JPH06184196A - ビトロネクチン由来合成ペプチドおよびそれらを含有する医薬組成物 - Google Patents
ビトロネクチン由来合成ペプチドおよびそれらを含有する医薬組成物Info
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- JPH06184196A JPH06184196A JP5227772A JP22777293A JPH06184196A JP H06184196 A JPH06184196 A JP H06184196A JP 5227772 A JP5227772 A JP 5227772A JP 22777293 A JP22777293 A JP 22777293A JP H06184196 A JPH06184196 A JP H06184196A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ビトロネクチン分子のＫ３４８−Ａ３８０配
列に由来する合成ペプチド。 【効果】 このペプチドは，プラスミノーゲンアクティ
ベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性
を修飾し，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，
播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎
症，肝疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに
血管形成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋
白分解を伴う病的状態の処置用医薬組成物の活性成分と
して有用である。
列に由来する合成ペプチド。 【効果】 このペプチドは，プラスミノーゲンアクティ
ベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性
を修飾し，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，
播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎
症，肝疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに
血管形成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋
白分解を伴う病的状態の処置用医薬組成物の活性成分と
して有用である。
Description
【０００１】発明の分野および背景 本発明は，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
ター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性を修飾できる，ビ
トロネクチン由来の合成ペプチドからなる医薬組成物，
およびその一部の新規合成ペプチドに関する。
ター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性を修飾できる，ビ
トロネクチン由来の合成ペプチドからなる医薬組成物，
およびその一部の新規合成ペプチドに関する。
【０００２】傷害血管からの出血を停止させる過程，止
血は，血管，血小板および血漿因子の共同的活動，なら
びに血管壁傷害領域への血小板およびフィブリンの蓄積
を制限する相殺機構によって特徴づけられる。
血は，血管，血小板および血漿因子の共同的活動，なら
びに血管壁傷害領域への血小板およびフィブリンの蓄積
を制限する相殺機構によって特徴づけられる。
【０００３】血液凝固反応は，止血シール，すなわちフ
ィブリンクロットの鍵要素を形成する，血小板プラグか
ら外方に広がり，それを定着させて，フィブリンクロッ
トは止血シールに必要な容積を付加する。
ィブリンクロットの鍵要素を形成する，血小板プラグか
ら外方に広がり，それを定着させて，フィブリンクロッ
トは止血シールに必要な容積を付加する。
【０００４】血液凝固反応には，それが活性化されて
も，正常時には，局所性血栓や播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）のような病的状態を生じるまで制御なく進行
することを防止する調節機構が存在する。これらの調節
機構には，とくに血液が肝臓を通過する際の活性化凝固
因子の細胞性クリアランス，および血液凝固の活性化酵
素や補因子を中和する血液自体の内部の機構が包含され
る。
も，正常時には，局所性血栓や播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）のような病的状態を生じるまで制御なく進行
することを防止する調節機構が存在する。これらの調節
機構には，とくに血液が肝臓を通過する際の活性化凝固
因子の細胞性クリアランス，および血液凝固の活性化酵
素や補因子を中和する血液自体の内部の機構が包含され
る。
【０００５】繊維素溶解系はフィブリンの沈着に続いて
活性化される。フィブリンを溶解することによって，こ
の系は傷害血管の内腔が開口状態に保持されるのを助け
る。フィブリンの沈着と溶解の間の平衡が，傷害血管壁
の修復に必要な数日間，止血シールを維持し，再形成す
る。
活性化される。フィブリンを溶解することによって，こ
の系は傷害血管の内腔が開口状態に保持されるのを助け
る。フィブリンの沈着と溶解の間の平衡が，傷害血管壁
の修復に必要な数日間，止血シールを維持し，再形成す
る。
【０００６】フィブリノーゲンがトロンビンによってフ
ィブリンに変換されると，プラスミンの不活性血漿前駆
体であるプラスミノーゲンが，その天然のアクティベー
ターたとえば組織プラスミノーゲンアクティベーター
（ｔＰＡ）によって活性化され，強力な蛋白分解酵素，
プラスミンに変換され，これがフィブリンをフィブリン
分解産物と呼ばれる可溶性フラグメントに分解して，循
環中に洗い流す。
ィブリンに変換されると，プラスミンの不活性血漿前駆
体であるプラスミノーゲンが，その天然のアクティベー
ターたとえば組織プラスミノーゲンアクティベーター
（ｔＰＡ）によって活性化され，強力な蛋白分解酵素，
プラスミンに変換され，これがフィブリンをフィブリン
分解産物と呼ばれる可溶性フラグメントに分解して，循
環中に洗い流す。
【０００７】過剰な繊維素溶解の防止には，フィブリノ
ーゲンよりもむしろフィブリンに対して結合するプラス
ミノーゲンの親和性の増大，およびフィブリンに結合し
た場合における組織プラスミノーゲンアクティベーター
のプラスミノーゲン活性化能の増大を含めたいくつかの
機構が作動する。繊維素溶解の主要なインヒビターはプ
ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ−１）である。さらに，血漿は，フィブリンクロット
から遊出するプラスミンを直ちに不活性化できる，α２
−抗プラスミンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターを
含有する。
ーゲンよりもむしろフィブリンに対して結合するプラス
ミノーゲンの親和性の増大，およびフィブリンに結合し
た場合における組織プラスミノーゲンアクティベーター
のプラスミノーゲン活性化能の増大を含めたいくつかの
機構が作動する。繊維素溶解の主要なインヒビターはプ
ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ−１）である。さらに，血漿は，フィブリンクロット
から遊出するプラスミンを直ちに不活性化できる，α２
−抗プラスミンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターを
含有する。
【０００８】プラスミンの活動を停止させるためには，
過剰の既形成プラスミンをびα２−抗プラスミンで不活
性化するだけでは十分ではない（Ｃｏｌｌｅｎ，１９７
６）。プラスミノーゲンからの更なるプラスミンの産生
を停止させる必要がある。これはＰＡＩ−１によるプラ
スミノーゲンアクティベーターの阻害によって行われ
る。ＰＡＩ−１は，ビトロネクチンに結合し（Ｌｏｓｋ
ｕｔｏｆｆら，１９８８；Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ ＆ Ｋ
ｌｕｆｔ，１９８７），その結果，循環血中および細胞
外マトリックス（ＥＣＭ）中の両者でその活性型として
安定化されることが明らかにされた（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ
ら，１９８８；Ｓａｌｏｎｅｎら，１９８９；Ｍｉｍｕ
ｒｏ ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，１９８９；Ｐｒｅｉｓ
ｓｎｅｒら，１９９０）。
過剰の既形成プラスミンをびα２−抗プラスミンで不活
性化するだけでは十分ではない（Ｃｏｌｌｅｎ，１９７
６）。プラスミノーゲンからの更なるプラスミンの産生
を停止させる必要がある。これはＰＡＩ−１によるプラ
スミノーゲンアクティベーターの阻害によって行われ
る。ＰＡＩ−１は，ビトロネクチンに結合し（Ｌｏｓｋ
ｕｔｏｆｆら，１９８８；Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ ＆ Ｋ
ｌｕｆｔ，１９８７），その結果，循環血中および細胞
外マトリックス（ＥＣＭ）中の両者でその活性型として
安定化されることが明らかにされた（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ
ら，１９８８；Ｓａｌｏｎｅｎら，１９８９；Ｍｉｍｕ
ｒｏ ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，１９８９；Ｐｒｅｉｓ
ｓｎｅｒら，１９９０）。
【０００９】最初は細胞伸展因子として発見されたビト
ロネクチンは，現在では，正常および腫瘍細胞の付着お
よび伸展のような様々な細胞外過程ならびに補体および
凝固経路の機能に関与する多機能調節蛋白質として認識
されている。循環血中では，ビトロネクチンは２つの分
子型として存在する。すなわち，単一鎖７５ｋＤａポリ
ペプチド（Ｖ７５）ならびに２つの鎖（６５ｋＤａおよ
び１０ｋＤａ）が鎖間ジスルフィド橋によって連結され
ているニックポリペプチド（Ｖ６５＋１０）である。血
小板放出プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）（Ｋｒｏｃ−Ｇ
ｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９８８ａ；Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄ
ｚｉｃｋｉら，１９８８ｂ；Ｃｈａｉｎら，１９９０；
Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０；Ｃｈａｉ
ｎら，１９９１ａ）によるビトロネクチンのＳｅｒ
３７８での特異的リン酸化を用い，本発明者らは最近，
プラスミンがビトロネクチンを，この蛋白質の２鎖型
（Ｖ６５＋１０）を生じる内因性切断部位から１８アミ
ノ酸上流のＡｒｇ３６１−Ｓｅｒ３６２結合において，
特異的に切断することを明らかにした（ｃｈａｉｎら，
１９９１ｂ）。本発明者らはまた，プラスミン切断の結
果，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の間の親和性が有意に
低下すること（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ），およびこ
の切断は，ビトロネクチンをＥＣＭに繋留するグリコサ
ミノグリカンによって刺激され，したがって，このマト
リックス内に見出されるビトロネクチン分子の切断に好
都合であることも報告した。これらの所見に基づき，本
発明者らは，図に示すように，プラスミンがフィードバ
ックシグナリングによってそれ自身の産生を停止できる
機構を提案した。
ロネクチンは，現在では，正常および腫瘍細胞の付着お
よび伸展のような様々な細胞外過程ならびに補体および
凝固経路の機能に関与する多機能調節蛋白質として認識
されている。循環血中では，ビトロネクチンは２つの分
子型として存在する。すなわち，単一鎖７５ｋＤａポリ
ペプチド（Ｖ７５）ならびに２つの鎖（６５ｋＤａおよ
び１０ｋＤａ）が鎖間ジスルフィド橋によって連結され
ているニックポリペプチド（Ｖ６５＋１０）である。血
小板放出プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）（Ｋｒｏｃ−Ｇ
ｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９８８ａ；Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄ
ｚｉｃｋｉら，１９８８ｂ；Ｃｈａｉｎら，１９９０；
Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０；Ｃｈａｉ
ｎら，１９９１ａ）によるビトロネクチンのＳｅｒ
３７８での特異的リン酸化を用い，本発明者らは最近，
プラスミンがビトロネクチンを，この蛋白質の２鎖型
（Ｖ６５＋１０）を生じる内因性切断部位から１８アミ
ノ酸上流のＡｒｇ３６１−Ｓｅｒ３６２結合において，
特異的に切断することを明らかにした（ｃｈａｉｎら，
１９９１ｂ）。本発明者らはまた，プラスミン切断の結
果，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の間の親和性が有意に
低下すること（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ），およびこ
の切断は，ビトロネクチンをＥＣＭに繋留するグリコサ
ミノグリカンによって刺激され，したがって，このマト
リックス内に見出されるビトロネクチン分子の切断に好
都合であることも報告した。これらの所見に基づき，本
発明者らは，図に示すように，プラスミンがフィードバ
ックシグナリングによってそれ自身の産生を停止できる
機構を提案した。
【００１０】繊維素溶解の初期段階においては，プラス
ミノーゲンアクティベーターがプラスミノーゲンをプラ
スミンに変換する。これは，多分グリコサミノグリカン
を介してＥＣＭ中に固定化されることが既に明らかにさ
れている（Ｐｏｌｌｅｎら，１９８８）ビトロネクチン
分子によってＰＡＩ−１が繋留（捕捉）されるので，可
能になる。このＰＡＩ−１の捕捉は，それがプラスミノ
ーゲンアクティベーターに到達し，それを阻害すること
を防止するので，インヒビターの局所的枯渇を生じる。
プラスミンレベルが高くなりすぎると，過剰のプラスミ
ンは，内皮下層に固定化されたビトロネクチン分子を選
択的にクリノプすることができる。その結果，繋留され
たＰＡＩ−１と遊離した（可動性）ＰＡＩ−１との間の
平衡が変位し，したがって，解放されたＰＡＩ−１は血
漿中の可溶性（可動性）ビトロネクチン分子に移送さ
れ，ついでそれがプラスミノーゲンアクティベーターに
到達しそれを阻害して，プラスミンの産生を停止させる
ことができる。この解放は，実際に，転位すなわち，Ｅ
ＣＭ−結合（プラスミンにクリップされた）ビトロネク
チンから，プラスミンによってクリップされていないし
たがってＰＡＩ−１に対してより高い親和性を有する可
溶性ビトロネクチン分子への繋留ＰＡＩ−１の転換を生
じる。
ミノーゲンアクティベーターがプラスミノーゲンをプラ
スミンに変換する。これは，多分グリコサミノグリカン
を介してＥＣＭ中に固定化されることが既に明らかにさ
れている（Ｐｏｌｌｅｎら，１９８８）ビトロネクチン
分子によってＰＡＩ−１が繋留（捕捉）されるので，可
能になる。このＰＡＩ−１の捕捉は，それがプラスミノ
ーゲンアクティベーターに到達し，それを阻害すること
を防止するので，インヒビターの局所的枯渇を生じる。
プラスミンレベルが高くなりすぎると，過剰のプラスミ
ンは，内皮下層に固定化されたビトロネクチン分子を選
択的にクリノプすることができる。その結果，繋留され
たＰＡＩ−１と遊離した（可動性）ＰＡＩ−１との間の
平衡が変位し，したがって，解放されたＰＡＩ−１は血
漿中の可溶性（可動性）ビトロネクチン分子に移送さ
れ，ついでそれがプラスミノーゲンアクティベーターに
到達しそれを阻害して，プラスミンの産生を停止させる
ことができる。この解放は，実際に，転位すなわち，Ｅ
ＣＭ−結合（プラスミンにクリップされた）ビトロネク
チンから，プラスミンによってクリップされていないし
たがってＰＡＩ−１に対してより高い親和性を有する可
溶性ビトロネクチン分子への繋留ＰＡＩ−１の転換を生
じる。
【００１１】このプラスミン産生の制御機構の損傷が，
臨床的に広範な関連を有するものと考えられる。最近の
いくつかの所見は，プラスミノーゲンのその天然のアク
ティベーター（たとえば，ｔＰＡ，ストレプトキナー
ゼ，ウロキナーゼ）による活性化がプラスミンによる障
壁の蛋白分解的溶解のための多目的生物学的ツールを構
成することを示唆している。血餅の場合には，それが偶
発的に形成されたものであれも早不必要なものであれ，
それらの溶解は血液の自由な活力ある流れを回復する。
しかしながら，それと全く同じ機構は，悪性細胞により
組織への浸透および転移の形成に（Ｄａｎｏら，１９８
５；Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１
９９０），神経細胞により神経再生に，また血管により
血管形成に（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９）利用され
ていることが明らかである。プラスミノーゲン／プラス
ミン系は，炎症，排卵，組織の再造形および発生にも関
与することが明らかにされた。
臨床的に広範な関連を有するものと考えられる。最近の
いくつかの所見は，プラスミノーゲンのその天然のアク
ティベーター（たとえば，ｔＰＡ，ストレプトキナー
ゼ，ウロキナーゼ）による活性化がプラスミンによる障
壁の蛋白分解的溶解のための多目的生物学的ツールを構
成することを示唆している。血餅の場合には，それが偶
発的に形成されたものであれも早不必要なものであれ，
それらの溶解は血液の自由な活力ある流れを回復する。
しかしながら，それと全く同じ機構は，悪性細胞により
組織への浸透および転移の形成に（Ｄａｎｏら，１９８
５；Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１
９９０），神経細胞により神経再生に，また血管により
血管形成に（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９）利用され
ていることが明らかである。プラスミノーゲン／プラス
ミン系は，炎症，排卵，組織の再造形および発生にも関
与することが明らかにされた。
【００１２】この機能の多様性を考慮すると，プラスミ
ン活性は，局所的な部位限定的作用を保証し，またその
持続を制限するために，厳密な調整制御下に置かなけれ
ばならないことが明白である。
ン活性は，局所的な部位限定的作用を保証し，またその
持続を制限するために，厳密な調整制御下に置かなけれ
ばならないことが明白である。
【００１３】ＰＡＩ−１はプラスミノーゲンの活性化の
調節に重要な役割をもち，それ自体，ブラスミンによる
生物学的障壁の溶解の調節に関与している。したがっ
て，そのＰＡＩ−１との機能的相互作用を介して，ビト
ロネクチンは，繊維素溶解，炎症，排卵，組織の再形成
および発生，血管形成，神経再生，悪性および腫瘍細胞
の侵襲に関与する（Ｄａｎｏら，１９８５；Ｍｉｇｎａ
ｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１９９０）。
調節に重要な役割をもち，それ自体，ブラスミンによる
生物学的障壁の溶解の調節に関与している。したがっ
て，そのＰＡＩ−１との機能的相互作用を介して，ビト
ロネクチンは，繊維素溶解，炎症，排卵，組織の再形成
および発生，血管形成，神経再生，悪性および腫瘍細胞
の侵襲に関与する（Ｄａｎｏら，１９８５；Ｍｉｇｎａ
ｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１９９０）。
【００１４】ビトロネクチンのヘパリン結合部位から誘
導される一部のペプチドは，最近，ビトロネクチン−ト
ロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体のヒト内皮細
胞への結合を仲介することが明らかにされた（ｄｅ Ｂ
ｏｅｒら，１９９２）。開示されたペプチドは，配列Ａ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
に相当する。これらの同じペプチドはまた，ビトロネク
チンのカルボキシ末端部分における，ヘパリン，ＰＡＩ
−１およびプラスミノーゲンへの結合部位を限局するマ
ッピング研究にも使用された（Ｋｏｓｔら，１９９
２）。これらの報告には，これらのペプチドの医薬的有
用性については，記載も示唆もない。
導される一部のペプチドは，最近，ビトロネクチン−ト
ロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体のヒト内皮細
胞への結合を仲介することが明らかにされた（ｄｅ Ｂ
ｏｅｒら，１９９２）。開示されたペプチドは，配列Ａ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
に相当する。これらの同じペプチドはまた，ビトロネク
チンのカルボキシ末端部分における，ヘパリン，ＰＡＩ
−１およびプラスミノーゲンへの結合部位を限局するマ
ッピング研究にも使用された（Ｋｏｓｔら，１９９
２）。これらの報告には，これらのペプチドの医薬的有
用性については，記載も示唆もない。
【００１５】発明の要約 本発明は，ビトロネクチン分子に由来する合成ペプチド
がＰＡＩ−１の生物学的活性を修飾できることを発見
し，完成されたものである。すなわち，これらのペプチ
ドは，ＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティベーター
に到達しそれを阻害することを防止するか，またはこれ
らのペプチドはＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティ
ベーターに到達しそれを阻害することを許容する。
がＰＡＩ−１の生物学的活性を修飾できることを発見
し，完成されたものである。すなわち，これらのペプチ
ドは，ＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティベーター
に到達しそれを阻害することを防止するか，またはこれ
らのペプチドはＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティ
ベーターに到達しそれを阻害することを許容する。
【００１６】本明細書においてはＢＰペプチドと呼ばれ
る本発明のペプチドは，ビトロネクチン分子の位置３４
８−３８０に相当する塩基性アミノ酸集団に完全にまた
は部分的に一致するアミノ酸配列からなる。
る本発明のペプチドは，ビトロネクチン分子の位置３４
８−３８０に相当する塩基性アミノ酸集団に完全にまた
は部分的に一致するアミノ酸配列からなる。
【００１７】すなわち，本発明は，式 ３４８ ３８０ ＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲＰＳＲＡ を有するビトロネクチンのアミノ酸残基Ｋ３４８−Ａ
３８０を包含する部分配列または全配列からなる合成ペ
プチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，および，
そのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度および全
体的疎水性特性に関して保存されるような１もしくは２
以上のアミノの酸置換，付加または欠失によって得られ
るそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−１の生物学的活性
を修飾することができる上記ペプチドならびにそれらの
塩，官能性誘導体および類縁体を活性成分とし，それと
医薬的に許容される担体とからなる医薬組成物に関す
る。
３８０を包含する部分配列または全配列からなる合成ペ
プチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，および，
そのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度および全
体的疎水性特性に関して保存されるような１もしくは２
以上のアミノの酸置換，付加または欠失によって得られ
るそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−１の生物学的活性
を修飾することができる上記ペプチドならびにそれらの
塩，官能性誘導体および類縁体を活性成分とし，それと
医薬的に許容される担体とからなる医薬組成物に関す
る。
【００１８】本発明はまた，ビトロネクチンのアミノ酸
残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全配
列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性
誘導体および上に定義したような類縁体（ただしＡ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
を除く）に関する。
残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全配
列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性
誘導体および上に定義したような類縁体（ただしＡ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
を除く）に関する。
【００１９】本発明のペプチドの例示的実例を以下の配
列式ＩおよびＩＩに示す。本明細書で使用されるアミノ
酸残基の番号は，Ｊｅｎｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１
９８５によって推定されたビトロネクチン配列によるも
のである。式１における第一の配列はビトロネクチン
（ＶＮ）のＫ３４８−Ｗ３８２配列である。これらのペ
プチドは，すべてＬ型もしくはＤ型の光学活性アミノ酸
であってもよく，またその一部がＬ型で他がＤ型であっ
てもよい（式ＩＩでは，Ｄ型のアミノ酸残基には下線を
付してある）。
列式ＩおよびＩＩに示す。本明細書で使用されるアミノ
酸残基の番号は，Ｊｅｎｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１
９８５によって推定されたビトロネクチン配列によるも
のである。式１における第一の配列はビトロネクチン
（ＶＮ）のＫ３４８−Ｗ３８２配列である。これらのペ
プチドは，すべてＬ型もしくはＤ型の光学活性アミノ酸
であってもよく，またその一部がＬ型で他がＤ型であっ
てもよい（式ＩＩでは，Ｄ型のアミノ酸残基には下線を
付してある）。
【表１】
【表２】
【００２０】ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクティベ
ーターへの到達およびその阻害を防止するペプチドは，
プラスミノーゲンのプラスミンの活性化を亢進させ，し
たがって繊維素溶解を促進する。この場合のペプチドは
ビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ｒ３７０，とくに好ま
しくはＫ３４８−Ｑ３６３からなり，急性心筋梗塞，深
部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，播種性血管内凝
固症候群，肺塞栓症および他の疾患の処置用プロフィブ
リン分解剤として有用である。これらは，内因性フィブ
リン溶解過程を増強するために，単独で，またはプラス
ミノーゲンアクティベーターたとえばｔＰＡ，ストレプ
トキナーゼまたはウロキナーゼと併用して投与すること
ができる。
ーターへの到達およびその阻害を防止するペプチドは，
プラスミノーゲンのプラスミンの活性化を亢進させ，し
たがって繊維素溶解を促進する。この場合のペプチドは
ビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ｒ３７０，とくに好ま
しくはＫ３４８−Ｑ３６３からなり，急性心筋梗塞，深
部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，播種性血管内凝
固症候群，肺塞栓症および他の疾患の処置用プロフィブ
リン分解剤として有用である。これらは，内因性フィブ
リン溶解過程を増強するために，単独で，またはプラス
ミノーゲンアクティベーターたとえばｔＰＡ，ストレプ
トキナーゼまたはウロキナーゼと併用して投与すること
ができる。
【００２１】すなわち，好ましい一実施態様において
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｋ
３４８−Ｒ３７０の全配列または部分配列からなり，た
とえば本明細書においてＢＰ５（Ｋ３５８−Ｒ３７０）
およびＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と命名されたペプ
チドからなる。この配列内において，また別の好ましい
実施態様においては，ペプチドは，光学活性アミノ酸残
基の一部，とくに好ましくはそれらのすべてがＤコンフ
ィギュレーションであり，たとえば本明細書においてＢ
Ｐ７，ＢＰ８およびＢＰ１４と呼ばれるペプチドであ
る。ペプチドＢＰ７はＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と
同じ配列を有するが，配列式ＩＩにおいて下線を施した
残基はＬコンフィギュレーションではなく，Ｄコンフィ
ギュレーションである。ペプチドＢＰ８はＢＰ６と同じ
配列を有するが，すべての光学活性アミノ酸がＤコンフ
ィギュレーションである。ペプチドＢＰ１４（Ｎ３５６
−Ｑ３６３）はＢＰ８のＣ−末端残基を含有するが，そ
の光学活性アミノ酸はすべてＤコンフィギュレーション
を有する。光学活性アミノ酸残基の一部またはすべてが
Ｄ型であるペプチドは，止血および繊維素溶解に関与す
るプロテアーゼによる酵素的分解に，はるかに強力なま
たは完全な抵抗性を示すことになる。
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｋ
３４８−Ｒ３７０の全配列または部分配列からなり，た
とえば本明細書においてＢＰ５（Ｋ３５８−Ｒ３７０）
およびＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と命名されたペプ
チドからなる。この配列内において，また別の好ましい
実施態様においては，ペプチドは，光学活性アミノ酸残
基の一部，とくに好ましくはそれらのすべてがＤコンフ
ィギュレーションであり，たとえば本明細書においてＢ
Ｐ７，ＢＰ８およびＢＰ１４と呼ばれるペプチドであ
る。ペプチドＢＰ７はＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と
同じ配列を有するが，配列式ＩＩにおいて下線を施した
残基はＬコンフィギュレーションではなく，Ｄコンフィ
ギュレーションである。ペプチドＢＰ８はＢＰ６と同じ
配列を有するが，すべての光学活性アミノ酸がＤコンフ
ィギュレーションである。ペプチドＢＰ１４（Ｎ３５６
−Ｑ３６３）はＢＰ８のＣ−末端残基を含有するが，そ
の光学活性アミノ酸はすべてＤコンフィギュレーション
を有する。光学活性アミノ酸残基の一部またはすべてが
Ｄ型であるペプチドは，止血および繊維素溶解に関与す
るプロテアーゼによる酵素的分解に，はるかに強力なま
たは完全な抵抗性を示すことになる。
【００２２】ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクティベ
ーターへの到達およびその阻害を許容するペプチドはプ
ラスミノーゲンからのプラスミンの形成を防止する。こ
の場合，ペプチドはビトロネクチンの位置Ｓ３６２−Ａ
３８０こ相当する完全もしくは部分的配列からなり，た
とえば出血性障害のような，プラスミンによる過剰の
（非制御）蛋白分解に伴う障害の処置のための抗フィブ
リン溶解剤として有用である。このような抗フィブリン
溶解剤の例にはペプチドＢＰ４がある。
ーターへの到達およびその阻害を許容するペプチドはプ
ラスミノーゲンからのプラスミンの形成を防止する。こ
の場合，ペプチドはビトロネクチンの位置Ｓ３６２−Ａ
３８０こ相当する完全もしくは部分的配列からなり，た
とえば出血性障害のような，プラスミンによる過剰の
（非制御）蛋白分解に伴う障害の処置のための抗フィブ
リン溶解剤として有用である。このような抗フィブリン
溶解剤の例にはペプチドＢＰ４がある。
【００２３】すなわち，他の好ましい実施態様において
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ａ３８０の完全もしくは部分的配列からなり，
たとえば本明細劃こおいてＢＰ４（Ｓ３６２−
Ａ３８０），ＢＰ４−１（Ｓ３６２，Ｒ３７０）および
ＢＰ４−２（Ｓ３６２−Ｒ３６９）と呼ばれるペプチド
である。
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ａ３８０の完全もしくは部分的配列からなり，
たとえば本明細劃こおいてＢＰ４（Ｓ３６２−
Ａ３８０），ＢＰ４−１（Ｓ３６２，Ｒ３７０）および
ＢＰ４−２（Ｓ３６２−Ｒ３６９）と呼ばれるペプチド
である。
【００２４】本発明のペプチドおよび医薬組成物は，Ｐ
ＡＩ−１の変動が関与する疾患，たとえば急性心筋梗
塞，深部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，肺塞栓
症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症たとえば膵臓の炎症，肝疾患，細菌性血液感染
症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制御，神経再生，
または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う病的状態たとえ
ば癌転移の処置用に有用性が考えられる。
ＡＩ−１の変動が関与する疾患，たとえば急性心筋梗
塞，深部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，肺塞栓
症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症たとえば膵臓の炎症，肝疾患，細菌性血液感染
症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制御，神経再生，
または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う病的状態たとえ
ば癌転移の処置用に有用性が考えられる。
【００２５】図面の簡単な説明 図１は，繊維素溶解に関連する分子的事象の順序を示す
模式図である。この場合，プラスミンはフィードバック
シグナリング，細胞外マトリックス（たとえば血管内皮
下層）に見出される固定化ビトロネクチンから解放さ
れ，止血事象の局部に暴露されるＰＡＩ−１によって，
それ自体の産生を停止することができる。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害。
模式図である。この場合，プラスミンはフィードバック
シグナリング，細胞外マトリックス（たとえば血管内皮
下層）に見出される固定化ビトロネクチンから解放さ
れ，止血事象の局部に暴露されるＰＡＩ−１によって，
それ自体の産生を停止することができる。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害。
【００２６】図２は，陽電荷で荷電された塩基性アミノ
酸集団（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチ
ンの部分の配列を示し，ＰＫＡのリン酸化部位（Ｓｅｒ
３７８），内因性切断部位（Ａｒｇ３７９−Ａｌａ
３９０），プラスミン切断部位（Ａｒｇ３６１−Ｓｅｒ
３６２）およびヘパリン結合部位（位置３４８−３５
９）の間の関係を示す配列図である。
酸集団（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチ
ンの部分の配列を示し，ＰＫＡのリン酸化部位（Ｓｅｒ
３７８），内因性切断部位（Ａｒｇ３７９−Ａｌａ
３９０），プラスミン切断部位（Ａｒｇ３６１−Ｓｅｒ
３６２）およびヘパリン結合部位（位置３４８−３５
９）の間の関係を示す配列図である。
【００２７】図３Ａ〜Ｄは，ビトロネクチンの位置３４
８−３８０に相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影響
を示す。パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２
（△）および非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ３（□），
ＢＰ４（△），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ（４−
１）（□），ＢＰ（４−２）（△），非添加（○）；パ
ネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ６
（●），非添加（○）。グラフ中の各点は，３回の測定
結果の平均を表す。インキュベーション混合物中の最終
ペプチド濃度は２５μＭとした。
８−３８０に相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影響
を示す。パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２
（△）および非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ３（□），
ＢＰ４（△），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ（４−
１）（□），ＢＰ（４−２）（△），非添加（○）；パ
ネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ６
（●），非添加（○）。グラフ中の各点は，３回の測定
結果の平均を表す。インキュベーション混合物中の最終
ペプチド濃度は２５μＭとした。
【００２８】図４ＡおよびＢは，パネルＡ：ペプチドＢ
Ｐ４−１（△） およびＢＰ５（□），ならびにパネル
Ｂ：ペプチドＢＰ５（●）およびＢＰ６（▲）の等モル
濃度（２５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビト
ロネクチンの結合の妨害の相対的効果を示す。非添加
（○）
Ｐ４−１（△） およびＢＰ５（□），ならびにパネル
Ｂ：ペプチドＢＰ５（●）およびＢＰ６（▲）の等モル
濃度（２５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビト
ロネクチンの結合の妨害の相対的効果を示す。非添加
（○）
【００２９】図５Ａ〜Ｃは，様々な濃度のＢＰ４（パネ
ルＡ），ＢＰ５（パネルＢ）およびＢＰ６（パネルＣ）
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る効果を示す。パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），
５μＭ（△），１２μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角
▼），非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ
（□），１０μＭ（△），２５μＭ（●），１００μＭ
（▲黒四角▼），２５０μＭ（▲），非添加（○）；パ
ネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加（○）
ルＡ），ＢＰ５（パネルＢ）およびＢＰ６（パネルＣ）
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る効果を示す。パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），
５μＭ（△），１２μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角
▼），非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ
（□），１０μＭ（△），２５μＭ（●），１００μＭ
（▲黒四角▼），２５０μＭ（▲），非添加（○）；パ
ネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加（○）
【００３０】図６は，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネク
チンの結合に対する低濃度のＢＰ６の影響を示す。非添
加（○），０．１μＭ ＢＰ６（△），０．５μＭ Ｂ
Ｐ６（□）
チンの結合に対する低濃度のＢＰ６の影響を示す。非添
加（○），０．１μＭ ＢＰ６（△），０．５μＭ Ｂ
Ｐ６（□）
【００３１】図７は，ビトロネクチンのＰＡＩ−１への
会合の阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）および
ＢＰ６（●）の効果の比較を例示する。ビトロネクチン
の最終濃度は一定とし（０．５μｇ／ｍｌ），ペプチド
の濃度を指示のように変動させた。
会合の阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）および
ＢＰ６（●）の効果の比較を例示する。ビトロネクチン
の最終濃度は一定とし（０．５μｇ／ｍｌ），ペプチド
の濃度を指示のように変動させた。
【００３２】図８Ａ〜Ｃは，Ｄ−コンフィギュレーショ
ンをもつアミノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネル
Ａ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）
の様々な濃度での，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対する影響を示す。パネルＡ：ＢＰ７，１μ
Ｍ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），非添加
（○）；パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ
（△），１０μＭ（●），非添加（○）；パネルＣ：Ｂ
Ｐ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ
（●），非添加（○）
ンをもつアミノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネル
Ａ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）
の様々な濃度での，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対する影響を示す。パネルＡ：ＢＰ７，１μ
Ｍ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），非添加
（○）；パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ
（△），１０μＭ（●），非添加（○）；パネルＣ：Ｂ
Ｐ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ
（●），非添加（○）
【００３３】図９は，全Ｄ−ペプチドＢＰ８のプロフィ
ブリン溶解活性を示す。繊維素溶解の増強はＤ−ダイマ
ー形成によるフィブリンクロット溶解の測定によりモニ
タリングした。
ブリン溶解活性を示す。繊維素溶解の増強はＤ−ダイマ
ー形成によるフィブリンクロット溶解の測定によりモニ
タリングした。
【００３４】図１０Ａ〜Ｅは，５０μｇ／ｋｇ用量の薬
剤の投与後における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８の
プロフィブリン溶解活性を評価した実験を例示する。パ
ネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処眉動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
剤の投与後における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８の
プロフィブリン溶解活性を評価した実験を例示する。パ
ネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処眉動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
【００３５】好ましい実施態様の説明 本発明のペプチドは，ＰＡＩ−１に対して高い親和性を
有し，したがって，このインヒビターをビトロネクチン
から置換できる。それらは，内皮下層または凝集血小板
の表面から，阻害型（可溶性ビトロネクチンに結合）で
ＰＡＩ−１を解放することができて，したがってプラス
ミン形成および繊維素溶解をブロックし，または，ビト
ロネクチンからＰＡＩ−１を解放し，その潜在型（不活
性型）へ変換を許容し，その結果，プラスミノーゲンア
クティベーターの阻害が防止され，繊維素溶解が促進さ
れる。
有し，したがって，このインヒビターをビトロネクチン
から置換できる。それらは，内皮下層または凝集血小板
の表面から，阻害型（可溶性ビトロネクチンに結合）で
ＰＡＩ−１を解放することができて，したがってプラス
ミン形成および繊維素溶解をブロックし，または，ビト
ロネクチンからＰＡＩ−１を解放し，その潜在型（不活
性型）へ変換を許容し，その結果，プラスミノーゲンア
クティベーターの阻害が防止され，繊維素溶解が促進さ
れる。
【００３６】繊維素溶解の修飾におけるこれらのペプチ
ドの効果は，ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては，たとえば培
養内皮細胞によるＤ−ダイマー形成およびＰＡＩ−１の
放出，または，ｉｎ ｖｉｖｏにおいては動物での脈拍
血流の回復によって評価できる。他の一般に使用される
臨床的血液検査，たとえばトロンボン時間，オイグロブ
リン溶解時間，希釈全血血餅溶解時間，血餅退縮，およ
び培養内皮細胞によるｔＰＡの放出の測定を使用するこ
ともできる。
ドの効果は，ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては，たとえば培
養内皮細胞によるＤ−ダイマー形成およびＰＡＩ−１の
放出，または，ｉｎ ｖｉｖｏにおいては動物での脈拍
血流の回復によって評価できる。他の一般に使用される
臨床的血液検査，たとえばトロンボン時間，オイグロブ
リン溶解時間，希釈全血血餅溶解時間，血餅退縮，およ
び培養内皮細胞によるｔＰＡの放出の測定を使用するこ
ともできる。
【００３７】本明細書において用いられるペプチドなら
びにそれらの官能性誘導体および類縁体の「塩」の語
は，アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と有機または無
機塩基の塩，ならびに遊離アミノ基の酸付加塩を包含す
る。「官能性誘導体」の語は，遊離−ＯＨ，−ＮＨ２−
および−ＣＯＯＨ基の誘導体，たとえばエステルたとえ
ばＳ，ＴおよびＹ残基のリン酸エステル，エーテル，ア
ミド等を包含し，「類縁体」の語はアミノ残基の置換，
付加または欠失によって得られるペプチドからなり，環
状ペプチドを包含する。ペプチドの塩，官能性誘導体お
よび類縁体は，それらがＰＡＩ−１の生物学的活性を修
飾できる限り，本発明の範囲に包含される。
びにそれらの官能性誘導体および類縁体の「塩」の語
は，アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と有機または無
機塩基の塩，ならびに遊離アミノ基の酸付加塩を包含す
る。「官能性誘導体」の語は，遊離−ＯＨ，−ＮＨ２−
および−ＣＯＯＨ基の誘導体，たとえばエステルたとえ
ばＳ，ＴおよびＹ残基のリン酸エステル，エーテル，ア
ミド等を包含し，「類縁体」の語はアミノ残基の置換，
付加または欠失によって得られるペプチドからなり，環
状ペプチドを包含する。ペプチドの塩，官能性誘導体お
よび類縁体は，それらがＰＡＩ−１の生物学的活性を修
飾できる限り，本発明の範囲に包含される。
【００３８】本発明に要求されるペプチドの全体的陽電
荷高密度および疎水性特性は保存されていなければなら
ない。すなわち，ビトロネクチン分子中への付加，また
はその残基の置換に用いられるアミノ酸は，この要求に
合致するものでなければならない。陰性に荷電したアミ
ノ酸（Ｅ，Ｄ），および過剰に高度な疎水性アミノ酸
（Ｗ，Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｉ）は避けねばならない・陽性に荷
電したアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）が推奨される。すなわ
ち，Ｒ，ＫおよびＨのような残基間での交換が可能であ
る。
荷高密度および疎水性特性は保存されていなければなら
ない。すなわち，ビトロネクチン分子中への付加，また
はその残基の置換に用いられるアミノ酸は，この要求に
合致するものでなければならない。陰性に荷電したアミ
ノ酸（Ｅ，Ｄ），および過剰に高度な疎水性アミノ酸
（Ｗ，Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｉ）は避けねばならない・陽性に荷
電したアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）が推奨される。すなわ
ち，Ｒ，ＫおよびＨのような残基間での交換が可能であ
る。
【００３９】本発明の医薬組成物は，本発明のペプチ
ド，官能性誘導体，類縁体，またはそれらの塩，ならび
に医薬的に許容される担体からなる。この組成物は，任
意の投与様式，たとえば経口，局所，注射または静脈内
輸液によって使用できる。様々な賦形剤，たとえば正常
食塩水，グルコースまたは他の担体とともに，また他の
治療用物質とともにもしくは単独で，提供できる。投与
量は，患者の状態および処置すべき特定の状態によって
変動する。たとえば，血餅の溶解は，様々な生体領域，
たとえば脳，深部静脈，冠動脈等において実行できる。
ド，官能性誘導体，類縁体，またはそれらの塩，ならび
に医薬的に許容される担体からなる。この組成物は，任
意の投与様式，たとえば経口，局所，注射または静脈内
輸液によって使用できる。様々な賦形剤，たとえば正常
食塩水，グルコースまたは他の担体とともに，また他の
治療用物質とともにもしくは単独で，提供できる。投与
量は，患者の状態および処置すべき特定の状態によって
変動する。たとえば，血餅の溶解は，様々な生体領域，
たとえば脳，深部静脈，冠動脈等において実行できる。
【００４０】組成物が，プロフィブリン溶解性のペプチ
ドからなる場合には，単独で，あるいはプラスミノーゲ
ンアクティベーターたとえば天然もしくは組換え組織プ
ラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ），ウロキナ
ーゼまたはストレプトキナーゼと併用して投与できる。
ドからなる場合には，単独で，あるいはプラスミノーゲ
ンアクティベーターたとえば天然もしくは組換え組織プ
ラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ），ウロキナ
ーゼまたはストレプトキナーゼと併用して投与できる。
【００４１】本発明において使用される剤形は，既知の
製薬方法および操作を用いて処方できる。それらは粉末
として，または液体懸濁液ちして提供される。
製薬方法および操作を用いて処方できる。それらは粉末
として，または液体懸濁液ちして提供される。
【００４２】本発明はさらに，ビトロネクチンのアミノ
酸残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全
配列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能
性誘導体，およびそのペプチドの全体的性質がその高陽
電荷密度および全体的疎水性特性に関して保存されるよ
うな１もしくは２以上のアミノ酸の置換，付加または欠
失によって得られるそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−
１の生物学的活性を修飾することができる上記ペプチド
ならびにそれらの塩，官能性誘導体および類縁体の，急
性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性血管内
凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝疾患，
細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制
御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う
病的状態たとえば癌転移の処置用の医薬組成物の製造の
ための使用に関する。
酸残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全
配列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能
性誘導体，およびそのペプチドの全体的性質がその高陽
電荷密度および全体的疎水性特性に関して保存されるよ
うな１もしくは２以上のアミノ酸の置換，付加または欠
失によって得られるそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−
１の生物学的活性を修飾することができる上記ペプチド
ならびにそれらの塩，官能性誘導体および類縁体の，急
性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性血管内
凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝疾患，
細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制
御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う
病的状態たとえば癌転移の処置用の医薬組成物の製造の
ための使用に関する。
【００４３】本発明の他の実施態様においては，本発明
は，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性
血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝
疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形
成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解
を伴う病的状態から選ばれる疾患を有する患者の処置方
法において，本明細書で定義されたペプチドの治療有効
量を，本発明の医薬組成物の活性成分として，上述の患
者に投与することからなる方法に関する。
は，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性
血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝
疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形
成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解
を伴う病的状態から選ばれる疾患を有する患者の処置方
法において，本明細書で定義されたペプチドの治療有効
量を，本発明の医薬組成物の活性成分として，上述の患
者に投与することからなる方法に関する。
【００４４】本発明を以下の非限定的実施例により例示
する。実施例 材料および方法 ａ）購入された材料 新鮮な凍結ヒト血漿は，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉ
ｓｒａｅｌから入手した。ウサギ抗−ヒトビトロネクチ
ンポリクローナル抗体は，ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入
手した。β−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡおよび
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ
ＮＰＧ）はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．から購入した。
ＰＡＩ−１は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手した。他の試剤はすべ
て，入手できる市販品の最高の等級のものとした。
する。実施例 材料および方法 ａ）購入された材料 新鮮な凍結ヒト血漿は，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉ
ｓｒａｅｌから入手した。ウサギ抗−ヒトビトロネクチ
ンポリクローナル抗体は，ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入
手した。β−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡおよび
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ
ＮＰＧ）はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．から購入した。
ＰＡＩ−１は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手した。他の試剤はすべ
て，入手できる市販品の最高の等級のものとした。
【００４５】ｂ）ビトロネクチン ビトロネクチンは新鮮な凍結ヒト血漿から，Ｋｏｒｃ−
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０に報告された精製操作
を用いて調製した。このプレパレーションは通常，この
蛋白質を２つの分子型で含有していた。単一鎖Ｖ
７５型，および蛋白分解的にクリップされ，ジスルフィ
ド橋で互いに保持された２鎖Ｖ６５＋１０型である（Ｄ
ａｈｌｂａｃｋ ＆ Ｐｏｄａｃｋ，１９８５；Ｊｅｎ
ｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８５）。
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０に報告された精製操作
を用いて調製した。このプレパレーションは通常，この
蛋白質を２つの分子型で含有していた。単一鎖Ｖ
７５型，および蛋白分解的にクリップされ，ジスルフィ
ド橋で互いに保持された２鎖Ｖ６５＋１０型である（Ｄ
ａｈｌｂａｃｋ ＆ Ｐｏｄａｃｋ，１９８５；Ｊｅｎ
ｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８５）。
【００４６】Ｃ）文献の記載に従って実施された操作 蛋白質の濃度は，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６によって
報告された方法により測定した。固定化ＰＡＩ−１に対
するビトロネクチンの結合はＳａｌｏｎｅｎら，１９８
９の記載に従って実施した。ドデシル硫酸ナトリウムに
よるＰＡＩ−１の活性化はＫａｔａｇｉｒｉら，１９８
８の報告に従って実施した。アミノ酸の配列決定はＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７５Ａシーケンサ
ーを用いて行った。
報告された方法により測定した。固定化ＰＡＩ−１に対
するビトロネクチンの結合はＳａｌｏｎｅｎら，１９８
９の記載に従って実施した。ドデシル硫酸ナトリウムに
よるＰＡＩ−１の活性化はＫａｔａｇｉｒｉら，１９８
８の報告に従って実施した。アミノ酸の配列決定はＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７５Ａシーケンサ
ーを用いて行った。
【００４７】例１．ペプチドの合成 本発明のペプチドは，本技術分野でよく知られている操
作を用い，化学的合成または遺伝子工学的方法によって
製造できる。ペプチドの合成は，機械振盪器中，固相法
（Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８
０）を用い，クロロメチル化ポリスチレン−１％ジビニ
ルベンゼン樹脂（Ｃｈｅｍａｌｏｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌ
ａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）上で，手動で行った。α−ア
ミノ基はｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基
で保護した。側鎖は以下の保護基，すなわち，セリン
（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）はベンジル；チロシン
（Ｙ）は２，６−ジクロロベンジル；リジン（Ｋ）は２
−クロロベンジルオキシカルボニル；アルギニン（Ｒ）
はｐ−トルエンスルホニル；ヒスチジン（Ｈ）はベンジ
ルオキシカルボニルで遮蔽した。合成は，Ｃ末端アミノ
酸を樹脂にカップリングさせることにより開始した。ペ
プチドの延長（カップリング）は３倍モル過剰の保護ア
ミノ酸，およびカップリング剤としてＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールの等モル混合物を用いて行った。ペプチドの脱保
護およびポリマーからの離脱には無水ＨＦを用いた。粗
製のペプチドは，製造用ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂＲＰ−８：７μｍ；２５０×１０ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ，
Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により，水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および７５％アセ
トニトリル／水中０．１％ＴＦＡの間で確立された直線
勾配を用いて，均一に精製した。
作を用い，化学的合成または遺伝子工学的方法によって
製造できる。ペプチドの合成は，機械振盪器中，固相法
（Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８
０）を用い，クロロメチル化ポリスチレン−１％ジビニ
ルベンゼン樹脂（Ｃｈｅｍａｌｏｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌ
ａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）上で，手動で行った。α−ア
ミノ基はｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基
で保護した。側鎖は以下の保護基，すなわち，セリン
（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）はベンジル；チロシン
（Ｙ）は２，６−ジクロロベンジル；リジン（Ｋ）は２
−クロロベンジルオキシカルボニル；アルギニン（Ｒ）
はｐ−トルエンスルホニル；ヒスチジン（Ｈ）はベンジ
ルオキシカルボニルで遮蔽した。合成は，Ｃ末端アミノ
酸を樹脂にカップリングさせることにより開始した。ペ
プチドの延長（カップリング）は３倍モル過剰の保護ア
ミノ酸，およびカップリング剤としてＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールの等モル混合物を用いて行った。ペプチドの脱保
護およびポリマーからの離脱には無水ＨＦを用いた。粗
製のペプチドは，製造用ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂＲＰ−８：７μｍ；２５０×１０ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ，
Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により，水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および７５％アセ
トニトリル／水中０．１％ＴＦＡの間で確立された直線
勾配を用いて，均一に精製した。
【００４８】ビトロネクチン中のＰＡＩ−１結合部位の
マッピングには，その血漿切断部位（Ｒ３６１−Ｓ
３６２）（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ）の周囲のアミノ
酸配列に由来する構造の一連のペプチドを合成した。調
製したペプチドの配列は，前掲の配列式ＩおよびＩＩに
示す。各ペプチドの構造は，そのアミノ酸組成および配
列の決定によって確認した。ペプチドＢＰ４，ＢＰ４−
１，ＢＰ５，ＢＰ６およびＢＰ７のアミノ酸分折を表１
に掲げる・ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６の配列
分折を表２に示す。
マッピングには，その血漿切断部位（Ｒ３６１−Ｓ
３６２）（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ）の周囲のアミノ
酸配列に由来する構造の一連のペプチドを合成した。調
製したペプチドの配列は，前掲の配列式ＩおよびＩＩに
示す。各ペプチドの構造は，そのアミノ酸組成および配
列の決定によって確認した。ペプチドＢＰ４，ＢＰ４−
１，ＢＰ５，ＢＰ６およびＢＰ７のアミノ酸分折を表１
に掲げる・ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６の配列
分折を表２に示す。
【００４９】
【表３】
【表４】
【００５０】例２．固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対するＢＰ系合成ペプチドの影響 配列式Ｉに示した各合成ペプチドおよびＤコンフィギュ
レーションを有するアミノ酸を含有するペプチド（ＢＰ
７，ＢＰ８およびＢＰ１４）につき，固定化活性化ＰＡ
Ｉ−１へのビトロネクチンの結合のそれらの阻害能を競
合的ＥＬＩＳＡで試験した。最初のスクリーニング（図
３）は同じモル濃度（２５μＭ）のペプチドを用いて実
施した。このような試験には変動の可能性があることを
考慮し（主としてプレート上の活性化ＰＡＩ−１コーテ
ィングの変動による），各プレートについてビトロネク
チン単独のコントロールを対照として並流させた。
ンの結合に対するＢＰ系合成ペプチドの影響 配列式Ｉに示した各合成ペプチドおよびＤコンフィギュ
レーションを有するアミノ酸を含有するペプチド（ＢＰ
７，ＢＰ８およびＢＰ１４）につき，固定化活性化ＰＡ
Ｉ−１へのビトロネクチンの結合のそれらの阻害能を競
合的ＥＬＩＳＡで試験した。最初のスクリーニング（図
３）は同じモル濃度（２５μＭ）のペプチドを用いて実
施した。このような試験には変動の可能性があることを
考慮し（主としてプレート上の活性化ＰＡＩ−１コーテ
ィングの変動による），各プレートについてビトロネク
チン単独のコントロールを対照として並流させた。
【００５１】各種合成ペプチド（すべて５０μＭ）を，
ＰＢＳ，ツイーン２０（０．０１％），ポリエチレング
リコール（平均分子量８ｋＤａ）（４％ｗ／ｖ）からな
る緩衝液５０μｌ中に溶解した。各サンプルを，Ｋａｔ
ａｇｉｒｉら，１９８８の記載に従って調製したＳＤＳ
−活性化ＰＡＩでコーティングしたマイクロタイターウ
エルに添加した。２２℃で３３分間インキュベートした
のち，同一緩衝液中ビトロネクチン溶液（各種濃度）の
サンプル（５０μｌ）を各ウエルに加えた。ついで，３
７℃で２時間インキュベートした。結合したビトロネク
チンの量を，特異的ウサギ抗−ヒトＶｎ抗体（１：１０
０希釈），ついでβ−ガラクトシダーゼ連結プロテイン
Ａおよび基質としてｏ−ニトロフェニル−β−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）を加えて定量した。酵素反応を
進行させ，４０５＋４９０ｎｍにおける吸収を測定し
た。結果は図３に示す。グラフ中の各点は３回の測定か
らの平均を表す・インキュベーション混合物中の最終ペ
プチド濃度は２５μＭとし，ビトロネクチン濃度は指示
した通りとする。
ＰＢＳ，ツイーン２０（０．０１％），ポリエチレング
リコール（平均分子量８ｋＤａ）（４％ｗ／ｖ）からな
る緩衝液５０μｌ中に溶解した。各サンプルを，Ｋａｔ
ａｇｉｒｉら，１９８８の記載に従って調製したＳＤＳ
−活性化ＰＡＩでコーティングしたマイクロタイターウ
エルに添加した。２２℃で３３分間インキュベートした
のち，同一緩衝液中ビトロネクチン溶液（各種濃度）の
サンプル（５０μｌ）を各ウエルに加えた。ついで，３
７℃で２時間インキュベートした。結合したビトロネク
チンの量を，特異的ウサギ抗−ヒトＶｎ抗体（１：１０
０希釈），ついでβ−ガラクトシダーゼ連結プロテイン
Ａおよび基質としてｏ−ニトロフェニル−β−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）を加えて定量した。酵素反応を
進行させ，４０５＋４９０ｎｍにおける吸収を測定し
た。結果は図３に示す。グラフ中の各点は３回の測定か
らの平均を表す・インキュベーション混合物中の最終ペ
プチド濃度は２５μＭとし，ビトロネクチン濃度は指示
した通りとする。
【００５２】図３から明らかなように，血漿切断部位
（Ｒ３６１−Ｓ３６２）および内因性切断部位（Ｒ
３７９−Ｒ３８０）の間のビトロネクチン配列をカバー
する，ペプチドＢＰ１，ＢＰ２，ＢＰ３およびＢＰ４は
すべて（パネルＡおよびＢ），ＰＡＩ−１へのビトロネ
クチンの結合をある程度まで阻害する。この阻害は，Ｂ
Ｐ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）がかなり有効なインヒ
ビターであり（図３，パネルＣ），一方，ＢＰＩ（Ｎ
３７１−Ａ３８０）には作用はあっても，きわめて軽度
の阻害しか示さなかったこと（図３，パネルＡ）から，
主として，ＢＰ４のＮ末端残基によるものである。Ｐ４
−１よりアミノ酸２個分小さいにすぎないＢＰ４−２
（Ｓ３６２−Ｒ３６３）のインヒビターとしての有効性
が劣ることは，Ｇ３６９および／またたＲ３７０が重要
な生物学的認識要素を含んでいることを示唆するもので
ある。また，各種ペプチドの阻害能は，ＢＰ４−１（正
味電荷＋４）がＢＰ３（正味電荷＋６）またはＢＰ４
（正味電荷＋７）よりも有効であったこと（図３，パネ
ルおよびＣ）から，単にそれらの陽性電荷によるのみで
はないことが考えられる。
（Ｒ３６１−Ｓ３６２）および内因性切断部位（Ｒ
３７９−Ｒ３８０）の間のビトロネクチン配列をカバー
する，ペプチドＢＰ１，ＢＰ２，ＢＰ３およびＢＰ４は
すべて（パネルＡおよびＢ），ＰＡＩ−１へのビトロネ
クチンの結合をある程度まで阻害する。この阻害は，Ｂ
Ｐ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）がかなり有効なインヒ
ビターであり（図３，パネルＣ），一方，ＢＰＩ（Ｎ
３７１−Ａ３８０）には作用はあっても，きわめて軽度
の阻害しか示さなかったこと（図３，パネルＡ）から，
主として，ＢＰ４のＮ末端残基によるものである。Ｐ４
−１よりアミノ酸２個分小さいにすぎないＢＰ４−２
（Ｓ３６２−Ｒ３６３）のインヒビターとしての有効性
が劣ることは，Ｇ３６９および／またたＲ３７０が重要
な生物学的認識要素を含んでいることを示唆するもので
ある。また，各種ペプチドの阻害能は，ＢＰ４−１（正
味電荷＋４）がＢＰ３（正味電荷＋６）またはＢＰ４
（正味電荷＋７）よりも有効であったこと（図３，パネ
ルおよびＣ）から，単にそれらの陽性電荷によるのみで
はないことが考えられる。
【００５３】ＢＰ４−１のすべてを含み，さらに血漿切
断部位を越えて延長されたペプチドＢＰ５（Ｋ３５８−
Ｒ３７０）は，インヒビターとしてＢＰ４−１よりも有
効であることが明らかにされた（図３，パネルＤ）。さ
らに，ペプチドＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）は，この
系で最も有効であると考えられた（図３，パネルＤ）。
断部位を越えて延長されたペプチドＢＰ５（Ｋ３５８−
Ｒ３７０）は，インヒビターとしてＢＰ４−１よりも有
効であることが明らかにされた（図３，パネルＤ）。さ
らに，ペプチドＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）は，この
系で最も有効であると考えられた（図３，パネルＤ）。
【００５４】ついで，ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢ
Ｐ６の相対的な阻害強度を，阻害の濃度依存性を測定す
ることによって評価した。図４に示すように，等モル
（各ペプチド２５μＭ）ベースで，ＢＰ５はＢＰ４−１
より優れ（パネルＡ），ＢＰ６はＢＰ５よりも有効であ
る（パネルＢ）。
Ｐ６の相対的な阻害強度を，阻害の濃度依存性を測定す
ることによって評価した。図４に示すように，等モル
（各ペプチド２５μＭ）ベースで，ＢＰ５はＢＰ４−１
より優れ（パネルＡ），ＢＰ６はＢＰ５よりも有効であ
る（パネルＢ）。
【００５５】図５から明らかなように，３種のペプチド
ＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６はすべて，濃度を増大させ
ると最大阻害に到達した。しかしながらＢＰ４は濃度２
５μＭで最大阻害に達し（図５，パネルＡ），ＢＰ５は
１００μＭで最大阻害に達した（図５，パネルＢ）のに
対し，ペプチドＢＰ６は濃度２．５μＭすでに最大効果
を示した（図５，パネルＣ）。
ＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６はすべて，濃度を増大させ
ると最大阻害に到達した。しかしながらＢＰ４は濃度２
５μＭで最大阻害に達し（図５，パネルＡ），ＢＰ５は
１００μＭで最大阻害に達した（図５，パネルＢ）のに
対し，ペプチドＢＰ６は濃度２．５μＭすでに最大効果
を示した（図５，パネルＣ）。
【００５６】これはさらに，ＰＡＩ−１結合の最大阻害
はペプチドＢＰ６ではすでに０．１μＭ（０．１５μｇ
／ｍｌ）の濃度で達成されたことを示す図６，ならびに
これらのペプチドの相対的阻害効果を単一のビトロネク
チン濃度（０．５μｇ／ｍｌ）で比較した図７によって
例示される。この図からは，３種のペプチドのすべてが
同じレベルの阻害（約６５％）を達成することが明らか
である。しかしながら，ＢＰ６は，このレベルの阻害を
ＢＰ４およびＢＰ５の場合よりも２００〜５００倍低い
濃度で示す。
はペプチドＢＰ６ではすでに０．１μＭ（０．１５μｇ
／ｍｌ）の濃度で達成されたことを示す図６，ならびに
これらのペプチドの相対的阻害効果を単一のビトロネク
チン濃度（０．５μｇ／ｍｌ）で比較した図７によって
例示される。この図からは，３種のペプチドのすべてが
同じレベルの阻害（約６５％）を達成することが明らか
である。しかしながら，ＢＰ６は，このレベルの阻害を
ＢＰ４およびＢＰ５の場合よりも２００〜５００倍低い
濃度で示す。
【００５７】上に示した結果は，ＰＡＩ−１結合部位の
高い親和性要素の一部はＫ３４８−Ｒ３５７領域に存在
するが，完全なＰＡＩ−１結合部位はＫ３４８−Ｒ
３７０配列を包含することを示している。このＰＡＩ−
１結合部位の位置決定は，Ｒ３６１−Ｓ３６２結合をプ
ラスミンで切断すると，この切断によりＰＡＩ−１結合
部位が２つに分裂して，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の
間の親和性が減弱し，このインヒビターが解放されると
いう，われわれの以前の所見（Ｃｈａｉｎら，１９９１
ｂ）を説明するものである。
高い親和性要素の一部はＫ３４８−Ｒ３５７領域に存在
するが，完全なＰＡＩ−１結合部位はＫ３４８−Ｒ
３７０配列を包含することを示している。このＰＡＩ−
１結合部位の位置決定は，Ｒ３６１−Ｓ３６２結合をプ
ラスミンで切断すると，この切断によりＰＡＩ−１結合
部位が２つに分裂して，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の
間の親和性が減弱し，このインヒビターが解放されると
いう，われわれの以前の所見（Ｃｈａｉｎら，１９９１
ｂ）を説明するものである。
【００５８】Ｄコンフィギュレーションを有するアミノ
酸を含むペプチドに関しては，図８に示すように，ＢＰ
７（パネルＡ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４
（パネルＣ）の３種のすべてのペプチドが，固定化ＰＡ
Ｉ−１に結合するが，ＢＰ８はＢＰ７およびＢＰ１４よ
りも強力に結合するように思われる。
酸を含むペプチドに関しては，図８に示すように，ＢＰ
７（パネルＡ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４
（パネルＣ）の３種のすべてのペプチドが，固定化ＰＡ
Ｉ−１に結合するが，ＢＰ８はＢＰ７およびＢＰ１４よ
りも強力に結合するように思われる。
【００５９】例３．ＢＰ系合成ペプチドの繊維素溶解の
修飾に対する影響 本発明の合成ペプチドの，繊維素溶解の修飾における効
果は，一般に使用されている臨床的血液検査，主とし
て，培養内皮細胞によるフィブリンＤ−ダイマー形成お
よびＰＡＩ−１の放出によるフィブリンクロット溶解の
修飾によって評価される。使用できる他の検査には，ト
ロンビン時間，オイグロブリン溶解時間，希釈全血血餅
溶解時間，血餅退縮，および培養内皮細胞によるｔＰＡ
の放出の測定が包含される。
修飾に対する影響 本発明の合成ペプチドの，繊維素溶解の修飾における効
果は，一般に使用されている臨床的血液検査，主とし
て，培養内皮細胞によるフィブリンＤ−ダイマー形成お
よびＰＡＩ−１の放出によるフィブリンクロット溶解の
修飾によって評価される。使用できる他の検査には，ト
ロンビン時間，オイグロブリン溶解時間，希釈全血血餅
溶解時間，血餅退縮，および培養内皮細胞によるｔＰＡ
の放出の測定が包含される。
【００６０】３．１ Ｄ−ダイマー形成によるフィブリ
ンクロット溶解の修飾 ペプチドが添加ｔＰＡの存在下または非存在下に，フィ
ブリンクロット溶解を修飾する能力を評価するために
は，厚い層に生育させたヒト内皮細胞（ヒト臍帯から）
上に，ヒトフィブリノーゲン（若干のプラスミノーゲン
を含む）およびトロンビンを用いて，フィブリンクロッ
トゲルを形成させた。すなわち，ヒト内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣ）を，細胞外マトリックスで予めコートしたまたは
コートしていない２４ウエル組織培養プレート上，半コ
ンフルーエントな方法で培養した。この細胞を洗浄し，
３ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノーゲンと１単位のトロンビ
ン（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）を混合して構築したフィ
ブリンゲル０．４ｍｌにより，細胞上を覆った。フィブ
リンを３７℃で１時間クロットさせたのち，試験すべき
ペプチドを含有する０．４ｍｌの培地［１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）含有Ｍ−１９９］をフィブリンゲルの上
に置いた。ｔＰＡを加えまたは加えないで，アッセイ物
質を上清に希釈し，細胞とともに６時間インキュベート
した。上清からのサンプルを，Ｄ−ダオマーＥＩＡで試
験した。上清中におけるＤ−ダイマーの存在は，Ｒｙｌ
ａｔｔら，１９８３の酵素イムノアッセイにより，Ａｇ
ｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｂｒｉｓｂａ
ｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａからのキットを用いて検定し
た。Ｄ−ダイマー形成は，試験すべきペプチドと，ｔＰ
Ａ（０．０９Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下に，６
時間インキュベートしたのち，２つのウエルで検出され
た。別のペプチド溶液をフィブリンゲルに，クロット１
時間後に添加した。添加ペプチドに非存在下，使用条件
では，このクロットは細胞から放出されるｔＰＡによる
プラスミノーゲンの活性化によって，約２４時間で溶解
する。外因性ｔＰＡはこの過程を促進するために添加で
きる。結果は表３に示す。
ンクロット溶解の修飾 ペプチドが添加ｔＰＡの存在下または非存在下に，フィ
ブリンクロット溶解を修飾する能力を評価するために
は，厚い層に生育させたヒト内皮細胞（ヒト臍帯から）
上に，ヒトフィブリノーゲン（若干のプラスミノーゲン
を含む）およびトロンビンを用いて，フィブリンクロッ
トゲルを形成させた。すなわち，ヒト内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣ）を，細胞外マトリックスで予めコートしたまたは
コートしていない２４ウエル組織培養プレート上，半コ
ンフルーエントな方法で培養した。この細胞を洗浄し，
３ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノーゲンと１単位のトロンビ
ン（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）を混合して構築したフィ
ブリンゲル０．４ｍｌにより，細胞上を覆った。フィブ
リンを３７℃で１時間クロットさせたのち，試験すべき
ペプチドを含有する０．４ｍｌの培地［１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）含有Ｍ−１９９］をフィブリンゲルの上
に置いた。ｔＰＡを加えまたは加えないで，アッセイ物
質を上清に希釈し，細胞とともに６時間インキュベート
した。上清からのサンプルを，Ｄ−ダオマーＥＩＡで試
験した。上清中におけるＤ−ダイマーの存在は，Ｒｙｌ
ａｔｔら，１９８３の酵素イムノアッセイにより，Ａｇ
ｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｂｒｉｓｂａ
ｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａからのキットを用いて検定し
た。Ｄ−ダイマー形成は，試験すべきペプチドと，ｔＰ
Ａ（０．０９Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下に，６
時間インキュベートしたのち，２つのウエルで検出され
た。別のペプチド溶液をフィブリンゲルに，クロット１
時間後に添加した。添加ペプチドに非存在下，使用条件
では，このクロットは細胞から放出されるｔＰＡによる
プラスミノーゲンの活性化によって，約２４時間で溶解
する。外因性ｔＰＡはこの過程を促進するために添加で
きる。結果は表３に示す。
【表５】
【００６１】１００％を越える値を示すプロフィブリン
溶解ペプチド，たとえばＢＰ５およびＢＰ６はその過程
を促進し，１００％を下回る値を示す抗フィブリン溶解
ペプチド，たとえばＢＰ４はそれを阻害する。上述のペ
プチド中，ＢＰ６は，様々な濃度でそれについて実施し
た他の一連の実験から明らかなように，試験したペプチ
ド中で最も強力なプロフィブリン溶解ペプチドである。
溶解ペプチド，たとえばＢＰ５およびＢＰ６はその過程
を促進し，１００％を下回る値を示す抗フィブリン溶解
ペプチド，たとえばＢＰ４はそれを阻害する。上述のペ
プチド中，ＢＰ６は，様々な濃度でそれについて実施し
た他の一連の実験から明らかなように，試験したペプチ
ド中で最も強力なプロフィブリン溶解ペプチドである。
【表６】
【００６２】結果は，図３〜７に示す固定化ＰＡＩ−１
へのビトロネクチンの結合阻害における，他のペプチド
に対するＢＰ６の相対的効果と一致する。
へのビトロネクチンの結合阻害における，他のペプチド
に対するＢＰ６の相対的効果と一致する。
【００６３】別の実験では，全ＤペプチドＢＰ８（Ｋ
３４８−Ｑ３６３）のプロフィブリン溶解活性について
検定した。これらの検定は同一の血漿プール（健常ドナ
ーから）について６回重複して行った。加クエン酸血漿
（２００μｌ） をヒト内皮細胞上に被覆し，１Ｕ／ｍ
ｌのトロンビンで凝固させた。試験物質は１％ＦＣＳ含
有ＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）２５０μｌ中に希釈
し，血漿クロット上に載せた。Ｄ−ダイマー分析用のサ
ンプルは６時間後に採取した。図９に示すように，ＢＰ
８は対照（最右端，ペプチド非添加）に比べて２．５倍
まで，繊維素溶解を有意に増強させた。
３４８−Ｑ３６３）のプロフィブリン溶解活性について
検定した。これらの検定は同一の血漿プール（健常ドナ
ーから）について６回重複して行った。加クエン酸血漿
（２００μｌ） をヒト内皮細胞上に被覆し，１Ｕ／ｍ
ｌのトロンビンで凝固させた。試験物質は１％ＦＣＳ含
有ＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）２５０μｌ中に希釈
し，血漿クロット上に載せた。Ｄ−ダイマー分析用のサ
ンプルは６時間後に採取した。図９に示すように，ＢＰ
８は対照（最右端，ペプチド非添加）に比べて２．５倍
まで，繊維素溶解を有意に増強させた。
【００６４】３．２ 動物でのｉｎ ｖｉｖｏ繊維素溶
解作用 ｉｎ ｖｉｖｏでの繊維素溶解に対するペプチドの効果
は，試験ペプチドを注射した動物，たとえばラット，ウ
サギ，モルモットで評価する。実験系には，試験血漿中
にｔＰＡを添加または添加しないで，プラスミノーゲ
ン，α−２抗プラスミンおよびＤ−ダイマーの測定を包
含する。この系では，ｔＰＡは，繊維素溶解に対するペ
プチドの相加的な緩和な作用を測定するために，ペプチ
ドとともに注射することができる。ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解作用は以下の実験操作を用いて検定した。
解作用 ｉｎ ｖｉｖｏでの繊維素溶解に対するペプチドの効果
は，試験ペプチドを注射した動物，たとえばラット，ウ
サギ，モルモットで評価する。実験系には，試験血漿中
にｔＰＡを添加または添加しないで，プラスミノーゲ
ン，α−２抗プラスミンおよびＤ−ダイマーの測定を包
含する。この系では，ｔＰＡは，繊維素溶解に対するペ
プチドの相加的な緩和な作用を測定するために，ペプチ
ドとともに注射することができる。ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解作用は以下の実験操作を用いて検定した。
【００６５】３．２．ａ動物：雄性Ｗｉｓｔａｒ ＳＰ
ＦラットはＨａｒｌｏｎ Ｏｌａｃ，ＵＫから購入し，
Ｓａｃｋｌｅｒ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌの動物舎で馴化さ
せた。使用した動物は，月齢５〜６月，体重４００〜５
００ｇの成熟ラットとした。
ＦラットはＨａｒｌｏｎ Ｏｌａｃ，ＵＫから購入し，
Ｓａｃｋｌｅｒ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌの動物舎で馴化さ
せた。使用した動物は，月齢５〜６月，体重４００〜５
００ｇの成熟ラットとした。
【００６６】３．２．ｂ 動物プレパレーション：無麻
酔ラットで血圧および心拍数を測定下。動物はＡｖｅｒ
ｔｉｎ（２−メチル−２−ブタノール中２，２，２−ト
リブロモエタノールを食塩溶液で希釈）で軽く麻酔し，
慢性植え込みカテーテルを，血圧測定用に尾動脈に，薬
剤投与用に頸静脈に設置した。動物を手術および麻酔か
ら回復させ，設置後少なくとも２４時間経過してから試
験を行った。カテーテルは，血圧をラットのホームケー
ジ中でさらに手で扱ったり操作しないで測定できるよう
に植え込んだ。クロットの形成を一夜防止するために，
カテーテルにヘパリン加食塩溶液（５００単意／ｍｌ）
を充填し，試験期間中はヘパリン加食塩溶液（５０単位
／ｍｌ）で洗浄した。
酔ラットで血圧および心拍数を測定下。動物はＡｖｅｒ
ｔｉｎ（２−メチル−２−ブタノール中２，２，２−ト
リブロモエタノールを食塩溶液で希釈）で軽く麻酔し，
慢性植え込みカテーテルを，血圧測定用に尾動脈に，薬
剤投与用に頸静脈に設置した。動物を手術および麻酔か
ら回復させ，設置後少なくとも２４時間経過してから試
験を行った。カテーテルは，血圧をラットのホームケー
ジ中でさらに手で扱ったり操作しないで測定できるよう
に植え込んだ。クロットの形成を一夜防止するために，
カテーテルにヘパリン加食塩溶液（５００単意／ｍｌ）
を充填し，試験期間中はヘパリン加食塩溶液（５０単位
／ｍｌ）で洗浄した。
【００６７】３．２．ｃ 血圧および心拍数の記録とデ
ータ解析：動脈カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧トランス
デューサーに接続し，血圧をＧｒａｓｓ多チャンネルポ
リグラフに記録した。ポリグラフ上に記録されたシグナ
ルを抽出シ，ＩＢＭコンピューターＰＣを用いて解析
し，ＤＡＳ ８ Ａ／Ｄコンバーターを用いて数値化シ
タ。データ処理は，度数２５０Ｈｚで１０秒間の抽出に
よった。シグナルはピーク検出によって解析した。この
プログラムは，予め定められた間隔で，収縮期，拡張期
および平均血圧，ならびに心拍数を抽出した。
ータ解析：動脈カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧トランス
デューサーに接続し，血圧をＧｒａｓｓ多チャンネルポ
リグラフに記録した。ポリグラフ上に記録されたシグナ
ルを抽出シ，ＩＢＭコンピューターＰＣを用いて解析
し，ＤＡＳ ８ Ａ／Ｄコンバーターを用いて数値化シ
タ。データ処理は，度数２５０Ｈｚで１０秒間の抽出に
よった。シグナルはピーク検出によって解析した。この
プログラムは，予め定められた間隔で，収縮期，拡張期
および平均血圧，ならびに心拍数を抽出した。
【００６８】３．２．ｄ 薬剤投与：手術後３〜４日
で，ヘパリン投与にもかかわらず，動脈カテーテルが閉
鎖した場合に，フィブリン溶解ペプチドＢＰ８を注射し
た。これらのラットでは，動脈カテーテルを介して食塩
溶液を注射できたが，血液を採取することはできず，脈
動および血圧の記録は消失した。薬剤の効果は拍動血圧
の回復およびカテーテルからの採血の容易さによって評
価下，薬剤は５０μｇ／ｋｇの濃度で動脈カテーテル中
に動脈内投与した。
で，ヘパリン投与にもかかわらず，動脈カテーテルが閉
鎖した場合に，フィブリン溶解ペプチドＢＰ８を注射し
た。これらのラットでは，動脈カテーテルを介して食塩
溶液を注射できたが，血液を採取することはできず，脈
動および血圧の記録は消失した。薬剤の効果は拍動血圧
の回復およびカテーテルからの採血の容易さによって評
価下，薬剤は５０μｇ／ｋｇの濃度で動脈カテーテル中
に動脈内投与した。
【００６９】このような処置の結果を図１０に例示す
る。図中，パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ，健康ラ
ット（対照，血流は妨害されていない）および血流が妨
害されたラットの拍動血圧を示す。後者をＢＰ８で処置
すると，拍動血圧は１８秒後に有意に回復することが認
められる（パネルＥ）。
る。図中，パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ，健康ラ
ット（対照，血流は妨害されていない）および血流が妨
害されたラットの拍動血圧を示す。後者をＢＰ８で処置
すると，拍動血圧は１８秒後に有意に回復することが認
められる（パネルＥ）。
【００７０】３．３ 培養内皮細胞によるＰＡＩ−１の
放出 Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａら，１９８３の方法に従い，Ｈ
ＵＶＥＣ細胞の上清中のＰＡＩ−１を測定する。略述す
れば，細胞を，ＥＣＭの存在下または非存在下に，半コ
ンフルーエントに培養する。培地を，２％ＦＣＳ含有ハ
ンクの平衡塩溶液に交換し，添加プラスミン（５μｇ／
ｍｌ）を加えたまたは加えない試験物質をこの緩衝液に
希釈し，細胞とともに６時間インキュベートする。細胞
上清からのサンプルについてＰＡＩ−１活性を検定す
る。
放出 Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａら，１９８３の方法に従い，Ｈ
ＵＶＥＣ細胞の上清中のＰＡＩ−１を測定する。略述す
れば，細胞を，ＥＣＭの存在下または非存在下に，半コ
ンフルーエントに培養する。培地を，２％ＦＣＳ含有ハ
ンクの平衡塩溶液に交換し，添加プラスミン（５μｇ／
ｍｌ）を加えたまたは加えない試験物質をこの緩衝液に
希釈し，細胞とともに６時間インキュベートする。細胞
上清からのサンプルについてＰＡＩ−１活性を検定す
る。
【００７１】ＰＡＩ−１の検定には，細胞上清を一定量
のｔＰＡ（４００Ｕ／ｍｌ）とインキュベートし，ｔＰ
Ａの残留活性を，プラスミノーゲン（０．１μｇ／ｍ
ｌ），発色性基質（Ｓ−２２５１）およびスチミュレー
ター（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなる基質によって
測定する。基質とインキュベートしたのち，Ｏ，Ｄを４
０５ｎｍで測定し，インヒビターの量を検量曲線から計
算する。ＰＡＩ−１抗原も市販のキットで測定できる。
のｔＰＡ（４００Ｕ／ｍｌ）とインキュベートし，ｔＰ
Ａの残留活性を，プラスミノーゲン（０．１μｇ／ｍ
ｌ），発色性基質（Ｓ−２２５１）およびスチミュレー
ター（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなる基質によって
測定する。基質とインキュベートしたのち，Ｏ，Ｄを４
０５ｎｍで測定し，インヒビターの量を検量曲線から計
算する。ＰＡＩ−１抗原も市販のキットで測定できる。
【００７２】アッセイは様々な濃度のＢＰ６およびＢＰ
４を用いて実施した。結果を表５および６にまとめる。
４を用いて実施した。結果を表５および６にまとめる。
【表７】
【表８】
【００７３】ＢＰ６のプロフィブリン溶解活性はヒト内
皮細胞系におけるＰＡＩ−１の活性を低下させるその能
力，すなわちプラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰ
Ａ）の活性の増大およびその結果としてのプラスミン活
性の増大ならびに繊維素溶解の促進によって表す（表
５）。一方，ＢＰ４の抗フィブリン溶解活性は，同じ系
でのＰＡＩ−１の活性を増大させるその能力，すなわち
プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）の活性の
低下およびその結果としてのプラスミン活性の低下なら
びに繊維素溶解の防止によって表す（表６）。
皮細胞系におけるＰＡＩ−１の活性を低下させるその能
力，すなわちプラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰ
Ａ）の活性の増大およびその結果としてのプラスミン活
性の増大ならびに繊維素溶解の促進によって表す（表
５）。一方，ＢＰ４の抗フィブリン溶解活性は，同じ系
でのＰＡＩ−１の活性を増大させるその能力，すなわち
プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）の活性の
低下およびその結果としてのプラスミン活性の低下なら
びに繊維素溶解の防止によって表す（表６）。
【００７４】３．４ オイグロビン溶解時間 加クエン酸血漿を冷却下に酢酸（０．０１６Ｍ）中に希
釈し，１０分後に沈殿を遠心分離によって分離し，ホウ
酸緩衝液に溶解し，ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）で再石
灰沈着を行って凝固させる。血餅を３７℃でインキュベ
ートする。正常な血餅の溶解は２〜３時間で起こる。沈
殿工程の前に，試験物質を血漿に添加する。
釈し，１０分後に沈殿を遠心分離によって分離し，ホウ
酸緩衝液に溶解し，ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）で再石
灰沈着を行って凝固させる。血餅を３７℃でインキュベ
ートする。正常な血餅の溶解は２〜３時間で起こる。沈
殿工程の前に，試験物質を血漿に添加する。
【００７５】３．５ 希釈全血血餅溶解時間 血液１ｍｌをベロナール緩衝液に１：１０に希釈する。
インキュベートしたトロンビン（４０Ｕ／ｍｌ）１００
μｌの添加により血栓を形成させる，凝固した血液を３
７℃で４８時間インキュベートする。正常な血餅は溶解
するか，４８時間後もまだ存在する。プロフィブリン溶
解剤の添加により，凝血の溶解時間は短縮する。
インキュベートしたトロンビン（４０Ｕ／ｍｌ）１００
μｌの添加により血栓を形成させる，凝固した血液を３
７℃で４８時間インキュベートする。正常な血餅は溶解
するか，４８時間後もまだ存在する。プロフィブリン溶
解剤の添加により，凝血の溶解時間は短縮する。
【００７６】 引用文献 Ｂａｒａｎｙ，Ｇ． ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．
Ｂ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＡＮａｌｙｓｉ
ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｅ． ＆ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），２巻，
１−２８４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ），１９８０ ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅ
ｍ．２６７：２２６４−２２６８（１９９２） Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．７２：２４８−２５４（１０７６） Ｃａｊｏｔ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６９３９−６９４３（１９
９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：２
２１−２２５（１９９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４：３
８７−３９４（１９９１ａ） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：２
５１−２５６（１９９１ｂ） Ｃｈｎｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｊ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．３１：４２７−４３６（１９９３） Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
９：２０９−２１６（１９７６） Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ． ＆ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：２３６８−２３７
４（１９８５） Ｄａｎｏ，Ｋ，ら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
４：１３９−１６６（１９８５） Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３：１５４５４−１５４６１（１９８８） Ｊｅｎｎｅ，Ｄ． ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．ＥＭ
ＢＯ Ｊ． ４：３１５３−３１５７（１９８５） Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１７６：８１−８７（１９８８） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７５４１−
７５４５（１９８８ａ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：
１１３１−１１３８（１９８８ｂ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１８８：２８８−２９４（１９９０） ｋｏｓｔ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１２０９８−１２１０５（１９９２） Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．ら，ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｂｏｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ，９巻（ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．編）， Ｓａｕｎｄ
ｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６７−１１５頁
（１９８８） Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０８：６７１−６８２（１９８９） Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ． ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９３６−９３
９（１９８９） Ｐｏｌｌａｎｅｎ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０６：８７−９５（１９８８） Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｋ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２６５：１８４９０−１８４９８（１９９０） Ｒｙｌａｔｔら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ． ３１：７６
７−７７８（１９８３）Ｓａｌｏｎｅｎ，Ｅ．−Ｍ．
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：６３３９−６
３４３（１９８９） Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ，Ｅ．Ｄ． ＆ Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．
Ｂｌｏｏｄ ６９：３８１−３８７（１９８７）
Ｂ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＡＮａｌｙｓｉ
ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｅ． ＆ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），２巻，
１−２８４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ），１９８０ ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅ
ｍ．２６７：２２６４−２２６８（１９９２） Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．７２：２４８−２５４（１０７６） Ｃａｊｏｔ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６９３９−６９４３（１９
９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：２
２１−２２５（１９９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４：３
８７−３９４（１９９１ａ） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：２
５１−２５６（１９９１ｂ） Ｃｈｎｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｊ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．３１：４２７−４３６（１９９３） Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
９：２０９−２１６（１９７６） Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ． ＆ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：２３６８−２３７
４（１９８５） Ｄａｎｏ，Ｋ，ら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
４：１３９−１６６（１９８５） Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３：１５４５４−１５４６１（１９８８） Ｊｅｎｎｅ，Ｄ． ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．ＥＭ
ＢＯ Ｊ． ４：３１５３−３１５７（１９８５） Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１７６：８１−８７（１９８８） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７５４１−
７５４５（１９８８ａ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：
１１３１−１１３８（１９８８ｂ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１８８：２８８−２９４（１９９０） ｋｏｓｔ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１２０９８−１２１０５（１９９２） Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．ら，ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｂｏｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ，９巻（ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．編）， Ｓａｕｎｄ
ｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６７−１１５頁
（１９８８） Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０８：６７１−６８２（１９８９） Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ． ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９３６−９３
９（１９８９） Ｐｏｌｌａｎｅｎ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０６：８７−９５（１９８８） Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｋ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２６５：１８４９０−１８４９８（１９９０） Ｒｙｌａｔｔら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ． ３１：７６
７−７７８（１９８３）Ｓａｌｏｎｅｎ，Ｅ．−Ｍ．
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：６３３９−６
３４３（１９８９） Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ，Ｅ．Ｄ． ＆ Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．
Ｂｌｏｏｄ ６９：３８１−３８７（１９８７）
【図１】図１：繊維素溶解に関連する分子的事象の順序
を示す模式図。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害
を示す模式図。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害
【図２】図２：陽電荷で荷電された塩基性アミノ酸集団
（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチンの部
分の配列図。
（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチンの部
分の配列図。
【図３】図３：ビトロネクチンの位置３４８−３８０に
相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固定化ＰＡＩ−
１へのビトロネクチンの結合に対する影響。 パネルＡ：ペプチドＢＰＩ（□），ＢＰ２（△）および
非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ３（□），ＢＰ４（△），非添加
（○）； パネルＣ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ（４−２）
（△），非添加（○）； パネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ
６（●），非添加（○）
相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固定化ＰＡＩ−
１へのビトロネクチンの結合に対する影響。 パネルＡ：ペプチドＢＰＩ（□），ＢＰ２（△）および
非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ３（□），ＢＰ４（△），非添加
（○）； パネルＣ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ（４−２）
（△），非添加（○）； パネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ
６（●），非添加（○）
【図４】図４：パネルＡ：ペプチドＢＰ４−１（△）お
よびＢＰ５（□），ならびにパネルＢ：等モル濃度（２
５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１（こ対するビトロネク
チンの結合の妨害の相対的効果。 ペプチドＢＰ５（●），ＢＰ６（▲），非添加（○）
よびＢＰ５（□），ならびにパネルＢ：等モル濃度（２
５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１（こ対するビトロネク
チンの結合の妨害の相対的効果。 ペプチドＢＰ５（●），ＢＰ６（▲），非添加（○）
【図５】図５：様々な濃度における固定化ＰＡＩ−１へ
のビトロネクチンの結合に対する効果 パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１２μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加
（○） パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０μＭ
（△），２５μＭ（●），１００μＭ（▲黒四角▼），
２５０μＭ（▲），非添加（○）； パネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１０μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加
（○）
のビトロネクチンの結合に対する効果 パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１２μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加
（○） パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０μＭ
（△），２５μＭ（●），１００μＭ（▲黒四角▼），
２５０μＭ（▲），非添加（○）； パネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１０μＭ（●），２５μＭ（▲黒四角▼），非添加
（○）
【図６】図６は：固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチン
の結合に対する低濃度のＢＰ６の影響。 非添加（○），０．１μＭ ＢＰ６（△），０．５μＭ
ＢＰ６（□）
の結合に対する低濃度のＢＰ６の影響。 非添加（○），０．１μＭ ＢＰ６（△），０．５μＭ
ＢＰ６（□）
【図７】図７：ビトロネクチンのＰＡＩ−１への会合の
阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）およびＢＰ６
（●）の効果の比較
阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）およびＢＰ６
（●）の効果の比較
【図８】図８：Ｄ−コンフィギュレーションをもつアミ
ノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネルＡ），ＢＰ８（パ
ネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）の様々な濃度で
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る影響。 パネルＡ：ＢＰ７，１μＭ（口），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＣ：ＢＰ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），非添加（○）
ノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネルＡ），ＢＰ８（パ
ネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）の様々な濃度で
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る影響。 パネルＡ：ＢＰ７，１μＭ（口），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＣ：ＢＰ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），非添加（○）
【図９】図９：全Ｄ−ペプチドＢＰ８のプロフィブリン
溶解活性。
溶解活性。
【図１０】図１０：５０μｇ／ｋｇ用量の薬剤の投与後
における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解活性を評価した実験例。 パネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解活性を評価した実験例。 パネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１１月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ビトロネクチン由来合成ペプチドおよ
びそれらを含有する医薬組成物
びそれらを含有する医薬組成物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野および背景 本発明は，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
ター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性を修飾できる，ビ
トロネクチン由来の合成ペプチドからなる医薬組成物，
およびその一部の新規合成ペプチドに関する。
ター１（ＰＡＩ−１）の生物学的活性を修飾できる，ビ
トロネクチン由来の合成ペプチドからなる医薬組成物，
およびその一部の新規合成ペプチドに関する。
【０００２】傷害血管からの出血を停止させる過程，止
血は，血管，血小板および血漿因子の共同的活動，なら
びに血管壁傷害領域への血小板およびフィブリンの蓄積
を制限する相殺機構によって特徴づけられる。
血は，血管，血小板および血漿因子の共同的活動，なら
びに血管壁傷害領域への血小板およびフィブリンの蓄積
を制限する相殺機構によって特徴づけられる。
【０００３】血液凝固反応は，止血シール，すなわちフ
ィブリンクロットの鍵要素を形成する。血小板プラグか
ら外方に広がり，それを定着させて，フィブリンクロッ
トは止血シールに必要な容積を付加する。
ィブリンクロットの鍵要素を形成する。血小板プラグか
ら外方に広がり，それを定着させて，フィブリンクロッ
トは止血シールに必要な容積を付加する。
【０００４】血液凝固反応には，それが活性化されて
も，正常時には，局所性血栓や播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）のような病的状態を生じるまで制御なく進行
することを防止する調節機構が存在する。これらの調節
機構には，とくに血液が肝臓を通過する際の活性化凝固
因子の細胞性クリアランス，および血液凝固の活性化酵
素や補因子を中和する血液自体の内部の機構が包含され
る。
も，正常時には，局所性血栓や播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）のような病的状態を生じるまで制御なく進行
することを防止する調節機構が存在する。これらの調節
機構には，とくに血液が肝臓を通過する際の活性化凝固
因子の細胞性クリアランス，および血液凝固の活性化酵
素や補因子を中和する血液自体の内部の機構が包含され
る。
【０００５】繊維素溶解系はフィブリンの沈着に続いて
活性化される。フィブリンを溶解することによって，こ
の系は傷害血管の内腔が開口状態に保持されるのを助け
る。フィブリンの沈着と溶解の間の平衡が，傷害血管壁
の修復に必要な数日間，止血シールを維持し，再形成す
る。
活性化される。フィブリンを溶解することによって，こ
の系は傷害血管の内腔が開口状態に保持されるのを助け
る。フィブリンの沈着と溶解の間の平衡が，傷害血管壁
の修復に必要な数日間，止血シールを維持し，再形成す
る。
【０００６】フィブリノーゲンがトロンビンによってフ
ィブリンに変換されると，プラスミンの不活性血漿前駆
体であるプラスミノーゲンが，その天然のアクティベー
ターたとえば組織プラスミノーゲンアクティベーター
（ｔＰＡ）によって活性化され，強力な蛋白分解酵素，
プラスミンに変換され，これがフィブリンをフィブリン
分解産物と呼ばれる可溶性フラグメントに分解して，循
環中に洗い流す。
ィブリンに変換されると，プラスミンの不活性血漿前駆
体であるプラスミノーゲンが，その天然のアクティベー
ターたとえば組織プラスミノーゲンアクティベーター
（ｔＰＡ）によって活性化され，強力な蛋白分解酵素，
プラスミンに変換され，これがフィブリンをフィブリン
分解産物と呼ばれる可溶性フラグメントに分解して，循
環中に洗い流す。
【０００７】過剰な繊維素溶解の防止には，フィブリノ
ーゲンよりもむしろフィブリンに対して結合するプラス
ミノーゲンの親和性の増大，およびフィブリンに結合し
た場合における組織プラスミノーゲンアクティベーター
のプラスミノーゲン活性化能の増大を含めたいくつかの
機構が作動する。繊維素溶解の主要なインヒビターはプ
ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ−１）である。さらに，血漿は，フィブリンクロット
から遊出するプラスミンを直ちに不活性化できる，α２
−抗プラスミンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターを
含有する。
ーゲンよりもむしろフィブリンに対して結合するプラス
ミノーゲンの親和性の増大，およびフィブリンに結合し
た場合における組織プラスミノーゲンアクティベーター
のプラスミノーゲン活性化能の増大を含めたいくつかの
機構が作動する。繊維素溶解の主要なインヒビターはプ
ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター１（ＰＡ
Ｉ−１）である。さらに，血漿は，フィブリンクロット
から遊出するプラスミンを直ちに不活性化できる，α２
−抗プラスミンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターを
含有する。
【０００８】プラスミンの活動を停止させるためには，
過剰の既形成プラスミンをα２−抗プラスミンで不活性
化するだけでは十分ではない（Ｃｏｌｌｅｎ，１９７
６）。プラスミノーゲンからの更なるプラスミンの産生
を停止させる必要がある。これはＰＡＩ−１によるプラ
スミノーゲンアクティベーターの阻害によって行われ
る。ＰＡＩ−１は，ビトロネクチンに結合し（Ｌｏｓｋ
ｕｔｏｆｆ ら，１９８８；Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ ＆
Ｋｌｕｆｔ，１９８７），その結果，循環血中および細
胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の両者でその活性型とし
て安定化されることが明らかにされた（Ｄｅｃｌｅｒｃ
ｋら，１９８８；Ｓａｌｏｎｅｎら，１９８９；Ｍｉｍ
ｕｒｏ ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，１９８９；Ｐｒｅｉ
ｓｓｎｅｒｅら，１９９０）。
過剰の既形成プラスミンをα２−抗プラスミンで不活性
化するだけでは十分ではない（Ｃｏｌｌｅｎ，１９７
６）。プラスミノーゲンからの更なるプラスミンの産生
を停止させる必要がある。これはＰＡＩ−１によるプラ
スミノーゲンアクティベーターの阻害によって行われ
る。ＰＡＩ−１は，ビトロネクチンに結合し（Ｌｏｓｋ
ｕｔｏｆｆ ら，１９８８；Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ ＆
Ｋｌｕｆｔ，１９８７），その結果，循環血中および細
胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の両者でその活性型とし
て安定化されることが明らかにされた（Ｄｅｃｌｅｒｃ
ｋら，１９８８；Ｓａｌｏｎｅｎら，１９８９；Ｍｉｍ
ｕｒｏ ＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，１９８９；Ｐｒｅｉ
ｓｓｎｅｒｅら，１９９０）。
【０００９】最初は細胞伸展因子として発見されたビト
ロネクチンは，現在では，正常および腫瘍細胞の付着お
よび伸展のような様々な細胞外過程ならびに補体および
凝固経路の機能に関与する多機能調節蛋白質として認識
されている。循環血中では，ビトロネクチンは２つの分
子型として存在する。すなわち，単一鎖７５ｋＤａポリ
ペプチド（Ｖ７５）ならびに２つの鎖（６５ｋＤａ お
よび１０ｋＤａ）が鎖間ジスルフィド橋によって連結さ
れているニックポリペプチド（Ｖ６５＋１０）である。
血小板放出プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）（Ｋｒｏｃ−
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ ら，１９８８ａ；Ｋｒｏｃ−Ｇｒ
ｏｄｚｉｃｋｉら，１９８８ｂ；Ｃｈａｉｎら，１９９
０；Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ ら，１９９０；Ｃ
ｈａｉｎら，１９９１ａ）によるビトロネクチンのＳｅ
ｒ３７８での特異的リン酸化を用い，本発明者らは最
近，プラスミンがビトロネクチンを，この蛋白質の２鎖
型（Ｖ６５＋１０）を生じる内因性切断部位から１８ア
ミノ酸上流のＡｒｇ３６１−Ｓｅｒ３６２結合におい
て，特異的に切断することを明らかにした（Ｃｈａｉｎ
ら，１９９１ｂ）。本発明者らはまた，プラスミン切断
の結果，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の間の親和性が有
意に低下すること（Ｃｈａｉｎ ら，１９９１ｂ），お
よびこの切断は，ビトロネクチンをＥＣＭに繋留するグ
リコサミノグリカンによって刺激され，したがって，こ
のマトリックス内に見出されるビトロネクチン分子の切
断に好都合であることも報告した。これらの所見に基づ
き，本発明者らは，図１に示すように，プラスミンがフ
ィードバックシグナリングによってそれ自身の産生を停
止できる機構を提案した。
ロネクチンは，現在では，正常および腫瘍細胞の付着お
よび伸展のような様々な細胞外過程ならびに補体および
凝固経路の機能に関与する多機能調節蛋白質として認識
されている。循環血中では，ビトロネクチンは２つの分
子型として存在する。すなわち，単一鎖７５ｋＤａポリ
ペプチド（Ｖ７５）ならびに２つの鎖（６５ｋＤａ お
よび１０ｋＤａ）が鎖間ジスルフィド橋によって連結さ
れているニックポリペプチド（Ｖ６５＋１０）である。
血小板放出プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）（Ｋｒｏｃ−
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ ら，１９８８ａ；Ｋｒｏｃ−Ｇｒ
ｏｄｚｉｃｋｉら，１９８８ｂ；Ｃｈａｉｎら，１９９
０；Ｋｒｏｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ ら，１９９０；Ｃ
ｈａｉｎら，１９９１ａ）によるビトロネクチンのＳｅ
ｒ３７８での特異的リン酸化を用い，本発明者らは最
近，プラスミンがビトロネクチンを，この蛋白質の２鎖
型（Ｖ６５＋１０）を生じる内因性切断部位から１８ア
ミノ酸上流のＡｒｇ３６１−Ｓｅｒ３６２結合におい
て，特異的に切断することを明らかにした（Ｃｈａｉｎ
ら，１９９１ｂ）。本発明者らはまた，プラスミン切断
の結果，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の間の親和性が有
意に低下すること（Ｃｈａｉｎ ら，１９９１ｂ），お
よびこの切断は，ビトロネクチンをＥＣＭに繋留するグ
リコサミノグリカンによって刺激され，したがって，こ
のマトリックス内に見出されるビトロネクチン分子の切
断に好都合であることも報告した。これらの所見に基づ
き，本発明者らは，図１に示すように，プラスミンがフ
ィードバックシグナリングによってそれ自身の産生を停
止できる機構を提案した。
【００１０】繊維素溶解の初期段階においては，プラス
ミノーゲンアクティベーターがプラスミノーゲンをプラ
スミンに変換する。これは，多分グリコサミノグリカン
を介してＥＣＭ中に固定化されることが既に明らかにさ
れている（Ｐｏｌｌｅｎら，１９８８）ビトロネクチン
分子によってＰＡＩ−１が繋留（捕捉）されるので，可
能になる。このＰＡＩ−１の捕捉は，それがプラスミノ
ーゲンアクティベーターに到達し，それを阻害すること
を防止するので，インヒビターの局所的枯渇を生じる。
プラスミンレベルが高くなりすぎると，過剰のプラスミ
ンは，内皮下層に固定化されたビトロネクチン分子を選
択的にクリップすることができる。その結果，繋留され
たＰＡＩ−１と遊離した（可動性）ＰＡＩ−１との間の
平衡が変位し，したがって，解放されたＰＡＩ−１は血
漿中の可溶性（可動性）ビトロネクチン分子に移送さ
れ，ついでそれがプラスミノーゲンアクティベーターに
到達しそれを阻害して，プラスミンの産生を停止させる
ことができる。この解放は，実際に，転位すなわち，Ｅ
ＣＭ−結合（プラスミンにクリップされた）ビトロネク
チンから，プラスミンによってクリップされていないし
たがってＰＡＩ−１に対してより高い親和性を有する可
溶性ビトロネクチン分子への繋留ＰＡＩ−１の転換を生
じる。
ミノーゲンアクティベーターがプラスミノーゲンをプラ
スミンに変換する。これは，多分グリコサミノグリカン
を介してＥＣＭ中に固定化されることが既に明らかにさ
れている（Ｐｏｌｌｅｎら，１９８８）ビトロネクチン
分子によってＰＡＩ−１が繋留（捕捉）されるので，可
能になる。このＰＡＩ−１の捕捉は，それがプラスミノ
ーゲンアクティベーターに到達し，それを阻害すること
を防止するので，インヒビターの局所的枯渇を生じる。
プラスミンレベルが高くなりすぎると，過剰のプラスミ
ンは，内皮下層に固定化されたビトロネクチン分子を選
択的にクリップすることができる。その結果，繋留され
たＰＡＩ−１と遊離した（可動性）ＰＡＩ−１との間の
平衡が変位し，したがって，解放されたＰＡＩ−１は血
漿中の可溶性（可動性）ビトロネクチン分子に移送さ
れ，ついでそれがプラスミノーゲンアクティベーターに
到達しそれを阻害して，プラスミンの産生を停止させる
ことができる。この解放は，実際に，転位すなわち，Ｅ
ＣＭ−結合（プラスミンにクリップされた）ビトロネク
チンから，プラスミンによってクリップされていないし
たがってＰＡＩ−１に対してより高い親和性を有する可
溶性ビトロネクチン分子への繋留ＰＡＩ−１の転換を生
じる。
【００１１】このプラスミン産生の制御機構の損傷が，
臨床的に広範な関連を有するものと考えられる。最近の
いくつかの所見は，プラスミノーゲンのその天然のアク
ティベーター（たとえば，ｔＰＡ，ストレプトキナー
ゼ，ウロキナーゼ）による活性化がプラスミンによる障
壁の蛋白分解的溶解のための多目的生物学的ツールを構
成することを示唆している。血餅の場合には，それが偶
発的に形成されたものであれも早不必要なものであれ，
それらの溶解は血液の自由な活力ある流れを回復する。
しかしながら，それと全く同じ機構は，悪性細胞により
組織への浸透および転移の形成に（Ｄａｎｏら，１９８
５；Ｍｉｇｎａｔｔｉ ら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，
１９９０），神経細胞により神経再生に，また血管によ
り血管形成に（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９）利用さ
れていることが明らかである。プラスミノーゲン／プラ
スミン系は，炎症，排卵，組織の再造形および発生にも
関与することが明らかにされた。
臨床的に広範な関連を有するものと考えられる。最近の
いくつかの所見は，プラスミノーゲンのその天然のアク
ティベーター（たとえば，ｔＰＡ，ストレプトキナー
ゼ，ウロキナーゼ）による活性化がプラスミンによる障
壁の蛋白分解的溶解のための多目的生物学的ツールを構
成することを示唆している。血餅の場合には，それが偶
発的に形成されたものであれも早不必要なものであれ，
それらの溶解は血液の自由な活力ある流れを回復する。
しかしながら，それと全く同じ機構は，悪性細胞により
組織への浸透および転移の形成に（Ｄａｎｏら，１９８
５；Ｍｉｇｎａｔｔｉ ら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，
１９９０），神経細胞により神経再生に，また血管によ
り血管形成に（Ｍｉｇｎａｔｔｉら，１９８９）利用さ
れていることが明らかである。プラスミノーゲン／プラ
スミン系は，炎症，排卵，組織の再造形および発生にも
関与することが明らかにされた。
【００１２】この機能の多様性を考慮すると，プラスミ
ン活性は，局所的な部位限定的作用を保証し，またその
持続を制限するために，厳密な調整制御下に置かなけれ
ばならないことが明白である。
ン活性は，局所的な部位限定的作用を保証し，またその
持続を制限するために，厳密な調整制御下に置かなけれ
ばならないことが明白である。
【００１３】ＰＡＩ−１はプラスミノーゲンの活性化の
調節に重要な役割をもち，それ自体，プラスミンによる
生物学的障壁の溶解の調節に関与している。したがっ
て，そのＰＡＩ−１との機能的相互作用を介して，ビト
ロネクチンは，繊維素溶解，炎症，排卵，組織の再形成
および発生，血管形成，神経再生，悪性および腫瘍細胞
の侵襲に関与する（Ｄａｎｏら，１９８５；Ｍｉｇｎａ
ｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１９９０）。
調節に重要な役割をもち，それ自体，プラスミンによる
生物学的障壁の溶解の調節に関与している。したがっ
て，そのＰＡＩ−１との機能的相互作用を介して，ビト
ロネクチンは，繊維素溶解，炎症，排卵，組織の再形成
および発生，血管形成，神経再生，悪性および腫瘍細胞
の侵襲に関与する（Ｄａｎｏら，１９８５；Ｍｉｇｎａ
ｔｔｉら，１９８９；Ｃａｊｏｔら，１９９０）。
【００１４】ビトロネクチンのヘパリン結合部位から誘
導される一部のペプチドは，最近，ビトロネクチン−ト
ロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体のヒト内皮細
胞への結合を仲介することが明らかにされた（ｄｅ Ｂ
ｏｅｒら，１９９２）。開示されたペプチドは，配列Ａ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
に相当する。これらの同じペプチドはまた，ビトロネク
チンのカルボキシ末端部分における，ヘパリン，ＰＡＩ
−１およびプラスミノーゲンへの結合部位を限局するマ
ッピング研究にも使用された（Ｋｏｓｔら，１９９
２），これらの報告には，これらのペプチドの医薬的有
用性については，記載も示唆もない。
導される一部のペプチドは，最近，ビトロネクチン−ト
ロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体のヒト内皮細
胞への結合を仲介することが明らかにされた（ｄｅ Ｂ
ｏｅｒら，１９９２）。開示されたペプチドは，配列Ａ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
に相当する。これらの同じペプチドはまた，ビトロネク
チンのカルボキシ末端部分における，ヘパリン，ＰＡＩ
−１およびプラスミノーゲンへの結合部位を限局するマ
ッピング研究にも使用された（Ｋｏｓｔら，１９９
２），これらの報告には，これらのペプチドの医薬的有
用性については，記載も示唆もない。
【００１５】発明の要約 本発明は，ビトロネクチン分子に由来する合成ペプチド
がＰＡＩ−１の生物学的活性を修飾できることを発見
し，完成されたものである。すなわち，これらのペプチ
ドは，ＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティベーター
に到達しそれを阻害することを防止するか，またはこれ
らのペプチドはＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティ
ベーターに到達しそれを阻害することを許容する。
がＰＡＩ−１の生物学的活性を修飾できることを発見
し，完成されたものである。すなわち，これらのペプチ
ドは，ＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティベーター
に到達しそれを阻害することを防止するか，またはこれ
らのペプチドはＰＡＩ−１がプラスミノーゲンアクティ
ベーターに到達しそれを阻害することを許容する。
【００１６】本明細書においてはＢＰペプチドと呼ばれ
る本発明のペプチドは，ビトロネクチン分子の位置３４
８−３８０に相当する塩基性アミノ酸集団に完全にまた
は部分的に一致するアミノ酸配列からなる。
る本発明のペプチドは，ビトロネクチン分子の位置３４
８−３８０に相当する塩基性アミノ酸集団に完全にまた
は部分的に一致するアミノ酸配列からなる。
【００１７】すなわち，本発明は，式 を有するビトロネクチンのアミノ酸残基Ｋ３４８−Ａ
３８０を包含する部分配列または全配列からなる合成ペ
プチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，および，
そのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度および全
体的疎水性特性に関して保存されるような１もしくは２
以上のアミノの酸置換，付加または欠失によって得られ
るそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−１の生物学的活性
を修飾することができる上記ペプチドならびにそれらの
塩，官能性誘導体および類縁体を活性成分とし，それと
医薬的に許容される担体とからなる医薬組成物に関す
る。
３８０を包含する部分配列または全配列からなる合成ペ
プチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，および，
そのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度および全
体的疎水性特性に関して保存されるような１もしくは２
以上のアミノの酸置換，付加または欠失によって得られ
るそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−１の生物学的活性
を修飾することができる上記ペプチドならびにそれらの
塩，官能性誘導体および類縁体を活性成分とし，それと
医薬的に許容される担体とからなる医薬組成物に関す
る。
【００１８】本発明はまた，ビトロネクチンのアミノ酸
残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全配
列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性
誘導体および上に定義したような類縁体（ただしＡ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
を除く）に関する。
残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全配
列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性
誘導体および上に定義したような類縁体（ただしＡ
３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ３５７−Ｒ
３７０，Ｈ３６６−Ｒ３７９およびＮ３７１−Ｌ３８３
を除く）に関する。
【００１９】本発明のペプチドの例示的実例を以下の配
列式ＩおよびＩＩに示す。本明細書で使用されるアミノ
酸残基の番号は，Ｊｅｎｎｅ＆Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８
５によって推定されたビトロネクチン配列によるもので
ある。式Ｉにおける第一の配列はビトロネクチン（Ｖ
Ｎ）のＫ３４８−Ｗ３８２配列である。これらのペプチ
ドは，すべてＬ型もしくはＤ型の光学活性アミノ酸であ
ってもよく，またその一部がＬ型で他がＤ型であっても
よい（式ＩＩでは，Ｄ型のアミノ酸残基には下線を付し
てある）。
列式ＩおよびＩＩに示す。本明細書で使用されるアミノ
酸残基の番号は，Ｊｅｎｎｅ＆Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８
５によって推定されたビトロネクチン配列によるもので
ある。式Ｉにおける第一の配列はビトロネクチン（Ｖ
Ｎ）のＫ３４８−Ｗ３８２配列である。これらのペプチ
ドは，すべてＬ型もしくはＤ型の光学活性アミノ酸であ
ってもよく，またその一部がＬ型で他がＤ型であっても
よい（式ＩＩでは，Ｄ型のアミノ酸残基には下線を付し
てある）。
【表１】
【表２】
【００２０】ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクティベ
ーターへの到達およびその阻害を防止するペプチドは，
プラスミノーゲンのプラスミンの活性化を亢進させ，し
たがって繊維素溶解を促進する。この場合のペプチドは
ビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ｒ３７０，とくに好ま
しくはＫ３４８−Ｑ３６３からなり，急性心筋梗塞，深
部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，播種性血管内凝
固症候群，肺塞栓症および他の疾患の処置用プロフィブ
リン分解剤として有用である。これらは，内因性フィブ
リン溶解過程を増強するために，単独で，またはプラス
ミノーゲンアクティベーターたとえばｔＰＡ，ストレプ
トキナーゼまたはウロキナーゼと併用して投与すること
ができる。
ーターへの到達およびその阻害を防止するペプチドは，
プラスミノーゲンのプラスミンの活性化を亢進させ，し
たがって繊維素溶解を促進する。この場合のペプチドは
ビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ｒ３７０，とくに好ま
しくはＫ３４８−Ｑ３６３からなり，急性心筋梗塞，深
部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，播種性血管内凝
固症候群，肺塞栓症および他の疾患の処置用プロフィブ
リン分解剤として有用である。これらは，内因性フィブ
リン溶解過程を増強するために，単独で，またはプラス
ミノーゲンアクティベーターたとえばｔＰＡ，ストレプ
トキナーゼまたはウロキナーゼと併用して投与すること
ができる。
【００２１】すなわち，好ましい一実施態様において
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｋ
３４８−Ｒ３７０の全配列または部分配列からなり，た
とえば本明細書においてＢＰ５（Ｋ３５８−Ｒ３７０）
およびＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と命名されたペプ
チドからなる。この配列内において，また別の好ましい
実施態様においては，ペプチドは，光学活性アミノ酸残
基の一部，とくに好ましくはそれらのすべてがＤコンフ
ィギュレーションであり，たとえば本明細書においてＢ
Ｐ７，ＢＰ８およびＢＰ１４と呼ばれるペプチドであ
る。ペプチドＢＰ７はＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と
同じ配列を有するが，配列式ＩＩにおいて下線を施した
残基はＬコンフィギュレーションではなく，Ｄコンフィ
ギュレーションである。ペプチドＢＰ８はＢＰ６と同じ
配列を有するが，すべての光学活性アミノ酸がＤコンフ
ィギュレーションである。ペプチドＢＰ１４（Ｎ３５６
−Ｑ３６３）はＢＰ８のＣ−末端残基を含有するが，そ
の光学活性アミノ酸はすべてＤコンフィギュレーション
を有する。光学活性アミノ酸残基の一部またはすべてが
Ｄ型であるペプチドは，止血および繊維素溶解に関与す
るプロテアーゼによる酵素的分解に，はるかに強力なま
たは完全な抵抗性を示すことになる。
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｋ
３４８−Ｒ３７０の全配列または部分配列からなり，た
とえば本明細書においてＢＰ５（Ｋ３５８−Ｒ３７０）
およびＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と命名されたペプ
チドからなる。この配列内において，また別の好ましい
実施態様においては，ペプチドは，光学活性アミノ酸残
基の一部，とくに好ましくはそれらのすべてがＤコンフ
ィギュレーションであり，たとえば本明細書においてＢ
Ｐ７，ＢＰ８およびＢＰ１４と呼ばれるペプチドであ
る。ペプチドＢＰ７はＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）と
同じ配列を有するが，配列式ＩＩにおいて下線を施した
残基はＬコンフィギュレーションではなく，Ｄコンフィ
ギュレーションである。ペプチドＢＰ８はＢＰ６と同じ
配列を有するが，すべての光学活性アミノ酸がＤコンフ
ィギュレーションである。ペプチドＢＰ１４（Ｎ３５６
−Ｑ３６３）はＢＰ８のＣ−末端残基を含有するが，そ
の光学活性アミノ酸はすべてＤコンフィギュレーション
を有する。光学活性アミノ酸残基の一部またはすべてが
Ｄ型であるペプチドは，止血および繊維素溶解に関与す
るプロテアーゼによる酵素的分解に，はるかに強力なま
たは完全な抵抗性を示すことになる。
【００２２】ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクティベ
ーターへの到達およびその阻害を許容するペプチドはプ
ラスミノーゲンからのプラスミンの形成を防止する。こ
の場合，ペプチドはビトロネクチンの位置Ｓ３６２−Ａ
３８０に相当する完全もしくは部分的配列からなり，た
とえば出血性障害のような，プラスミンによる過剰の
（非制御）蛋白分解に伴う障害の処置のための抗フィブ
リン溶解剤として有用である。このような抗フィブリン
溶解剤の例にはペプチドＢＰ４がある。
ーターへの到達およびその阻害を許容するペプチドはプ
ラスミノーゲンからのプラスミンの形成を防止する。こ
の場合，ペプチドはビトロネクチンの位置Ｓ３６２−Ａ
３８０に相当する完全もしくは部分的配列からなり，た
とえば出血性障害のような，プラスミンによる過剰の
（非制御）蛋白分解に伴う障害の処置のための抗フィブ
リン溶解剤として有用である。このような抗フィブリン
溶解剤の例にはペプチドＢＰ４がある。
【００２３】すなわち，他の好ましい実施態様において
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ａ３８０の完全もしくは部分的配列からなり，
たとえば本明細書においてＢＰ４（Ｓ３６２−
Ａ３８０），ＢＰ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）および
ＢＰ４−２（Ｓ３６２−Ｒ３６９）と呼ばれるペプチド
である。
は，本発明のペプチドは，ビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ａ３８０の完全もしくは部分的配列からなり，
たとえば本明細書においてＢＰ４（Ｓ３６２−
Ａ３８０），ＢＰ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）および
ＢＰ４−２（Ｓ３６２−Ｒ３６９）と呼ばれるペプチド
である。
【００２４】本発明のペプチドおよび医薬組成物は，Ｐ
ＡＩ−１の変動が関与する疾患，たとえば急性心筋梗
塞，深部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，肺塞栓
症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症たとえば膵臓の炎症，肝疾患，細菌性血液感染
症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制御，神経再生，
または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う病的状態たとえ
ば癌転移の処置用に有用性が考えられる。
ＡＩ−１の変動が関与する疾患，たとえば急性心筋梗
塞，深部静脈血栓症たとえば下腿静脈血栓症，肺塞栓
症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症たとえば膵臓の炎症，肝疾患，細菌性血液感染
症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制御，神経再生，
または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う病的状態たとえ
ば癌転移の処置用に有用性が考えられる。
【００２５】図面の簡単な説明 図１は，繊維素溶解に関連する分子的事象の順序を示す
模式図である。この場合，プラスミンはフィードバック
シグナリング，細胞外マトリックス（たとえば血管内皮
下層）に見出される固定化ビトロネクチンから解放さ
れ，止血事象の局部に暴露されるＰＡＩ−１によって，
それ自体の産生を停止することができる。ＰＡ，プラス
ミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−１，プラスミノ
ーゲンアクティベーターインヒビター１；Ｖｎ，ビトロ
ネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリップされたビトロ
ネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），不溶性；＋，刺
激；−，阻害。
模式図である。この場合，プラスミンはフィードバック
シグナリング，細胞外マトリックス（たとえば血管内皮
下層）に見出される固定化ビトロネクチンから解放さ
れ，止血事象の局部に暴露されるＰＡＩ−１によって，
それ自体の産生を停止することができる。ＰＡ，プラス
ミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−１，プラスミノ
ーゲンアクティベーターインヒビター１；Ｖｎ，ビトロ
ネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリップされたビトロ
ネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），不溶性；＋，刺
激；−，阻害。
【００２６】図２は，陽電荷で荷電された塩基性アミノ
酸集団（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチ
ンの部分の配列を示し，ＰＫＡのリン酸化部位（Ｓｅｒ
３７８），内因性切断部位（Ａｒｇ３７９−Ａｌａ
３９０），プラスミン切断部位（Ａｒｇ３６１−Ｓｅｒ
３６２ ）およびヘパリン結合部位（位置３４８−３５
９）の間の関係を示す配列図である。
酸集団（残基３４８−３８０）を含有するビトロネクチ
ンの部分の配列を示し，ＰＫＡのリン酸化部位（Ｓｅｒ
３７８），内因性切断部位（Ａｒｇ３７９−Ａｌａ
３９０），プラスミン切断部位（Ａｒｇ３６１−Ｓｅｒ
３６２ ）およびヘパリン結合部位（位置３４８−３５
９）の間の関係を示す配列図である。
【００２７】図３Ａ〜Ｄは，ビトロネクチンの位置３４
８−３８０に相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影響
を示す。パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２
（△）および非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ３（□），
ＢＰ４（△），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ（４−
１）（□），ＢＰ（４−２）（△），非添加（○）；パ
ネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ６
（●），非添加（○）。グラフ中の各点は，３回の測定
結果の平均を表す。インキュベーション混合物中の最終
ペプチド濃度は２５μＭとした。
８−３８０に相当するＢＰ系からの合成ペプチドの，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影響
を示す。パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２
（△）および非添加（○）；パネルＢ：ＢＰ３（□），
ＢＰ４（△），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ（４−
１）（□），ＢＰ（４−２）（△），非添加（○）；パ
ネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ６
（●），非添加（○）。グラフ中の各点は，３回の測定
結果の平均を表す。インキュベーション混合物中の最終
ペプチド濃度は２５μＭとした。
【００２８】図４ＡおよびＢは，パネルＡ：ペプチドＢ
Ｐ４−１（△）およびＢＰ５（□），ならびにパネル
Ｂ：ペプチドＢＰ５（●）およびＢＰ６（▲）の等モル
濃度（２５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビト
ロネクチンの結合の妨害の相対的効果を示す。非添加
（○）
Ｐ４−１（△）およびＢＰ５（□），ならびにパネル
Ｂ：ペプチドＢＰ５（●）およびＢＰ６（▲）の等モル
濃度（２５μＭ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビト
ロネクチンの結合の妨害の相対的効果を示す。非添加
（○）
【００２９】図５Ａ〜Ｃは，様々な濃度のＢＰ４（パネ
ルＡ），ＢＰ５（パネルＢ）およびＢＰ６（パネルＣ）
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る効果を示す。パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），
５μＭ（△），１２μＭ（●），２５μＭ（■），非添
加（○）；パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０
μＭ（△），２５μＭ（●），１００μＭ（■），２５
０μＭ（▲），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ６，２．
５μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），２５μ
Ｍ（■），非添加（○）
ルＡ），ＢＰ５（パネルＢ）およびＢＰ６（パネルＣ）
の，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対す
る効果を示す。パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），
５μＭ（△），１２μＭ（●），２５μＭ（■），非添
加（○）；パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０
μＭ（△），２５μＭ（●），１００μＭ（■），２５
０μＭ（▲），非添加（○）；パネルＣ：ＢＰ６，２．
５μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），２５μ
Ｍ（■），非添加（○）
【００３０】図６は，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネク
チンの結合に対する低濃度のＢＰ６の影響を示す。非添
加（○），０．１μＭＢＰ６（△），０．５μＭＢＰ６
（□）
チンの結合に対する低濃度のＢＰ６の影響を示す。非添
加（○），０．１μＭＢＰ６（△），０．５μＭＢＰ６
（□）
【００３１】図７は，ビトロネクチンのＰＡＩ−１への
会合の阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）および
ＢＰ６（●）の効果の比較を例示する。ビトロネクチン
の最終濃度は一定とし（０．５μｇ／ｍｌ），ペプチド
の濃度を指示のように変動させた。
会合の阻害におけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）および
ＢＰ６（●）の効果の比較を例示する。ビトロネクチン
の最終濃度は一定とし（０．５μｇ／ｍｌ），ペプチド
の濃度を指示のように変動させた。
【００３２】図８Ａ〜Ｃは，Ｄ−コンフィギュレーショ
ンをもつアミノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネル
Ａ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）
の様々な濃度での，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対する影響を示す。パネルＡ：ＢＰ７，１μ
Ｍ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），非添加
（○）；パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ
（△），１０μＭ（●），非添加（○）；パネルＣ：Ｂ
Ｐ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ
（●），非添加（○）
ンをもつアミノ酸からなるペプチドＢＰ７（パネル
Ａ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４（パネルＣ）
の様々な濃度での，固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対する影響を示す。パネルＡ：ＢＰ７，１μ
Ｍ（□），５μＭ（△），１０μＭ（●），非添加
（○）；パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ
（△），１０μＭ（●），非添加（○）；パネルＣ：Ｂ
Ｐ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１０μＭ
（●），非添加（○）
【００３３】図９は，全Ｄ−ペプチドＢＰ８のプロフィ
ブリン溶解活性を示す。繊維素溶解の増強はＤ−ダイマ
ー形成によるフィブリンクロット溶解の測定によりモニ
タリングした。
ブリン溶解活性を示す。繊維素溶解の増強はＤ−ダイマ
ー形成によるフィブリンクロット溶解の測定によりモニ
タリングした。
【００３４】図１０Ａ〜Ｅは，５０μｇ／ｋｇ用量の薬
剤の投与後における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８の
プロフィブリン溶解活性を評価した実験を例示する。パ
ネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
剤の投与後における脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８の
プロフィブリン溶解活性を評価した実験を例示する。パ
ネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
【００３５】好ましい実施態様の説明 本発明のペプチドは，ＰＡＩ−１に対して高い親和性を
有し，したがって，このインヒビターをビトロネクチン
から置換できる。それらは，内皮下層または凝集血小板
の表面から，阻害型（可溶性ビトロネクチンに結合）で
ＰＡＩ−１を解放することができて，したがってプラス
ミン形成および繊維素溶解をブロックし，または，ビト
ロネクチンからＰＡＩ−１を解放し，その潜在型（不活
性型）への変換を許容し，その結果，プラスミノーゲン
アクティベーターの阻害が防止され，繊維素溶解が促進
される。
有し，したがって，このインヒビターをビトロネクチン
から置換できる。それらは，内皮下層または凝集血小板
の表面から，阻害型（可溶性ビトロネクチンに結合）で
ＰＡＩ−１を解放することができて，したがってプラス
ミン形成および繊維素溶解をブロックし，または，ビト
ロネクチンからＰＡＩ−１を解放し，その潜在型（不活
性型）への変換を許容し，その結果，プラスミノーゲン
アクティベーターの阻害が防止され，繊維素溶解が促進
される。
【００３６】繊維素溶解の修飾におけるこれらのペプチ
ドの効果は，ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては，たとえば培
養内皮細胞によるＤ−ダイマー形成およびＰＡＩ−１の
放出，または，ｉｎ ｖｉｖｏにおいては動物での脈拍
血流の回復によって評価できる。他の一般に使用される
臨床的血液検査，たとえばトロンボン時間，オイグロブ
リン溶解時間，希釈全血血餅溶解時間，血餅退縮，およ
び培養内皮細胞によるｔＰＡの放出の測定を使用するこ
ともできる。
ドの効果は，ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては，たとえば培
養内皮細胞によるＤ−ダイマー形成およびＰＡＩ−１の
放出，または，ｉｎ ｖｉｖｏにおいては動物での脈拍
血流の回復によって評価できる。他の一般に使用される
臨床的血液検査，たとえばトロンボン時間，オイグロブ
リン溶解時間，希釈全血血餅溶解時間，血餅退縮，およ
び培養内皮細胞によるｔＰＡの放出の測定を使用するこ
ともできる。
【００３７】本明細書において用いられるペプチドなら
びにそれらの官能性誘導体および類縁体の「塩」の語
は，アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と有機または無
機塩基の塩，ならびに遊離アミノ基の酸付加塩を包含す
る。「官能性誘導体」の語は，遊離−ＯＨ，−ＮＨ２−
および−ＣＯＯＨ基の誘導体，たとえばエステルたとえ
ばＳ，ＴおよびＹ残基のリン酸エステル，エーテル，ア
ミド等を包含し，「類縁体」の語はアミノ残基の置換，
付加または欠失によって得られるペプチドからなり，環
状ペプチドを包含する。ペプチドの塩，官能性誘導体お
よび類縁体は，それらがＰＡＩ−１の生物学的活性を修
飾できる限り，本発明の範囲に包含される。
びにそれらの官能性誘導体および類縁体の「塩」の語
は，アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と有機または無
機塩基の塩，ならびに遊離アミノ基の酸付加塩を包含す
る。「官能性誘導体」の語は，遊離−ＯＨ，−ＮＨ２−
および−ＣＯＯＨ基の誘導体，たとえばエステルたとえ
ばＳ，ＴおよびＹ残基のリン酸エステル，エーテル，ア
ミド等を包含し，「類縁体」の語はアミノ残基の置換，
付加または欠失によって得られるペプチドからなり，環
状ペプチドを包含する。ペプチドの塩，官能性誘導体お
よび類縁体は，それらがＰＡＩ−１の生物学的活性を修
飾できる限り，本発明の範囲に包含される。
【００３８】本発明に要求されるペプチドの全体的陽電
荷高密度および疎水性特性は保存されていなければなら
ない。すなわち，ビトロネクチン分子中への付加，また
はその残基の置換に用いられるアミノ酸は，この要求に
合致するものでなければならない。陰性に荷電したアミ
ノ酸（Ｅ，Ｄ），および過剰に高度な疎水性アミノ酸
（Ｗ，Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｉ）は避けねばならない。陽性に荷
電したアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）が推奨される。すなわ
ち，Ｒ，ＫおよびＨのような残基間での交換が可能であ
る。
荷高密度および疎水性特性は保存されていなければなら
ない。すなわち，ビトロネクチン分子中への付加，また
はその残基の置換に用いられるアミノ酸は，この要求に
合致するものでなければならない。陰性に荷電したアミ
ノ酸（Ｅ，Ｄ），および過剰に高度な疎水性アミノ酸
（Ｗ，Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｉ）は避けねばならない。陽性に荷
電したアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）が推奨される。すなわ
ち，Ｒ，ＫおよびＨのような残基間での交換が可能であ
る。
【００３９】本発明の医薬組成物は，本発明のペプチ
ド，官能性誘導体，類縁体，またはそれらの塩，ならび
に医薬的に許容される担体からなる。この組成物は，任
意の投与様式，たとえば経口，局所，注射または静脈内
輸液によって使用できる。様々な賦形剤，たとえば正常
食塩水，グルコースまたは他の担体とともに，また他の
治療用物質とともにもしくは単独で，提供できる。投与
量は，患者の状態および処置すべき特定の状態によって
変動する。たとえば，血餅の溶解は，様々な生体領域，
たとえば脳，深部静脈，冠動脈等において実行できる。
ド，官能性誘導体，類縁体，またはそれらの塩，ならび
に医薬的に許容される担体からなる。この組成物は，任
意の投与様式，たとえば経口，局所，注射または静脈内
輸液によって使用できる。様々な賦形剤，たとえば正常
食塩水，グルコースまたは他の担体とともに，また他の
治療用物質とともにもしくは単独で，提供できる。投与
量は，患者の状態および処置すべき特定の状態によって
変動する。たとえば，血餅の溶解は，様々な生体領域，
たとえば脳，深部静脈，冠動脈等において実行できる。
【００４０】組成物が，プロフィブリン溶解性のペプチ
ドからなる場合には，単独で，あるいはプラスミノーゲ
ンアクティベーターたとえば天然もしくは組換え組織プ
ラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ），ウロキナ
ーゼまたはストレプトキナーゼと併用して投与できる。
ドからなる場合には，単独で，あるいはプラスミノーゲ
ンアクティベーターたとえば天然もしくは組換え組織プ
ラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ），ウロキナ
ーゼまたはストレプトキナーゼと併用して投与できる。
【００４１】本発明において使用される剤形は，既知の
製薬方法および操作を用いて処方できる。それらは粉末
として，または液体懸濁液ちして提供される。
製薬方法および操作を用いて処方できる。それらは粉末
として，または液体懸濁液ちして提供される。
【００４２】本発明はさらに，ビトロネクチンのアミノ
酸残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全
配列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能
性誘導体，およびそのペプチドの全体的性質がその高陽
電荷密度および全体的疎水性特性に関して保存されるよ
うな１もしくは２以上のアミノ酸の置換，付加または欠
失によって得られるそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−
１の生物学的活性を修飾することができる上記ペプチド
ならびにそれらの塩，官能性誘導体および類縁体の，急
性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性血管内
凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝疾患，
細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制
御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う
病的状態たとえば癌転移の処置用の医薬組成物の製造の
ための使用に関する。
酸残基Ｋ３４８−Ａ３８０を包含する部分配列または全
配列からなる合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能
性誘導体，およびそのペプチドの全体的性質がその高陽
電荷密度および全体的疎水性特性に関して保存されるよ
うな１もしくは２以上のアミノ酸の置換，付加または欠
失によって得られるそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−
１の生物学的活性を修飾することができる上記ペプチド
ならびにそれらの塩，官能性誘導体および類縁体の，急
性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性血管内
凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝疾患，
細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形成の制
御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解を伴う
病的状態たとえば癌転移の処置用の医薬組成物の製造の
ための使用に関する。
【００４３】本発明の他の実施態様においては，本発明
は，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性
血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝
疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形
成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解
を伴う病的状態から選ばれる疾患を有する患者の処置方
法において，本明細書で定義されたペプチドの治療有効
量を，本発明の医薬組成物の活性成分として，上述の患
者に投与することからなる方法に関する。
は，急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞栓症，播種性
血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転移，炎症，肝
疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，ならびに血管形
成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ仲介蛋白分解
を伴う病的状態から選ばれる疾患を有する患者の処置方
法において，本明細書で定義されたペプチドの治療有効
量を，本発明の医薬組成物の活性成分として，上述の患
者に投与することからなる方法に関する。
【００４４】本発明を以下の非限定的実施例により例示
する。実施例 材料および方法 ａ）購入された材料 新鮮な凍結ヒト血漿は，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉ
ｓｒａｅｌから入手した。ウサギ抗−ヒトビトロネクチ
ンポリクローナル抗体は，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入
手した。β−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡおよび
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ
ＮＰＧ）は Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．から購入し
た。ＰＡＩ−１は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手した。他の試剤は
すべて，入手できる市販品の最高の等級のものとした。
する。実施例 材料および方法 ａ）購入された材料 新鮮な凍結ヒト血漿は，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉ
ｓｒａｅｌから入手した。ウサギ抗−ヒトビトロネクチ
ンポリクローナル抗体は，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入
手した。β−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡおよび
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ
ＮＰＧ）は Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．から購入し
た。ＰＡＩ−１は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手した。他の試剤は
すべて，入手できる市販品の最高の等級のものとした。
【００４５】ｂ）ビトロネクチン ビトロネクチンは新鮮な凍結ビト血漿から，Ｋｏｒｃ−
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０に報告された精製操作
を用いて調製した。このプレパレーションは通常，この
蛋白質を２つの分子型で含有していた。単一鎖Ｖ
７５型，および蛋白分解的にクリップされ，ジスルフィ
ド橋で互いに保持された２鎖Ｖ６５＋１０型である（Ｄ
ａｈｌｂａｃｋ ＆ Ｐｏｄａｃｋ，１９８５；Ｊｅｎ
ｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８５）。
Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉら，１９９０に報告された精製操作
を用いて調製した。このプレパレーションは通常，この
蛋白質を２つの分子型で含有していた。単一鎖Ｖ
７５型，および蛋白分解的にクリップされ，ジスルフィ
ド橋で互いに保持された２鎖Ｖ６５＋１０型である（Ｄ
ａｈｌｂａｃｋ ＆ Ｐｏｄａｃｋ，１９８５；Ｊｅｎ
ｎｅ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９８５）。
【００４６】ｃ）文献の記載に従って実施された操作 蛋白質の濃度は，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６によって
報告された方法により測定した。固定化ＰＡＩ−１に対
するビトロネクチンの結合はＳａｌｏｎｅｎら，１９８
９の記載に従って実施した。ドデシル硫酸ナトリウムに
よるＰＡＩ−１の活性化はＫａｔａｇｉｒｉら，１９８
８の報告に従って実施した。アミノ酸の配列決定はＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７５Ａシーケンサ
ーを用いて行った。
報告された方法により測定した。固定化ＰＡＩ−１に対
するビトロネクチンの結合はＳａｌｏｎｅｎら，１９８
９の記載に従って実施した。ドデシル硫酸ナトリウムに
よるＰＡＩ−１の活性化はＫａｔａｇｉｒｉら，１９８
８の報告に従って実施した。アミノ酸の配列決定はＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７５Ａシーケンサ
ーを用いて行った。
【００４７】例１．ペプチドの合成 本発明のペプチドは，本技術分野でよく知られている操
作を用い，化学的合成または遺伝子工学的方法によって
製造できる。ペプチドの合成は，機械振盪器中，固相法
（Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８
０）を用い，クロロメチル化ポリスチレン−１％ジビニ
ルベンゼン樹脂（Ｃｈｅｍａｌｏｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌ
ａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）上で，手動で行った。α−ア
ミノ基はｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基
で保護した。側鎖は以下の保護基，すなわち，セリン
（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）はベンジル；チロシン
（Ｙ）は２，６−ジクロロベンジル；リジン（Ｋ）は２
−クロロベンジルオキシカルボニル；アルギニン（Ｒ）
はｐ−トルエンスルホニル；ヒスチジン（Ｈ）はベンジ
ルオキシカルボニルで遮蔽した。合成は，Ｃ末端アミノ
酸を樹脂にカップリングさせることにより開始した。ペ
プチドの延長（カップリング）は３倍モル過剰の保護ア
ミノ酸，およびカップリング剤としてＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールの等モル混合物を用いて行った。ペプチドの脱保
護およびポリマーからの離脱には無水ＨＦを用いた。粗
製のペプチドは，製造用ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂＲＰ−８；７μｍ；２５０×１０ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ，
Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により，水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および７５％アセ
トニトリル／水中０．１％ＴＦＡの間で確立された直線
勾配を用いて，均一に精製した。
作を用い，化学的合成または遺伝子工学的方法によって
製造できる。ペプチドの合成は，機械振盪器中，固相法
（Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８
０）を用い，クロロメチル化ポリスチレン−１％ジビニ
ルベンゼン樹脂（Ｃｈｅｍａｌｏｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌ
ａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）上で，手動で行った。α−ア
ミノ基はｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基
で保護した。側鎖は以下の保護基，すなわち，セリン
（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）はベンジル；チロシン
（Ｙ）は２，６−ジクロロベンジル；リジン（Ｋ）は２
−クロロベンジルオキシカルボニル；アルギニン（Ｒ）
はｐ−トルエンスルホニル；ヒスチジン（Ｈ）はベンジ
ルオキシカルボニルで遮蔽した。合成は，Ｃ末端アミノ
酸を樹脂にカップリングさせることにより開始した。ペ
プチドの延長（カップリング）は３倍モル過剰の保護ア
ミノ酸，およびカップリング剤としてＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールの等モル混合物を用いて行った。ペプチドの脱保
護およびポリマーからの離脱には無水ＨＦを用いた。粗
製のペプチドは，製造用ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂＲＰ−８；７μｍ；２５０×１０ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ，
Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により，水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および７５％アセ
トニトリル／水中０．１％ＴＦＡの間で確立された直線
勾配を用いて，均一に精製した。
【００４８】ビトロネクチン中のＰＡＩ−１結合部位の
マッピングには，その血漿切断部位（Ｒ３６１−Ｓ
３６２）（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ）の周囲のアミノ
酸配列に由来する構造の一連のペプチドを合成した。調
製したペプチドの配列は，前掲の配列式ＩおよびＩＩに
示す。各ペプチドの構造は，そのアミノ酸組成および配
列の決定によって確認した。ペプチドＢＰ４，ＢＰ４−
１，ＢＰ５，ＢＰ６およびＢＰ７のアミノ酸分析を表３
に掲げる。ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６の配列
分析を表４に示す。
マッピングには，その血漿切断部位（Ｒ３６１−Ｓ
３６２）（Ｃｈａｉｎら，１９９１ｂ）の周囲のアミノ
酸配列に由来する構造の一連のペプチドを合成した。調
製したペプチドの配列は，前掲の配列式ＩおよびＩＩに
示す。各ペプチドの構造は，そのアミノ酸組成および配
列の決定によって確認した。ペプチドＢＰ４，ＢＰ４−
１，ＢＰ５，ＢＰ６およびＢＰ７のアミノ酸分析を表３
に掲げる。ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６の配列
分析を表４に示す。
【００４９】
【表３】
【表４】
【００５０】例２．固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチ
ンの結合に対するＢＰ系合成ペプチドの影響 配列式Ｉに示した各合成ペプチドおよびＤコンフィギュ
レーションを有するアミノ酸を含有するペプチド（ＢＰ
７，ＢＰ８およびＢＰ１４）につき，固定化活性化ＰＡ
Ｉ−１へのビトロネクチンの結合のそれらの阻害能を競
合的ＥＬＩＳＡで試験した。最初のスクリーニング（図
３）は同じモル濃度（２５μＭ）のペプチドを用いて実
施した。このような試験には変動の可能性があることを
考慮し（主としてプレート上の活性化ＰＡＩ−１コーテ
ィングの変動による），各プレートについてビトロネク
チン単独のコントロールを対照として並流させた。
ンの結合に対するＢＰ系合成ペプチドの影響 配列式Ｉに示した各合成ペプチドおよびＤコンフィギュ
レーションを有するアミノ酸を含有するペプチド（ＢＰ
７，ＢＰ８およびＢＰ１４）につき，固定化活性化ＰＡ
Ｉ−１へのビトロネクチンの結合のそれらの阻害能を競
合的ＥＬＩＳＡで試験した。最初のスクリーニング（図
３）は同じモル濃度（２５μＭ）のペプチドを用いて実
施した。このような試験には変動の可能性があることを
考慮し（主としてプレート上の活性化ＰＡＩ−１コーテ
ィングの変動による），各プレートについてビトロネク
チン単独のコントロールを対照として並流させた。
【００５１】各種合成ペプチド（すべて５０μＭ）を，
ＰＢＳ，ツイーン２０（０．０１％），ポリエチレング
リコール（平均分子量８ｋＤａ）（４％ｗ／ｖ）からな
る緩衝液５０μｌ中に溶解した。各サンプルを，Ｋａｔ
ａｇｉｒｉら，１９８８の記載に従って調製したＳＤＳ
−活性化ＰＡＩでコーティングしたマイクロタイターウ
エルに添加した。２２℃で３３分間インキュベートした
のち，同一緩衝液中ビトロネクチン溶液（各種濃度）の
サンプル（５０μｌ）を各ウエルに加えた。ついで，３
７℃で２時間インキュベートした。結合したビトロネク
チンの量を，特異的ウサギ抗−ヒトＶｎ抗体（１：１０
０希釈），ついでβ−ガラクトシダーゼ連結プロテイン
Ａおよび基質としてｏ−ニトロフェニル−β−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）を加えて定量した。酵素反応を
進行させ，４０５ ＋４９０ｎｍにおける吸収を測定し
た。結果は図３に示す。グラフ中の各点は３回の測定か
らの平均を表す。インキュベーション混合物中の最終ペ
プチド濃度は２５μＭとし，ビトロネクチン濃度は指示
した通りとする。
ＰＢＳ，ツイーン２０（０．０１％），ポリエチレング
リコール（平均分子量８ｋＤａ）（４％ｗ／ｖ）からな
る緩衝液５０μｌ中に溶解した。各サンプルを，Ｋａｔ
ａｇｉｒｉら，１９８８の記載に従って調製したＳＤＳ
−活性化ＰＡＩでコーティングしたマイクロタイターウ
エルに添加した。２２℃で３３分間インキュベートした
のち，同一緩衝液中ビトロネクチン溶液（各種濃度）の
サンプル（５０μｌ）を各ウエルに加えた。ついで，３
７℃で２時間インキュベートした。結合したビトロネク
チンの量を，特異的ウサギ抗−ヒトＶｎ抗体（１：１０
０希釈），ついでβ−ガラクトシダーゼ連結プロテイン
Ａおよび基質としてｏ−ニトロフェニル−β−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）を加えて定量した。酵素反応を
進行させ，４０５ ＋４９０ｎｍにおける吸収を測定し
た。結果は図３に示す。グラフ中の各点は３回の測定か
らの平均を表す。インキュベーション混合物中の最終ペ
プチド濃度は２５μＭとし，ビトロネクチン濃度は指示
した通りとする。
【００５２】図３から明らかなように，血漿切断部位
（Ｒ３６１−Ｓ３６２）および内因性切断部位（Ｒ
３７９−Ｒ３８０）の間のビトロネクチン配列をカバー
する，ペプチドＢＰ１，ＢＰ２，ＢＰ３およびＢＰ４は
すべて（パネルＡおよびＢ），ＰＡＩ−１へのビトロネ
クチンの結合をある程度まで阻害する。この阻害は，Ｂ
Ｐ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）がかなり有効なインヒ
ビターであり（図３，パネルＣ），一方，ＢＰ１（Ｎ
３７１−Ａ３８０）には作用はあっても，きわめて軽度
の阻害しか示さなかったこと（図３，パネルＡ）から，
主として，ＢＰ４のＮ末端残基によるものである。ＢＰ
４−１よりアミノ酸２個分小さいにすぎないＢＰ４−２
（Ｓ３６２−Ｒ３６８）のインヒビターとしての有効性
が劣ることは，Ｇ３６９および／またはＲ３７０が重要
な生物学的認識要素を含んでいることを示唆するもので
ある。また，各種ペプチドの阻害能は，ＢＰ４−１（正
味電荷＋４）がＢＰ３（正味電荷＋６）またはＢＰ４
（正味電荷＋７）よりも有効であったこと（図３，パネ
ルおよびＣ）から，単にそれらの陽性電荷によるのみで
はないことが考えられる。
（Ｒ３６１−Ｓ３６２）および内因性切断部位（Ｒ
３７９−Ｒ３８０）の間のビトロネクチン配列をカバー
する，ペプチドＢＰ１，ＢＰ２，ＢＰ３およびＢＰ４は
すべて（パネルＡおよびＢ），ＰＡＩ−１へのビトロネ
クチンの結合をある程度まで阻害する。この阻害は，Ｂ
Ｐ４−１（Ｓ３６２−Ｒ３７０）がかなり有効なインヒ
ビターであり（図３，パネルＣ），一方，ＢＰ１（Ｎ
３７１−Ａ３８０）には作用はあっても，きわめて軽度
の阻害しか示さなかったこと（図３，パネルＡ）から，
主として，ＢＰ４のＮ末端残基によるものである。ＢＰ
４−１よりアミノ酸２個分小さいにすぎないＢＰ４−２
（Ｓ３６２−Ｒ３６８）のインヒビターとしての有効性
が劣ることは，Ｇ３６９および／またはＲ３７０が重要
な生物学的認識要素を含んでいることを示唆するもので
ある。また，各種ペプチドの阻害能は，ＢＰ４−１（正
味電荷＋４）がＢＰ３（正味電荷＋６）またはＢＰ４
（正味電荷＋７）よりも有効であったこと（図３，パネ
ルおよびＣ）から，単にそれらの陽性電荷によるのみで
はないことが考えられる。
【００５３】ＢＰ４−１のすべてを含み，さらに血漿切
断部位を越えて延長されたペプチドＢＰ５（Ｋ３５８−
Ｒ３７０）は，インヒビターとしてＢＰ４−１よりも有
効であることが明らかにされた（図３，パネルＤ）。さ
らに，ペプチドＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）は，この
系で最も有効であると考えられた（図３，パネルＤ）。
断部位を越えて延長されたペプチドＢＰ５（Ｋ３５８−
Ｒ３７０）は，インヒビターとしてＢＰ４−１よりも有
効であることが明らかにされた（図３，パネルＤ）。さ
らに，ペプチドＢＰ６（Ｋ３４８−Ｑ３６３）は，この
系で最も有効であると考えられた（図３，パネルＤ）。
【００５４】ついで，ペプチドＢＰ４，ＢＰ５およびＢ
Ｐ６の相対的な阻害強度を，阻害の濃度依存性を測定す
ることによって評価した。図４に示すように，等モル
（各ペプチド２５μＭ）ベースで，ＢＰ５はＢＰ４−１
より優れ（パネルＡ），ＢＰ６はＢＰ５よりも有効であ
る（パネルＢ）。
Ｐ６の相対的な阻害強度を，阻害の濃度依存性を測定す
ることによって評価した。図４に示すように，等モル
（各ペプチド２５μＭ）ベースで，ＢＰ５はＢＰ４−１
より優れ（パネルＡ），ＢＰ６はＢＰ５よりも有効であ
る（パネルＢ）。
【００５５】図５から明らかなように，３種のペプチド
ＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６はすべて，濃度を増大させ
ると最大阻害に到達した。しかしながらＢＰ４は濃度２
５μＭで最大阻害に達し（図５，パネルＡ），ＢＰ５は
１００μＭで最大阻害に達した（図５，パネルＢ）のに
対し，ペプチドＢＰ６は濃度２．５μＭすでに最大効果
を示した（図５，パネルＣ）。
ＢＰ４，ＢＰ５およびＢＰ６はすべて，濃度を増大させ
ると最大阻害に到達した。しかしながらＢＰ４は濃度２
５μＭで最大阻害に達し（図５，パネルＡ），ＢＰ５は
１００μＭで最大阻害に達した（図５，パネルＢ）のに
対し，ペプチドＢＰ６は濃度２．５μＭすでに最大効果
を示した（図５，パネルＣ）。
【００５６】これはさらに，ＰＡＩ−１結合の最大阻害
はペプチドＢＰ６ではすでに０．１μＭ（０．１５μｇ
／ｍｌ）の濃度で達成されたことを示す図６，ならびに
これらのペプチドの相対的阻害効果を単一のビトロネク
チン濃度（０．５μｇ／ｍｌ）で比較した図７によって
例示される。この図からは，３種のペプチドのすべてが
同じレベルの阻害（約６５％）を達成することが明らか
である。しかしながら，ＢＰ６は，このレベルの阻害を
ＢＰ４およびＢＰ５の場合よりも２００〜５００倍低い
濃度で示す。
はペプチドＢＰ６ではすでに０．１μＭ（０．１５μｇ
／ｍｌ）の濃度で達成されたことを示す図６，ならびに
これらのペプチドの相対的阻害効果を単一のビトロネク
チン濃度（０．５μｇ／ｍｌ）で比較した図７によって
例示される。この図からは，３種のペプチドのすべてが
同じレベルの阻害（約６５％）を達成することが明らか
である。しかしながら，ＢＰ６は，このレベルの阻害を
ＢＰ４およびＢＰ５の場合よりも２００〜５００倍低い
濃度で示す。
【００５７】上に示した結果は，ＰＡＩ−１結合部位の
高い親和性要素の一部はＫ３４８−Ｒ３５７領域に存在
するが，完全なＰＡＩ−１結合部位はＫ３４８−Ｒ
３７０配列を包含することを示している。このＰＡＩ−
１結合部位の位置決定は，Ｒ３６１−Ｓ３６２結合をプ
ラスミンで切断すると，この切断によりＰＡＩ−１結合
部位が２つに分裂して，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の
間の親和性が減弱し，このインヒビターが解放されると
いう，われわれの以前の所見（Ｃｈａｉｎら，１９９１
ｂ）を説明するものである。
高い親和性要素の一部はＫ３４８−Ｒ３５７領域に存在
するが，完全なＰＡＩ−１結合部位はＫ３４８−Ｒ
３７０配列を包含することを示している。このＰＡＩ−
１結合部位の位置決定は，Ｒ３６１−Ｓ３６２結合をプ
ラスミンで切断すると，この切断によりＰＡＩ−１結合
部位が２つに分裂して，ビトロネクチンとＰＡＩ−１の
間の親和性が減弱し，このインヒビターが解放されると
いう，われわれの以前の所見（Ｃｈａｉｎら，１９９１
ｂ）を説明するものである。
【００５８】Ｄコンフィギュレーションを有するアミノ
酸を含むペプチドに関しては，図８に示すように，ＢＰ
７（パネルＡ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４
（パネルＣ）の３種のすべてのペプチドが，固定化ＰＡ
Ｉ−１に結合するが，ＢＰ８はＢＰ７およびＢＰ１４よ
りも強力に結合するように思われる。
酸を含むペプチドに関しては，図８に示すように，ＢＰ
７（パネルＡ），ＢＰ８（パネルＢ）およびＢＰ１４
（パネルＣ）の３種のすべてのペプチドが，固定化ＰＡ
Ｉ−１に結合するが，ＢＰ８はＢＰ７およびＢＰ１４よ
りも強力に結合するように思われる。
【００５９】例３．ＢＰ系合成ペプチドの繊維素溶解の
修飾に対する影響 本発明の合成ペプチドの，繊維素溶解の修飾における効
果は，一般に使用されている臨床的血液検査，主とし
て，培養内皮細胞によるフィブリンＤ−ダイマー形成お
よびＰＡＩ−１の放出によるフィブリンクロット溶解の
修飾によって評価される。使用できる他の検査には，ト
ロンビン時間，オイグロブリン溶解時間，希釈全血血餅
溶解時間，血餅退縮，および培養内皮細胞によるｔＰＡ
の放出の測定が包含される。
修飾に対する影響 本発明の合成ペプチドの，繊維素溶解の修飾における効
果は，一般に使用されている臨床的血液検査，主とし
て，培養内皮細胞によるフィブリンＤ−ダイマー形成お
よびＰＡＩ−１の放出によるフィブリンクロット溶解の
修飾によって評価される。使用できる他の検査には，ト
ロンビン時間，オイグロブリン溶解時間，希釈全血血餅
溶解時間，血餅退縮，および培養内皮細胞によるｔＰＡ
の放出の測定が包含される。
【００６０】３．１ Ｄ−ダイマー形成によるフィブリ
ンクロット溶解の修飾 ペプチドが添加ｔＰＡの存在下または非存在下に，フィ
ブリンクロット溶解を修飾する能力を評価するために
は，厚い層に生育させたヒト内皮細胞（ヒト臍帯から）
上に，ヒトフィブリノーゲン（若干のプラスミノーゲン
を含む）およびトロンビンを用いて，フィブリンクロッ
トゲルを形成させた。すなわち，ヒト内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣ）を，細胞外マトリックスで予めコートしたまたは
コートしていない２４ウエル組織培養プレート上，半コ
ンフルーエントな方法で培養した。この細胞を洗浄し，
３ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノーゲンと１単位のトロンビ
ン（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）を混合して構築したフィ
ブリンゲル０．４ｍｌにより，細胞上を覆った。フィブ
リンを３７℃で１時間クロットさせたのち，試験すべき
ペプチドを含有する０．４ｍｌの培地［１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）含有Ｍ−１９９］をフィブリンゲルの上
に置いた。ｔＰＡを加えまたは加えないで，アッセイ物
質を上清に希釈し，細胞とともに６時間インキュベート
した。上清からのサンプルを，Ｄ−ダオマーＥＩＡで試
験した。上清中におけるＤ−ダイマーの存在は，Ｒｙｌ
ａｔｔら，１９８３の酵素イムノアッセイにより，Ａｇ
ｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｂｒｉｓｂａ
ｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ からのキットを用いて検定
した。Ｄ−ダイマー形成は，試験すべきペプチドと，ｔ
ＰＡ（０．０９Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下に，
６時間インキュベートしたのち，２つのウエルで検出さ
れた。別のペプチド溶液をフィブリンゲルに，クロット
１時間後に添加した。添加ペプチドに非存在下，使用条
件では，このクロットは細胞から放出されるｔＰＡによ
るプラスミノーゲンの活性化によって，約２４時間で溶
解する。外因性ｔＰＡはこの過程を促進するために添加
できる。結果は表５に示す。
ンクロット溶解の修飾 ペプチドが添加ｔＰＡの存在下または非存在下に，フィ
ブリンクロット溶解を修飾する能力を評価するために
は，厚い層に生育させたヒト内皮細胞（ヒト臍帯から）
上に，ヒトフィブリノーゲン（若干のプラスミノーゲン
を含む）およびトロンビンを用いて，フィブリンクロッ
トゲルを形成させた。すなわち，ヒト内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣ）を，細胞外マトリックスで予めコートしたまたは
コートしていない２４ウエル組織培養プレート上，半コ
ンフルーエントな方法で培養した。この細胞を洗浄し，
３ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノーゲンと１単位のトロンビ
ン（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）を混合して構築したフィ
ブリンゲル０．４ｍｌにより，細胞上を覆った。フィブ
リンを３７℃で１時間クロットさせたのち，試験すべき
ペプチドを含有する０．４ｍｌの培地［１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）含有Ｍ−１９９］をフィブリンゲルの上
に置いた。ｔＰＡを加えまたは加えないで，アッセイ物
質を上清に希釈し，細胞とともに６時間インキュベート
した。上清からのサンプルを，Ｄ−ダオマーＥＩＡで試
験した。上清中におけるＤ−ダイマーの存在は，Ｒｙｌ
ａｔｔら，１９８３の酵素イムノアッセイにより，Ａｇ
ｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｂｒｉｓｂａ
ｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ からのキットを用いて検定
した。Ｄ−ダイマー形成は，試験すべきペプチドと，ｔ
ＰＡ（０．０９Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下に，
６時間インキュベートしたのち，２つのウエルで検出さ
れた。別のペプチド溶液をフィブリンゲルに，クロット
１時間後に添加した。添加ペプチドに非存在下，使用条
件では，このクロットは細胞から放出されるｔＰＡによ
るプラスミノーゲンの活性化によって，約２４時間で溶
解する。外因性ｔＰＡはこの過程を促進するために添加
できる。結果は表５に示す。
【表５】
【００６１】１００％を越える値を示すプロフィブリン
溶解ペプチド，たとえばＢＰ５およびＢＰ６はその過程
を促進し，１００％を下回る値を示す抗フィブリン溶解
ペプチド，たとえばＢＰ４はそれを阻害する。上述のペ
プチド中，ＢＰ６は，様々な濃度でそれについて実施し
た他の一連の実験から明らかなように，試験したペプチ
ド中で最も強力なプロフィブリン溶解ペプチドである。
溶解ペプチド，たとえばＢＰ５およびＢＰ６はその過程
を促進し，１００％を下回る値を示す抗フィブリン溶解
ペプチド，たとえばＢＰ４はそれを阻害する。上述のペ
プチド中，ＢＰ６は，様々な濃度でそれについて実施し
た他の一連の実験から明らかなように，試験したペプチ
ド中で最も強力なプロフィブリン溶解ペプチドである。
【表６】
【００６２】結果は，図３〜７に示す固定化ＰＡＩ−１
へのビトロネクチンの結合阻害における，他のペプチド
に対するＢＰ６の相対的効果と一致する。
へのビトロネクチンの結合阻害における，他のペプチド
に対するＢＰ６の相対的効果と一致する。
【００６３】別の実験では，全ＤペプチドＢＰ８（Ｋ
３４８−Ｑ３６３）のプロフィブリン溶解活性について
検定した。これらの検定は同一の血漿プール（健常ドナ
ーから）について６回重複して行った。加クエン酸血漿
（２００μｌ）をヒト内皮細胞上に被覆し，１Ｕ／ｍｌ
のトロンビンで凝固させた。試験物質は１％ＦＣＳ含有
ＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）２５０μｌ中に希釈し，
血漿クロット上に載せた。Ｄ−ダイマー分析用のサンプ
ルは６時間後に採取した。図９に示すように，ＢＰ８は
対照（最右端，ペプチド非添加）に比べて２．５倍ま
で，繊維素溶解を有意に増強させた。
３４８−Ｑ３６３）のプロフィブリン溶解活性について
検定した。これらの検定は同一の血漿プール（健常ドナ
ーから）について６回重複して行った。加クエン酸血漿
（２００μｌ）をヒト内皮細胞上に被覆し，１Ｕ／ｍｌ
のトロンビンで凝固させた。試験物質は１％ＦＣＳ含有
ＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）２５０μｌ中に希釈し，
血漿クロット上に載せた。Ｄ−ダイマー分析用のサンプ
ルは６時間後に採取した。図９に示すように，ＢＰ８は
対照（最右端，ペプチド非添加）に比べて２．５倍ま
で，繊維素溶解を有意に増強させた。
【００６４】３．２ 動物でのｉｎ ｖｉｖｏ繊維素溶
解作用 ｉｎ ｖｉｖｏでの繊維素溶解に対するペプチドの効果
は，試験ペプチドを注射した動物，たとえばラット，ウ
サギ，モルモットで評価する。実験系には，試験血漿中
にｔＰＡを添加または添加しないで，プラスミノーゲ
ン，α−２抗プラスミンおよびＤ−ダイマーの測定を包
含する。この系では，ｔＰＡは，繊維素溶解に対するペ
プチドの相加的な緩和な作用を測定するために，ペプチ
ドとともに注射することができる。ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解作用は以下の実験操作を用いて検定した。
解作用 ｉｎ ｖｉｖｏでの繊維素溶解に対するペプチドの効果
は，試験ペプチドを注射した動物，たとえばラット，ウ
サギ，モルモットで評価する。実験系には，試験血漿中
にｔＰＡを添加または添加しないで，プラスミノーゲ
ン，α−２抗プラスミンおよびＤ−ダイマーの測定を包
含する。この系では，ｔＰＡは，繊維素溶解に対するペ
プチドの相加的な緩和な作用を測定するために，ペプチ
ドとともに注射することができる。ＢＰ８のプロフィブ
リン溶解作用は以下の実験操作を用いて検定した。
【００６５】３．２．ａ 動物：雄性Ｗｉｓｔａｒ Ｓ
ＰＦラットはＨａｒｌｏｎ Ｏｌａｃ，ＵＫから購入
し，ＳａｃｋｌｅｒＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ，Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ，ＩＳｒａｅｌの動物舎で馴化
させた。使用した動物は，月齢５〜６月，体重４００〜
５００ｇの成熟ラットとした。
ＰＦラットはＨａｒｌｏｎ Ｏｌａｃ，ＵＫから購入
し，ＳａｃｋｌｅｒＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ，Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ，ＩＳｒａｅｌの動物舎で馴化
させた。使用した動物は，月齢５〜６月，体重４００〜
５００ｇの成熟ラットとした。
【００６６】３．２．ｂ 動物プレパレーション：無麻
酔ラットで血圧および心拍数を測定下。動物はＡｖｅｒ
ｔｉｎ （２−メチル−２−ブタノール中２，２，２−
トリブロモエタノールを食塩溶液で希釈）で軽く麻酔
し，慢性植え込みカテーテルを，血圧測定用に尾動脈
に，薬剤投与用に頚静脈に設置した。動物を手術および
麻酔から回復させ，設置後少なくとも２４時間経過して
から試験を行った。カテーテルは，血圧をラットのホー
ムケージ中でさらに手で扱ったり操作しないで測定でき
るように植え込んだ。クロットの形成を一夜防止するた
めに，カテーテルにヘパリン加食塩溶液（５００単位／
ｍｌ）を充填し，試験期間中はヘパリン加食塩溶液（５
０単位／ｍｌ）で洗浄した。
酔ラットで血圧および心拍数を測定下。動物はＡｖｅｒ
ｔｉｎ （２−メチル−２−ブタノール中２，２，２−
トリブロモエタノールを食塩溶液で希釈）で軽く麻酔
し，慢性植え込みカテーテルを，血圧測定用に尾動脈
に，薬剤投与用に頚静脈に設置した。動物を手術および
麻酔から回復させ，設置後少なくとも２４時間経過して
から試験を行った。カテーテルは，血圧をラットのホー
ムケージ中でさらに手で扱ったり操作しないで測定でき
るように植え込んだ。クロットの形成を一夜防止するた
めに，カテーテルにヘパリン加食塩溶液（５００単位／
ｍｌ）を充填し，試験期間中はヘパリン加食塩溶液（５
０単位／ｍｌ）で洗浄した。
【００６７】３．２．ｃ 血圧および心拍数の記録とデ
ータ解析：動脈カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧トランス
デューサーに接続し，血圧をＧｒａｓｓ多チャンネルポ
リグラフに記録した。ポリグラフ上に記録されたシグナ
ルを抽出シ，ＩＢＭコンピューターＰＣを用いて解析
し，ＤＡＳ ８ Ａ／Ｄコンバーターを用いて数値化シ
タ。データ処理は，度数２５０Ｈｚで１０秒間の抽出に
よった。シグナルはピーク検出によって解析した。この
プログラムは，予め定められた間隔で，収縮期，拡張期
および平均血圧，ならびに心拍数を抽出した。
ータ解析：動脈カテーテルをＳｔａｔｈａｍ圧トランス
デューサーに接続し，血圧をＧｒａｓｓ多チャンネルポ
リグラフに記録した。ポリグラフ上に記録されたシグナ
ルを抽出シ，ＩＢＭコンピューターＰＣを用いて解析
し，ＤＡＳ ８ Ａ／Ｄコンバーターを用いて数値化シ
タ。データ処理は，度数２５０Ｈｚで１０秒間の抽出に
よった。シグナルはピーク検出によって解析した。この
プログラムは，予め定められた間隔で，収縮期，拡張期
および平均血圧，ならびに心拍数を抽出した。
【００６８】３．２．ｄ 薬剤投与：手術後３〜４日
で，ヘパリン投与にもかかわらず，動脈カテーテルが閉
鎖した場合に，フィブリン溶解ペプチドＢＰ８を注射し
た。これらのラットでは，動脈カテーテルを介して食塩
溶液を注射できたが，血液を採取することはできず，脈
動および血圧の記録は消失した。薬剤の効果は拍動血圧
の回復およびカテーテルからの採血の容易さによって評
価下。薬剤は５０μｇ／ｋｇの濃度で動脈カテーテル中
に動脈内投与した。
で，ヘパリン投与にもかかわらず，動脈カテーテルが閉
鎖した場合に，フィブリン溶解ペプチドＢＰ８を注射し
た。これらのラットでは，動脈カテーテルを介して食塩
溶液を注射できたが，血液を採取することはできず，脈
動および血圧の記録は消失した。薬剤の効果は拍動血圧
の回復およびカテーテルからの採血の容易さによって評
価下。薬剤は５０μｇ／ｋｇの濃度で動脈カテーテル中
に動脈内投与した。
【００６９】このような処置の結果を図１０に例示す
る。図中，パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ，健康ラ
ット（対照，血流は妨害されていない）および血流が妨
害されたラットの拍動血圧を示す。後者をＢＰ８で処置
すると，拍動血圧は１８秒後に有意に回復することが認
められる（パネルＥ）。
る。図中，パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ，健康ラ
ット（対照，血流は妨害されていない）および血流が妨
害されたラットの拍動血圧を示す。後者をＢＰ８で処置
すると，拍動血圧は１８秒後に有意に回復することが認
められる（パネルＥ）。
【００７０】３．３ 培養内皮細胞によるＰＡＩ−１の
放出 Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ ら，１９８３の方法に従い，
ＨＵＶＥＣ細胞の上清中のＰＡＩ−１を測定する。略述
すれば，細胞を，ＥＣＭの存在下または非存在下に，半
コンフルーエントに培養する。培地を，２％ＦＣＳ含有
ハンクの平衡塩溶液に交換し，添加プラスミン（５μｇ
／ｍｌ）を加えたまたは加えない試験物質をこの緩衝液
に希釈し，細胞とともに６時間インキュベートする。細
胞上清からのサンプルについてＰＡＩ−１活性を検定す
る。
放出 Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ ら，１９８３の方法に従い，
ＨＵＶＥＣ細胞の上清中のＰＡＩ−１を測定する。略述
すれば，細胞を，ＥＣＭの存在下または非存在下に，半
コンフルーエントに培養する。培地を，２％ＦＣＳ含有
ハンクの平衡塩溶液に交換し，添加プラスミン（５μｇ
／ｍｌ）を加えたまたは加えない試験物質をこの緩衝液
に希釈し，細胞とともに６時間インキュベートする。細
胞上清からのサンプルについてＰＡＩ−１活性を検定す
る。
【００７１】ＰＡＩ−１の検定には，細胞上清を一定量
のｔＰＡ（４００Ｕ／ｍｌ）とインキュベートし，ｔＰ
Ａの残留活性を，プラスミノーゲン（０．１μｇ／ｍ
ｌ），発色性基質（Ｓ−２２５１）およびスチミュレー
ター（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなる基質によって
測定する。基質とインキュベートしたのち，Ｏ．Ｄ．を
４０５ｎｍで測定し，インヒビターの量を検量曲線から
計算する。ＰＡＩ−１抗原も市販のキットで測定でき
る。
のｔＰＡ（４００Ｕ／ｍｌ）とインキュベートし，ｔＰ
Ａの残留活性を，プラスミノーゲン（０．１μｇ／ｍ
ｌ），発色性基質（Ｓ−２２５１）およびスチミュレー
ター（Ｋａｂｉ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなる基質によって
測定する。基質とインキュベートしたのち，Ｏ．Ｄ．を
４０５ｎｍで測定し，インヒビターの量を検量曲線から
計算する。ＰＡＩ−１抗原も市販のキットで測定でき
る。
【００７２】アッセイは様々な濃度のＢＰ６およびＢＰ
４を用いて実施した。結果を表７および８にまとめる。
４を用いて実施した。結果を表７および８にまとめる。
【表７】
【表８】
【００７３】ＢＰ６のプロフィブリン溶解活性はヒト内
皮細胞系におけるＰＡＩ−１の活性を低下させるその能
力，すなわちプラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰ
Ａ）の活性の増大およびその結果としてのプラスミン活
性の増大ならびに繊維素溶解の促進によって表す（表
７）。一方，ＢＰ４の抗フィブリン溶解活性は，同じ系
でのＰＡＩ−１の活性を増大させるその能力，すなわち
プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）の活性の
低下およびその結果としてのプラスミン活性の低下なら
びに繊維素溶解の防止によって表す（表８）。
皮細胞系におけるＰＡＩ−１の活性を低下させるその能
力，すなわちプラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰ
Ａ）の活性の増大およびその結果としてのプラスミン活
性の増大ならびに繊維素溶解の促進によって表す（表
７）。一方，ＢＰ４の抗フィブリン溶解活性は，同じ系
でのＰＡＩ−１の活性を増大させるその能力，すなわち
プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）の活性の
低下およびその結果としてのプラスミン活性の低下なら
びに繊維素溶解の防止によって表す（表８）。
【００７４】３．４ オイグロビン溶解時間 加クエン酸血漿を冷却下に酢酸（０．０１６Ｍ）中に希
釈し，１０分後に沈殿を遠心分離によって分離し，ホウ
酸緩衝液に溶解し，ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）で再石
灰沈着を行って凝固させる。血餅を３７℃でインキュベ
ートする。正常な血餅の溶解は２〜３時間で起こる。沈
殿工程の前に，試験物質を血漿に添加する。
釈し，１０分後に沈殿を遠心分離によって分離し，ホウ
酸緩衝液に溶解し，ＣａＣｌ２（０．０２５Ｍ）で再石
灰沈着を行って凝固させる。血餅を３７℃でインキュベ
ートする。正常な血餅の溶解は２〜３時間で起こる。沈
殿工程の前に，試験物質を血漿に添加する。
【００７５】３．５ 希釈全血血餅溶解時間 血液１ｍｌをベロナール緩衝液に１：１０に希釈する。
インキュベートしたトロンビン（４０Ｕ／ｍｌ）１００
μｌの添加により血栓を形成させる。凝固した血液を３
７℃で４８時間インキュベートする。正常な血餅は溶解
するか，４８時間後もまだ存在する。プロフィブリン溶
解剤の添加により，凝血の溶解時間は短縮する。
インキュベートしたトロンビン（４０Ｕ／ｍｌ）１００
μｌの添加により血栓を形成させる。凝固した血液を３
７℃で４８時間インキュベートする。正常な血餅は溶解
するか，４８時間後もまだ存在する。プロフィブリン溶
解剤の添加により，凝血の溶解時間は短縮する。
【００７６】引用文献 Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．
Ｂ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＡＮａｌｙｓｉ
ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｅ．＆ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），２巻，１
−２８４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）， １９８０ ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅ
ｍ．２６７：２２６４−２２６８（１９９２） Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．７２：２４８−２５４（１０７６） Ｃａｊｏｔ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６９３９−６９４３（１９９
０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：２
２１−２２５（１９９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４：３
８７−３９４（１９９１ａ） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：２
５１−２５６（１９９１ｂ） Ｃｈｎｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｊ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．３１：４２７−４３６（１９９３） Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
９：２０９−２１６（１９７６） Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．＆Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：２３６８−２３７４（１９
８５） Ｄａｎｏ，Ｋ，ら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
４：１３９−１６６（１９８５） Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３：１５４５４−１５４６１（１９８８） Ｊｅｎｎｅ，Ｄ．＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．４：３１５３−３１５７（１９８５） Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１７６：８１−８７（１９８８） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７５４１−
７５４５（１９８８ａ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：
１１３１−１１３８（１９８８ｂ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１８８：２８８−２９４（１９９０） Ｋｏｓｔ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１２０９８−１２１０５（１９９２） Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．ら，ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｂｏｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ，９巻（Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．編），Ｓａｕｎｄｅ
ｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６７−１１５ 頁
（１９８８） Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０８：６７１−６８２（１９８９） Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９３６−９３
９（１９８９） Ｐｏｌｌａｎｅｎ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０６：８７−９５（１９８８） Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｋ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：１８４９０−１８４９８（１９９０） Ｒｙｌａｔｔら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３１：７６７
−７７８（１９８３） Ｓａｌｏｎｅｎ，Ｅ．−Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：６３３９−６３４３（１９８９） Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ，Ｅ．Ｄ．＆ Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．Ｂ
ｌｏｏｄ ６９：３８１−３８７（１９８７）
Ｂ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＡＮａｌｙｓｉ
ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｅ．＆ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），２巻，１
−２８４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）， １９８０ ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅ
ｍ．２６７：２２６４−２２６８（１９９２） Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．７２：２４８−２５４（１０７６） Ｃａｊｏｔ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６９３９−６９４３（１９９
０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：２
２１−２２５（１９９０） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４：３
８７−３９４（１９９１ａ） Ｃｈａｉｎ，Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：２
５１−２５６（１９９１ｂ） Ｃｈｎｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｊ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．３１：４２７−４３６（１９９３） Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
９：２０９−２１６（１９７６） Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．＆Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：２３６８−２３７４（１９
８５） Ｄａｎｏ，Ｋ，ら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
４：１３９−１６６（１９８５） Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３：１５４５４−１５４６１（１９８８） Ｊｅｎｎｅ，Ｄ．＆ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．４：３１５３−３１５７（１９８５） Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１７６：８１−８７（１９８８） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７５４１−
７５４５（１９８８ａ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：
１１３１−１１３８（１９８８ｂ） Ｋｏｒｃ−Ｇｒｏｄｚｉｃｋｉ，Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１８８：２８８−２９４（１９９０） Ｋｏｓｔ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１２０９８−１２１０５（１９９２） Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．ら，ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｂｏｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ，９巻（Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．編），Ｓａｕｎｄｅ
ｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６７−１１５ 頁
（１９８８） Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０８：６７１−６８２（１９８９） Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９３６−９３
９（１９８９） Ｐｏｌｌａｎｅｎ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０６：８７−９５（１９８８） Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｋ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：１８４９０−１８４９８（１９９０） Ｒｙｌａｔｔら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３１：７６７
−７７８（１９８３） Ｓａｌｏｎｅｎ，Ｅ．−Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：６３３９−６３４３（１９８９） Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ，Ｅ．Ｄ．＆ Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．Ｂ
ｌｏｏｄ ６９：３８１−３８７（１９８７）
【図面の簡単な説明】
【図１】繊維素溶解に関連する分子的事象の順序を示す
模式図。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害
模式図。 ＰＡ，プラスミノーゲンアクティベーター；ＰＡＩ−
１，プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
１；Ｖｎ，ビトロネクチン；Ｖｎ’，プラスミンにクリ
ップされたビトロネクチン；（ｓ），可溶性；（ｉ），
不溶性；＋，刺激；−，阻害
【図２】陽電荷で荷電された塩基性アミノ酸集団（残基
３４８−３８０）を含有するビトロネクチンの部分の配
列図。
３４８−３８０）を含有するビトロネクチンの部分の配
列図。
【図３】ビトロネクチンの位置３４８−３８０に相当す
るＢＰ系からの合成ペプチドの，固定化ＰＡＩ−１への
ビトロネクチンの結合に対する影響。 パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２（△）および
非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ３（□），ＢＰ４（△），非添加
（○）； パネルＣ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ（４−２）
（△），非添加（○）； パネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ
６（●），非添加（○）
るＢＰ系からの合成ペプチドの，固定化ＰＡＩ−１への
ビトロネクチンの結合に対する影響。 パネルＡ：ペプチドＢＰ１（□），ＢＰ２（△）および
非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ３（□），ＢＰ４（△），非添加
（○）； パネルＣ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ（４−２）
（△），非添加（○）； パネルＤ：ＢＰ（４−１）（□），ＢＰ５（△），ＢＰ
６（●），非添加（○）
【図４】パネルＡ：ペプチドＢＰ４−１（△）およびＢ
Ｐ５（□），ならびにパネルＢ：等モル濃度（２５μ
Ｍ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビトロネクチンの
結合の妨害の相対的効果。 ペプチドＢＰ５（●），ＢＰ６（▲），非添加（○）
Ｐ５（□），ならびにパネルＢ：等モル濃度（２５μ
Ｍ）での，固定化ＰＡＩ−１に対するビトロネクチンの
結合の妨害の相対的効果。 ペプチドＢＰ５（●），ＢＰ６（▲），非添加（○）
【図５】様々な濃度における固定化ＰＡＩ−１へのビト
ロネクチンの結合に対する効果 パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１２μＭ（●），２５μＭ（■），非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０μＭ
（△），２５μＭ（●），１００μＭ（■），２５０μ
Ｍ（▲），非添加（○）； パネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１０μＭ（●），２５μＭ（■），非添加（○）
ロネクチンの結合に対する効果 パネルＡ：ＢＰ４，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１２μＭ（●），２５μＭ（■），非添加（○）； パネルＢ：ＢＰ５，２．５μＭ（□），１０μＭ
（△），２５μＭ（●），１００μＭ（■），２５０μ
Ｍ（▲），非添加（○）； パネルＣ：ＢＰ６，２．５μＭ（□），５μＭ（△），
１０μＭ（●），２５μＭ（■），非添加（○）
【図６】固定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に
対する低濃度のＢＰ６の影響。 非添加（○），０．１μＭＢＰ６（△），０．５μＭＢ
Ｐ６（□）
対する低濃度のＢＰ６の影響。 非添加（○），０．１μＭＢＰ６（△），０．５μＭＢ
Ｐ６（□）
【図７】ビトロネクチンのＰＡＩ−１への会合の阻害に
おけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）およびＢＰ６（●）
の効果の比較
おけるＢＰ４（○），ＢＰ５（□）およびＢＰ６（●）
の効果の比較
【図８】Ｄ−コンフィギュレーションをもつアミノ酸か
らなるペプチドＢＰ７（パネルＡ），ＢＰ８（パネル
Ｂ）およびＢＰ１４（パネルＣ）の様々な濃度での，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影
響。 パネルＡ：ＢＰ７，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＣ：ＢＰ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），非添加（○）
らなるペプチドＢＰ７（パネルＡ），ＢＰ８（パネル
Ｂ）およびＢＰ１４（パネルＣ）の様々な濃度での，固
定化ＰＡＩ−１へのビトロネクチンの結合に対する影
響。 パネルＡ：ＢＰ７，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＢ：ＢＰ８，１μＭ（□），５μＭ（△），１０
μＭ（●），非添加（○） パネルＣ：ＢＰ１４，１μＭ（□），５μＭ（△），１
０μＭ（●），非添加（○）
【図９】全Ｄ−ペプチドＢＰ８のプロフィブリン溶解活
性。
性。
【図１０】５０μｇ／ｋｇ用量の薬剤の投与後における
脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８のプロフィブリン溶解
活性を評価した実験例。 パネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
脈拍血圧の回復によって，ＢＰ８のプロフィブリン溶解
活性を評価した実験例。 パネルＡ：血流が妨害されていない対照動物コントロー
ル；パネルＢ：血流が妨害された動物；パネルＣ：ＢＰ
処置動物，１３分後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１５分
後；パネルＤ：ＢＰ処置動物，１８分後
Claims (25)
- 【請求項１】 式 ３４８ ３８０ ＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲＰＳＲＡ を有するビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ａ３８０に相
当するアミノ酸を包含する部分配列または全配列からな
る合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，
および，そのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度
および全体的疎水性特性に関して保存されるような１も
しくは２以上のアミノの酸置換，付加または欠失によっ
て得られるそれらの類縁体であって，プラスミノーゲン
アクティベーターインヒビター１（以下ＰＡＩ−１とい
う）の生物学的活性を修飾することができる上記ペプチ
ドならびにそれらの塩，官能性誘導体および類縁体（た
だしＡ３４１−Ｒ３５５，Ｋ３４８−Ｒ３６１，Ｒ
３５７，Ｒ３７０，Ｈ３６６，Ｒ３７９およびＮ３７１
−Ｌ３８３を除く）。 - 【請求項２】 ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクテ
ィベーターへの到達およびその阻害を防止することによ
りＰＡＩ−１ の生物学的活性を修飾する「請求項１」
記載のペプチド。 - 【請求項３】 ＰＡＩ−１のプラスミノーゲンアクテ
ィベーターへの到達およびその阻害を許容することによ
りＰＡＩ−１の生物学的活性を修飾する「請求項１」記
載のペプチド。 - 【請求項４】 すべてのアミノ酸残基がＬコンフィギュ
レーションを有する「請求項１〜３」のいずれかに記載
のペプチド。 - 【請求項５】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ａ３８０に相当する，ＢＰ４と命名された「請
求項４」記載のペプチド。 - 【請求項６】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置Ｓ
３６２−Ｒ３７０に相当する，ＢＰ４−１と命名された
「請求項４」記載のペプチド。 - 【請求項７】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置Ｋ
３５８−Ｒ３７０に相当する，ＢＰ５と命名された「請
求項４」記載のペプチド。 - 【請求項８】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置Ｋ
３４８−Ｑ３６３に相当する，ＢＰ６と命名された「請
求項４」記載のペプチド。 - 【請求項９】 一部のアミノ酸残基は，Ｄコンフィギュ
レーションを有する「請求項１〜３」のいずれかに記載
のペプチド。 - 【請求項１０】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置
Ｋ３４８−Ｑ３６３に相当し，下線を施したアミノ酸： ３４８ ３６３ＫＫ ＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱ はＤコンフィギュレーションを有する，ＢＰ７と命名さ
れた「請求項９」記載のペプチド。 - 【請求項１１】 すべての光学活性アミノ酸はＤコンフ
ィギュレーションを有する「請求項１〜３」のいずれか
に記載のペプチド。 - 【請求項１２】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置
Ｋ３４８−Ｑ３６３に相当し，ＢＰ８と命名された「請
求項１１」記載のペプチド。 - 【請求項１３】 アミノ酸配列はビトロネクチンの位置
Ｎ３５６−Ｑ３６３に相当する，ＢＰ１４と命名された
「請求項１１」記載のペプチド。 - 【請求項１４】 「請求項１または２」に記載のペプチ
ドの，プロフィブリン分解医薬組成物の製造のための使
用。 - 【請求項１５】 ビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ｒ
３７０に相当するペプチドの「請求項１４」による使
用。 - 【請求項１６】 「請求項７，８，１０，１２または１
３」のいずれかに記載のペプチドの「請求項１５」によ
る使用。 - 【請求項１７】 「請求項１または３」に記載のペプチ
ドの，抗フィブリン分解医薬組成物の製造のための使
用。 - 【請求項１８】 ビトロネクチンの位置Ｓ３６２−Ａ
３８０に相当するペプチドの「請求項１７」による使
用。 - 【請求項１９】 「請求項５または６」のいずれかに記
載のペプチドの，「請求項１７」による使用。 - 【請求項２０】 過剰の繊維素溶解を伴う障害たとえば
出血性障害の処置用医薬組成物の製造のための「請求項
１７〜１９」のいずれかに記載の使用。 - 【請求項２１】 急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞
栓症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症，肝疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，な
らびに血管形成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ
仲介蛋白分解を伴う病的状態の処置用医薬組成物の製造
のための「請求項１」記載のペプチドの使用。 - 【請求項２２】 式 ３４８ ３８０ ＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲＰＳＲＡ を有するビトロネクチンの位置Ｋ３４８−Ａ３８０に相
当するアミノ酸を包含する部分配列または全配列からな
る合成ペプチド，ならびにそれらの塩，官能性誘導体，
およびそのペプチドの全体的性質がその高陽電荷密度お
よび全体的疎水性特性に関して保存されるような１もし
くは２以上のアミノ酸の置換，付加または欠失によって
得られるそれらの類縁体であって，ＰＡＩ−１の生物学
的活性を修飾することができる上記ペプチドならびにそ
れらの塩，官能性誘導体および類縁体と医薬的に許容さ
れる担体からなる医薬組成物。 - 【請求項２３】 急性心筋梗塞，深部静脈血栓症，肺塞
栓症，播種性血管内凝固症候群，腫瘍細胞浸潤および転
移，炎症，肝疾患，細菌性血液感染症，妊娠中毒症，な
らびに血管形成の制御，神経再生，または過剰のｔＰＡ
仲介蛋白分解を伴う病的状態の処置用の「請求項２２」
記載の医薬組成物。 - 【請求項２４】 「請求項２２」記載のプロフィブリン
分解医薬組成物。 - 【請求項２５】 「請求項２２」記載の抗フィブリン分
解医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| IL102688 | 1992-07-30 | ||
| IL10268892A IL102688A (en) | 1992-07-30 | 1992-07-30 | Synthetic peptides derived from vitronectin and pharmaceutical compositions comprising them |
| IL104296A IL104296A0 (en) | 1992-12-31 | 1992-12-31 | Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them |
| IL104296 | 1992-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06184196A true JPH06184196A (ja) | 1994-07-05 |
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|---|---|---|---|
| JP5227772A Pending JPH06184196A (ja) | 1992-07-30 | 1993-07-30 | ビトロネクチン由来合成ペプチドおよびそれらを含有する医薬組成物 |
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|---|---|
| US (1) | US5491129A (ja) |
| EP (1) | EP0589181A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06184196A (ja) |
| KR (1) | KR940005671A (ja) |
| CN (1) | CN1091746A (ja) |
| AU (1) | AU4436393A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021014419A (ja) * | 2019-07-11 | 2021-02-12 | 公立大学法人福井県立大学 | サバ由来のペプチドを有効成分とするｐａｉ−１阻害剤及び組成物 |
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| WO1995030438A2 (en) * | 1994-05-10 | 1995-11-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Methods and compositions to enhance endogenous fibrinolytic activity |
| EP0857210B1 (en) | 1995-10-23 | 2003-09-03 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
| US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
| ES2217340T3 (es) * | 1995-12-13 | 2004-11-01 | The Children's Medical Center Corporation | Inhibidor de la proliferacion de celulas endoteliales y utilizacion de este. |
| US20020022588A1 (en) * | 1998-06-23 | 2002-02-21 | James Wilkie | Methods and compositions for sealing tissue leaks |
| WO2000038715A2 (en) | 1998-12-23 | 2000-07-06 | G.D. Searle & Co. | Use of an integrin antagonist and radiation in the treatment of neoplasia |
| US7101989B1 (en) | 1999-07-09 | 2006-09-05 | University Of North Carolina At Chapel Hill | DsrA protein and polynucleotides encoding the same |
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| BRPI0613525A2 (pt) * | 2005-07-13 | 2011-05-31 | Crossbeta Biosciences Bv | métodos para produzir uma composição imunogênica, para melhorar a imunogenicidade de uma composição, para intensificar a imunogenicidade de uma composição de vacina, e para determinar a quantidade de estruturas beta-cruzadas em uma composição de vacina, usos de estruturas beta-cruzadas, e de uma composição imunogênica, vacina de subunidade, e, composição imunogênica |
| US8114832B2 (en) * | 2005-07-13 | 2012-02-14 | Crossbeta Biosciences B.V. | Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition |
| EP2058001A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Crossbeta Biosciences B.V. | Enhancement of immunogenicity of antigens |
| EP2058000A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Crossbeta Biosciences B.V. | Immunogenic compositions capable of activating T cells |
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| HU9302217D0 (en) | 1993-10-28 |
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