において、照明光11は移動台
15の移動方向つまり主走査方向Ｘに進行してミラー16に
入射するので、移動台15内において照明光11は、該移動
台15のＸ方向位置にかかわらず、常に平行光状態でか
つ、そのビーム中心がレンズ17、19および24の光軸と一
致する状態に保たれる。また透過光11’もミラー20から
上記主走査方向Ｘと同じ向きに出射するので、移動台15
のＸ方向位置にかかわらず、透過光11’のビーム中心が
レンズ27の光軸と一致する状態が保たれる。

【００４９】また、照明光光点Ｐの走査方式によって
は、対物レンズ19から出射する透過光11’が平行光状態
でないとき、図５に破線で示すように、照明光光点Ｐの
走査に従って点像Ｑが移動してしまうことがある。その
ような場合には、光検出器29の前に置く絞りとしてピン
ホール板28に代えて、点像移動方向に沿って延びるスリ
ットを有するスリット板を用いればよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例による走査型屈折率顕微鏡を
示す概略側面図

【図２】図１のII−II線矢視図

【図３】上記走査型屈折率顕微鏡において試料屈折率デ
ータを形成する処理の流れを示すフローチャート

【図４】上記走査型屈折率顕微鏡における絞り位置と試
料屈折率との関係の概略を示すグラフ

【図５】上記走査型屈折率顕微鏡の光学系の要部を示す
側面図

【図６】図５の光学系における光学的条件を示すための
概略図

【図７】本発明の走査型屈折率顕微鏡における対物レン
ズの前側焦点および照明光光点間の距離と、集光レンズ
の後側焦点および点像間の距離との関係の概略を示すグ
ラフ

【符号の説明】

10 単色光レーザ 11 照明光 11’ 透過光 12 コリメート光学系 15 移動台 20 ミラー 17、19 対物レンズ 22 試料台 23 試料 24、27 集光レンズ 25、29 光検出器 26、28 コンフォーカルピンホール板（絞り） 36 架台 37、40、41 積層ピエゾ素子 38、42、43 ピエゾ素子駆動回路 45 制御回路 50 移動ステージ 51 ピエゾ素子 52 変位計 54 フィードバック制御回路 55 コンピュータ 58 Ａ／Ｄ変換器 60 ラインバッファメモリ 61 第１メモリ 62 第２メモリ 65 画像再生装置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料が載置される試料台と、照明光を発する光源と、この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
る送光光学系と、前記試料からの透過光を集光して点像に結像させる受光
光学系と、この点像の結像位置近辺に配された絞りと、この絞りを通過した前記透過光を検出する光検出器と、前記光点を試料上において２次元走査させる手段と、前記光検出器の出力信号を画素分割して、試料上の各画
素毎の光量信号を得る手段と、前記絞りを光軸方向に移動させる手段と、この絞りの移動にともなって変化する前記各画素毎の光
量信号が最大値を取るときの絞り位置を、各画素毎に求
める絞り位置検出手段と、この絞り位置検出手段が求めた絞り位置に基づいて各画
素毎の試料屈折率を求める演算手段とからなる走査型屈
折率顕微鏡。