JPH06189771A - ポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo lati
folia ）の果実から以下の配列で表されるアミノ酸配列
からなる植物タンパク質クルクリンＢをコードする塩基
配列を含むＤＮＡを単離すると共に、以下の配列で表さ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドを形質転換体によ
り産生させた。 Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly 。 【効果】 味覚修飾物質である、植物タンパク質クルク
リンＢの大量生産手段が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，ポリペプチドおよびそ
れをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo
latifolia ）は、西マレーシアやタイ南部等に自生する
きんばいざさ科（または分類の仕方によってはひがんば
な科）に属する植物である。このクルクリゴ・ラチフォ
リアに含まれているタンパク質であるクルクリン同族体
（以下、クルクリンという）が味覚修飾物質として有用
であることは、従来から本発明者らによって確認されて
いる。そして、本発明者らは、特開平２−１０４２６３
号公報にクルクリゴ・ラチフォリアから得られたクルク
リンについて記載し、特開平２−８４１５７号公報には
クルクリンの安定化方法を、そして特開平２−８４１６
０号および特開平２−８４１６１号各公報にはクルクリ
ンの加工方法を開示している。更に、特開平３−１９０
８９９号公報にはクルクリン同族体のひとつであるクル
クリンＡ（以下、クルクリンＡという）について、その
全アミノ酸配列を記載している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
特開平２−１０４２６３号、特開平２−８４１５７号、
特開平２−８４１６０号、特開平２−８４１６１号及び
特開平３−１９０８９９号の各公報に記載の技術では、
クルクリゴ・ラチフォリア植物体から抽出しているため
クルクリンの大量生産が困難であった。また、クルクリ
ゴ・ラチフォリア植物体の処理が容易でなく、しかも抽
出法によって得られたクルクリンは、それ自体の活性が
低下しやすいという問題点があった。

【０００４】本発明者は、クルクリンの大量生産手段を
提供することを目指して、既に解明したクルクリンＡの
アミノ酸配列を利用してオリゴヌクレオチドを作成し、
このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてクルク
リンＢ（以下クルクリンＢという）をコードするｃＤＮ
Ａをクローン化することに成功し、更にこのクローン化
ＤＮＡを組込んだプラスミドで形質転換させた微生物が
クルクリン同族体のひとつであるクルクリンＢを産生す
ることを確認し、本発明を完成した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
表の配列番号１の配列で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドに関する。更に、本発明は、配列表の配
列番号１の配列で表されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする塩基配列を含むことを特徴とするＤ
ＮＡにも関する。

【０００６】クルクリンは、プレペプチドまたはプレプ
ロペプチドを含む前駆体（未成熟体）の形で植物細胞内
に産生され、プロセシングによりこのプレペプチドまた
はプレプロペプチドが脱離して成熟体になるものと推定
される。本発明者が見出したところによれば、成熟クル
クリンＢは配列表の配列番号１の配列に示すアミノ酸１
１４個からなり、クルクリンＢ前駆体は配列表の配列番
号２の配列に示すアミノ酸１５８個からなる。従って、
本発明は、配列表の配列番号２の配列で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドにも関する。更に、本発
明は、配列表の配列番号２の配列で表されるアミノ酸配
列からなるクルクリンＢ前駆体をコードする塩基配列を
含むことを特徴とするＤＮＡ、更に、クルクリンＢ成熟
体またはクルクリンＢ前駆体を微生物や培養細胞によっ
て生産するために、前記塩基配列に開始メチオニンをコ
ードするＡＴＧが結合した塩基配列からなるＤＮＡにも
関する。

【０００７】天然または人工的変異により、主要な活性
を変化させることなく、ＤＮＡの構造または対応するペ
プチドの構造の一部を変化させることができる。従っ
て、本発明の前記各ＤＮＡは、前記の全てのポリペプチ
ドの相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を含有するＤＮＡも包含する。

【０００８】クルクリンＢをコードするＤＮＡは、以下
の方法によって得ることができる。 （Ａ）ｍＲＮＡの抽出 クルクリンを特に高濃度で産生する、クルクリゴ・ラチ
フォリアの果実を粉末状にし、この粉末試料からＲＮＡ
を抽出する。ＲＮＡの抽出は、グアニジンチオシアネー
ト法〔Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２）〕、または
フェノール・ＳＤＳ法〔Ｂｒａｗｅｒｍａｎら：Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，６３７−６４１，（１９７
２）〕を用いて行うことができる。

【０００９】グアニジンチオシアネート法は、試料にグ
アニジンチオシアネート液を添加後、ホモジナイズす
る。得られたホモジネートを、スイングローター用ポリ
アロマーチューブに入れて遠心し、ＲＮＡの沈殿を得
る。このＲＮＡの沈殿を精製してｍＲＮＡを得る。

【００１０】フェノール・ＳＤＳ法は、試料粉末に、フ
ェノール、ＥＤＴＡおよびＳＤＳ含有トリス塩酸緩衝
液、並びにジチオスレイトールを添加して水層を得る。
得られた水層には多糖類等のＲＮＡ以外の物質が含まれ
ているので、塩化リチウムなどによる塩析操作を行っ
て、ＲＮＡの沈殿を得る。続いて、ＲＮＡ沈殿を適当な
溶媒に再溶解し、オリゴ（ｄＴ）カラムによりｍＲＮＡ
を精製して抽出する〔Ａｖｉｖら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９，１４０８−
１４１８，（１９７２）参照〕。本発明においては、ク
ルクリゴ・ラチフォリア等の植物体の細胞膜が固いの
で、フェノール・ＳＤＳ法を用いるのが好ましい。

【００１１】（Ｂ）ｃＤＮＡの合成およびベクターへの
ｃＤＮＡの挿入 ｃＤＮＡの合成には、岡山−バーグの方法〔Ｏｋａｙａ
ｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２，１６１，
（１９８２）〕、またはグブラーホフマンの方法〔Ｇｕ
ｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ ２５，２６３，（１９８３）〕
等を利用することができる。

【００１２】岡山−バーグ法を以下に説明する。 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０ベクター用プラスミドを、制
限酵素ＫｐｎＩで切断した後、オリゴｄＴを添加する。
次に、制限酵素ＨｐａＩを反応させた後、オリゴｄＡセ
ルロース（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
製）カラムを用いてｄＴの付加していないものやオリゴ
ｄＴの短いものを除いて、ベクタープライマーを調製す
る。 次に、別のｐＢＲ３２２−ＳＶ４０融合プラスミドＤ
ＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して精製した後、オリゴ
ｄＧ鎖を付加して、制限酵素ＨｉｎｄIII で切断される
塩基配列をもつリンカーＤＮＡを調製する。 精製したｍＲＮＡと、で調製したベクタープライマ
ーとを混合し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。 合成したｃＤＮＡを融合させたプライマーにオリゴｄ
Ｇ鎖を付加した後、ＨｉｎｄIII により消化し、ｃＤＮ
Ａが融合した端部とは反対側のオリゴｄＧ鎖付加部分を
除去する。 前記ので調製したオリゴｄＧ鎖をもつリンカーＤＮ
Ａと、で調製したベクタープライマーＤＮＡ−ｍＲＮ
Ａハイブリッドとを、Ｔ４リガーゼ等のＤＮＡ結合酵素
を用いてＨｉｎｄIII 断片をつないで環状化した後、リ
ボヌクレアーゼＨでＲＮＡを部分的に消化する。続い
て、ＲＮＡ断片をプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ
ＩでＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換し、Ｔ４リガーゼでつな
いで二重鎖環状ＤＮＡに調製する。 コンピテント細胞を調製後、形質転換を行い、アンピ
シリンを含有する培地（例えば、χ−ブロス、ＬＢ−ブ
ロスまたはＹＴ−ブロス）で培養して目的とするＤＮＡ
を含有するコロニーを得ることができる。

【００１３】次に、グブラー−ホフマン法を説明する。
この方法では、ベクターにλｇｔ１０、λｇｔ１１、λ
ＺＡＰ等を用いることができる。 精製したｍＲＮＡのポリＡ部にアニールさせたオリゴ
ｄＴをプライマーとし、逆転写酵素を用いて第一鎖ｃＤ
ＮＡ（またはｓｓｃＤＮＡ）を合成する。 前記で調製したｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド
に、リボヌクレアーゼＨ等のエンド型ＲＮＡ分解酵素を
加えてｍＲＮＡを消化した後、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＣＴＰを添加し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
またはクレノウ断片等と反応させて、第二鎖ｃＤＮＡ
（またはｄｓｃＤＮＡ）を合成する。 前記で調製したｄｓｃＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ反応により両端をそろえ、ＥｃｏＲＩメチラーゼ
によりＥｃｏＲＩ部位をメチル化した後、ＥｃｏＲＩリ
ンカーを両端に付加し、ＥｃｏＲＩ消化を行う。 前記で調製したＥｃｏＲＩ消化ｃＤＮＡとＥｃｏＲ
Ｉ消化λｇｔベクターとをＴ４リガーゼによりライゲイ
ションした後、パッケージングを行って、ライブラリ−
を作成する。

【００１４】以上のようにして、ｃＤＮＡの合成および
ベクターへのｃＤＮＡの組み込みを行うが、本発明にお
いては、後述の実施例で示すとおりグブラー−ホフマン
法により行うのが好ましく、ベクターとしてはλｇｔ１
０を用いるのが好ましい。

【００１５】（Ｃ）プローブの作成 クルクリンＡは、既に本発明者等によってクルクリゴ・
ラチフォリア植物体から精製され、そのタンパク質の全
アミノ酸配列が解明されており、特開平３−１９０８９
９号明細書に記載されている。このアミノ酸配列の適当
な部分を選択してプローブを作成することができる。プ
ローブとして用いるＤＮＡの合成には、公知の方法〔例
えば、ＤＮＡ自動合成機を利用するホスホアミダイト
法、日本生化学会編：遺伝子研究法Ｉ，１−２７，（１
９８６）またはＭａｔｔｅｕｃｃｉら：Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２１，７１９，（１９８０）〕
を使用することができる。

【００１６】（Ｄ）スクリーニング Ｂ項で作成されたｃＤＮＡライブラリーからの、目的遺
伝子を含むプラークのスクリーニングは、Ｃ項で作成さ
れたプローブを用いて行うことができる。まず、プラー
クをナイロンメンブランまたはニトロセルロース等のフ
ィルターメンブラン上に焼き付ける（ベイキング）。ま
た、Ｃ項で得られたそれぞれのプローブを、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの前述の文献に記載の方法等により〔³²Ｐ〕等
の放射性同位体でラベルする。上記のフィルターメンブ
ラン上に焼き付けたプラークと、上記³²Ｐ等でラベルし
たプローブとをハイブリダイゼーションさせ、目的遺伝
子を含むプラークのスクリーニングを行うことができ
る。

【００１７】更に、ｃＤＮＡライブラリーからの、目的
遺伝子を含むプラークのスクリーニングに、Ｇｌｏｖｅ
ｒ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５１−５２，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓに記載されている方法を用いることもでき
る。即ち、目的とするｃＤＮＡから発現したタンパク質
の活性を検出したり、そのタンパク質に特異的な抗体を
用いて目的とするｃＤＮＡから発現したタンパク質を検
出することにより、目的とするｃＤＮＡを同定する、抗
体によるスクリーニング方法である。しかしながら、本
発明においては、プラークハイブリダイゼイション（ま
たはコロニーハイブリダイゼイション）による方法が望
ましい。

【００１８】（Ｅ）サブクローニング サブクローニングに用いるベクターとしては、例えばｐ
ＵＣ系列（例えば、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐ
ＵＣ１８またはｐＵＣ１９）またはｐＢＲ系列（例え
ば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２７）
のプラスミドを挙げることができ、特にｐＵＣ１８を用
いるのが好ましい。前記のスクリーニング工程によって
選択されたプラークまたはコロニーからファージＤＮＡ
またはプラスミドＤＮＡを取り出して精製し、適当な制
限酵素で消化し、サブクローニング用ベクターに挿入す
る。

【００１９】こうして得られる組換えベクターを、例え
ば、Ｈａｎａｈａｎら：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５
５７−５８０，（１９８３）に記載の方法によって、コ
ンピテント細胞に導入する。宿主細胞としては、大腸菌
Ｋ１２株由来のもの、例えば、ＨＢ１０１またはＭＭ２
９４、ＭＣ１０６１、Ｃ６００、ＤＨ１、ＪＭ１０９等
を挙げることができる。こうして得られた形質転換体
を、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前述の文献に記載の
方法、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）を用いる方法によって選定するこ
とができる。

【００２０】（Ｆ）プラスミドＤＮＡの調製 サブクローニングによって得られたクローンから、例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前述の文献に記載のアルカリ
−ＳＤＳ法、またはボイリング法によってプラスミドＤ
ＮＡを精製することができる。必要により、塩化セシウ
ム超遠心法を用いることもできる。

【００２１】（Ｇ）ｃＤＮＡの構造解析 Ｆ項で得られたプラスミドＤＮＡを、各種の制限酵素で
切断して制限酵素地図を作成する。更に、ジデオキシ法
〔Ｓａｎｇｅｒら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４３，１
６１−１７８，（１９８０）〕等によって、ヌクレオチ
ド配列を決定する。

【００２２】（Ｈ）発現 Ｆ項で得られたプラスミドＤＮＡを利用し、例えば、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらの前述の文献に記載の方法により、大
腸菌ＹＡ２１株のコンピテント細胞を形質転換してクル
クリンＢを発現させることができる。発現用の宿主細胞
としては、前記の大腸菌ＹＡ２１株の他、大腸菌ＭＭ２
９４、ＤＨ１、ＤＨ５、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＧＣ
５０８またはＣＥＳ２０１等を挙げることができる。

【００２３】更に、本発明で利用することのできるベク
ターとしては、ＣｏｌＥ１系プラスミドベクターであ
る、ｐＵＣ系（例えば、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、ｐＢＲ系（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７）、更に、そ
れらに由来するｐＴＶ１１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１
１９等を挙げることができる。また、ファージ系ベクタ
ーとしては、λファージ由来のλｇｔ１０、λｇｔ１
１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、λｇｔＷＥＳ・λＢ、ＥＭＢＬ
３、ＥＭＢＬ４等を挙げることができる。

【００２４】また、酵母用の発現ベクターとしては、例
えば、ｐＹＥＳ２．０、ｐＡＨ９、ｐＭＡＣ５６１、ｐ
ＬＧ６６９、ｐＭＡ９１、ｐＡＭ８２、ｐＭＣ２０１
０、ｐＯＰ、ｐＴＥ４３２、ｐＳＤ９２２等を挙げるこ
とができ、枯草菌用の発現ベクターとしては、例えば、
ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０、ｐＫＴＨ５１、ｐＫＴＨ
５３、ｐＫＴＨ３８、ｐＨＹ３００、ｐＬＫ等、そし
て、動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒
色腫細胞、ＣＨＯ細胞）用の発現ベクターとしては、例
えば、ｐＭＴ、ｐＳＶ、ｐＣＤ、ｐＭＤＳＧ、ｐＢＰＶ
等を挙げることができる。

【００２５】得られた形質転換体を適当な公知の培地に
おいて、細胞密度が十分な濃度に達するまで培養する。
続いて、例えば超音波処理して細胞を破砕し、その破砕
液を公知の方法によって処理してクルクリンＢを精製す
ることができる。こうして得られたクルクリンＢは、味
覚修飾剤、食品、医薬品等に用いることができる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に具体的に
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

【００２７】実施例１：ＲＮＡの抽出 クルクリゴ・ラチフォリアの果実（開花直後から完熟ま
で、即ち０週から約８週までの各段階の各種果実を混合
したものであって、果実全体をそのまま使用したので、
果実の皮、種および果肉などの果実の全ての成分が含ま
れる）約６ｇをドライアイスによって凍結し、解凍しな
いようにして粉砕し、粉末５ｇを得た。

【００２８】得られた粉末５ｇに、フェノール１５ｍ
ｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５、５ｍＭ−
ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）１５ｍｌおよび１Ｍジチオスレ
イトール６００μｌを加え、直ちに激しく振盪した。遠
心分離により水層をとり、フェノール抽出をさらに３回
行った。得られた水層には、多糖類等のＲＮＡ以外の物
質が含有されているので、１．０５容量倍の５Ｍ塩化リ
チウムを加え、４℃で２時間放置した後、遠心分離して
ＲＮＡを沈殿状態で得た。次いで、沈殿物をエタノール
で処理し、ＲＮＡ７６８μｇを得た。

【００２９】実施例２：ｍＲＮＡの抽出 実施例１で得られたＲＮＡ７６８μｇを熱変性（６５
℃、１０分間）した後、この熱変性ＲＮＡを含有する
０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を調製し、この溶液をオリ
ゴ（ｄＴ）カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロ
ジー社製のｍＲＮＡ精製用スパンカラム）に通した。
０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液により非吸着画分を除去し
た後、塩化ナトリウムを含まない溶出液により溶出し
て、高濃度で存在するｍＲＮＡを８μｇ得た。

【００３０】実施例３：ｃＤＮＡの合成 市販のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ Ｋｉｔ：ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社製）を用いて、ｍＲＮＡからｓｓｃＤＮＡ、更にはｄ
ｓｃＤＮＡを合成し、クレノウ断片で平滑末端としてか
らＥｃｏＲＩアダプターを連結した。

【００３１】即ち、オリゴｄ（Ｔ）_12-18 プライマー、
モロニー・マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の逆転写
酵素、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを
含むバッファー（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ Ｍｉｘ）に、熱変性したｍＲＮＡ４μｇを含
有するＲＮアーゼ不含水２０μｌを加え、３７℃で１時
間反応させた。次に、ＲＮアーゼＨ、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを
含むバッファー（Ｓｅｃｏｎｄ−ＳｔｒａｎｄＲｅａｃ
ｔｉｏｎ Ｍｉｘ）に前記の反応液を加えて全量を１０
０μｌとし、１２℃で１時間、続いて２２℃で１時間反
応させた。反応終了後、クレノウ断片１μｌを加えて３
７℃で３０分間反応させた。フェノール／クロロホルム
１００μｌを加えてから１分間遠心し、上部の水層をス
パンカラムで精製した。カラム溶出液１００μｌにＥｃ
ｏＲＩアダプター（構造を図１に示す）溶液４μｌ、Ａ
ＴＰ溶液１μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ３μｌを加
え、穏やかに攪拌して短時間遠心した後、１２℃で一晩
反応させた。反応液を６５℃で１０分間加熱してＤＮＡ
リガーゼを変性させ、氷冷してからＡＴＰ溶液１０μｌ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌを加え、穏
やかに攪拌した後、３７℃で３０分間反応させた。反応
液にフェノール／クロロホルム１００μｌを加えてから
１分間遠心し、上部の水層をスパンカラムで精製し、Ｅ
ｃｏＲＩアダプター連結ｄｓｃＤＮＡを得た。

【００３２】実施例４：ベクターへのｃＤＮＡの挿入 Ｅｃｏ ＲＩで切断してからアルカリ・ホスファターゼで
処理して脱リン酸化したλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位
に、実施例３で得られたＥｃｏＲＩアダプター連結ｄｓ
ｃＤＮＡを連結した。始めにテストライゲーションを行
って、最良の混合比を求めた。即ち、実施例３で得たカ
ラム溶出液（ｄｓｃＤＮＡ５．０ｎｇ、１５．０ｎｇま
たは４０．０ｎｇ含有液となるようにカラム用緩衝液で
希釈）３０μｌにλｇｔ１０の２μｌを加え、３Ｍ酢酸
ナトリウム３μｌおよび冷エタノール６０μｌを加えて
混合した後、−７０℃で１５分間冷却した。１０分間遠
心して得た沈殿を乾燥し、乾燥ｃＤＮＡをカラム用緩衝
液９μｌに再懸濁し、ＡＴＰ溶液１μｌおよびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μｌを加えた。攪拌後、遠心処理してから
１２℃で１６時間反応させた。続いて、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓらの前述の文献に記載の方法により、イン・ヴィトロ
パッケージング（Giga pack gold）を行い、組換えファ
ージを大腸菌ｃ６００ｈｆｌに感染させたところ、４０
ｎｇのＥｃｏＲＩアダプター連結ｄｓｃＤＮＡに対して
０．３μｇのλｇｔ１０を混合した場合に最良の結果を
与えることが分かった。そこで、この量比で、ライゲー
ションおよびパッケージングをスケールアップして実施
し、約３０万個の独立したプラークからなるライブラリ
ーを作製した。

【００３３】実施例５：スクリーニング 特開平3-190899号公報に記載されたクルクリンＡのアミ
ノ酸配列に基づいて、以下の３種のプローブを作製し
た。以下の塩基配列で、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴ、Ｈは
Ａ、ＣおよびＴ、ＤはＡ、ＧおよびＴ、ＲはＡおよび
Ｇ、ＫはＧおよびＴ、そしてＹはＣおよびＴの、それぞ
れデオキシリボ核酸残基を示す。また、合成方法は、日
本生化学会編の前述の文献（遺伝子研究法Ｉ）に記載の
方法を使用した。

【００３４】（１）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−
Ｃｙｓ−Ａｓｎ（成熟クルクリンＡのアミノ末端より２
５位から３０位まで）に基づくセンスＤＮＡプローブ
（１７ｍｅｒ；４８種）： 5'−ＡＴＨ−ＣＡＲ−ＡＡＫ−ＡＡＫ−ＴＧＹ−ＡＡ−
3' （２）Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ（３４位から４２位まで）
に基づくアンチセンスＤＮＡプローブ（２６ｍｅｒ；１
５３６種）： 5'−ＧＣ−ＣＣＡ−ＤＡＴ−ＹＴＧ−ＮＣＫ−ＮＣＣ−
ＲＴＴ−ＹＴＧ−ＲＴＡ−3' （３）Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ（９４位から１００位まで）に基づくアンチ
センスＤＮＡプローブ（２０ｍｅｒ；７６８種）： 5'−ＡＣ−ＮＧＧ−ＮＣＣ−ＲＴＡ−ＤＡＴ−ＮＡＣ−
ＲＡＡ−3' これらの各プローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を使用して、〔γ−³²Ｐ〕ｄＡＴＰにより５’末端をラ
ベルし、以下の実施例６に使用した。

【００３５】実施例６：プラークハイブリダイゼーショ
ン 実施例４で得られたライブラリーのプラークをナイロン
メンブレンに移し、ＤＮＡを固定した。続いて、実施例
５で調製したプローブ（１）〜（３）で順にハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの温度
は、プローブ（１）が３３〜３４℃、プローブ（２）が
５５℃、プローブ（３）が４５〜４６℃とした。また、
洗いの条件は、プローブ（１）〜（３）のいずれも６×
ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）とし、温度はそれぞ
れのハイブリダイゼーション温度と同温度とした。こう
して、約３０万個のプラークからすべてのプローブとハ
イブリダイズするプラーク群１６個を得た。

【００３６】実施例７：シングルプラークの分離 実施例６で得た１６個のプラーク群の各々について２次
スクリーニングを実施した。即ち、各プラーク群を独立
のプラークに別け、実施例６と同様にプローブ（１）〜
（３）と次々にハイブリダイズさせた。プローブ（１）
〜（３）の全てにハイブリダイズするプラークが、１６
個のプラーク群の各々から１個づつ得られた。こうして
得られたプラークをファージλＱ１〜λＱ１６と命名し
た。これらのファージλＱ１〜λＱ１６からファージＤ
ＮＡを取り出し、ＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動によっ
てインサート分子量を比較したところ、ファージλＱ９
に含まれるインサートが最長（約１．２ｋｂｐ）であっ
た。

【００３７】実施例８：サブクローニング ｐＵＣ１８を用いて、ファージλＱ９に含まれるインサ
ートをサブクローニングした。即ち、ファージλＱ９か
ら、例えば、日本生化学会編：続生化学実験講座Ｉ，遺
伝子研究法２，１００，（１９８６）に記載の方法によ
りファージλＱ９のＤＮＡ３０μｇを精製し、１００ユ
ニットのＥｃｏＲＩを用いて消化し、クルクリンをコー
ドするＥｃｏＲＩ断片４００ｎｇを調製した。一方、Ｅ
ｃｏＲＩで切断してからアルカリ・ホスファターゼで処
理して脱リン酸化したｐＵＣ１８（５０ｎｇ）を調製
し、前記ＥｃｏＲＩ断片１００ｎｇ、Ｔ４リガーゼ１．
０μｌ含有ライゲーション緩衝液（０．０１ｍＭＡＴ
Ｐ、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレ
イトールを含む６６ｍＭトリス塩酸緩衝液，ｐＨ７．
６）２０μｌを加え１２℃で１６時間インキュベートし
てライゲーションした。

【００３８】続いて、Ｈａｎａｈａｎらの前述の文献に
記載の方法によって形質転換を行った。即ち、形質転換
用に調製された大腸菌ＭＭ２９４のコンピテント細胞２
１０μｌに、前記のｃＤＮＡ−プラスミドＤＮＡ１００
ｎｇ含有緩衝液５μｌを加え、０℃で３０分間および４
２℃で８０秒間静置した後、氷冷し、ＳＯＣ培地８００
μｌを加え、３７℃で１時間振盪した。続いて、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを含有するχブロス寒天培地で３
７℃にて培養し、プレート１枚当たり約１００個の形質
転換体を得た。

【００３９】実施例９：コロニーハイブリダイゼーショ
ン 実施例８で得たプレートのレプリカを常法によって変性
および焼付処理してＤＮＡを固定した。前記実施例５で
調製したプローブ（２）を用い、５５℃でハイブリダイ
ズさせ、同じ温度にて６×ＳＳＣで洗った。陽性クロー
ン７５個が得られた。

【００４０】実施例１０：プラスミドＤＮＡ 実施例９で陽性とされた形質転換体１個を、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌ含有のχ培地３０ｍｌに植え継ぎ、３
７℃で一晩振盪培養した後、４℃で遠心（２０００×ｇ
にて７分間）し、菌体約２００μｇを得た。この菌体約
２００μｇを、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）含有２５
ｍＭトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭグルコースおよび１０
ｍＭＥＤＴＡ含有、ｐＨ８．０）８００μｌに溶解した
後、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前述の文献に記載の方法によ
り、プラスミド（以下、プラスミドｐＱ９と称する）Ｄ
ＮＡ約２０μｇを得た。このプラスミドｐＱ９の構造を
図３に示す（図３の挿入部において、矢印はクルクリン
ＢをコードするＤＮＡの挿入方向を示す）。

【００４１】実施例１１：制限酵素地図の作製および塩
基配列の決定 プラスミドｐＱ９を種々の制限酵素で切断し、図２に示
すような制限酵素地図を作製した。更に、各種のＤＮＡ
断片をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒらの前述の文献参
照）によって、そのヌクレオチド配列を決定した。結果
を配列表の配列番号３の配列に示す。配列番号３の配列
には、塩基配列から演繹されるアミノ酸配列も示す。な
お、図２において斜線部分はコード部分を、矢印は塩基
配列を決定した方向を示す。また、配列番号３の配列に
おいて、５’側および３’側非翻訳領域の塩基配列は１
例である。即ち、ファージλＱ１〜ファージλＱ１６の
中で、ファージλＱ９以外のファージを用いて前記と同
様に処理して塩基配列を決定すると、配列番号３の配列
に示す５’側および３’側非翻訳領域の塩基配列とは部
分的に異なる塩基配列を有するものが見出された。

【００４２】実施例１２：発現 Ｈａｎａｈａｎらの前述の文献に記載の方法によって発
現用ベクターを作成した。即ち、プラスミドｐＱ９（１
０μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ断片（１．０
μｌ：５．０ユニット）で平滑化して、クルクリンＢを
コードするＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）を得、そのＤ
ＮＡ断片１００ｎｇをＨｉｎｃIIで消化したｐＵＣ１８
（５０ｎｇ）に挿入して組換えプラスミドを作成した
（図４参照）。一方、大腸菌ＹＡ２１株をカルシウム法
によりコンピテント細胞にし、前記の組換えプラスミド
で形質転換した。形質転換体を、アンピシリン５０μｇ
／ｍｌを含有するχブロス培地０．２ｍｌに植菌し、３
７℃で１８時間培養した。次いで、菌懸濁液を遠心分離
（３０００×ｇにて１０分間）し、得られた沈殿約５μ
ｇをＭ９培地１．０ｍｌに懸濁して、予備培養した。そ
の後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの濃度で添加し、２時間培養し
た。

【００４３】実施例１３：抗血清の調製 後記参考例４で調製し、参考例５で確認したクルクリン
Ａ１ｍｇ／４ｍｌを含む０．１ＭＰＢＳリン酸生理的緩
衝液（ｐＨ７．６）を抗原原液（１回分）とし、抗原原
液４ｍｌをそれぞれ等量のフロイント完全アジュバンド
（ＦＣＡ）、およびフロイント不完全アジュバンド（Ｆ
ＩＡ）と混合して得られた油中水型エマルジョンを、Ｆ
ＣＡ抗原溶液およびＦＩＡ抗原溶液とした。前記ＦＣＡ
抗原溶液２ｍｌをウサギ（体重約１．５ｋｇの雌２匹）
の左右両モモに筋肉注射して免疫した（初回免疫）。初
回免疫から１週間経過後、ＦＩＡ抗原溶液を用いたこと
以外は初回免疫と同様にして免疫を行った（追加免
疫）。追加免疫から１週間経過後、ウサギの血液３０ｍ
ｌ／羽を採取し、得られた血液を室温で約２時間放置し
た後、３５００回転で５分間遠心分離し、その上清を更
に１００００回転で２０分間遠心分離し、その上清から
抗クルクリンＡ抗体を含む抗血清を調製した。不溶性プ
ロテインＡを活性吸着体として用いたカラムクロマトグ
ラフィー（カラム１．０×４．０ｃｍ、自然落下）によ
り抗血清を処理し、精製抗血清を調製した。

【００４４】実施例１４：ウエスタン分析 実施例１２で得られた細胞を、１ｍＭ−ＰＭＳＦ（フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド）を含有する１０ｍＭ
トリス−１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）１００
μｌに懸濁させ、超音波処理して菌体を破壊し、得られ
た破砕液３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離した。結果を図５のレーン３に示す。図５の
レーン４は対照用のレーンであり、実施例１２の組換え
を行っていないプラスミドで形質転換した大腸菌ＹＡ２
１株を前記と同様に破壊し、得られた破砕液をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離したものであ
る。レーン３の左側に矢印で示すように、約１７ｋダル
トンの位置にタンパク成分が見出される。なお、マーカ
ー（図示せず）としては、Ｐｒｅ−ＳｔａｉｎｅｄＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ〔ホスホリラーゼＢ
（１１０ｋダルトン）、ウシ血清アルブミン（８４ｋダ
ルトン）、オボアルブミン（４７ｋダルトン）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（３３ｋダルトン）、ダイズトリ
プシンインヒビター（２４ｋダルトン）およびリゾチー
ム（１６ｋダルトン）含有：バイオラッドラボラトリー
ズ社製〕を用いた。

【００４５】続いて、分離成分をニトロセルロースのメ
ンブランフィルターに転写し、メンブランフィルター
を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液〔ｐＨ７．４；
０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）
ツイン２０を含む：以下、ＴＰＢＳと称する〕で室温で
５分間洗浄し、更にブロッキング溶液として２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４；３％アルブミンお
よび０．５Ｍ塩化ナトリウム含有）を添加し、３７℃で
６０分間静置して、非結合部位をブロックした。実施例
１３で得られた精製抗血清を１５００倍に希釈し、１５
００倍希釈精製抗血清１０ｍｌを前記メンブランフィル
ターに添加し、４℃で一昼夜静置し、ＴＰＢＳで３回洗
浄した。続いて、２次抗体を添加し、室温で２時間静置
した。２次抗体としては、アルカリホスファターゼコン
ジュゲート抗ウサギＩｇＧ（シグマ社製）の１０００倍
希釈液５ｍｌを使用した。

【００４６】次に、アルカリホスファターゼ緩衝液約１
０ｍｌを添加し、室温で１０分間静置した後、ＮＢＴ
（ニトロブルーテトラゾリウム）溶液６６μｌ、ＢＣＩ
Ｐ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート）溶液３３μｌとアルカリホスファターゼ緩衝液
９．９ｍｌからなる基質溶液を添加し、室温で５分間発
色させ、続いて３％トリクロロ酢酸溶液を添加して反応
を停止させ、蒸留水で洗浄した。なお、ＮＢＴ溶液は、
ＮＢＴ５０ｍｇを７０％ジメチルホルムアミド１ｍｌに
溶解して調製し、ＢＣＩＰ溶液は、ＢＣＩＰ５０ｍｇを
１００％ホルムアミド１ｍｌに溶解して調製した。

【００４７】結果を図５のレーン１およびレーン２に示
す。レーン１はレーン３を転写したものであり、レーン
２はレーン４（対照用）を転写したものである。レーン
２には抗クルクリンＡ抗体と反応する成分が存在しない
のに対し、レーン１には、その左側に矢印で示すよう
に、レーン３の約１７ｋダルトンの位置に現れたタンパ
ク成分に相当する位置に抗クルクリンＡ抗体と反応する
成分が存在する。

【００４８】参考例１：水洗および塩化ナトリウム水溶
液による抽出 クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇを取り、水４０
ｍｌを加えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００
ｒｐｍ、６０分間）した。この上清は褐色を示し、味覚
修飾活性はなかった。さらに得られた沈渣に、水４０ｍ
ｌを加えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００ｒ
ｐｍ、２０分間）した。この上清は、無色で、味覚修飾
活性はなかった。

【００４９】次に、得られた沈渣に０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液を加えてホモジナイズし、遠心分離（３０，
０００ｒｐｍ、６０分間）した。得られた上清は、無色
で味覚修飾活性を示した。さらに、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液４０ｍｌによる抽出操作を３回繰り返し、こ
れら３回分の上清を合わせ、クルクリンを含む粗抽出液
を得た。

【００５０】参考例２：硫酸アンモニウムによる塩析 参考例１で得られた粗抽出液に、８０％飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを添加して活性物質を析出させた。
これを遠心分離（３２，０００ｒｐｍ、６０分間）して
得た沈殿を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０
０ｍｌに溶解した。

【００５１】参考例３：ＣＭ−セファロースイオン交換
クロマトグラフィー 参考例２で得られた溶液を、ＣＭ−セファロースＣＬ−
６Ｂ−カラム（直径２．２×１８ｃｍ、ベッド体積６８
ｍｌ、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）に
流し吸着させた。続いて、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）で素通り画分を除去した後、塩化ナトリウム
溶液０〜１．０Ｍの直線濃度勾配溶出法でクルクリンを
溶出した（流速５ｍｌ／１時間、１分画５ｍｌ、全溶出
液量５００ｍｌ）。溶出したタンパク質は２８０ｎｍの
吸収によりモニターした。その結果を図６に示した。図
６に示すピーク（Ｂ）が味覚修飾物質クルクリンを含む
画分である。

【００５２】参考例４：分子ふるいクロマトグラフィー 参考例３で得られた、図６のピーク（Ｂ）の斜線部分に
示された画分に、８０％飽和になるように硫酸アンモニ
ウムを添加して活性物質を析出させた。これを遠心分離
（３２，０００ｒｐｍ、６０分間）して得た沈殿を０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．５ｍｌに溶解し
た。この濃縮液をセファデックス（ファルマシアＬＫＢ
バイオテクノロジー社製）Ｇ−１００カラム（直径１．
６ｃｍ×５８ｃｍ、ベッド体積１６０ｍｌ）を用い、
０．５Ｍ−ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）により分離した（流速８．４ｍｌ／１時間、
１分画２．８ｍｌ、全溶出液量１８２ｍｌ）。タンパク
質は２８０ｎｍの吸収によりモニターした。図７に示す
ピーク（Ａ）が味覚修飾物質クルクリンを含む画分であ
る。

【００５３】参考例５：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動 参考例４で得られた、図７のピーク（Ａ）の斜線部分に
示された画分の物質の純度および分子量を、８Ｍ尿素を
含む、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
確認した。その結果、分子量１２，０００ダルトンのと
ころに単一バンドを示したことから、図７のピーク
（Ａ）の斜線部分に示された画分の味覚修飾物質クルク
リンは、純品（クルクリンＡ）であることが確認でき
た。

【００５４】クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇか
ら得られた、各クルクリン画分のタンパク質含量、活性
収率および精製度は下記表１に示す通りである。なお、
タンパク質含量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）らの方法に
より確定した。

【００５５】また、活性は、試料を３分間口に含んだ後
水で口をすすぎ、０．０２Ｍクエン酸溶液を味わった時
の甘さを各種濃度のショ糖溶液と比較し、同等の甘さの
ショ糖濃度を求めることにより測定した。その結果を図
８に示す。図８から判るように、高純度のクルクリンＡ
の活性は、０．３Ｍショ糖の甘さに相当した。

【００５６】参考例６：等電点電気泳動 ファーストシステム〔ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（商
標）：ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製〕に
より、ファーストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ５−
８）を用いて、高純度クルクリンＡの等電点電気泳動を
行ったところ、等電点は７．１であった。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【配列表】

【００５９】配列番号：１ 配列の長さ：１１４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifo
lia ） 配列 Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu 1 5 10 15 Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val 20 25 30 Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg 35 40 45 Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile 50 55 60 Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp 65 70 75 80 Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile 85 90 95 Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val 100 105 110 Asn Gly

【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifo
lia ） 配列 Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala Ala Val -20 -15 -10 Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu -5 1 5 10 His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln 15 20 25 Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala 30 35 40 Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser 45 50 55 Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly 60 65 70 Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys 75 80 85 90 Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro 95 100 105 Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser 110 115 120 Thr Glu Pro Gln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn 125 130 135

【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：１１６６ 配列の型：核酸 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：クルクリゴ・ラチフォリア 配列 CGCAAAGACA ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC ACC TTT 49 Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe -20 -15 -10 GCG GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC CTG CTC TCC GGG 97 Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly -5 1 5 CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC TCT CTC CAG GCG GGC GCC TAT ACC TTA 145 Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu 10 15 20 ACC ATA CAA AAC AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC CAG AAC GGG AGG CAG 193 Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln 25 30 35 ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCC GGC TGC CGC CTC ACA 241 Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr 40 45 50 55 TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TAC GAC CAC AAC AAC AAC GAC 289 Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp 60 65 70 GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GAC AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT 337 Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val 75 80 85 CTT CAG AAG GAT GGC AGA TTT GTC ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC 385 Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser 90 95 100 CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGC CGT GTT AAT GGT GGA ATC ACA GTT GCT 433 Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala 105 110 115 AAG GAT TCT ACT GAA CCA CAA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT 481 Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn 120 125 130 135 AAT Asn 136 TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA TGGAAGACCA ATCTCATGTC 544 GGTGTGGCCT ATCTCCACCT GTTTGCAGTG CCTTTGTTAA AATAACACAT TGGGGAATAA 604 TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCA AATTTTCTGT TCAGTTTTCC TCTCACATGT 664 CAATGTCGAT TTTTTGCCGC GGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT 724 GGCTCAAATG GAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGCAT CTCCGGGTCT TCCAACTTAC 784 GAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTA CATCAAAGGA 844 GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCT GCCATGGTTG ATAGTACAAG 904 TAGAACGACG CATGTATTGC TTCCAGGAAT CACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC 964 CTTTTCACCA CCGAAAGCAC CACCAATTTC AGCACCATTG GTAGGTATAT TTACATTAAC 1024 AATACCACAG TCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACTTCAG GTCTACGAGT 1084 GAAAATAGAA CTGCTTAAAC TTGCGGTACA GAGTTATTTA TTTCAATTGC TTCTTTCAGA 1144 GTCTGGAATT TCATTACGTA AA 1166

【図面の簡単な説明】

【図１】ＥｃｏＲＩアダプターの構造を示す説明図であ
る。

【図２】クルクリンＢをコードするクローン化ＤＮＡの
制限酵素地図である。

【図３】プラスミドｐＱ９の構造を示す説明図である。

【図４】発現プラスミドの作成過程および構造を示す説
明図である。

【図５】電気泳動およびそのウエスタン分析の結果を示
す図面に代わる写真である。

【図６】クルクリゴ・ラチフォリアの果実から水洗、抽
出、塩析操作によって得た味覚修飾物質のＣＭ−セファ
ロースイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを
示すグラフである。

【図７】図６のピーク（Ｂ）の斜線部分に示された画分
の、セファデックスＧ−１００分子ふるいクロマトグラ
フィーの溶出パターンを示すグラフである。

【図８】高純度クルクリンＡからなる味覚修飾物質の活
性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 荒井 綜一 神奈川県横浜市神奈川区七島町38 (72)発明者 阿部 啓子 埼玉県蕨市南町１−16−15 (72)発明者 山下 治之 東京都荒川区東尾久７−２−35 旭電化工 業株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１の配列で表されるア
   ミノ酸配列を含有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２の配列で表されるア
   ミノ酸配列を含有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１の配列で表されるア
   ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列
   を含むことを特徴とするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２の配列で表されるア
   ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列
   を含むことを特徴とするＤＮＡ。