JPH06184183A

JPH06184183A - シアリルオリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JPH06184183A
Application number: JP4354390A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Sugimoto; 守杉本
Original assignee: Mect Corp
Current assignee: Mect Corp
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1994-07-05

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】シアル酸を含有する糖鎖化合物の原料となる
シアリルオリゴ糖の製造方法の提供。【構成】燕の巣をヒドラジンで処理して遊離アミンを
得る工程、得られた遊離アミンをＮ−アセチル化する工
程、及び得られた生成物からシアリルオリゴ糖を単離す
る工程を含むことを特徴とするシアリルオリゴ糖の製造
方法。単離されるシアリルオリゴ糖は、式１で示される
シアリルガラクトース及び式２で示されるシアル酸二量
体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シアリルオリゴ糖の製
造方法に関する。さらに詳しくは、糖鎖原料として使用
できるシアリルガラクトース及びシアル酸二量体を製造
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガングリオシドは、シアル酸含有糖脂質
ともよばれ、細胞膜表面に存在し、細胞表面の陰性電荷
に寄与している。神経機能や細胞の相互識別、分化、増
殖、がん化、老化などに寄与する生理機能を有してい
る。さらに、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素
等の細胞毒素や甲状腺刺激ホルモンなどのペプチドホル
モン、インターフェロン等の受容体機能にあずかるもの
として注目されている。

【０００３】このような様々な生理機能を有するガング
リオシドを合成する試みがなされている。例えば、特開
昭６１−１２６９５号、特開昭６１−２８２３９１号、
特開昭６３−４５２９３号等に種々のガングリオシドの
合成法が記載されている。これらの方法の主流は、糖鎖
化合物とシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）とを連
結するものである。また、原料となるシアル酸は、燕の
巣に含まれる糖タンパク質を酸で分解することにより製
造されている。

【０００４】ところが、ガングリオシドの合成は、シア
ル酸に糖鎖化合物及びセラミドを連結することにより行
われるのであり、予めシアル酸に糖鎖化合物が連結した
シアル酸化合物が得られれば、ある種のガングリオシド
については、シアル酸を用いた従来法に比べて効率的に
合成することも可能となる。

【０００５】

【発明の目的】そこで、本発明の目的は、シアル酸を含
有する糖鎖化合物の原料となるシアリルオリゴ糖の新規
な製造方法を提供することにある。

【０００６】

【発明の説明】本発明は、燕の巣をヒドラジンで処理し
て遊離アミンを得る工程、得られた遊離アミンをＮ−ア
セチル化する工程、及び得られた生成物からシアリルオ
リゴ糖を単離する工程を含むことを特徴とするシアリル
オリゴ糖の製造方法に関する。

【０００７】以下本発明について説明する。燕の巣は、
従来からシアル酸の製造方法に用いられていたものと同
様のもの、即ち、食用の燕の巣を用いれば良い。燕の巣
は、糖タンパク質を含んでいる。

【０００８】燕の巣は、ヒドラジン、好ましくは無水ヒ
ドラジンで還元処理して分解し、遊離のアミン化合物と
する。ヒドラジンは、通常加熱した状態で行うことが、
分解を促進するという観点から好ましい。加熱は、例え
ば５０〜１１０℃の範囲とすることができる。さらに、
この加熱は、封管中で行うことがより分解を促進でき、
かつ収率を向上できるという観点から好ましい。燕の巣
に対するヒドラジンの使用量は、例えば燕の巣１重量部
に対して約３〜１０重量部とすることができる。処理時
間は、燕の巣の種類、温度及び処理の規模等により適宜
決定される。例えば、約１〜１２時間とすることができ
る。

【０００９】ヒドラジン処理により得られた遊離のアミ
ン化合物は、次いでＮ−アセチル化される。Ｎ−アセチ
ル化は、常法により行うことができ、遊離のアミン化合
物を、例えば炭酸水素ナトリウムの存在下で無水酢酸と
反応させることにより行うことができる。

【００１０】炭酸水素ナトリウムの存在下で無水酢酸を
用いるＮ−アセチル化反応は、飽和量の炭酸水素ナトリ
ウムの存在下、無水酢酸を反応液に少量ずつ添加するこ
とにより行うことが適当である。無水酢酸の使用量は、
原料として用いた燕の巣１重量部当たり、例えば３〜１
０重量部とすることができる。

【００１１】次いで、得られた反応液から、目的とする
シアリルオリゴ糖を単離する。この単離には、シアリル
オリゴ糖を単離するのに通常用いられている薄層クロマ
トグラフィーやイオン交換カラムクロマトグラフィーを
用いることができる。条件は、目的とするシアリルオリ
ゴ糖と薄層やカラムの種類等を考慮して適宜決定され
る。本発明では、特に、シアリルオリゴ糖として下記に
化１として示すシアリルガラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα
２→３Ｇａｌ）及び化２として示すシアル酸二量体（Ｎ
ｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃ）を単離することがで
きる。

【００１２】

【化１】

【００１３】

【化２】

【００１４】尚、Ｎ−アセチル化反応液からシアリルオ
リゴ糖を単離するに際しては、予め反応液から不要な塩
類を除去しておくことが好ましい。塩類の除去には、除
去する塩類の種類に応じて、各種のイオン交換樹脂を用
いることができる。

【００１５】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、シアル酸を
含有する糖鎖化合物の原料となるシアリルオリゴ糖の新
規な製造方法を提供することができる。

【００１６】

【有用性】本発明の製造方法により得られるシアリルガ
ラクトースは、ＧＭ₃等のガングリオシドの合成の原料
として有用である。従来、シアリルガラクトースは、シ
アル酸及びガラクトースを化学的に結合させることによ
り合成していた。この合成には、５〜１０ステップを必
要とし、かつトータル収率も１０％以下であった。しか
し、本発明の方法によれば、シアリルガラクトースを直
接得ることができ、ガングリオシドの合成を格段に効率
良くすることが可能である。

【００１７】また、本発明の製造方法により得られるシ
アル酸二量体は、ＧＤ₃やＧＱ_1b等のシアロシル基を２
つ以上有するガングリオシドの合成の原料として有用で
ある。従来、シアル酸二量体は、２つのシアル酸を化学
的に結合させることにより合成していた（例えば、特開
平３−１７０９２号）。この合成には、５ステップ程度
を必要とし、かつ収率も１０％以下であった。しかし、
本発明の方法によれば、シアル酸二量体を直接得ること
ができ、シアロシル基を２つ以上有するガングリオシド
の合成を格段に効率良くすることが可能である。

【００１８】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。実施例１ Neu5Ac 2α→3Gal よく乾燥した後、粉末にした燕の巣5.0gをとり、無水ヒ
ドラジン20mlを加え封管中１００℃で８時間加熱撹拌す
る。室温でさらに１２時間撹拌した後、減圧濃縮する。
残渣に飽和重曹水 200mlを加えて均一な溶液とした後、
撹拌しながら、無水酢酸30mlを少量ずつ滴下する。室温
で１２時間撹拌した後、AmberliteIR-120B（Ｈ型）また
は Dowex50（Ｈ型）のイオン交換樹脂（ 300ml）のカラ
ムに通す。カラムを 500mlの蒸留水で洗浄した後、洗液
及び通過液を合わせて凍結乾燥する。11.24gの粗生成物
が得られた。

【００１９】ここで得られた粗生成物11.24gを50mlの蒸
留水に溶かし、Dowex50 （Ｈ型）（60ml）及び DowexＩ
（HCOO型）（60ml）のイオン交換樹脂のカラムに通す。
樹脂を蒸留水で洗浄した後、Dowex Ｉより1N−蟻酸を用
いて溶出し、薄層クロマトグラフィーを用いて、目的物
を含有するフラクションを集め凍結乾燥し、粗生成物0.
91g を得た。

【００２０】ここで得られた粗生成物 0.91g を0.01M-
Tris塩酸バッファーPH 7.6、20mlに溶かし、DEAE−セフ
ァデックスA-25（0.01M-Tris塩酸バッファーPH 7.6で平
衡化しておく）カラム（ 300ml）に吸着させた後、0.25
%-NaClを含む 0.1M-Tris塩酸バッファー（PH 7.6）で溶
出する。溶出液は凍結乾燥した後、再び Bio Gel P-3
（ 500ml）のカラムを用いて脱塩操作を行い、182.4mg
（3.6%）の粉末を得た。

【００２１】〔α〕²⁰ _D＝3.8 （C=1.0 H₂O ）¹ H-N.M.R. 500MHz D₂O （内標 t-BuOH） 5.278(d,0.3H,J=3.7Hz,H-1a α),4.627(d,0.7H,J=8.1H
z,H-1a β),4.319(dd,0.3H,J=2.9,10.3Hz,H-3a α),4.6
88(dd,0.7Hz,J=3.3,10.0HZ,H-3aβ),4.005(d,0.3H,J=2.
2Hz,H-4a α),3.935(d,0.7H,J=3.3Hz,H-4a β),3.509(d
d,0.7H,J=8.1,9.9Hz,h-2aβ),2.748(dd,0.7H,J=4.7,12.
5HZ,H-3beq β),2.733(dd,0.3H,J=4.8,12.5Hz-3beq
α),2.036(s,0.9H,NHAc,α),2.018(s,2.1H,NHAc,β),1.
806(t,0.3H,J=12.5Hz,H-3bexα),1.787(t,0.7H,J=12.1H
z,H-3bax β）

【００２２】実施例２ Neu5Ac 2α→8Neu5Ac よく乾燥した後、粉末にした燕の巣1.5gをとり、無水ヒ
ドラジン15mlを加え封管中１００℃で７時間加熱撹拌す
る。室温でさらに１２時間撹拌した後、減圧濃縮する。
残渣に飽和重曹水 200mlを加えて均一な溶液とした後、
撹拌しながら、無水酢酸40mlを少量ずつ滴下する。室温
で１２時間撹拌した後、AmberliteIR-120B（Ｈ型）また
は Dowex50（Ｈ型）のイオン交換樹脂（ 300ml）のカラ
ムに通す。カラムを 500mlの蒸留水で洗浄した後、洗液
及び通過液を合わせて凍結乾燥する。 2.51gの粗生成物
が得られた。

【００２３】ここで得られた粗生成物2.51g を10mlの蒸
留水に溶かし、セファデックスG-10（ 520ml）にて分画
する。分画したフラクションのうち、低分子フラクショ
ンを集め、凍結乾燥する。0.46gの粗生成物が得られ
た。

【００２４】ここで得られた粗生成物 0.46gを0.01M-Tr
is塩酸バッファーPH 7.6、5ml に溶かし、DEAE−セファ
デックスA-25（0.01M-Tris塩酸バッファーPH 7.6で平衡
化しておく）カラム（1000ml）に吸着させた後、5.0%-N
aCl を含む0.01M-Tris塩酸バッファー（PH 7.6）で溶出
する。溶出液は凍結乾燥した後、再びセファデックスG-
10（ 520ml）のカラムを用いて脱塩操作を行い、108.3m
g （7.2%）の粉末を得る。

【００２５】¹ H-N.M.R. 500MHz D₂O （内標 t-BuOH） 2.747(dd,1H,J=4.4,12.1Hz,H-3beq),2.201(dd,1H,J=4.
8,12.8Hz,H-3aeq),2.046(s,3H,NHAc),2.012(s,3H,NHA
c),1.727(t,1H,J=12.1Hz,H-3aax),1.682(t,1H,J=12.1H
z,H-3bax),¹³ C-N.M.R. 125MHz D₂O （内標ジオキ
サン） 102.9(C-2b),97.5(C-2a),76.0(C-8a),73.7(C-6b),72.9
(C-8b),71.1(C-6a),69.2(C-4b),68.9(C-7b),68.4(C-4
a),67.8(C-7a),63.4(C-9b),61.7(C-9a),53.2(C-5a),52.
5(C-5b),41.9(C-3b),40.1(C-3a),23.0(COCH_3,b),22.9(C
OCH_3,a)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】燕の巣をヒドラジンで処理して遊離アミ
ンを得る工程、得られた遊離アミンをＮ−アセチル化す
る工程、及び得られた生成物からシアリルオリゴ糖を単
離する工程を含むことを特徴とするシアリルオリゴ糖の
製造方法。
【請求項２】遊離アミンをＮ−アセチル化して得られ
た生成物からシアリルガラクトース及びシアル酸二量体
の少なくとも１種を単離する、請求項１記載の製造方
法。