JPH0618528A - 遠心アナライザー中の粒子強化凝集反応を混濁の輝度の測定により分析する方法 - Google Patents
遠心アナライザー中の粒子強化凝集反応を混濁の輝度の測定により分析する方法Info
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- JPH0618528A JPH0618528A JP5076036A JP7603693A JPH0618528A JP H0618528 A JPH0618528 A JP H0618528A JP 5076036 A JP5076036 A JP 5076036A JP 7603693 A JP7603693 A JP 7603693A JP H0618528 A JPH0618528 A JP H0618528A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生物学的材料のサンプル中の被検物質の定量
方法の提供。 【構成】 被検物質を含有する可能性がある生物学的材
料のサンプルを、その被検物質に特異的で粒子状担体材
料上に固定化された少なくとも１種の結合パートナーと
インキュベートし、被検物質によってもたらされた濁度
の変化を測定することからなる。
方法の提供。 【構成】 被検物質を含有する可能性がある生物学的材
料のサンプルを、その被検物質に特異的で粒子状担体材
料上に固定化された少なくとも１種の結合パートナーと
インキュベートし、被検物質によってもたらされた濁度
の変化を測定することからなる。
Description
【０００１】本発明は、被検験物質を含有する可能性が
ある生物学的材料サンプルをその被検物質に特異的で粒
子状担体材料上に固定化された少なくとも１種の結合パ
ートナーとインキュベートし、その被検物質によって生
じた混濁度の変化を測定することによる、被検物質の定
量方法に関する。
ある生物学的材料サンプルをその被検物質に特異的で粒
子状担体材料上に固定化された少なくとも１種の結合パ
ートナーとインキュベートし、その被検物質によって生
じた混濁度の変化を測定することによる、被検物質の定
量方法に関する。
【０００２】治療的および／または診断的に重要な物質
の定性および定量分析のための免疫化学的検出方法にお
いては、検出すべき被検物質に親和性を有する結合パー
トナー（たとえば、抗体、抗原、基質および基質類縁
体、酵素、レクチン）が水不溶性担体（固相）上に固定
化される固相法原理に基づく。固相としては、様々な形
状の物体たとえばチューブ、球体またはマイクロタイタ
ープレートに採用されている各種の水不溶性ポリマーが
使用できる。
の定性および定量分析のための免疫化学的検出方法にお
いては、検出すべき被検物質に親和性を有する結合パー
トナー（たとえば、抗体、抗原、基質および基質類縁
体、酵素、レクチン）が水不溶性担体（固相）上に固定
化される固相法原理に基づく。固相としては、様々な形
状の物体たとえばチューブ、球体またはマイクロタイタ
ープレートに採用されている各種の水不溶性ポリマーが
使用できる。
【０００３】たとえばＥＬＩＳＡのような、いわゆる不
均一系イムノアッセイでは、被検物質と固定化結合パー
トナーから構成される複合体の形状により、非結合被検
物質の除去が可能である。次の検出工程において固定化
被検物質が定量的に測定される。しかしながら、これら
の方法は労力を要し、時間がかかる。
均一系イムノアッセイでは、被検物質と固定化結合パー
トナーから構成される複合体の形状により、非結合被検
物質の除去が可能である。次の検出工程において固定化
被検物質が定量的に測定される。しかしながら、これら
の方法は労力を要し、時間がかかる。
【０００４】いわゆる均一法においては主に比濁法また
は濁度法が使用される。被検物質（Ａ）と結合パートナ
ー（Ｂ）からのＡＢ形成のカイネティックスは、入射光
の散乱または吸収に生じる変化によって追跡できる。結
合パートナーが固定化されている懸濁粒子たとえばラテ
ックス粒子を使用する場合、かなり低濃度の被検物質で
も定量を可能にする効果の増大がある。これらの均一法
では、サンプルの分析を、迅速かつ簡単に、とくに自動
化して実施することができる。
は濁度法が使用される。被検物質（Ａ）と結合パートナ
ー（Ｂ）からのＡＢ形成のカイネティックスは、入射光
の散乱または吸収に生じる変化によって追跡できる。結
合パートナーが固定化されている懸濁粒子たとえばラテ
ックス粒子を使用する場合、かなり低濃度の被検物質で
も定量を可能にする効果の増大がある。これらの均一法
では、サンプルの分析を、迅速かつ簡単に、とくに自動
化して実施することができる。
【０００５】ＡＢの記号は、互いに一定の化学量論比で
の量の組成物を指示することを意図するものではなく、
被検物質（Ａ）と結合パートナーまたは固定化結合パー
トナー（Ｂ）の反応から生じる生成物（ＡＢ）を表すも
のである。
の量の組成物を指示することを意図するものではなく、
被検物質（Ａ）と結合パートナーまたは固定化結合パー
トナー（Ｂ）の反応から生じる生成物（ＡＢ）を表すも
のである。
【０００６】この種の粒子増強濁度法イムノアッセイ
は、たとえば特許ＤＥ ２９ ０５ ４３４に記載されて
いる。ここで使用される粒子は、直径＜１.６μｍであ
り、検討される溶液中で０.０５〜１％の濃度で使用さ
れる。この特許によれば理想的には、反応カイネティッ
クスは粒子径の少なくとも１.５倍の波長で追跡され
る。溶液中の測定される混濁は粒子径に依存するある至
適を示す。すなわち粒子径が増大すると、初期に混濁は
増大するが粒子径が極めて大きくなると再び低下する
（Malinski, J.A. & Nelsesyuen, G.L.：「濁度の血小
板凝集との関係」Biochim. Biophys. Acta, 882：177〜
182，1986を参照）。混濁の低下は、粒子径が入射光の
波長に近づくと光路の方向での散乱が増加し、濁度法に
おける至適輝度がシミュレートされるという事実に起因
する。この効果は、比濁分析においては、前方に向いた
散乱光をシャッターで除くと抑制される。
は、たとえば特許ＤＥ ２９ ０５ ４３４に記載されて
いる。ここで使用される粒子は、直径＜１.６μｍであ
り、検討される溶液中で０.０５〜１％の濃度で使用さ
れる。この特許によれば理想的には、反応カイネティッ
クスは粒子径の少なくとも１.５倍の波長で追跡され
る。溶液中の測定される混濁は粒子径に依存するある至
適を示す。すなわち粒子径が増大すると、初期に混濁は
増大するが粒子径が極めて大きくなると再び低下する
（Malinski, J.A. & Nelsesyuen, G.L.：「濁度の血小
板凝集との関係」Biochim. Biophys. Acta, 882：177〜
182，1986を参照）。混濁の低下は、粒子径が入射光の
波長に近づくと光路の方向での散乱が増加し、濁度法に
おける至適輝度がシミュレートされるという事実に起因
する。この効果は、比濁分析においては、前方に向いた
散乱光をシャッターで除くと抑制される。
【０００７】濁度法においては、被検物質濃度の分析に
はこれまで殆どもっぱら吸収の増大、すなわち基底の関
数の上昇部分が使用されてきた〔たとえば、Brustolin
Dら：「アポリポ蛋白質Ａ−１およびＢの定形的測定の
ための免疫濁度測定法」Chin. Chem. 37(5): 742〜747,
1991を参照〕。前方への光散乱効果を避けるために、
したがって、長波長の光、たとえば引用した特許ＤＥ
２９ ０５ ４３４では＞６００nmの光が使用されてい
る。
はこれまで殆どもっぱら吸収の増大、すなわち基底の関
数の上昇部分が使用されてきた〔たとえば、Brustolin
Dら：「アポリポ蛋白質Ａ−１およびＢの定形的測定の
ための免疫濁度測定法」Chin. Chem. 37(5): 742〜747,
1991を参照〕。前方への光散乱効果を避けるために、
したがって、長波長の光、たとえば引用した特許ＤＥ
２９ ０５ ４３４では＞６００nmの光が使用されてい
る。
【０００８】光輝反応（関数の下降部分）を用いるＡＢ
の定量は、極めてわずかしか報告されていない〔たとえ
ばDezelic, G.J.ら：「免疫化学系のヒト血清アルブミ
ン／抗ヒト血清アルブミンヒツジ血清におけるラテック
ス粒子凝集」Eur. J. Biochem. 20(4): 553〜560, 1971
を参照〕。しかしながら、記載された方法では、濁度の
減少速度測定のために、感作ラテックスの０.００７〜
０.０２８％の範囲の極めて低い濃度が要求される。こ
れらの低濃度のために、混濁を生じる不純物を除去する
必要がある。この低ラテックス濃度は、抗原−抗体反応
が必然的に低下し、したがって１８〜２０時間の測定時
間が必要になることを意味する。これらの方法で得られ
る精度、再現性および感度は、抗原または抗体の濃度の
測定には不適当である（Cohen, R.J. & Benedek, G.
B.：「光散乱スペクトロスコピーによるイムノアッセ
イ」Immunochem. 12：349〜351, 1975）。
の定量は、極めてわずかしか報告されていない〔たとえ
ばDezelic, G.J.ら：「免疫化学系のヒト血清アルブミ
ン／抗ヒト血清アルブミンヒツジ血清におけるラテック
ス粒子凝集」Eur. J. Biochem. 20(4): 553〜560, 1971
を参照〕。しかしながら、記載された方法では、濁度の
減少速度測定のために、感作ラテックスの０.００７〜
０.０２８％の範囲の極めて低い濃度が要求される。こ
れらの低濃度のために、混濁を生じる不純物を除去する
必要がある。この低ラテックス濃度は、抗原−抗体反応
が必然的に低下し、したがって１８〜２０時間の測定時
間が必要になることを意味する。これらの方法で得られ
る精度、再現性および感度は、抗原または抗体の濃度の
測定には不適当である（Cohen, R.J. & Benedek, G.
B.：「光散乱スペクトロスコピーによるイムノアッセ
イ」Immunochem. 12：349〜351, 1975）。
【０００９】臨床化学における遠心アナライザーの発展
は、濁度法のこれらのデバイスへの適合を招き、これに
より自動化処理および結果として正確な測定を可能にす
る。しかしながら、これらのデバイスを用いる方法も、
現在まで、ＡＢ形成によって生じる吸収の増加による濁
度法での被検物質の測定があるのみである（たとえばGa
li, A & Hudsonら：「Cobas Faraの１２の蛋白質のイム
ノアッセイのプロフィル」J. Clin. Lab. Anal. 1：191
〜197, 1987を参照）。
は、濁度法のこれらのデバイスへの適合を招き、これに
より自動化処理および結果として正確な測定を可能にす
る。しかしながら、これらのデバイスを用いる方法も、
現在まで、ＡＢ形成によって生じる吸収の増加による濁
度法での被検物質の測定があるのみである（たとえばGa
li, A & Hudsonら：「Cobas Faraの１２の蛋白質のイム
ノアッセイのプロフィル」J. Clin. Lab. Anal. 1：191
〜197, 1987を参照）。
【００１０】Lentrichia & Yeung（「遠心分離に適合す
る高感度カイネティックラテックス凝集イムノアッセ
イ」J. Immunol. Meth. 89：257〜263, 1988）は、遠心
アナライザーにおけるＨＣＧの競合的定量方法を発表し
ている。この際、著者らは、吸収の通常の増加から約６
分後に、測定シグナルの低下を観察した。この反応カイ
ネティックスの下降部分を、市販のラテックス試薬（粒
子径２２０nm）でのＨＣＧアッセイに適合させて用い
た。定量は波長６９０nm、アッセイ混合物中のラテック
ス濃度０.０９％で実施された。しかしながら、この方
法での測定時間は約３０分であり、したがって、一般的
に３〜５分を要するのみの現在の濁度法よりも劣ってい
る。しかも、混合した反応カイネティックス（シグナル
の初期増加ついで減少）は、測定誤差の危険があること
を意味する。すなわち、非特異的な懸濁はたとえば反応
カイネティックスの上昇部分の延長、したがって場合に
よっては、陰性シグナルさえ生じる可能性がある。これ
が、反応開始８分後まで測定を開始できなかった理由で
ある。以下現技術水準と呼ぶことにするこの方法は、し
たがって満足できるものではない。
る高感度カイネティックラテックス凝集イムノアッセ
イ」J. Immunol. Meth. 89：257〜263, 1988）は、遠心
アナライザーにおけるＨＣＧの競合的定量方法を発表し
ている。この際、著者らは、吸収の通常の増加から約６
分後に、測定シグナルの低下を観察した。この反応カイ
ネティックスの下降部分を、市販のラテックス試薬（粒
子径２２０nm）でのＨＣＧアッセイに適合させて用い
た。定量は波長６９０nm、アッセイ混合物中のラテック
ス濃度０.０９％で実施された。しかしながら、この方
法での測定時間は約３０分であり、したがって、一般的
に３〜５分を要するのみの現在の濁度法よりも劣ってい
る。しかも、混合した反応カイネティックス（シグナル
の初期増加ついで減少）は、測定誤差の危険があること
を意味する。すなわち、非特異的な懸濁はたとえば反応
カイネティックスの上昇部分の延長、したがって場合に
よっては、陰性シグナルさえ生じる可能性がある。これ
が、反応開始８分後まで測定を開始できなかった理由で
ある。以下現技術水準と呼ぶことにするこの方法は、し
たがって満足できるものではない。
【００１１】本発明の基盤となった目的は、極めて正確
で再現性よく被検物質の濃度を、それ自体公知の自動遠
心アナライザーを用いとくにこのような自動デバイスに
おいて通例の約３〜８分の時間内に（サンプルの添加か
ら結果の出力まで）、ＡＢ形成のカイネティックスによ
って定量的に測定するために使用できる測光法を見出す
ことにあった。
で再現性よく被検物質の濃度を、それ自体公知の自動遠
心アナライザーを用いとくにこのような自動デバイスに
おいて通例の約３〜８分の時間内に（サンプルの添加か
ら結果の出力まで）、ＡＢ形成のカイネティックスによ
って定量的に測定するために使用できる測光法を見出す
ことにあった。
【００１２】驚くべきことに、適当な反応条件下では、
混合の直後、サンプルの添加により生じた分布相におい
て、濁度の低下を測定すことも可能で、約２〜７分後に
は明白な結果がえられることを見出したのである。
混合の直後、サンプルの添加により生じた分布相におい
て、濁度の低下を測定すことも可能で、約２〜７分後に
は明白な結果がえられることを見出したのである。
【００１３】反応の機構を説明することによって本発明
の主題を限定するものではないが、本発明の目的におい
ては、以下の点がＡＢ形成のカイネティックスに有利な
影響を与えるものと考えられる。
の主題を限定するものではないが、本発明の目的におい
ては、以下の点がＡＢ形成のカイネティックスに有利な
影響を与えるものと考えられる。
【００１４】１．遠心加速の増大または高密度の、たと
えば磁鉄鉱からなる粒子の使用、 ２．ストークス半径を小さくするため可能な限り球形の
粒子の使用と、高密度を招来する媒体たとえばグリセロ
ール、ポリエチレングリコールの添加、 ３．混合物中での粒子密度および感作粒子上の負荷密度
の増大。
えば磁鉄鉱からなる粒子の使用、 ２．ストークス半径を小さくするため可能な限り球形の
粒子の使用と、高密度を招来する媒体たとえばグリセロ
ール、ポリエチレングリコールの添加、 ３．混合物中での粒子密度および感作粒子上の負荷密度
の増大。
【００１５】驚くべきことに、現在の技術水準で使用さ
れているよりも高い粒子濃度の使用により、分析溶液中
に、現在の技術水準で報告されている挙動に比べて極め
て迅速な光輝の発現の起こることが明らかにされたので
ある。吸収の低下の速度および程度は、検討溶液中での
被検物質の濃度に依存する。
れているよりも高い粒子濃度の使用により、分析溶液中
に、現在の技術水準で報告されている挙動に比べて極め
て迅速な光輝の発現の起こることが明らかにされたので
ある。吸収の低下の速度および程度は、検討溶液中での
被検物質の濃度に依存する。
【００１６】したがって、本発明は被検物質を含有する
可能性がある生物学的材料サンプルをその被検物質に特
異的で粒子状担体材料上に固定化された少なくとも１種
の結合パートナーとインキュベートして被検物質を定量
する方法において、(ａ) 反応は、測定の経過を通じて
一定の、好ましくは１０〜１０,０００×ｇ、とくに好
ましくは１００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８０
０×１,２００×ｇの遠心加速の影響下に行い、(ｂ)
測定混合物中の粒子密度は少なくとも０.１重量％であ
り、(ｃ) 生じた混濁中の輝度を、混合の完了直後、サ
ンプルの添加によって生じた分布相で測定し、ついで、
(ｄ) サンプルについての混濁中の輝度を、被検物質含
量が既知のサンプルでの同一条件での測定値と比較する
ことにより、被検物質の濃度を明白に決定する方法に関
する。
可能性がある生物学的材料サンプルをその被検物質に特
異的で粒子状担体材料上に固定化された少なくとも１種
の結合パートナーとインキュベートして被検物質を定量
する方法において、(ａ) 反応は、測定の経過を通じて
一定の、好ましくは１０〜１０,０００×ｇ、とくに好
ましくは１００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８０
０×１,２００×ｇの遠心加速の影響下に行い、(ｂ)
測定混合物中の粒子密度は少なくとも０.１重量％であ
り、(ｃ) 生じた混濁中の輝度を、混合の完了直後、サ
ンプルの添加によって生じた分布相で測定し、ついで、
(ｄ) サンプルについての混濁中の輝度を、被検物質含
量が既知のサンプルでの同一条件での測定値と比較する
ことにより、被検物質の濃度を明白に決定する方法に関
する。
【００１７】さらに、好ましい方法においては、被検物
質および特異的結合パートナーは、免疫化学的反応にお
けるパートナーであり、とくに好ましい方法において
は、特異的結合パートナーは凝血、繊維素溶解または補
体系からの蛋白質またはペプチドに対する抗体であり、
最も好ましい特異的結合パートナーはフィブリン分解生
成物Ｄダイマーに対する抗体である。本発明の目的にお
ける抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
のいずれでもよく、また抗体フラグメントおよび修飾抗
体たとえば二特異性抗体であってもよい。
質および特異的結合パートナーは、免疫化学的反応にお
けるパートナーであり、とくに好ましい方法において
は、特異的結合パートナーは凝血、繊維素溶解または補
体系からの蛋白質またはペプチドに対する抗体であり、
最も好ましい特異的結合パートナーはフィブリン分解生
成物Ｄダイマーに対する抗体である。本発明の目的にお
ける抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
のいずれでもよく、また抗体フラグメントおよび修飾抗
体たとえば二特異性抗体であってもよい。
【００１８】さらに好ましい方法においては、可能な限
り球形の粒子状天然および／または合成ポリマーが担体
材料として使用され、とくに好ましくは、粒子状担体材
料としてスチレン／メタクリル酸またはメタクリレート
／メタクリル酸コポリマーが使用される。
り球形の粒子状天然および／または合成ポリマーが担体
材料として使用され、とくに好ましくは、粒子状担体材
料としてスチレン／メタクリル酸またはメタクリレート
／メタクリル酸コポリマーが使用される。
【００１９】好ましい方法はまた、反応を、所定の密度
および粘度を有する緩衝液中で実施する方法である。好
ましい方法はまた、吸収の変化を沈降方向に対して０°
〜１８０°の角度で追跡できる方法である。好ましい方
法はさらにまた、吸収の変化の測定に２８０〜９００nm
の範囲の波長を使用する方法である。
および粘度を有する緩衝液中で実施する方法である。好
ましい方法はまた、吸収の変化を沈降方向に対して０°
〜１８０°の角度で追跡できる方法である。好ましい方
法はさらにまた、吸収の変化の測定に２８０〜９００nm
の範囲の波長を使用する方法である。
【００２０】本発明はまた、この種類の方法において、
被検物質特異的結合パートナーでコーティングされた粒
子状担体材料の、測定混合物中０.０９重量％を越える
粒子濃度での使用に関する。
被検物質特異的結合パートナーでコーティングされた粒
子状担体材料の、測定混合物中０.０９重量％を越える
粒子濃度での使用に関する。
【００２１】なお、添付の図面について総括的に説明す
ると次ぎのとおりである。 図１：市販されている製品の抗−ＩｇＥコーティングラ
テックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、慣用
されるラテックス濃度での反応のカイネティックス。濁
度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔
で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶液中０.０
２５％であった。０.５秒後の吸収から測定された差を
示す。
ると次ぎのとおりである。 図１：市販されている製品の抗−ＩｇＥコーティングラ
テックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、慣用
されるラテックス濃度での反応のカイネティックス。濁
度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔
で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶液中０.０
２５％であった。０.５秒後の吸収から測定された差を
示す。
【００２２】図２：抗体−Ｄダイマーコーティングラテ
ックス粒子の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度にお
ける、慣用されるラテックス濃度での反応のカイネティ
ックス。濁度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、
１０秒間隔で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶
液中０.０２５％であった。試薬のカップリング比（抗
体：ラテックス）は１：４０であった。０.５秒後の吸
収から測定された差を示す。
ックス粒子の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度にお
ける、慣用されるラテックス濃度での反応のカイネティ
ックス。濁度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、
１０秒間隔で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶
液中０.０２５％であった。試薬のカップリング比（抗
体：ラテックス）は１：４０であった。０.５秒後の吸
収から測定された差を示す。
【００２３】図３：反応媒体中の感作粒子の密度に対す
る濁度シグナルの依存性。抗−Ｄダイマーでコーティン
グしたラテックス粒子（カップリング比１：４０）を、
生理食塩溶液で、濃度０.０２５、０.１および０.２％
に希釈した。Ｄダイマー溶液（２５０μｇ／リットル）
との反応カイネティックスをCobas Bioにより、４０５n
mにおいて、１０秒間隔で５分間測定した。０.５秒後の
吸収から測定された差を示す。
る濁度シグナルの依存性。抗−Ｄダイマーでコーティン
グしたラテックス粒子（カップリング比１：４０）を、
生理食塩溶液で、濃度０.０２５、０.１および０.２％
に希釈した。Ｄダイマー溶液（２５０μｇ／リットル）
との反応カイネティックスをCobas Bioにより、４０５n
mにおいて、１０秒間隔で５分間測定した。０.５秒後の
吸収から測定された差を示す。
【００２４】図４：市販されている製品の抗−ＩｇＥコ
ーティングラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度に
おける、本発明の方法での反応のカイネティックス。濁
度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔
で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶液中０.２
％であった。０.５秒後の吸収から測定された差を示
す。
ーティングラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度に
おける、本発明の方法での反応のカイネティックス。濁
度はCobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔
で５分間測定した。試薬の濃度はサンプル溶液中０.２
％であった。０.５秒後の吸収から測定された差を示
す。
【００２５】図５：抗−Ｄダイマーコーティングラテッ
クス粒子の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度におけ
る、本発明の方法での反応のカイネティックス。濁度は
Cobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔で５
分間測定した。採用した試薬の濃度は０.２％であった
（カップリング比１：４０）。０.５秒後の吸収から測
定された差を示す。
クス粒子の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度におけ
る、本発明の方法での反応のカイネティックス。濁度は
Cobas Bioにより、４０５nmにおいて、１０秒間隔で５
分間測定した。採用した試薬の濃度は０.２％であった
（カップリング比１：４０）。０.５秒後の吸収から測
定された差を示す。
【００２６】図６：抗体−Ｄダイマー抗体によるラテッ
クス粒子の負荷密度に対する濁度シグナルの依存性につ
いてのもので、ラテックス粒子を、Ｄダイマーに対する
モノクローナル抗体により、実施例１に記載の方法で、
比１：６７、１：４０および１：２９にコーティングし
た。試薬は濃度０.２％で使用した。Ｄダイマー溶液
（１２５μｇ／リットル）でCobas Bioにより、４０５n
mにおいて、１０秒間隔で５分間測定した場合の、０.５
秒後の吸収から測定された差を示す。
クス粒子の負荷密度に対する濁度シグナルの依存性につ
いてのもので、ラテックス粒子を、Ｄダイマーに対する
モノクローナル抗体により、実施例１に記載の方法で、
比１：６７、１：４０および１：２９にコーティングし
た。試薬は濃度０.２％で使用した。Ｄダイマー溶液
（１２５μｇ／リットル）でCobas Bioにより、４０５n
mにおいて、１０秒間隔で５分間測定した場合の、０.５
秒後の吸収から測定された差を示す。
【００２７】現在の技術水準による粒子濃度を用い、た
とえば反応溶液中０.０１２５重量％で例２のように実
施すると（図１および２）、凝集反応は記載の過程で起
こる。被検物質の濃度に応じて、溶液の懸濁には初期の
比例した増加が起こる。これらの反応カイネティックス
は、ＩｇＥの比濁定量用に市販されている試薬（図１）
および発明者らによってＤダイマーの定量用に調製され
たラテックス試薬（例１のように実施）で明らかにされ
た。各場合とも、粒子径は２３０nmであった。
とえば反応溶液中０.０１２５重量％で例２のように実
施すると（図１および２）、凝集反応は記載の過程で起
こる。被検物質の濃度に応じて、溶液の懸濁には初期の
比例した増加が起こる。これらの反応カイネティックス
は、ＩｇＥの比濁定量用に市販されている試薬（図１）
および発明者らによってＤダイマーの定量用に調製され
たラテックス試薬（例１のように実施）で明らかにされ
た。各場合とも、粒子径は２３０nmであった。
【００２８】しかしながら、本発明に従い、現在の技術
水準で用いられ０.０９％濃度よりも高い粒子密度を使
用すると、実質的に濁度の低下のみが記録される。これ
に関連した範囲は、好ましくは０.１〜１、とくに好ま
しくは０.１〜０.４、最も好ましくは０.１〜０.２重量
％である。現在の技術水準によるラテックス濃度との比
較は、たとえば図３（例３）にＤダイマーラテックス試
薬について示されている。図４（ＩｇＥラテックス試薬
について）および図５（Ｄダイマーラテックス試薬につ
いて）は、本発明により粒子濃度が高くなるほど、たと
えば反応溶液中０.１％（例４）では、反応カイネティ
ックスはわずか約１分後に十分一定で、測定は５分以内
に可能であることを示している。
水準で用いられ０.０９％濃度よりも高い粒子密度を使
用すると、実質的に濁度の低下のみが記録される。これ
に関連した範囲は、好ましくは０.１〜１、とくに好ま
しくは０.１〜０.４、最も好ましくは０.１〜０.２重量
％である。現在の技術水準によるラテックス濃度との比
較は、たとえば図３（例３）にＤダイマーラテックス試
薬について示されている。図４（ＩｇＥラテックス試薬
について）および図５（Ｄダイマーラテックス試薬につ
いて）は、本発明により粒子濃度が高くなるほど、たと
えば反応溶液中０.１％（例４）では、反応カイネティ
ックスはわずか約１分後に十分一定で、測定は５分以内
に可能であることを示している。
【００２９】遠心アナライザーの反応キュベット中での
混合過程により、測定は通常、サンプル添加後わずかな
潜時で実施可能である。被検物質濃度の測定には、カイ
ネティックス法すなわち吸収の低下速度、終点法すなわ
ち選択された時間後における吸収の絶対差の測定、また
は域値法すなわち吸収に特定の変化が起こるまでの時間
の測定を選ぶことができる。これらの可能性は、たとえ
ば、例６の表１および２に示されている。
混合過程により、測定は通常、サンプル添加後わずかな
潜時で実施可能である。被検物質濃度の測定には、カイ
ネティックス法すなわち吸収の低下速度、終点法すなわ
ち選択された時間後における吸収の絶対差の測定、また
は域値法すなわち吸収に特定の変化が起こるまでの時間
の測定を選ぶことができる。これらの可能性は、たとえ
ば、例６の表１および２に示されている。
【００３０】驚くべきことに濁度の増加による濁度測定
法と本発明の方法の比較では（図１と４および図２と５
の比較）、本発明の方法における吸収の絶対変化がファ
クターで３〜５大きいことを示していて、これは一般
に、測定の正確度で相当する改善を伴うものであり、本
発明の方法の大きな利点を示すものである。
法と本発明の方法の比較では（図１と４および図２と５
の比較）、本発明の方法における吸収の絶対変化がファ
クターで３〜５大きいことを示していて、これは一般
に、測定の正確度で相当する改善を伴うものであり、本
発明の方法の大きな利点を示すものである。
【００３１】驚くべきことに、沈降速度も同様にコーテ
ィング密度の増加によって増強できることが明らかにさ
れている。たとえば、負荷密度の異なる粒子でＤダイマ
ーについて行った例５の測定では、図６に示すように、
沈降速度は高い負荷密度で増大する。しかしながら、ラ
テックス試薬の反応性の増大は同時に反応開始時の濁度
の増加をも意味し、これは例３において行われたよう
に、粒子濃度の相当する調整によって補正されなければ
ならない。
ィング密度の増加によって増強できることが明らかにさ
れている。たとえば、負荷密度の異なる粒子でＤダイマ
ーについて行った例５の測定では、図６に示すように、
沈降速度は高い負荷密度で増大する。しかしながら、ラ
テックス試薬の反応性の増大は同時に反応開始時の濁度
の増加をも意味し、これは例３において行われたよう
に、粒子濃度の相当する調整によって補正されなければ
ならない。
【００３２】さらに驚くべきことに、本発明の方法によ
る被検物質濃度の測定は、遠心アナライザーにおける測
定の光学的構築には依存しないことが明らかにされた。
例６において用いられた遠心アナライザーは極端な場合
を述べている。一方（たとえばCobas Bio）では光路は
沈降の方向と逆平行に調整されているのに対し、他方の
極端な例（たとえばＡＣＬ３００）では濁度は沈降の方
向と直角に測定される。本発明の方法による被検物質の
濃度の測定はいずれの方法でも可能である。したがっ
て、本発明の方法はすべての遠心アナライザーに適用可
能であると考えられる。
る被検物質濃度の測定は、遠心アナライザーにおける測
定の光学的構築には依存しないことが明らかにされた。
例６において用いられた遠心アナライザーは極端な場合
を述べている。一方（たとえばCobas Bio）では光路は
沈降の方向と逆平行に調整されているのに対し、他方の
極端な例（たとえばＡＣＬ３００）では濁度は沈降の方
向と直角に測定される。本発明の方法による被検物質の
濃度の測定はいずれの方法でも可能である。したがっ
て、本発明の方法はすべての遠心アナライザーに適用可
能であると考えられる。
【００３３】例６において、比較のために、異なる密度
の媒体（緩衝溶液、血清、血漿）中においてＤダイマー
の測定を行った。密度の効果は結果にわずかな差をもた
らしたのみであり（表１および２）、したがってこの方
法は、様々な生物学的液体に問題なく適用できる。
の媒体（緩衝溶液、血清、血漿）中においてＤダイマー
の測定を行った。密度の効果は結果にわずかな差をもた
らしたのみであり（表１および２）、したがってこの方
法は、様々な生物学的液体に問題なく適用できる。
【００３４】この方法は、遠心分離前、後および／また
は分離時にサンプルと試薬の混合物の光学密度を測定す
るすべてのアナライザーに適している。遠心加速は、好
ましくは１０〜１０,０００×ｇ、とくに好ましくは１
００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８００×１,２０
０×ｇで行われ、至適遠心加速は粒子密度に対してある
種の依存性を示す。
は分離時にサンプルと試薬の混合物の光学密度を測定す
るすべてのアナライザーに適している。遠心加速は、好
ましくは１０〜１０,０００×ｇ、とくに好ましくは１
００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８００×１,２０
０×ｇで行われ、至適遠心加速は粒子密度に対してある
種の依存性を示す。
【００３５】凝集体形成の指標としては、たとえばアッ
セイ混合物中の吸収に予じめ定められた変化が生じるま
での時間を測定することができる（域値法）。他の方法
では、吸収の低下が連続的に測定され、吸収の低下の速
度が評価される（カイネティック法）。最後に、ある時
間後の吸収と初期値の差を評価に使用することも可能で
ある（終点法）。
セイ混合物中の吸収に予じめ定められた変化が生じるま
での時間を測定することができる（域値法）。他の方法
では、吸収の低下が連続的に測定され、吸収の低下の速
度が評価される（カイネティック法）。最後に、ある時
間後の吸収と初期値の差を評価に使用することも可能で
ある（終点法）。
【００３６】適当な水不溶性担体（固相）は、本技術分
野の熟練者にはよく知られている天然および合成の有機
および無機のポリマーであり、たとえばポリスチレン、
ポリデキストラン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス、ラテックス、マグネタイト、多孔性ガラス末、赤血
球、白血球、またはスチレン／ブタジエン、スチレン／
メタクリル酸もしくはメタクリレート／メタクリル酸コ
ポリマーであり、また混合ポリマーも適当である。
野の熟練者にはよく知られている天然および合成の有機
および無機のポリマーであり、たとえばポリスチレン、
ポリデキストラン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス、ラテックス、マグネタイト、多孔性ガラス末、赤血
球、白血球、またはスチレン／ブタジエン、スチレン／
メタクリル酸もしくはメタクリレート／メタクリル酸コ
ポリマーであり、また混合ポリマーも適当である。
【００３７】担体は粒子形状であるのが適当である。親
和性結合パートナーのための固相としては、ポリスチレ
ン球状体またはラテックス球状体がとくに適している。
粒子の直径は、好ましくは０.１〜１μm、とくに好まし
くは０.１〜０.３μmである。担体材料上の親和性結合
パートナーは、好ましくは生物学的物質、たとえば抗
原、抗体、ハプテン、レクチン、基質類縁体、プロテア
ーゼインヒビターまたプロテアーゼもしくはその変異体
である。この場合、抗体または抗原が好ましい。
和性結合パートナーのための固相としては、ポリスチレ
ン球状体またはラテックス球状体がとくに適している。
粒子の直径は、好ましくは０.１〜１μm、とくに好まし
くは０.１〜０.３μmである。担体材料上の親和性結合
パートナーは、好ましくは生物学的物質、たとえば抗
原、抗体、ハプテン、レクチン、基質類縁体、プロテア
ーゼインヒビターまたプロテアーゼもしくはその変異体
である。この場合、抗体または抗原が好ましい。
【００３８】粒子濃度は測定開始時の光学密度が５を越
えないように選択される。１〜３の光学密度が好まし
い。検出には、好ましくは２８０〜９００nmの範囲の波
長が選択される。一般に慣用されている比色アッセイで
使用されていて、臨床化学アナライザーで利用できるよ
うな波長、たとえば、３９０、４０５、４９０、５４
０、６３０nmを用いることがとくに好ましい。４０５nm
の波長が最も好ましい。二色測定法もまた好ましい。
えないように選択される。１〜３の光学密度が好まし
い。検出には、好ましくは２８０〜９００nmの範囲の波
長が選択される。一般に慣用されている比色アッセイで
使用されていて、臨床化学アナライザーで利用できるよ
うな波長、たとえば、３９０、４０５、４９０、５４
０、６３０nmを用いることがとくに好ましい。４０５nm
の波長が最も好ましい。二色測定法もまた好ましい。
【００３９】アッセイ混合物は、サンプルおよび試薬、
ならびに反応媒体から構成される。反応媒体には、本技
術分野の熟練者にはよく知られていて、反応を促進する
環境の作成に役立つ無機および有機物質、たとえば、pH
緩衝物質たとえばリン酸塩、トリ（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、密度および粘度に影響を与える物質たと
えばポリエチレングリコール、グリセロール、脂質の干
渉を最小限にする物質たとえば界面活性剤、リウマチ因
子の干渉を最小限にする物質たとえばガンマグロブリン
分画を含有させることができる。反応媒体は好ましくは
生理学的食塩水である。
ならびに反応媒体から構成される。反応媒体には、本技
術分野の熟練者にはよく知られていて、反応を促進する
環境の作成に役立つ無機および有機物質、たとえば、pH
緩衝物質たとえばリン酸塩、トリ（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、密度および粘度に影響を与える物質たと
えばポリエチレングリコール、グリセロール、脂質の干
渉を最小限にする物質たとえば界面活性剤、リウマチ因
子の干渉を最小限にする物質たとえばガンマグロブリン
分画を含有させることができる。反応媒体は好ましくは
生理学的食塩水である。
【００４０】測定は、好ましくは＋１０°〜４０℃、と
くに好ましくは＋２０°〜＋４０℃、最も好ましくは＋
３７℃で行われる。本発明の方法は、これまで開示され
ている濁度法と比較して改善されたその単純性、自動化
の容易性および測定の正確度によって検出している。
くに好ましくは＋２０°〜＋４０℃、最も好ましくは＋
３７℃で行われる。本発明の方法は、これまで開示され
ている濁度法と比較して改善されたその単純性、自動化
の容易性および測定の正確度によって検出している。
【００４１】以下の実施例は本発明を詳細に説明するも
のであるが、いかなる意味においても本発明を限定する
ものではない。実施例中、粒子濃度に関しての百分率
は、いずれの場合も重量％である。
のであるが、いかなる意味においても本発明を限定する
ものではない。実施例中、粒子濃度に関しての百分率
は、いずれの場合も重量％である。
【００４２】実施例１ フィブリンフラグメントＤダイマー定量用のラテックス
試薬の調製 ラテックス試薬は、W.H. Kapmeyerら：「新規なシェル
／コア粒子を使用する自動比法イムノアッセイ」J. Cli
n. Lab. Anal. 2：76〜83（1988）の方法によって調製
した。Ｄダイマーに対するモノクローナル抗体（ＭＡb
ＤＤ５, Behringwerke AG, Marburg, FRG）を、グラフ
トコポリマーのジフェニルアセタール基に、反応試薬の
重量に基づいて１：６７〜１：２９の比でカップリング
させた。
試薬の調製 ラテックス試薬は、W.H. Kapmeyerら：「新規なシェル
／コア粒子を使用する自動比法イムノアッセイ」J. Cli
n. Lab. Anal. 2：76〜83（1988）の方法によって調製
した。Ｄダイマーに対するモノクローナル抗体（ＭＡb
ＤＤ５, Behringwerke AG, Marburg, FRG）を、グラフ
トコポリマーのジフェニルアセタール基に、反応試薬の
重量に基づいて１：６７〜１：２９の比でカップリング
させた。
【００４３】グラフトコポリマー（４％）１mlを０.１m
lのＭＡb ＤＤ５溶液（１mg／ml；カップリング比１：
４０に相当）および０.０５mlの２０％濃度のTweenR ２
０水溶液と混合した。溶液のpHを１Ｎの塩酸約０.０１m
lで２に調整してラテックスを活性化した。室温で３０
分間インキュベートしたのち、０.２５mlの飽和リン酸
水素ナトリウム溶液（pH６.５）および０.２５mlの水素
化ホウ素ナトリウム水溶液（２５mg／ml）を加え、激し
く混合した。抗体を、活性化アルデヒド基に室温で１時
間カップリングさせた。ついで、抗−Ｄダイマーラテッ
クス接合体を遠心分離し（Beckman遠心分離機、４０,０
００×ｇ、３０分）、ペレットを１.５mlの０.１モルグ
リシン緩衝液（pH８.２、０.１７Ｍ ＮａＣｌおよび０.
５％TweenR ２０含有）に再懸濁した。溶液を約５秒間
超音波で処理した（Branson超音波処理器Ｂ１５）。こ
の保存溶液は＋４℃で保存した。ラテックス固体含量に
基づいて濃度０.０２５〜０.２％の処理溶液は、保存溶
液を生理食塩溶液（反応溶液中０.０１２５〜０.１％）
で希釈して調製した。
lのＭＡb ＤＤ５溶液（１mg／ml；カップリング比１：
４０に相当）および０.０５mlの２０％濃度のTweenR ２
０水溶液と混合した。溶液のpHを１Ｎの塩酸約０.０１m
lで２に調整してラテックスを活性化した。室温で３０
分間インキュベートしたのち、０.２５mlの飽和リン酸
水素ナトリウム溶液（pH６.５）および０.２５mlの水素
化ホウ素ナトリウム水溶液（２５mg／ml）を加え、激し
く混合した。抗体を、活性化アルデヒド基に室温で１時
間カップリングさせた。ついで、抗−Ｄダイマーラテッ
クス接合体を遠心分離し（Beckman遠心分離機、４０,０
００×ｇ、３０分）、ペレットを１.５mlの０.１モルグ
リシン緩衝液（pH８.２、０.１７Ｍ ＮａＣｌおよび０.
５％TweenR ２０含有）に再懸濁した。溶液を約５秒間
超音波で処理した（Branson超音波処理器Ｂ１５）。こ
の保存溶液は＋４℃で保存した。ラテックス固体含量に
基づいて濃度０.０２５〜０.２％の処理溶液は、保存溶
液を生理食塩溶液（反応溶液中０.０１２５〜０.１％）
で希釈して調製した。
【００４４】実施例２ 従来慣用されている方法でのラテックス試薬の使用にお
ける濁度シグナルのカイネティックス 血清中の１ｇＥの比濁定量用に市販されているラテック
ス試薬および濃度５１２IU／mlのＩｇＥ標準血清（ＮＡ
−ラテックス−ＩｇＥ試薬、Behringwerke AG,Marburg,
FRG）を指示書に従い蒸留水で再構築した。ＩｇＥ標準
は非希釈で、また生理食塩水で希釈して使用した。実施
例１で調製したカップリング比１：４０のＤダイマーラ
テックス試薬を、生理食塩溶液で濃度０.０２５％に希
釈した。Ｄダイマー標準（Behringwerke AG, Marburg,
FRG）は生理食塩溶液で濃度６２.５〜５００μｇ／リッ
トルに希釈した。反応媒体には生理食塩溶液を使用し
た。
ける濁度シグナルのカイネティックス 血清中の１ｇＥの比濁定量用に市販されているラテック
ス試薬および濃度５１２IU／mlのＩｇＥ標準血清（ＮＡ
−ラテックス−ＩｇＥ試薬、Behringwerke AG,Marburg,
FRG）を指示書に従い蒸留水で再構築した。ＩｇＥ標準
は非希釈で、また生理食塩水で希釈して使用した。実施
例１で調製したカップリング比１：４０のＤダイマーラ
テックス試薬を、生理食塩溶液で濃度０.０２５％に希
釈した。Ｄダイマー標準（Behringwerke AG, Marburg,
FRG）は生理食塩溶液で濃度６２.５〜５００μｇ／リッ
トルに希釈した。反応媒体には生理食塩溶液を使用し
た。
【００４５】測定は遠心アナライザー中で実施例した
（Cobas Bio型、Hoffmann La Roche &Co. AG, Basel, S
witzerland）。４０μｌのサンプルおよび５μｌの反応
媒体を導入した。１０秒後、４０μｌのラテックス試薬
を加えた。サンプルを遠心で混合することによって反応
を開始させた。約１,０００×ｇの一定の遠心スピード
で、４０５nmにおける吸収を１０秒間隔で５分間にわた
って測定した。
（Cobas Bio型、Hoffmann La Roche &Co. AG, Basel, S
witzerland）。４０μｌのサンプルおよび５μｌの反応
媒体を導入した。１０秒後、４０μｌのラテックス試薬
を加えた。サンプルを遠心で混合することによって反応
を開始させた。約１,０００×ｇの一定の遠心スピード
で、４０５nmにおける吸収を１０秒間隔で５分間にわた
って測定した。
【００４６】測定開始時の吸収は約０.８単位であっ
た。初期吸収シグナルからの４０５nmにおける測定期間
での変化を、ＩｇＥについては図１に、Ｄダイマーラテ
ックス試薬については図２に示す。
た。初期吸収シグナルからの４０５nmにおける測定期間
での変化を、ＩｇＥについては図１に、Ｄダイマーラテ
ックス試薬については図２に示す。
【００４７】実施例３ 測定混合物中における粒子濃度に対する反応カイネティ
ックスの依存性 実施例１で調製したカップリング比１：４０の抗−Ｄダ
イマーラテックス試薬を、生理食塩溶液で、濃度０.０
２５、０.１および０.２％に希釈した。Ｄダイマー標準
（Behringwerke AG, Marburg, FRG）は生理食塩溶液で
濃度２５０μｇ／リットルに希釈した。反応媒体として
は生理食塩溶液を使用した。
ックスの依存性 実施例１で調製したカップリング比１：４０の抗−Ｄダ
イマーラテックス試薬を、生理食塩溶液で、濃度０.０
２５、０.１および０.２％に希釈した。Ｄダイマー標準
（Behringwerke AG, Marburg, FRG）は生理食塩溶液で
濃度２５０μｇ／リットルに希釈した。反応媒体として
は生理食塩溶液を使用した。
【００４８】吸収の変化は実施例２と同様にして遠心ア
ナライザー中で定量した。測定の開始時における吸光度
は、４５０nmで０.８、１.４および１.８単位であっ
た。その吸収で測定した変化の経過を図３に示す。
ナライザー中で定量した。測定の開始時における吸光度
は、４５０nmで０.８、１.４および１.８単位であっ
た。その吸収で測定した変化の経過を図３に示す。
【００４９】実施例４ 本発明の方法でのラテックス試薬の使用に対する濁度シ
グナルの経過 凍結乾燥したＩｇＥラテックス試薬（ＮＡ−ラテックス
−ＩｇＥ試薬、Behringwerke AG, Marburg, FRG）を、
通常使用される量の１/３だけの蒸留水で再構築した。
実施例１と同様にして調製したカップリング比１：４０
の抗−Ｄダイマーラテックス試薬を、生理食塩溶液で、
濃度０.２％に希釈した。ＩｇＥおよびＤダイマー標準
には実施例２の場合と同じものを使用した。
グナルの経過 凍結乾燥したＩｇＥラテックス試薬（ＮＡ−ラテックス
−ＩｇＥ試薬、Behringwerke AG, Marburg, FRG）を、
通常使用される量の１/３だけの蒸留水で再構築した。
実施例１と同様にして調製したカップリング比１：４０
の抗−Ｄダイマーラテックス試薬を、生理食塩溶液で、
濃度０.２％に希釈した。ＩｇＥおよびＤダイマー標準
には実施例２の場合と同じものを使用した。
【００５０】吸収の変化は実施例２と同様にして遠心ア
ナライザー中で定量した。測定の開始時における吸光度
は、４５０nmで１.８単位であった。様々な抗原濃度に
おいてその吸収で測定した変化の経過を、ＩｇＥについ
ては図４に、Ｄダイマーラテックス試薬については図５
に示す。
ナライザー中で定量した。測定の開始時における吸光度
は、４５０nmで１.８単位であった。様々な抗原濃度に
おいてその吸収で測定した変化の経過を、ＩｇＥについ
ては図４に、Ｄダイマーラテックス試薬については図５
に示す。
【００５１】実施例５ ラテックス試薬の負荷密度に対する反応カイネティック
スの依存性 実施例１で調製したカップリング比１：６７、１：４０
および１：２９の抗−Ｄダイマーラテックス試薬を生理
食塩溶液で濃度０.２％に希釈した。Ｄダイマー標準（B
ehringwerke AG, Marburg, FRG）は生理食塩溶液で濃度
１２５μｇ／リットルに希釈した。反応媒体としては生
理食塩溶液を使用した。
スの依存性 実施例１で調製したカップリング比１：６７、１：４０
および１：２９の抗−Ｄダイマーラテックス試薬を生理
食塩溶液で濃度０.２％に希釈した。Ｄダイマー標準（B
ehringwerke AG, Marburg, FRG）は生理食塩溶液で濃度
１２５μｇ／リットルに希釈した。反応媒体としては生
理食塩溶液を使用した。
【００５２】吸収の変化は実施例２と同様にして遠心ア
ナライザー中で定量した。測定の開始時における溶液の
吸収は、４５０nmで約１.８単位であった。抗体の負荷
が異なるラテックス試薬について、その吸収で測定した
変化の経過を図６に示す。
ナライザー中で定量した。測定の開始時における溶液の
吸収は、４５０nmで約１.８単位であった。抗体の負荷
が異なるラテックス試薬について、その吸収で測定した
変化の経過を図６に示す。
【００５３】実施例６ リン酸塩緩衝液、血清および血漿中のＤダイマーの、遠
心アナライザーを用いた、沈降方向と直角に調整した測
定光線による定量 実施例１と同様にしてコーティングしたラテックス試薬
（カップリング比１：２９）を、リン酸緩衝、等張性食
塩溶液（ＰＢＳ）中、０.２％濃度の処理濃度に希釈し
た。Ｄダイマー抗原（Behringwerke AG, Marburg, FR
G）をＰＢＳまたは正常血液ドナーからの血清もしくは
血漿のプールに加え、最終濃度を０、３１３、６２５、
１,２５０、２,５００および５,０００μｇ／リットル
とした。反応媒体としてはＰＢＳを使用した。
心アナライザーを用いた、沈降方向と直角に調整した測
定光線による定量 実施例１と同様にしてコーティングしたラテックス試薬
（カップリング比１：２９）を、リン酸緩衝、等張性食
塩溶液（ＰＢＳ）中、０.２％濃度の処理濃度に希釈し
た。Ｄダイマー抗原（Behringwerke AG, Marburg, FR
G）をＰＢＳまたは正常血液ドナーからの血清もしくは
血漿のプールに加え、最終濃度を０、３１３、６２５、
１,２５０、２,５００および５,０００μｇ／リットル
とした。反応媒体としてはＰＢＳを使用した。
【００５４】測定は、Instrument Laboratory, Milan,
Italy製のＡＣＬ３００型の遠心アナライザー中で実施
した。このアナライザーでは、測定光線は沈降の方向に
対して直角にサンプル溶液を通過する。２０μｌのサン
プル（ＰＢＳ、血清または血漿）および８０μｌの反応
媒体を導入し、遠心によって混合した。３０秒後、５０
μｌのラテックス試薬をピペットで加えた。ついで、反
応を約８００×ｇで実施した。測定は４０５nmで１０分
間連続的に行った。
Italy製のＡＣＬ３００型の遠心アナライザー中で実施
した。このアナライザーでは、測定光線は沈降の方向に
対して直角にサンプル溶液を通過する。２０μｌのサン
プル（ＰＢＳ、血清または血漿）および８０μｌの反応
媒体を導入し、遠心によって混合した。３０秒後、５０
μｌのラテックス試薬をピペットで加えた。ついで、反
応を約８００×ｇで実施した。測定は４０５nmで１０分
間連続的に行った。
【００５５】この装置は、装置特異的対照溶液との比較
により光の吸収低下を測定し、結果を正の符号で与え
る。各種方法（終点、カイネティックスおよび域値法）
による評価の詳細を表１に示す。０.１の吸収低下を生
じるまでの時間はＤダイマー濃度に逆比例する。吸収の
低下速度または最終測定における吸収の総低下は、サン
プル中のＤダイマー濃度に比例する。方法の結果は、Ｐ
ＢＳならびに血清および血漿中の両者で一致する。
により光の吸収低下を測定し、結果を正の符号で与え
る。各種方法（終点、カイネティックスおよび域値法）
による評価の詳細を表１に示す。０.１の吸収低下を生
じるまでの時間はＤダイマー濃度に逆比例する。吸収の
低下速度または最終測定における吸収の総低下は、サン
プル中のＤダイマー濃度に比例する。方法の結果は、Ｐ
ＢＳならびに血清および血漿中の両者で一致する。
【００５６】表１は、遠心アナライザーでの吸収の変化
の、沈降方向に直角の光路との依存性を示している。
の、沈降方向に直角の光路との依存性を示している。
【表１】
【００５７】実施例７ リン酸塩緩衝液および血漿中のＤダイマーの、遠心アナ
ライザーを用いた、沈降方向と逆平行に調整した測定光
線による定量 実施例１と同様にしてコーティングしたＤダイマーラテ
ックス試薬（カップリング比１：２９）を、リン酸緩衝
等張性食塩溶液（ＰＢＳ）中０.２％濃度の処理濃度に
調整した。これは、波長４０５nmにおいて約１.８の吸
収に相当する。Ｄダイマー抗原（Behringwerke AG, Mar
burg, FRG）をＰＢＳまたは正常血液ドナーからの血漿
のプールに加え、最終濃度を０、６２.５、１２５、２
５０、５００，１,０００および２,０００μｇ／リット
ルとした。反応媒体としてはＰＢＳを使用した。
ライザーを用いた、沈降方向と逆平行に調整した測定光
線による定量 実施例１と同様にしてコーティングしたＤダイマーラテ
ックス試薬（カップリング比１：２９）を、リン酸緩衝
等張性食塩溶液（ＰＢＳ）中０.２％濃度の処理濃度に
調整した。これは、波長４０５nmにおいて約１.８の吸
収に相当する。Ｄダイマー抗原（Behringwerke AG, Mar
burg, FRG）をＰＢＳまたは正常血液ドナーからの血漿
のプールに加え、最終濃度を０、６２.５、１２５、２
５０、５００，１,０００および２,０００μｇ／リット
ルとした。反応媒体としてはＰＢＳを使用した。
【００５８】測定は、例２の記載のように、Cobas Bio
型（F. Hoffmann La Roche & Co. AG, Basel, Switzerl
and）の遠心アナライザー中で実施した。このアナライ
ザーでは、測定光線は沈降の方向に対して逆平行に進行
する。
型（F. Hoffmann La Roche & Co. AG, Basel, Switzerl
and）の遠心アナライザー中で実施した。このアナライ
ザーでは、測定光線は沈降の方向に対して逆平行に進行
する。
【００５９】終点、カイネティックスおよび域値法によ
る評価の詳細を表２に示す。０.０５の吸収低下を生じ
るまでの時間はＤダイマー濃度に逆比例する。吸収の低
下速度または最終測定における吸収の総低下は、サンプ
ル中のＤダイマー濃度に比例する。方法の結果は、ＰＢ
Ｓならびに血漿中ので一致する。
る評価の詳細を表２に示す。０.０５の吸収低下を生じ
るまでの時間はＤダイマー濃度に逆比例する。吸収の低
下速度または最終測定における吸収の総低下は、サンプ
ル中のＤダイマー濃度に比例する。方法の結果は、ＰＢ
Ｓならびに血漿中ので一致する。
【００６０】表２は、遠心アナライザーでの吸収の変化
の、沈降方向に逆平行の光路との依存性を示している。
の、沈降方向に逆平行の光路との依存性を示している。
【表２】
【００６１】以上、本発明を詳細に説明したが、本発明
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １） 被検物質を含有する可能性がある生物学的材料サ
ンプルをその被検物質に特異的で粒子状担体材料上に固
定化された少なくとも１種の結合パートナーとインキュ
ベートして被検物質を定量する方法において、(ａ) 反
応は、測定の経過を通じて一定の、好ましくは１０〜１
０,０００×ｇ、とくに好ましくは１００〜２,０００×
ｇ、最も好ましくは８００×１,２００×ｇの遠心加速
の影響下に行い、(ｂ) 測定混合物中の粒子密度は少な
くとも０.１重量％であり、(ｃ) 生じた混濁中の輝度
を、混合の完了直後、サンプルの添加によって生じた分
布相で測定し、ついで、(ｄ) サンプルについての混濁
中の輝度を、被検物質含量が既知のサンプルでの同一条
件での測定値と比較することにより、被検物質の濃度を
明白に決定する方法。
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １） 被検物質を含有する可能性がある生物学的材料サ
ンプルをその被検物質に特異的で粒子状担体材料上に固
定化された少なくとも１種の結合パートナーとインキュ
ベートして被検物質を定量する方法において、(ａ) 反
応は、測定の経過を通じて一定の、好ましくは１０〜１
０,０００×ｇ、とくに好ましくは１００〜２,０００×
ｇ、最も好ましくは８００×１,２００×ｇの遠心加速
の影響下に行い、(ｂ) 測定混合物中の粒子密度は少な
くとも０.１重量％であり、(ｃ) 生じた混濁中の輝度
を、混合の完了直後、サンプルの添加によって生じた分
布相で測定し、ついで、(ｄ) サンプルについての混濁
中の輝度を、被検物質含量が既知のサンプルでの同一条
件での測定値と比較することにより、被検物質の濃度を
明白に決定する方法。
【００６２】２） 被検物質および特異的結合パートナ
ーは、免疫化学的反応におけるパートナーである前項１
記載の方法。 ３） 可能な限り球形の粒子状天然および／または合成
ポリマーを担体材料として使用する前項１記載の方法。 ４） 反応は所定の密度および粘度を有する緩衝液中で
実施する前項１記載の方法。 ５） 吸収の変化は沈降方向に対して０°〜１８０°の
角度で起こる前項１記載の方法。
ーは、免疫化学的反応におけるパートナーである前項１
記載の方法。 ３） 可能な限り球形の粒子状天然および／または合成
ポリマーを担体材料として使用する前項１記載の方法。 ４） 反応は所定の密度および粘度を有する緩衝液中で
実施する前項１記載の方法。 ５） 吸収の変化は沈降方向に対して０°〜１８０°の
角度で起こる前項１記載の方法。
【００６３】６） 吸収の変化の測定には２８０〜９０
０nmの範囲の波長を使用する前項１記載の方法。 ７） 遠心加速は１０〜１０,０００×ｇ、好ましくは
１００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８００〜１,２
００×ｇで行う前項１記載の方法。 ８） フィブリン分解生成物Ｄダイマーに対する抗体を
特異的結合パートナーとして使用する前項１記載の方
法。 ９） スチレン／メタクリル酸またはメタクリレート／
メタクリル酸コポリマーを粒子状担体材料として使用す
る前項１記載の方法。
０nmの範囲の波長を使用する前項１記載の方法。 ７） 遠心加速は１０〜１０,０００×ｇ、好ましくは
１００〜２,０００×ｇ、最も好ましくは８００〜１,２
００×ｇで行う前項１記載の方法。 ８） フィブリン分解生成物Ｄダイマーに対する抗体を
特異的結合パートナーとして使用する前項１記載の方
法。 ９） スチレン／メタクリル酸またはメタクリレート／
メタクリル酸コポリマーを粒子状担体材料として使用す
る前項１記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】市販されている製品の抗−ＩｇＥコーティング
ラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、慣
用されるラテックス濃度での反応のカイネティックスで
０.５秒後の吸収から測定された差を示す図。
ラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、慣
用されるラテックス濃度での反応のカイネティックスで
０.５秒後の吸収から測定された差を示す図。
【図２】抗−Ｄダイマーコーティングラテックス粒子
の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度における、慣用
されるラテックス濃度での反応のカイネティックスで
０.５秒後の吸収から測定された差を示す図。
の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度における、慣用
されるラテックス濃度での反応のカイネティックスで
０.５秒後の吸収から測定された差を示す図。
【図３】反応媒体中の感作粒子の密度に対する濁度シグ
ナルの依存性について、反応カイネティックスで０.５
秒後の吸収から測定された差を示す図。
ナルの依存性について、反応カイネティックスで０.５
秒後の吸収から測定された差を示す図。
【図４】市販されている製品の抗−ＩｇＥコーティング
ラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、本
発明の方法での反応のカイネティックスで０.５秒後の
吸収から測定された差を示す図。
ラテックス粒子の、血清中各種ＩｇＥ濃度における、本
発明の方法での反応のカイネティックスで０.５秒後の
吸収から測定された差を示す図。
【図５】抗−Ｄダイマーコーティングラテックス粒子
の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度における、本発
明の方法での反応のカイネティックスで０.５秒後の吸
収から測定された差を示す図。
の、生理食塩溶液中各種Ｄダイマー濃度における、本発
明の方法での反応のカイネティックスで０.５秒後の吸
収から測定された差を示す図。
【図６】抗−Ｄダイマー抗体によるラテックス粒子の負
荷密度に対する濁度シグナルの依存について０.５秒後
の吸収から測定された差を示す図。
荷密度に対する濁度シグナルの依存について０.５秒後
の吸収から測定された差を示す図。
Claims (1)
- 【請求項１】 被検物質を含有する可能性がある生物学
的材料サンプルをその被検物質に特異的で粒子状担体材
料上に固定化された少なくとも１種の結合パートナーと
インキュベートして被検物質を定量する方法において、 (ａ) 反応は、測定の経過を通じて一定の、好ましくは
１０〜１０,０００×ｇ、とくに好ましくは１００〜２,
０００×ｇ、最も好ましくは８００×１,２００×ｇの
遠心加速の影響下に行い、 (ｂ) 測定混合物中の粒子密度は少なくとも０.１重量
％であり、 (ｃ) 生じた混濁中の輝度を、混合の完了直後、サンプ
ルの添加によって生じた分布相で測定し、ついで (ｄ) サンプルについての混濁中の輝度を、被検物質含
量が既知のサンプルでの同一条件での測定値と比較する
ことにより、被検物質の濃度を明白に決定する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4211351A DE4211351A1 (de) | 1992-04-04 | 1992-04-04 | Verfahren zur Analyse partikelverstärkter Agglutinationsreaktionen auf Zentrifugalanalysatoren durch Bestimmung der Trübungsaufhellung |
| DE4211351:2 | 1992-04-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0618528A true JPH0618528A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3327484B2 JP3327484B2 (ja) | 2002-09-24 |
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ID=6456084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07603693A Expired - Fee Related JP3327484B2 (ja) | 1992-04-04 | 1993-04-02 | 遠心アナライザー中の粒子強化凝集反応を混濁の輝度の測定により分析する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0568797B1 (ja) |
| JP (1) | JP3327484B2 (ja) |
| AT (1) | ATE187820T1 (ja) |
| AU (1) | AU661764B2 (ja) |
| CA (1) | CA2093307A1 (ja) |
| DE (2) | DE4211351A1 (ja) |
| ES (1) | ES2141735T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4440487A1 (de) * | 1994-11-12 | 1996-05-15 | Behringwerke Ag | Heterogener Immunoassay mittels präzipitierbarer Festphase |
| DE19505204A1 (de) * | 1995-02-16 | 1996-08-22 | Behringwerke Ag | Modifikation der Reaktivität von Agglutinationsreagenzien durch Cobeschichtung mit nicht gegen den Analyten gerichteten Substanzen |
| US6833275B1 (en) * | 1997-07-22 | 2004-12-21 | Roche Diagnostics Gmbh | Gold conjugates containing detergent |
| US20060115865A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-06-01 | Anlong Ouyang | Lamotrigine analogs |
| US7678551B2 (en) * | 2004-10-25 | 2010-03-16 | Seradyn, Inc. | Immunoassays for lamotrigine |
| US7638291B2 (en) * | 2004-10-25 | 2009-12-29 | Seradyn, Inc. | Immunoassays for topiramate |
| US20060088886A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-04-27 | Anlong Ouyang | Topiramate analogs |
| DK1952154T3 (da) * | 2005-11-24 | 2010-09-13 | Gentian As | Turbidimetrisk immunoassay til bestemmelse af humant Cystatin C |
| WO2008142057A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Gentian As | Turbidimetric immunoassay for assessing human cystatin c |
| WO2011057198A1 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Carson Cantwell G | Vaccine testing system |
| US9127057B2 (en) | 2010-07-20 | 2015-09-08 | Teva Pharmaceuticals Ausralia Pty Ltd | Anti-IL-23 heterodimer specific antibodies |
| WO2012142656A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | Garvan Institute Of Medical Research | Method of diagnosing cancer |
| CN104114577A (zh) | 2011-09-30 | 2014-10-22 | 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 | 针对TL1a的抗体及其用途 |
| US9970929B2 (en) | 2013-01-18 | 2018-05-15 | Ark Diagnostics, Inc. | Voriconazole immunoassays |
| NZ711543A (en) | 2013-02-01 | 2020-08-28 | Univ California | Anti-cd83 antibodies and use thereof |
| WO2014121325A1 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Csl Limited | Il-11r binding proteins and uses thereof |
| ES2674704T3 (es) | 2013-02-13 | 2018-07-03 | Ark Diagnostics, Inc. | Inmunoensayos de posaconazol |
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| EP3209695A4 (en) | 2014-10-23 | 2018-05-30 | DendroCyte BioTech Pty Ltd | Cd83 binding proteins and uses thereof |
| EP3761036B1 (en) | 2015-03-03 | 2025-11-19 | ARK Diagnostics, Inc. | Pregabalin immunoassays |
| US11795435B2 (en) | 2015-05-05 | 2023-10-24 | Mesoblast International Sárl; | Potency assay |
| EP3380514A4 (en) | 2015-11-27 | 2019-05-22 | CSL Limited | GDF131-BINDING PROTEINS AND USES THEREOF |
| EP4137562A1 (en) | 2017-05-04 | 2023-02-22 | Mesoblast International Sàrl | Mesenchymal lineage precursor or stem cells with enhanced immunosuppression |
| US20220143097A1 (en) | 2019-01-02 | 2022-05-12 | Mesoblast International Sárl | Method for treating lower back pain |
| US11578140B2 (en) | 2019-03-26 | 2023-02-14 | Microgenics Corporation | Immunoassay for mitragynine |
| US10745492B1 (en) | 2019-04-03 | 2020-08-18 | Ark Diagnostics, Inc. | Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof |
| US20230398154A1 (en) | 2020-08-10 | 2023-12-14 | Mesoblast International Sárl | A composition comprising mesenchymal precursor or stem cells and their use |
| EP4551691A1 (en) | 2022-07-05 | 2025-05-14 | Mesoblast International Sàrl | Cryopreserved intermediate and potency assay for same |
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| JPS5811575B2 (ja) * | 1976-08-16 | 1983-03-03 | 帝国臓器製薬株式会社 | 抗原−抗体反応の測定法 |
| US4208185A (en) * | 1976-08-16 | 1980-06-17 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
| JPS54108695A (en) * | 1978-02-15 | 1979-08-25 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Method and device for measuring antigennantibody reaction |
| US4480042A (en) * | 1981-10-28 | 1984-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays |
| DE3145082A1 (de) * | 1981-11-13 | 1983-05-19 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | "ein latex, biologisch aktive latexkonjugate und verfahren zu ihrer herstellung" |
| US4721681A (en) * | 1985-05-14 | 1988-01-26 | Fisher Scientific Company | Immunoassay in centrifugal field with complementary particles of differing specific gravities |
| US4720465A (en) * | 1985-05-14 | 1988-01-19 | Fisher Scientific Company | Centrifugal kinetic agglutination assay |
| US4988630A (en) * | 1987-04-27 | 1991-01-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multiple beam laser instrument for measuring agglutination reactions |
| US4968742A (en) * | 1987-11-09 | 1990-11-06 | Miles Inc. | Preparation of ligand-polymer conjugate having a controlled number of introduced ligands |
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1993
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- 1993-03-13 DE DE59309900T patent/DE59309900D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-13 ES ES93104120T patent/ES2141735T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-13 AT AT93104120T patent/ATE187820T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-04-01 US US08/041,210 patent/US5571728A/en not_active Expired - Lifetime
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