JPH06189773A - トレポネーマ・ヒオジセンテリエ ワクチン - Google Patents
トレポネーマ・ヒオジセンテリエ ワクチンInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、ブタにおけるトレポネーマ・ヒオ
ジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）感染を防止
するためのワクチン、そのようなワクチンの調製のため
の組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関す
る。 【構成】 本発明のワクチンは、トレポネーマ・ヒオジ
センテリエの内鞭毛鞘タンパク質に典型的なタンパク質
もしくはポリペプチドを含有するか、または前記タンパ
ク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを一部として有する組換えポリヌクレオチドを含有す
る。
ジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）感染を防止
するためのワクチン、そのようなワクチンの調製のため
の組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関す
る。 【構成】 本発明のワクチンは、トレポネーマ・ヒオジ
センテリエの内鞭毛鞘タンパク質に典型的なタンパク質
もしくはポリペプチドを含有するか、または前記タンパ
ク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを一部として有する組換えポリヌクレオチドを含有す
る。
Description
【０００１】本発明は、トレポネーマ・ヒオジセンテリ
エ（Treponema hyodysenteriae）感染を防止するための
ワクチン、並びにそのようなワクチンの調製のための組
換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
エ（Treponema hyodysenteriae）感染を防止するための
ワクチン、並びにそのようなワクチンの調製のための組
換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】ブタ赤痢の病因物質であるトレポネーマ・
ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）は、ブ
タの大腸中に見つかる嫌気性でβ−溶血性のスピロヘー
タである。トレポネーマ・ヒオジセンテリエはらせん状
運動によりブタの結腸を侵すことが報告されている。感
染するとこの病原体は、該病気の病因に重要な役割を果
たすと考えられる溶血素を分泌する。この病気は粘性出
血性下痢によって特徴づけられる。これは、管腔の上皮
内層とリーベルキューン陰窩の広範な表面壊死に関係す
ると思われる。
ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）は、ブ
タの大腸中に見つかる嫌気性でβ−溶血性のスピロヘー
タである。トレポネーマ・ヒオジセンテリエはらせん状
運動によりブタの結腸を侵すことが報告されている。感
染するとこの病原体は、該病気の病因に重要な役割を果
たすと考えられる溶血素を分泌する。この病気は粘性出
血性下痢によって特徴づけられる。これは、管腔の上皮
内層とリーベルキューン陰窩の広範な表面壊死に関係す
ると思われる。
【０００３】トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Trepon
ema hyodysenteriae）は、溶血素に次いで、毒性因子と
して作用すると考えられる内鞭毛を生産する。内鞭毛は
幾つかの内鞭毛タンパク質から構成される。トレポネー
マ・ヒオジセンテリエの特徴的らせん状運動は、この生
物を上手くブタの結腸に定住させるのに働き、そして細
菌の外膜の下にある７〜９本の内鞭毛の束により可能に
なる。この内鞭毛の機能を阻害することは、トレポネー
マ・ヒオジセンテリエの好結果の定住を防止し、よって
ブタ赤痢に対してブタを保護すると考えられる。
ema hyodysenteriae）は、溶血素に次いで、毒性因子と
して作用すると考えられる内鞭毛を生産する。内鞭毛は
幾つかの内鞭毛タンパク質から構成される。トレポネー
マ・ヒオジセンテリエの特徴的らせん状運動は、この生
物を上手くブタの結腸に定住させるのに働き、そして細
菌の外膜の下にある７〜９本の内鞭毛の束により可能に
なる。この内鞭毛の機能を阻害することは、トレポネー
マ・ヒオジセンテリエの好結果の定住を防止し、よって
ブタ赤痢に対してブタを保護すると考えられる。
【０００４】内鞭毛は少なくとも４つのタンパク質から
成ることが発見された。43 kD タンパク質が鞭毛の中心
鞘を形成し、３つのタンパク質（37, 34および32 kD ）
がそのコアを構成する。それらの鞭毛タンパク質の各々
に対して惹起された抗体は、試験管内でトレポネーマ・
ヒオジセンテリエに対して殺菌性であることが示され
た。43 kD 鞘タンパク質をコードする遺伝子をクローニ
ングし、そしてそのヌクレオチド配列および推定アミノ
酸配列を確立した。それらは配列表の配列番号１に示さ
れる。
成ることが発見された。43 kD タンパク質が鞭毛の中心
鞘を形成し、３つのタンパク質（37, 34および32 kD ）
がそのコアを構成する。それらの鞭毛タンパク質の各々
に対して惹起された抗体は、試験管内でトレポネーマ・
ヒオジセンテリエに対して殺菌性であることが示され
た。43 kD 鞘タンパク質をコードする遺伝子をクローニ
ングし、そしてそのヌクレオチド配列および推定アミノ
酸配列を確立した。それらは配列表の配列番号１に示さ
れる。
【０００５】従って、本発明は、トレポネーマ・ヒオジ
センテリエ（Treponema hyodysenteriae）内鞭毛鞘タン
パク質または配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一
部分を有する内鞭毛鞘タンパク質断片（内鞭毛鞘ポリペ
プチド）の実質的に純粋な調製物に関する。
センテリエ（Treponema hyodysenteriae）内鞭毛鞘タン
パク質または配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一
部分を有する内鞭毛鞘タンパク質断片（内鞭毛鞘ポリペ
プチド）の実質的に純粋な調製物に関する。
【０００６】より詳しくは、本発明は、着目の内鞭毛鞘
タンパク質およびポリペプチドが、ブタに投与するとト
レポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysente
riae）に対する免疫応答を惹起せしめることができると
いう発見に基づく。
タンパク質およびポリペプチドが、ブタに投与するとト
レポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysente
riae）に対する免疫応答を惹起せしめることができると
いう発見に基づく。
【０００７】更に、本発明は内鞭毛鞘タンパク質および
ポリペプチドだけでなく、更に配列番号１のＤＮＡおよ
びその断片、並びに前記ＤＮＡおよびその断片にハイブ
リダイズし且つトレポネーマ・ヒオジセンテリエの内鞭
毛鞘タンパク質の免疫原性を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドにも関する。
ポリペプチドだけでなく、更に配列番号１のＤＮＡおよ
びその断片、並びに前記ＤＮＡおよびその断片にハイブ
リダイズし且つトレポネーマ・ヒオジセンテリエの内鞭
毛鞘タンパク質の免疫原性を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドにも関する。
【０００８】本発明は、配列番号１のＤＮＡもしくはそ
の断片または上述のハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドの少なくとも一部分のコドンが、同じアミノ酸に対す
る別のコドンにより置き換えられている、トレポネーマ
・ヒオジセンテリエの内鞭毛鞘タンパク質の免疫原性を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも
関する。
の断片または上述のハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドの少なくとも一部分のコドンが、同じアミノ酸に対す
る別のコドンにより置き換えられている、トレポネーマ
・ヒオジセンテリエの内鞭毛鞘タンパク質の免疫原性を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも
関する。
【０００９】小さい抗原はしばしば免疫原として有効で
ない。従って内鞭毛鞘タンパク質またはポリペプチドは
ホモポリマー（多数の同一の内鞭毛鞘ポリペプチドがカ
ップリングしたもの）またはヘテロポリマー（１もしく
は複数の内鞭毛鞘ポリペプチドが、１もしくは複数の異
なる内鞭毛鞘ポリペプチドに、またはトレポネーマ・ヒ
オジセンテリエにもしくは他の病原体に特徴的な１もし
くは複数の他の異なるポリペプチドにカップリングした
もの）として調製することができ、あるいは免疫原性を
増強するために１または複数の別の化合物にカップリン
グさせることができる。
ない。従って内鞭毛鞘タンパク質またはポリペプチドは
ホモポリマー（多数の同一の内鞭毛鞘ポリペプチドがカ
ップリングしたもの）またはヘテロポリマー（１もしく
は複数の内鞭毛鞘ポリペプチドが、１もしくは複数の異
なる内鞭毛鞘ポリペプチドに、またはトレポネーマ・ヒ
オジセンテリエにもしくは他の病原体に特徴的な１もし
くは複数の他の異なるポリペプチドにカップリングした
もの）として調製することができ、あるいは免疫原性を
増強するために１または複数の別の化合物にカップリン
グさせることができる。
【００１０】本発明によれば、上述した変形のいずれか
である内鞭毛鞘ポリペプチドは、当業界で既知の組換え
ＤＮＡ技術により調製することができ、または合成によ
り、例えば当業界で既知の均一もしくは固相ポリペプチ
ド合成により、調製することができる。
である内鞭毛鞘ポリペプチドは、当業界で既知の組換え
ＤＮＡ技術により調製することができ、または合成によ
り、例えば当業界で既知の均一もしくは固相ポリペプチ
ド合成により、調製することができる。
【００１１】適当な内鞭毛鞘ポリペプチドの特定のアミ
ノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からおよび／ま
たは内鞭毛鞘タンパク質の立体配置から誘導することが
できる。適当な内鞭毛鞘ポリペプチドは、例えばHoppお
よびWoods 〔T.P. Hopp およびK.R. Woods (1981) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828 〕により記
載された技術を適用することにより、内鞭毛鞘タンパク
質の最も親水性の部分から選択することができる。その
ようなポリペプチドを選択する別の適当な方法は、Chou
およびFasman〔P.Y. Chou およびG.D. Fasman (1987) A
dvances in Enzymology 47, 45-148〕により記載されて
いる。
ノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からおよび／ま
たは内鞭毛鞘タンパク質の立体配置から誘導することが
できる。適当な内鞭毛鞘ポリペプチドは、例えばHoppお
よびWoods 〔T.P. Hopp およびK.R. Woods (1981) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828 〕により記
載された技術を適用することにより、内鞭毛鞘タンパク
質の最も親水性の部分から選択することができる。その
ようなポリペプチドを選択する別の適当な方法は、Chou
およびFasman〔P.Y. Chou およびG.D. Fasman (1987) A
dvances in Enzymology 47, 45-148〕により記載されて
いる。
【００１２】タンパク質上の免疫原上重要なエピトープ
の位置を予想するために多数の方法が開発されている。
組み合わせた予想の結果は、抗原部位の良好な予想を提
供する。図１〜４は、トレポネーマ・ヒオジセンテリエ
の鞘タンパク質における抗原上重要な領域を最終的に予
想するのに使用した様々な演算法を示す。
の位置を予想するために多数の方法が開発されている。
組み合わせた予想の結果は、抗原部位の良好な予想を提
供する。図１〜４は、トレポネーマ・ヒオジセンテリエ
の鞘タンパク質における抗原上重要な領域を最終的に予
想するのに使用した様々な演算法を示す。
【００１３】関連エピトープの位置に関する追加の情報
は、GeysenおよびMeloen〔H.M. Geysen, R.H. Meloenお
よびS.J. Barteling (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA81(13), 3998-4002 〕により開発されたPEPSCAN 法を
使って得ることができる。この方法は、エンザイムリン
クドイムノソルベントアッセイにおいて反応させるのに
十分な長さを有する合成ポリペプチドを使用する。それ
らのポリペプチドは与えられたＤＮＡ配列に従って合成
される。それらは、第一ペプチドがアミノ酸番号１〜９
を含み、第二ペプチドがアミノ酸番号２〜10を含むとい
った事実により特徴づけられる。
は、GeysenおよびMeloen〔H.M. Geysen, R.H. Meloenお
よびS.J. Barteling (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA81(13), 3998-4002 〕により開発されたPEPSCAN 法を
使って得ることができる。この方法は、エンザイムリン
クドイムノソルベントアッセイにおいて反応させるのに
十分な長さを有する合成ポリペプチドを使用する。それ
らのポリペプチドは与えられたＤＮＡ配列に従って合成
される。それらは、第一ペプチドがアミノ酸番号１〜９
を含み、第二ペプチドがアミノ酸番号２〜10を含むとい
った事実により特徴づけられる。
【００１４】各ペプチドは抗血清またはモノクローナル
抗体との反応性について試験される。反応性ペプチドは
免疫原性エピトープを表さなければならない。
抗体との反応性について試験される。反応性ペプチドは
免疫原性エピトープを表さなければならない。
【００１５】免疫反応性エピトープを同定するために
（そしてそれらの反応性を鞘タンパク質の物理的地図と
関係づけるために）、鞘タンパク質遺伝子からのＤＮＡ
断片をpEX プラスミド（K. StanleyおよびJ.P. Luzio,
1984, EMBO J. 3, 1429-1434 ;並びにJ.G. Kusters, E.
J. JagerおよびB.A.M. Van der Zeijst, 1989, Nucl. A
cids Res. 17, 8007）中で発現させる。この系では、異
種発現が cro−β−ガラクトシダーゼハイブリッドタン
パク質のＣ末端伸長物の合成をもたらす。鞘タンパク質
ＤＮＡ配列中の制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
pEX プラスミド中への挿入のための鞘タンパク質遺伝子
断片を得ることができる。次いで、鞘タンパク質の種々
の重複領域に由来する融合タンパク質を合成するpEX ク
ローンを更なる特徴づけに用いる。pEX によりコードさ
れる鞘タンパク質断片を精製し、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分画し、そしてニトロセルロース膜に
ブロッティングする。次いでその膜を免疫ブタからの血
清と反応せしめる。免疫反応性エピトープを含む断片の
みがこれらの血清と反応する。エピトープの最小の長さ
を境界決定するために、反応性クローンのＤＮＡ挿入断
片をエキソヌクレアーゼIII 消化により、または鞘タン
パク質の小さい重複部分をコードする合成オリゴヌクレ
オチドをクローニングすることにより（J.G. Kusters,
E.J. Jager, G.Koch, J.A. Lenstra, G. Koch, W.P.A.
Posthumus, R.H. Meloen およびB.A.M.Van der Zeijst,
1989, J. Immunol., 143, 2692-2698）、漸進的に短縮
する。次いでエピトープをそれらの保護効果について試
験する。
（そしてそれらの反応性を鞘タンパク質の物理的地図と
関係づけるために）、鞘タンパク質遺伝子からのＤＮＡ
断片をpEX プラスミド（K. StanleyおよびJ.P. Luzio,
1984, EMBO J. 3, 1429-1434 ;並びにJ.G. Kusters, E.
J. JagerおよびB.A.M. Van der Zeijst, 1989, Nucl. A
cids Res. 17, 8007）中で発現させる。この系では、異
種発現が cro−β−ガラクトシダーゼハイブリッドタン
パク質のＣ末端伸長物の合成をもたらす。鞘タンパク質
ＤＮＡ配列中の制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
pEX プラスミド中への挿入のための鞘タンパク質遺伝子
断片を得ることができる。次いで、鞘タンパク質の種々
の重複領域に由来する融合タンパク質を合成するpEX ク
ローンを更なる特徴づけに用いる。pEX によりコードさ
れる鞘タンパク質断片を精製し、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分画し、そしてニトロセルロース膜に
ブロッティングする。次いでその膜を免疫ブタからの血
清と反応せしめる。免疫反応性エピトープを含む断片の
みがこれらの血清と反応する。エピトープの最小の長さ
を境界決定するために、反応性クローンのＤＮＡ挿入断
片をエキソヌクレアーゼIII 消化により、または鞘タン
パク質の小さい重複部分をコードする合成オリゴヌクレ
オチドをクローニングすることにより（J.G. Kusters,
E.J. Jager, G.Koch, J.A. Lenstra, G. Koch, W.P.A.
Posthumus, R.H. Meloen およびB.A.M.Van der Zeijst,
1989, J. Immunol., 143, 2692-2698）、漸進的に短縮
する。次いでエピトープをそれらの保護効果について試
験する。
【００１６】本発明の特定の実施態様によれば、内鞭毛
鞘タンパク質特異的ポリペプチドは、組換えポリヌクレ
オチドの一部分を構成する配列番号１のポリヌクレオチ
ドの少なくとも一部分を有するポリヌクレオチドの発現
により製造される。前記組換えポリヌクレオチドは、好
ましくはトレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema
hyodysenteriae）特異的ポリヌクレオチド断片が中に挿
入されているベクターに基づくことができる。適当なベ
クターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミ
ド、ウイルス、ミニクロモソームまたは安定な組み込み
型ベクターである。安定な組み込み型ベクターは特に植
物細胞または動物細胞に適する。一般にそれらのベクタ
ーは、宿主細胞の遺伝物質中にベクター自体を挿入して
宿主の遺伝物質と共に複製する安定な組み込み型ベクタ
ー以外は、自己複製特性を有することが必要である。適
当な宿主細胞は原核生物であっても真核生物であっても
よく、例えば細菌、酵母、マイコプラズマ、藻類、植物
細胞または動物細胞である。植物細胞または動物細胞
は、試験管内で培養することができるか、またはそれぞ
れ完全な植物または動物の一部を構成することができ
る。組換えポリヌクレオチドは挿入断片として、内鞭毛
鞘タンパク質をコードする完全なポリヌクレオチドまた
はその断片を含むことができる。挿入断片は、単一のコ
ード配列、または同じコード配列の多重コピー、または
少なくとも１つの内鞭毛鞘タンパク質コード配列と少な
くとも１つの第二配列（例えば、内鞭毛鞘タンパク質コ
ード配列の異なる部分、または別の病原体に特徴的なタ
ンパク質もしくは小さい内鞭毛鞘ポリペプチドのための
担体として機能する不活性タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド）とを含むハイブリッドポリヌクレオチド
を含んで成ることができる。
鞘タンパク質特異的ポリペプチドは、組換えポリヌクレ
オチドの一部分を構成する配列番号１のポリヌクレオチ
ドの少なくとも一部分を有するポリヌクレオチドの発現
により製造される。前記組換えポリヌクレオチドは、好
ましくはトレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema
hyodysenteriae）特異的ポリヌクレオチド断片が中に挿
入されているベクターに基づくことができる。適当なベ
クターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミ
ド、ウイルス、ミニクロモソームまたは安定な組み込み
型ベクターである。安定な組み込み型ベクターは特に植
物細胞または動物細胞に適する。一般にそれらのベクタ
ーは、宿主細胞の遺伝物質中にベクター自体を挿入して
宿主の遺伝物質と共に複製する安定な組み込み型ベクタ
ー以外は、自己複製特性を有することが必要である。適
当な宿主細胞は原核生物であっても真核生物であっても
よく、例えば細菌、酵母、マイコプラズマ、藻類、植物
細胞または動物細胞である。植物細胞または動物細胞
は、試験管内で培養することができるか、またはそれぞ
れ完全な植物または動物の一部を構成することができ
る。組換えポリヌクレオチドは挿入断片として、内鞭毛
鞘タンパク質をコードする完全なポリヌクレオチドまた
はその断片を含むことができる。挿入断片は、単一のコ
ード配列、または同じコード配列の多重コピー、または
少なくとも１つの内鞭毛鞘タンパク質コード配列と少な
くとも１つの第二配列（例えば、内鞭毛鞘タンパク質コ
ード配列の異なる部分、または別の病原体に特徴的なタ
ンパク質もしくは小さい内鞭毛鞘ポリペプチドのための
担体として機能する不活性タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド）とを含むハイブリッドポリヌクレオチド
を含んで成ることができる。
【００１７】上記態様の特定の場合は、いわゆるベクタ
ーワクチンとしてそのまま有用である、ウイルスベクタ
ーを含む組換えポリヌクレオチドに関する。この目的に
利用できるウイルスは、免疫処置しようとする動物、即
ちブタにおいて、複製する能力を持たなければならな
い。更に、それらのウイルスは、予防接種した動物中で
発現させようとする外来遺伝子（例えばトレポネーマ・
ヒオジセンテリエの内鞭毛鞘タンパク質またはポリペプ
チドをコードする遺伝子）の挿入に適するゲノム領域を
有するべきである。
ーワクチンとしてそのまま有用である、ウイルスベクタ
ーを含む組換えポリヌクレオチドに関する。この目的に
利用できるウイルスは、免疫処置しようとする動物、即
ちブタにおいて、複製する能力を持たなければならな
い。更に、それらのウイルスは、予防接種した動物中で
発現させようとする外来遺伝子（例えばトレポネーマ・
ヒオジセンテリエの内鞭毛鞘タンパク質またはポリペプ
チドをコードする遺伝子）の挿入に適するゲノム領域を
有するべきである。
【００１８】上記に指摘したように、本発明に係るタン
パク質およびポリペプチド並びに組換えポリヌクレオチ
ドは、ワクチンの調製に有用である。よって、それらの
ワクチンも本発明の一部を構成する。
パク質およびポリペプチド並びに組換えポリヌクレオチ
ドは、ワクチンの調製に有用である。よって、それらの
ワクチンも本発明の一部を構成する。
【００１９】本発明の特定の応用は細菌ベクターワクチ
ンに関する。ここでブタの中で集落形成することができ
る細菌は、トレポネーマ・ヒオジセンテリエに対する免
疫応答を引き起こすような形でそれらが内鞭毛鞘タンパ
ク質または内鞭毛鞘ポリペプチドを発現できるようにす
るために形質転換される。この目的に適当な細菌は、例
えばサルモネラ（Salmonella）菌である。
ンに関する。ここでブタの中で集落形成することができ
る細菌は、トレポネーマ・ヒオジセンテリエに対する免
疫応答を引き起こすような形でそれらが内鞭毛鞘タンパ
ク質または内鞭毛鞘ポリペプチドを発現できるようにす
るために形質転換される。この目的に適当な細菌は、例
えばサルモネラ（Salmonella）菌である。
【００２０】本発明のワクチンは、補助的ワクチン成
分、例えば担体、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、アジュバ
ントおよび保存剤を含むこともできる。有利には、それ
らのワクチンは、適用前に適当な液体（例えば水、緩衝
液）の添加によって再構成される凍結乾燥品である。
分、例えば担体、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、アジュバ
ントおよび保存剤を含むこともできる。有利には、それ
らのワクチンは、適用前に適当な液体（例えば水、緩衝
液）の添加によって再構成される凍結乾燥品である。
【００２１】該ワクチンは例えば経口、鼻内または筋肉
内的に投与することができる。該ワクチンは、ブタに対
する他の免疫原、例えばウイルス、例えば偽狂犬病ウイ
ルス、インフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイル
ス、パルボウイルス、ブタ脳脊髄炎ウイルス、ブタコレ
ラウイルスに特徴的な免疫原性物質、またはマイコプラ
ズマ、例えばマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Myco
plasma hyoneumoniae）およびマイコプラズマ・リオル
ヒニス（Mycoplasma lyorhinis）に特徴的な免疫原性物
質、または細菌、例えばエシェリキア・コリ（Escheric
hia coli）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetel
la bronchiseptica）、レプトスピラ（Leptospira）、
アクチノバシラス・プローロニューモニエ（Actinobaci
lluspleuroneumoniae）、パスツレラ・マルトサイダ（P
asteurella multocida）、ストレプトコッカス・スイ
ス（Streptococcus suis）に特徴的な免疫原性物質を更
に含むことができる。本発明を次の実施例により説明す
る。
内的に投与することができる。該ワクチンは、ブタに対
する他の免疫原、例えばウイルス、例えば偽狂犬病ウイ
ルス、インフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイル
ス、パルボウイルス、ブタ脳脊髄炎ウイルス、ブタコレ
ラウイルスに特徴的な免疫原性物質、またはマイコプラ
ズマ、例えばマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Myco
plasma hyoneumoniae）およびマイコプラズマ・リオル
ヒニス（Mycoplasma lyorhinis）に特徴的な免疫原性物
質、または細菌、例えばエシェリキア・コリ（Escheric
hia coli）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetel
la bronchiseptica）、レプトスピラ（Leptospira）、
アクチノバシラス・プローロニューモニエ（Actinobaci
lluspleuroneumoniae）、パスツレラ・マルトサイダ（P
asteurella multocida）、ストレプトコッカス・スイ
ス（Streptococcus suis）に特徴的な免疫原性物質を更
に含むことができる。本発明を次の実施例により説明す
る。
【００２２】実施例１：トレポネーマ・ヒオジセンテリ
エからのペリプラズム鞭毛の生化学的および構造的分析 1.1. 材料および方法 1.1.1. 菌株および増殖条件 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）は、嫌気的フード中で、10％のウシ胎児血清、
0.05％のTorula酵母からのＲＮＡコアタイプIIＣ(Sigm
a) および400 μg/mlのスペクチノマイシンが補足され
た250 mlのトリプティカーゼ大豆ブロス中、または10％
のヒツジ血液、400 μg/mlのスペクチノマイシンおよび
0.06％の酵母（Oxoid, Basingstoke, イギリス）が補足
されたトリプティカーゼ大豆寒天(Becton Dickinson, C
ockeysville, USA）プレート上のいずれかで40℃にて培
養した。ここに与えられるほとんどの実験は、ブタ赤痢
に重度感染したブタの結腸から最初に単離されたトレポ
ネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteria
e）C5株を使って行った。それは、血液寒天プレート上
で強い溶血を示し、そしてそのゲノムの制限酵素分析に
より評価すると、オランダにおけるトレポネーマ・ヒオ
ジセンテリエの最流行型の代表である。
エからのペリプラズム鞭毛の生化学的および構造的分析 1.1. 材料および方法 1.1.1. 菌株および増殖条件 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）は、嫌気的フード中で、10％のウシ胎児血清、
0.05％のTorula酵母からのＲＮＡコアタイプIIＣ(Sigm
a) および400 μg/mlのスペクチノマイシンが補足され
た250 mlのトリプティカーゼ大豆ブロス中、または10％
のヒツジ血液、400 μg/mlのスペクチノマイシンおよび
0.06％の酵母（Oxoid, Basingstoke, イギリス）が補足
されたトリプティカーゼ大豆寒天(Becton Dickinson, C
ockeysville, USA）プレート上のいずれかで40℃にて培
養した。ここに与えられるほとんどの実験は、ブタ赤痢
に重度感染したブタの結腸から最初に単離されたトレポ
ネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteria
e）C5株を使って行った。それは、血液寒天プレート上
で強い溶血を示し、そしてそのゲノムの制限酵素分析に
より評価すると、オランダにおけるトレポネーマ・ヒオ
ジセンテリエの最流行型の代表である。
【００２３】1.1.2. 鞭毛の単離および精製 ペリプラズマ鞭毛は、Kent (K.A. Kent, R. Sellwood,
R.M. Lemcke, M.R. Burrows およびR.J. Lysons, 1989,
"Analysis of the axial filaments of Treponema hy
odysenteriae by SDS-PAGE and immunoblotting", J. G
en. Microbiol.135:1625-1632) により記載された方法
の変形により調製した。細菌培養物を4℃における15,00
0 gでの30分間の遠心により収得し、リン酸塩緩衝化塩
溶液(PBS) で１回洗浄し、そしてペレットを同緩衝液中
に再懸濁した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) を0.1 ％
になるように添加し、そして懸濁液を穏やかに攪拌しな
がら室温で30分間インキュベートすることにより外殻を
除去した。4 ℃において25,000 gで30分間遠心すること
により生物を収集し、次いでPBS 中に再懸濁した。ブレ
ンダー中で破砕することにより細胞から鞭毛を取り、4
℃において30,000 gで30分間遠心することにより細菌か
ら分離した。上清にラウロイルサルコシン酸ナトリウム
(Sarkosyl)を添加し〔0.2 ％(w/v) 〕、4 ℃において9
4,000 gで60分間遠心することにより鞭毛を沈降させ、
そして水に再懸濁した。鞭毛タンパク質を−20℃で保存
した。
R.M. Lemcke, M.R. Burrows およびR.J. Lysons, 1989,
"Analysis of the axial filaments of Treponema hy
odysenteriae by SDS-PAGE and immunoblotting", J. G
en. Microbiol.135:1625-1632) により記載された方法
の変形により調製した。細菌培養物を4℃における15,00
0 gでの30分間の遠心により収得し、リン酸塩緩衝化塩
溶液(PBS) で１回洗浄し、そしてペレットを同緩衝液中
に再懸濁した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) を0.1 ％
になるように添加し、そして懸濁液を穏やかに攪拌しな
がら室温で30分間インキュベートすることにより外殻を
除去した。4 ℃において25,000 gで30分間遠心すること
により生物を収集し、次いでPBS 中に再懸濁した。ブレ
ンダー中で破砕することにより細胞から鞭毛を取り、4
℃において30,000 gで30分間遠心することにより細菌か
ら分離した。上清にラウロイルサルコシン酸ナトリウム
(Sarkosyl)を添加し〔0.2 ％(w/v) 〕、4 ℃において9
4,000 gで60分間遠心することにより鞭毛を沈降させ、
そして水に再懸濁した。鞭毛タンパク質を−20℃で保存
した。
【００２４】1.1.3. 電気泳動およびウエスタンブロッ
ティング 本質的にはLaemmli (U.K. Laemmli, 1970, "Cleavage o
f structural proteins during the assembly of the h
ead of bacteriophage T4", Nature (London)277:680-6
85)により確立された通りに、12.5％ SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）上でタンパク質を分
離した。タンパク質をクーマシーブルーR250染色により
視覚化し、低分子量マーカー(Pharmacia) との比較によ
って分子量を評価した。Towbinらの方法(H. Towbin, T.
StaehelinおよびJ. Gordon, 1979, Electrophoretic t
ransfer of proteins from polyacrylamide gels to ni
trocellulose sheets : procedure and some applicati
ons", Proc. Natl. Acad.Sci. USA 76:4350-4354) に
従って、Bio-Rad Transblot セル(Bio-Rad, Hertfordsh
ire,イギリス) を使ってニトロセルロース紙(Schleiche
r & Schuell, Dassel,ドイツ) にタンパク質を移行せし
めた。移行後、PBS 中の0.5 ％ゼラチンおよび0.5 ％Tw
een-20 (PBS + ) を使って揺り台上で１時間ニトロセル
ロースをブロックした。次いでニトロセルロースをPBS
+ 中の抗血清の適当な希釈液と共に１時間インキュベー
トした。次いでそれをPBS + で５分間３回洗浄し、更に
PBS +中のヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧのアルカリホ
スファターゼ接合体(Sigma) の1:300 希釈液、またはヤ
ギ抗マウス免疫グロブリンＧのアルカリホスファターゼ
接合体(Promega) の1:2000希釈液のいずれかと共に１時
間インキュベートした。PBS + で３回洗浄した後、結合
した抗体を100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl, 5mM
MgCl2 中に可溶化されたニトロブルーテトラゾリウム
（0.37mM）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスフェート（0.34mM）中での発色により視覚化した。
インキュベーションと洗浄は振盪器上で室温にて行っ
た。
ティング 本質的にはLaemmli (U.K. Laemmli, 1970, "Cleavage o
f structural proteins during the assembly of the h
ead of bacteriophage T4", Nature (London)277:680-6
85)により確立された通りに、12.5％ SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）上でタンパク質を分
離した。タンパク質をクーマシーブルーR250染色により
視覚化し、低分子量マーカー(Pharmacia) との比較によ
って分子量を評価した。Towbinらの方法(H. Towbin, T.
StaehelinおよびJ. Gordon, 1979, Electrophoretic t
ransfer of proteins from polyacrylamide gels to ni
trocellulose sheets : procedure and some applicati
ons", Proc. Natl. Acad.Sci. USA 76:4350-4354) に
従って、Bio-Rad Transblot セル(Bio-Rad, Hertfordsh
ire,イギリス) を使ってニトロセルロース紙(Schleiche
r & Schuell, Dassel,ドイツ) にタンパク質を移行せし
めた。移行後、PBS 中の0.5 ％ゼラチンおよび0.5 ％Tw
een-20 (PBS + ) を使って揺り台上で１時間ニトロセル
ロースをブロックした。次いでニトロセルロースをPBS
+ 中の抗血清の適当な希釈液と共に１時間インキュベー
トした。次いでそれをPBS + で５分間３回洗浄し、更に
PBS +中のヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧのアルカリホ
スファターゼ接合体(Sigma) の1:300 希釈液、またはヤ
ギ抗マウス免疫グロブリンＧのアルカリホスファターゼ
接合体(Promega) の1:2000希釈液のいずれかと共に１時
間インキュベートした。PBS + で３回洗浄した後、結合
した抗体を100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl, 5mM
MgCl2 中に可溶化されたニトロブルーテトラゾリウム
（0.37mM）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスフェート（0.34mM）中での発色により視覚化した。
インキュベーションと洗浄は振盪器上で室温にて行っ
た。
【００２５】1.1.4. 電子顕微鏡検査 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）細胞をトリプティカーゼ大豆寒天プレート上で
３日間増殖させ、そして２mlの0.03％ショ糖、0.01M Mg
Cl2 、0.01M CaCl2 中に集めた。試料をピオロホルムコ
ーティングされた銅網(200メッシュ、Biorad) に10分間
適用し、次いで蒸留水の水滴で３回簡単に洗浄し、そし
てホスホタングステン酸(PTA) で染色した。免疫金染色
のために、細菌を網に吸着させ、蒸留水で３回すすい
だ。次いでそれらをPBT (1% BSA, 0.05% Tweenおよび0.
1%ゼラチンを含むPBS)中に1:1000希釈された抗血清の水
滴上で30分間インキュベートした。PBT で３回洗浄した
後、更に10nmの金粒子(Janssen Life Sciences Product
s, Beerse,ベルギー) と接合されたプロテインＡと共に
30分間更にインキュベートした。網を蒸留水で２回洗浄
した後、上記の通り試料をPTA でネガティブ染色した。
全試料を、60 kV および30μm の対物レンズ口径で運転
するPhilips 201 電子顕微鏡を使って検査した。
teriae）細胞をトリプティカーゼ大豆寒天プレート上で
３日間増殖させ、そして２mlの0.03％ショ糖、0.01M Mg
Cl2 、0.01M CaCl2 中に集めた。試料をピオロホルムコ
ーティングされた銅網(200メッシュ、Biorad) に10分間
適用し、次いで蒸留水の水滴で３回簡単に洗浄し、そし
てホスホタングステン酸(PTA) で染色した。免疫金染色
のために、細菌を網に吸着させ、蒸留水で３回すすい
だ。次いでそれらをPBT (1% BSA, 0.05% Tweenおよび0.
1%ゼラチンを含むPBS)中に1:1000希釈された抗血清の水
滴上で30分間インキュベートした。PBT で３回洗浄した
後、更に10nmの金粒子(Janssen Life Sciences Product
s, Beerse,ベルギー) と接合されたプロテインＡと共に
30分間更にインキュベートした。網を蒸留水で２回洗浄
した後、上記の通り試料をPTA でネガティブ染色した。
全試料を、60 kV および30μm の対物レンズ口径で運転
するPhilips 201 電子顕微鏡を使って検査した。
【００２６】1.1.5. 抗血清 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ C5 から精製された鞭
毛の個々の成分に対するウサギ抗血清を次のようにして
得た。約600 μg の鞭毛タンパク質をSDS-PAGEにより分
離し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、そ
して3% TCA中の0.6% Ponceau Sで染色した。所望のタン
パク質を含むフィルターの領域を切り取り、液体窒素中
で瞬間凍結させ、Braun ミクロディスメンブレーターを
使ってホモジナイズした。ホモジナイズした材料を3 ml
の蒸留水に懸濁し、使用するまで−20℃で保存した。免
疫処置用には、この材料 1.5 ml を同容量のフロイント
完全アジュバントと混合し、そして第０日にニュージー
ランド白ウサギの筋肉内に接種した。このウサギを第28
日に同量のフロイント不完全アジュバント中の1.5mlの
ホモジナイズした抗原／ニトロセルロースで追加免疫し
た。第−1, 20, 34,41 および48日、並びにウサギを放
血する時に血清を集めた。
毛の個々の成分に対するウサギ抗血清を次のようにして
得た。約600 μg の鞭毛タンパク質をSDS-PAGEにより分
離し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、そ
して3% TCA中の0.6% Ponceau Sで染色した。所望のタン
パク質を含むフィルターの領域を切り取り、液体窒素中
で瞬間凍結させ、Braun ミクロディスメンブレーターを
使ってホモジナイズした。ホモジナイズした材料を3 ml
の蒸留水に懸濁し、使用するまで−20℃で保存した。免
疫処置用には、この材料 1.5 ml を同容量のフロイント
完全アジュバントと混合し、そして第０日にニュージー
ランド白ウサギの筋肉内に接種した。このウサギを第28
日に同量のフロイント不完全アジュバント中の1.5mlの
ホモジナイズした抗原／ニトロセルロースで追加免疫し
た。第−1, 20, 34,41 および48日、並びにウサギを放
血する時に血清を集めた。
【００２７】トレポネーマ・ファジェデニス（Treponem
a phagedenis）ライター生物型のペリプラズマ鞭毛に対
するウサギ抗血清(RαTPRPF)は、G. Noordhoek, RIVM B
ilthoven, オランダから入手し、そしてスピロヘータ・
アウランチア（Spirochaetaauranntia）の鞭毛に対する
ウサギ血清(RαSAPF) 並びにマウスモノクローナル.1H1
1G7 および.2A684は、P. Greenberg, University of Lo
wa, 合衆国から入手した（B. BrahamshaおよびE.P. Gre
enberg, 1988, "A biochemical and cytological analy
sis of the complex periplasmic flagella from Spir
ochaeta aurantia", J. Bact. 170:4023-4032 ）。37 k
D のトレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）鞭
毛タンパク質に対するマウスモノクローナルMCC9は、C.
W. Penn, University of Birmingham,イギリスから入手
した（M.J. Bailey, A. CockayneおよびC.W. Penn, 198
7, "Production of murine monoclonal antibodies tot
he major filament polypeptide of Treponema pallidu
m", J. Gen. Microbiol. 133:1805-1813 ）。
a phagedenis）ライター生物型のペリプラズマ鞭毛に対
するウサギ抗血清(RαTPRPF)は、G. Noordhoek, RIVM B
ilthoven, オランダから入手し、そしてスピロヘータ・
アウランチア（Spirochaetaauranntia）の鞭毛に対する
ウサギ血清(RαSAPF) 並びにマウスモノクローナル.1H1
1G7 および.2A684は、P. Greenberg, University of Lo
wa, 合衆国から入手した（B. BrahamshaおよびE.P. Gre
enberg, 1988, "A biochemical and cytological analy
sis of the complex periplasmic flagella from Spir
ochaeta aurantia", J. Bact. 170:4023-4032 ）。37 k
D のトレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）鞭
毛タンパク質に対するマウスモノクローナルMCC9は、C.
W. Penn, University of Birmingham,イギリスから入手
した（M.J. Bailey, A. CockayneおよびC.W. Penn, 198
7, "Production of murine monoclonal antibodies tot
he major filament polypeptide of Treponema pallidu
m", J. Gen. Microbiol. 133:1805-1813 ）。
【００２８】1.1.6. Ｎ末端配列分析 ペリプラズマ鞭毛タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、
そして10mM ３−シクロヘキシルアミノ−１，１−プロ
パンスルホン酸(pH 11.0) および10％メタノール中でポ
リビニリデンジフルオリド膜（Immobilon Transfer Mem
branes ; Millipore, Bedford,マサチューセッシュ州）
上に電気ブロッティングせしめた。ブロットされたタン
パク質をクーマシーブリリアントブルーR250染色により
視覚化し、着目のタンパク質を含むバンドを切り取り、
そして120A型 PTHアナライザーがオンライン装備された
Applied Biosystems 470A 型タンパク質配列分析装置を
使って、ブロットされたタンパク質のアミノ酸配列を決
定した。
そして10mM ３−シクロヘキシルアミノ−１，１−プロ
パンスルホン酸(pH 11.0) および10％メタノール中でポ
リビニリデンジフルオリド膜（Immobilon Transfer Mem
branes ; Millipore, Bedford,マサチューセッシュ州）
上に電気ブロッティングせしめた。ブロットされたタン
パク質をクーマシーブリリアントブルーR250染色により
視覚化し、着目のタンパク質を含むバンドを切り取り、
そして120A型 PTHアナライザーがオンライン装備された
Applied Biosystems 470A 型タンパク質配列分析装置を
使って、ブロットされたタンパク質のアミノ酸配列を決
定した。
【００２９】1.2. 結果 1.2.1. 精製およびSDS-PAGE分析 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）からのペリプラズマ鞭毛を構成する成分を同定
するために、トレポネーマ・ヒオジセンテリエC5株から
の鞭毛タンパク質を精製した。鞭毛調製物のSDS-PAGE分
析は、44, 37,35, 34および32 kD の見かけ分子量を有
する５種類の主要ポリペプチドの存在を明らかにした。
このことは、それらが鞭毛の主成分であることを示唆す
る。ある調製物では、30および28 kD のところに２つの
追加のバンドが検出された。それらのバンドは強度が低
いため、おそらく鞭毛の主成分ではなく、汚染物であろ
う。
teriae）からのペリプラズマ鞭毛を構成する成分を同定
するために、トレポネーマ・ヒオジセンテリエC5株から
の鞭毛タンパク質を精製した。鞭毛調製物のSDS-PAGE分
析は、44, 37,35, 34および32 kD の見かけ分子量を有
する５種類の主要ポリペプチドの存在を明らかにした。
このことは、それらが鞭毛の主成分であることを示唆す
る。ある調製物では、30および28 kD のところに２つの
追加のバンドが検出された。それらのバンドは強度が低
いため、おそらく鞭毛の主成分ではなく、汚染物であろ
う。
【００３０】1.2.2. イムノブロット分析 鞭毛調製物中の５つの主要ポリペプチドの鞭毛性質を確
かめるために、関連するスピロヘータの鞭毛タンパク質
に対する血清およびモノクローナル抗体を使ったイムノ
ブロットにおいてそれらの反応性を試験した。30および
28 kD タンパク質を除いて、鞭毛調製物中の全てのタン
パク質がそれらの血清の１つまたは複数と反応した（表
１）。反応性は、バックグラウンドより高いシグナルが
観察されなかった時は“−”、反応性が弱かった時には
“＋”、そして反応性が強かった時には“＋＋”として
記録した。これは単離されたタンパク質の鞭毛性質の指
標である。加えて、37, 34および32 kD タンパク質並び
に44および35 kD タンパク質は免疫学的に関連してい
る。
かめるために、関連するスピロヘータの鞭毛タンパク質
に対する血清およびモノクローナル抗体を使ったイムノ
ブロットにおいてそれらの反応性を試験した。30および
28 kD タンパク質を除いて、鞭毛調製物中の全てのタン
パク質がそれらの血清の１つまたは複数と反応した（表
１）。反応性は、バックグラウンドより高いシグナルが
観察されなかった時は“−”、反応性が弱かった時には
“＋”、そして反応性が強かった時には“＋＋”として
記録した。これは単離されたタンパク質の鞭毛性質の指
標である。加えて、37, 34および32 kD タンパク質並び
に44および35 kD タンパク質は免疫学的に関連してい
る。
【００３１】
【表１】
【００３２】鞭毛調製物中に存在するタンパク質の同一
性および免疫学的関連性を更に調べるために、それらを
ニトロセルロース紙にブロットし、クーマシーブリリア
ントフルーで染色した。個々のバンドを切り取り、ウサ
ギ抗血清の調製に使った。それらの血清を、トレポネー
マ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）C5
溶解物と精製した鞭毛の両方のイムノブロットにおいて
試験した。表２はそれらの実験の結果を要約する。反応
性は、バックグラウンドより高いシグナルが観察されな
かった時は“−”、反応性が弱かった時には“＋”、そ
して反応性が強かった時には“＋＋”として記録した。
性および免疫学的関連性を更に調べるために、それらを
ニトロセルロース紙にブロットし、クーマシーブリリア
ントフルーで染色した。個々のバンドを切り取り、ウサ
ギ抗血清の調製に使った。それらの血清を、トレポネー
マ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）C5
溶解物と精製した鞭毛の両方のイムノブロットにおいて
試験した。表２はそれらの実験の結果を要約する。反応
性は、バックグラウンドより高いシグナルが観察されな
かった時は“−”、反応性が弱かった時には“＋”、そ
して反応性が強かった時には“＋＋”として記録した。
【００３３】
【表２】
【００３４】この表中、α44, α37, α35, α34および
α32は、それぞれトレポネーマ・ヒオジセンテリエ C5
の44, 37, 35, 34および32 kD ペリプラズマ鞭毛関連タ
ンパク質に対して生起されたウサギ免疫血清である。
α32は、それぞれトレポネーマ・ヒオジセンテリエ C5
の44, 37, 35, 34および32 kD ペリプラズマ鞭毛関連タ
ンパク質に対して生起されたウサギ免疫血清である。
【００３５】イムノブロット分析の結果は、44 kD と35
kD のタンパク質がエピトープを共有し得ること、そし
て37, 34および32 kD タンパク質が免疫学的に関連して
いることを再度証明する。37, 34および32 kD タンパク
質と抗35 kD 血清との反応性は、おそらく35 kD 調製物
に37および／または34 kD タンパク質が混入しているた
めであろう。何故なら、37, 34および32 kD タンパク質
に対して生起された血清は35 kD タンパク質を認識しな
いからである。
kD のタンパク質がエピトープを共有し得ること、そし
て37, 34および32 kD タンパク質が免疫学的に関連して
いることを再度証明する。37, 34および32 kD タンパク
質と抗35 kD 血清との反応性は、おそらく35 kD 調製物
に37および／または34 kD タンパク質が混入しているた
めであろう。何故なら、37, 34および32 kD タンパク質
に対して生起された血清は35 kD タンパク質を認識しな
いからである。
【００３６】1.2.3. 免疫金染色 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）C5の鞭毛調製物中に存在するタンパク質がもっ
ぱら鞭毛中にのみ存在するかどうかを確立するために、
鞭毛の個々の成分に対して惹起されたウサギ抗血清を免
疫金電子顕微鏡検査実験に使った。44 kD および35 kD
ポリペプチドに対して向けられた抗体は特異的に鞭毛の
上を一面に覆った。このことは、それらのポリペプチド
が鞭毛の表面上に存在することを示す。対比して、37,
34および32 kD ポリペプチドを認識する抗体は、鞭毛の
切断末端および鞭毛の薄い断片ともっぱら反応する。こ
れは、鞭毛の破壊により外層が損傷を受けたかまたは除
去された時にのみ暴露される鞭毛の内側のエピトープを
それらの抗体が認識することを示唆する。
teriae）C5の鞭毛調製物中に存在するタンパク質がもっ
ぱら鞭毛中にのみ存在するかどうかを確立するために、
鞭毛の個々の成分に対して惹起されたウサギ抗血清を免
疫金電子顕微鏡検査実験に使った。44 kD および35 kD
ポリペプチドに対して向けられた抗体は特異的に鞭毛の
上を一面に覆った。このことは、それらのポリペプチド
が鞭毛の表面上に存在することを示す。対比して、37,
34および32 kD ポリペプチドを認識する抗体は、鞭毛の
切断末端および鞭毛の薄い断片ともっぱら反応する。こ
れは、鞭毛の破壊により外層が損傷を受けたかまたは除
去された時にのみ暴露される鞭毛の内側のエピトープを
それらの抗体が認識することを示唆する。
【００３７】1.2.4. Ｎ末端アミノ酸配列分析 ペリプラズマ鞭毛調製物中に存在する全ての主要タンパ
ク質をＮ末端アミノ酸配列分析により更に特徴づけた。
37, 34および32 kD タンパク質は、高度のＮ末端配列相
同性を共有するので関連している。それらのＮ末端配列
は類似しているが同一ではないので、それらのタンパク
質は互いの分解生成物でもプロセシング生成物でもな
く、異なる遺伝子によりコードされるらしい。44 kD と
35 kD タンパク質のＮ末端配列は、互いにおよび鞭毛調
製物中の他のタンパク質と別個のものであった。
ク質をＮ末端アミノ酸配列分析により更に特徴づけた。
37, 34および32 kD タンパク質は、高度のＮ末端配列相
同性を共有するので関連している。それらのＮ末端配列
は類似しているが同一ではないので、それらのタンパク
質は互いの分解生成物でもプロセシング生成物でもな
く、異なる遺伝子によりコードされるらしい。44 kD と
35 kD タンパク質のＮ末端配列は、互いにおよび鞭毛調
製物中の他のタンパク質と別個のものであった。
【００３８】1.2.5. 相同性 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）鞭毛タンパク質のＮ末端配列、NBRF（リリース
28.0）およびSwiss プロット（リリース18.0）データベ
ース中に存在する全ての入手可能なアミノ酸配列並びに
Ｓ．アウランチア（S. aurantia）の鞭毛タンパク質か
らのＮ末端アミノ酸配列(ParalesおよびGreenberg, 199
1)間で比較を行った。この調査は、35 kD および44 kD
タンパク質のＮ末端配列との有意な相同性が無いことを
明らかにした。しかしながら、44kD タンパク質は、ト
レポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、トレポ
ネーマ・ファジェデニス（Treponema phagedenis）およ
びＳ．アウランチア（S.aurantia）の鞘タンパク質と幾
つかのＮ末端アミノ酸残基を共有した。これは、トレポ
ネーマ・ヒオジセンテリエ鞭毛の表面上に44 kD タンパ
ク質が存在するという本発明者らの仮定と一致する。3
7, 34および32 kD タンパク質は別のスピロヘータから
のコアポリペプチドのＮ末端と強い類似性を共有し、そ
れらの鞭毛性質を確証する。
teriae）鞭毛タンパク質のＮ末端配列、NBRF（リリース
28.0）およびSwiss プロット（リリース18.0）データベ
ース中に存在する全ての入手可能なアミノ酸配列並びに
Ｓ．アウランチア（S. aurantia）の鞭毛タンパク質か
らのＮ末端アミノ酸配列(ParalesおよびGreenberg, 199
1)間で比較を行った。この調査は、35 kD および44 kD
タンパク質のＮ末端配列との有意な相同性が無いことを
明らかにした。しかしながら、44kD タンパク質は、ト
レポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、トレポ
ネーマ・ファジェデニス（Treponema phagedenis）およ
びＳ．アウランチア（S.aurantia）の鞘タンパク質と幾
つかのＮ末端アミノ酸残基を共有した。これは、トレポ
ネーマ・ヒオジセンテリエ鞭毛の表面上に44 kD タンパ
ク質が存在するという本発明者らの仮定と一致する。3
7, 34および32 kD タンパク質は別のスピロヘータから
のコアポリペプチドのＮ末端と強い類似性を共有し、そ
れらの鞭毛性質を確証する。
【００３９】1.2.6. トレポネーマ・ヒオジセンテリエ
の種々の単離物内での鞭毛タンパク質の抗原保存 本発明者らは、トレポネーマ・ヒオジセンテリエからの
鞭毛抗原の保存を調べるために、単一特異的鞭毛血清を
使った。トレポネーマ・ヒオジセンテリエの幾つかの単
離物および株の細胞溶解物を、トレポネーマ・ヒオジセ
ンテリエ C5 の個々の鞭毛サブユニットに対して惹起さ
れた血清を使うイムノブロットにおいて反応させた。ト
レポネーマは、血液寒天プレート上で強溶血性または弱
溶血性として予め特徴づけられていた。抗37 kD および
抗44 kD 血清を使ったイムノブロット実験の結果のみを
示す（表３）。というのは、それらが抗37、抗34および
抗32血清を使って得られた結果と抗44および抗35 kD 血
清を使って得られた結果をそれぞれ代表するからであ
る。
の種々の単離物内での鞭毛タンパク質の抗原保存 本発明者らは、トレポネーマ・ヒオジセンテリエからの
鞭毛抗原の保存を調べるために、単一特異的鞭毛血清を
使った。トレポネーマ・ヒオジセンテリエの幾つかの単
離物および株の細胞溶解物を、トレポネーマ・ヒオジセ
ンテリエ C5 の個々の鞭毛サブユニットに対して惹起さ
れた血清を使うイムノブロットにおいて反応させた。ト
レポネーマは、血液寒天プレート上で強溶血性または弱
溶血性として予め特徴づけられていた。抗37 kD および
抗44 kD 血清を使ったイムノブロット実験の結果のみを
示す（表３）。というのは、それらが抗37、抗34および
抗32血清を使って得られた結果と抗44および抗35 kD 血
清を使って得られた結果をそれぞれ代表するからであ
る。
【００４０】
【表３】
【００４１】a FI＝オランダの野外単離物；ATCC＝アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション。b +/- ＝弱溶血性；+++ ＝強溶血性。c Ｔ．ヒオジセンテリエ C5 の37 kDa鞭毛タンパク質に
対するウサギ血清と反応性であるタンパク質の分子量(k
Da) 。d Ｔ．ヒオジセンテリエ C5 の44 kDa鞭毛タンパク質に
対するウサギ血清と反応性であるタンパク質の分子量(k
Da) 。試験したＴ．ヒオジセンテリエの各々において35
kDaタンパク質との弱い反応性が観察された。
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション。b +/- ＝弱溶血性；+++ ＝強溶血性。c Ｔ．ヒオジセンテリエ C5 の37 kDa鞭毛タンパク質に
対するウサギ血清と反応性であるタンパク質の分子量(k
Da) 。d Ｔ．ヒオジセンテリエ C5 の44 kDa鞭毛タンパク質に
対するウサギ血清と反応性であるタンパク質の分子量(k
Da) 。試験したＴ．ヒオジセンテリエの各々において35
kDaタンパク質との弱い反応性が観察された。
【００４２】試験した全ての単離物が、トレポネーマ・
ヒオジセンテリエ C5 中の同じ分子量のタンパク質に対
して惹起された血清と強力に反応する37, 34および32 k
D のタンパク質を有した。よって、それらの３つの鞭毛
タンパク質はトレポネーマ・ヒオジセンテリエ中で保存
されていると思われる。また、試験した全てのトレポネ
ーマ・ヒオジセンテリエ単離物において、35 kD の鞭毛
タンパク質が存在していた。対比して、最大の鞭毛関連
ポリペプチドの分子量は単離物間で異なった。強溶血性
の単離物ではそれは44 kD であり、一方弱溶血性の単離
物では40〜46 kD の間で異なった。
ヒオジセンテリエ C5 中の同じ分子量のタンパク質に対
して惹起された血清と強力に反応する37, 34および32 k
D のタンパク質を有した。よって、それらの３つの鞭毛
タンパク質はトレポネーマ・ヒオジセンテリエ中で保存
されていると思われる。また、試験した全てのトレポネ
ーマ・ヒオジセンテリエ単離物において、35 kD の鞭毛
タンパク質が存在していた。対比して、最大の鞭毛関連
ポリペプチドの分子量は単離物間で異なった。強溶血性
の単離物ではそれは44 kD であり、一方弱溶血性の単離
物では40〜46 kD の間で異なった。
【００４３】実施例２：ペリプラズマ鞭毛鞘タンパク質
をコードするトレポネーマ・ヒオジセンテリエ遺伝子の
クローニングおよびＤＮＡ配列分析 2.1. 材料および方法 2.1.1. 菌株および増殖条件 実施例１参照。λZAP ライブラリーの作製にはエシェリ
キア・コリ（Escherichia coli）Y1090 を使った。プラ
スミド形質転換のための受容体としてＥ．コリDH5αF
′(Bethesda Research Laboratories Life Technologi
es, Inc., Gaithersburg, Md.) を使い、LB培地中また
はLB寒天プレート上で37℃にて増殖させた（Maniatis
ら、1982）。
をコードするトレポネーマ・ヒオジセンテリエ遺伝子の
クローニングおよびＤＮＡ配列分析 2.1. 材料および方法 2.1.1. 菌株および増殖条件 実施例１参照。λZAP ライブラリーの作製にはエシェリ
キア・コリ（Escherichia coli）Y1090 を使った。プラ
スミド形質転換のための受容体としてＥ．コリDH5αF
′(Bethesda Research Laboratories Life Technologi
es, Inc., Gaithersburg, Md.) を使い、LB培地中また
はLB寒天プレート上で37℃にて増殖させた（Maniatis
ら、1982）。
【００４４】2.1.2. 鞭毛の単離および精製 実施例１参照。 2.1.3. 電気泳動およびウエスタンブロット 実施例１参照 2.1.4. 抗血清 実施例１参照 2.1.5. Ｎ末端配列分析 実施例１参照
【００４５】2.1.6. プラスミドおよびＤＮＡ 染色体ＤＮＡライブラリーの作製にバクテリオファージ
λZAP (Stratagene, San Diego, カリフォルニア州) を
使った。サブクローニング実験と配列分析にはプラスミ
ド pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, カリ
フォルニア州)を使った。プラスミドＤＮＡ、染色体Ｄ
ＮＡおよびファージＤＮＡは、T. Maniatis, E.F. Frit
sch およびJ. Sambrook (1982) (Molecular Cloning :
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, ニューヨーク) に従って単離した。二本鎖配列決定
用のプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法を使って抽出
しそして塩化セシウム密度勾配遠心により精製した。サ
ザン分析用とライブラリーの作製用のトレポネーマ・ヒ
オジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）染色体Ｄ
ＮＡは、250 mlの培養物から収得した細菌から調製し、
そしてリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS) 中で２回洗浄した。
全ての制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ修飾酵素は
製造業者（Bethesda Research Laboratories, Inc., Ga
ithersburg, Md. またはBoehringer MannheimBiochemic
als）の指示に従って使用した。
λZAP (Stratagene, San Diego, カリフォルニア州) を
使った。サブクローニング実験と配列分析にはプラスミ
ド pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, カリ
フォルニア州)を使った。プラスミドＤＮＡ、染色体Ｄ
ＮＡおよびファージＤＮＡは、T. Maniatis, E.F. Frit
sch およびJ. Sambrook (1982) (Molecular Cloning :
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, ニューヨーク) に従って単離した。二本鎖配列決定
用のプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法を使って抽出
しそして塩化セシウム密度勾配遠心により精製した。サ
ザン分析用とライブラリーの作製用のトレポネーマ・ヒ
オジセンテリエ（Treponema hyodysenteriae）染色体Ｄ
ＮＡは、250 mlの培養物から収得した細菌から調製し、
そしてリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS) 中で２回洗浄した。
全ての制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ修飾酵素は
製造業者（Bethesda Research Laboratories, Inc., Ga
ithersburg, Md. またはBoehringer MannheimBiochemic
als）の指示に従って使用した。
【００４６】2.1.7. トレポネーマ・ヒオジセンテリエ
染色体ＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニング トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）C5からの染色体ＤＮＡをSau3AIで部分消化し、
６〜９キロ塩基対のサイズの断片を使ってλZAP ファー
ジライブラリーを作製した（R.A. YoungおよびR.W. Dav
is, 1983, "Efficient isolation of genes using anti
body probes", Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80, 1194-
1198 ）。簡単に言えば、ＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動により分画し、Eco RIアダプターと連結せしめ、次
いで製造業者(Stratagene, La Jolla,カリフォルニア
州）のプロトコルに従ってファージとしてパッケージン
グした。該ライブラリーの力価は、コンピテントＥ．コ
リ Y1090宿主細胞のトランスフェクション後に1.74×10
5 プラーク形成単位／mlであった。分析したファージの
約90％が６〜９キロ塩基の平均サイズを有する挿入断片
を含むことがわかった。該λZAP ライブラリーを次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、約90,000プラーク
をＥ．コリ Y1090上で42℃にて2.5 時間増殖させ、予め
10mM IPTG を含浸させておいたニトロセルロースフィル
ター(Schleicher & Schuell, Dassel, FRG) をその上に
載せ、そして更に37℃で４時間インキュベートした。該
フィルターを取り出し、PBS + 中に1:500 希釈されたト
レポネーマ・ヒオジセンテリエのペリプラズム鞭毛に対
して生じさせた抗血清と共にインキュベートした。第二
抗体としてPBS + 中に1:3000希釈されたアルカリホスフ
ァターゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体(Sigma) を使った。免疫
反応性プラークを、100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM Na
Cl, 5mM MgCl2 中に溶解されたニトロブルーテトラゾリ
ウム(0.37mM)および５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェート(0.34mM)中での発色により可視化し
た。
染色体ＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニング トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）C5からの染色体ＤＮＡをSau3AIで部分消化し、
６〜９キロ塩基対のサイズの断片を使ってλZAP ファー
ジライブラリーを作製した（R.A. YoungおよびR.W. Dav
is, 1983, "Efficient isolation of genes using anti
body probes", Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80, 1194-
1198 ）。簡単に言えば、ＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動により分画し、Eco RIアダプターと連結せしめ、次
いで製造業者(Stratagene, La Jolla,カリフォルニア
州）のプロトコルに従ってファージとしてパッケージン
グした。該ライブラリーの力価は、コンピテントＥ．コ
リ Y1090宿主細胞のトランスフェクション後に1.74×10
5 プラーク形成単位／mlであった。分析したファージの
約90％が６〜９キロ塩基の平均サイズを有する挿入断片
を含むことがわかった。該λZAP ライブラリーを次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、約90,000プラーク
をＥ．コリ Y1090上で42℃にて2.5 時間増殖させ、予め
10mM IPTG を含浸させておいたニトロセルロースフィル
ター(Schleicher & Schuell, Dassel, FRG) をその上に
載せ、そして更に37℃で４時間インキュベートした。該
フィルターを取り出し、PBS + 中に1:500 希釈されたト
レポネーマ・ヒオジセンテリエのペリプラズム鞭毛に対
して生じさせた抗血清と共にインキュベートした。第二
抗体としてPBS + 中に1:3000希釈されたアルカリホスフ
ァターゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体(Sigma) を使った。免疫
反応性プラークを、100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM Na
Cl, 5mM MgCl2 中に溶解されたニトロブルーテトラゾリ
ウム(0.37mM)および５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェート(0.34mM)中での発色により可視化し
た。
【００４７】2.1.8. ウサギ免疫血清からの抗体のアフ
ィニティー精製 ニトロセルロースに固定されたプラークの生産物への結
合により、ウサギ免疫血清から抗体をアフィニティー精
製した。約50,000個のプラークを14 cm のLB寒天プレー
ト上で42℃にて2.5 時間Ｅ．コリ Y1090上で増殖させ、
ニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)を
載せ、そして37℃にて２時間インキュベートした。PBS
+ 中で１時間該フィルターをブロックし、次いでPBS +
中に1:50希釈されたウサギ免疫血清の中で３時間インキ
ュベートした。フィルターをPBS+ 中で15分間３回洗浄
した。結合した抗体の溶出のため、ニトロセルロースフ
ィルターを10 ml の0.2Mグリシン、0.15M NaCl, pH 2.8
中で５分間インキュベートした。溶出液のpHを即座に5
mlの1M Tris-HCl, pH 8.0 によって8.0 に再調整した。
溶出液の1:10希釈液をPBS + 中で作り、ウエスタンブロ
ットを探査するのに使った。
ィニティー精製 ニトロセルロースに固定されたプラークの生産物への結
合により、ウサギ免疫血清から抗体をアフィニティー精
製した。約50,000個のプラークを14 cm のLB寒天プレー
ト上で42℃にて2.5 時間Ｅ．コリ Y1090上で増殖させ、
ニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)を
載せ、そして37℃にて２時間インキュベートした。PBS
+ 中で１時間該フィルターをブロックし、次いでPBS +
中に1:50希釈されたウサギ免疫血清の中で３時間インキ
ュベートした。フィルターをPBS+ 中で15分間３回洗浄
した。結合した抗体の溶出のため、ニトロセルロースフ
ィルターを10 ml の0.2Mグリシン、0.15M NaCl, pH 2.8
中で５分間インキュベートした。溶出液のpHを即座に5
mlの1M Tris-HCl, pH 8.0 によって8.0 に再調整した。
溶出液の1:10希釈液をPBS + 中で作り、ウエスタンブロ
ットを探査するのに使った。
【００４８】2.1.9. ＤＮＡの試験管内転写／翻訳 Amersham (Buckinghamshire,イギリス) からの原核ＤＮ
Ａ指令翻訳キットを使って、製造業者のプロトコルに従
ってＬ−35Ｓ−メチオニン（Amersham, Buckinghamshir
e,イギリス) の存在下で、ＤＮＡの試験管内転写／翻訳
を行った。合成された標識タンパク質の分子量を14Ｃメ
チル化タンパク質分子量マーカー（Amersham）との比較
により推定した。
Ａ指令翻訳キットを使って、製造業者のプロトコルに従
ってＬ−35Ｓ−メチオニン（Amersham, Buckinghamshir
e,イギリス) の存在下で、ＤＮＡの試験管内転写／翻訳
を行った。合成された標識タンパク質の分子量を14Ｃメ
チル化タンパク質分子量マーカー（Amersham）との比較
により推定した。
【００４９】2.1.10. サザンブロットハイブリダイゼー
ション ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、そして脱プリ
ン化、変性および中和後、20×SSPE (１×SSPEは0.15M
NaCl, 10mMリン酸ナトリウムおよび1mM EDTA,pH 7.4で
ある）中で１時間真空を適用してニトロセルロースフィ
ルター（Hybond-N, Amersham Corp., Arlington Height
s,イリノイ州）に移行せしめた。ＵＶに４分間暴露する
ことによりＤＮＡをフィルター上に固定した。次いでフ
ィルターを６×SSPE，５×デンハーツ溶液（１×デンハ
ーツ溶液は、0.02% ポリビニルピロリドン、0.02% BSA
および0.02% フィコール400 である）、0.5% SDSおよび
100 μg/mlの熱不活性化サケ精子ＤＮＡ中で45℃にて６
時間予備ハイブリダイズせしめた。放射能標識プローブ
を添加し、45℃で16時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ブロットを室温で２×SSPE，0.1% SDS中で20分間２
回そして45℃にて20分間２回簡単に洗浄した。0.5 ×SS
PE，0.1% SDS中で20分間の緊縮洗浄を行った。映像強化
膜を用いて−70℃にてFuji RX フィルム（富士フィル
ム）を使ってブロットのオートラジオグラフィーを行っ
た。
ション ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、そして脱プリ
ン化、変性および中和後、20×SSPE (１×SSPEは0.15M
NaCl, 10mMリン酸ナトリウムおよび1mM EDTA,pH 7.4で
ある）中で１時間真空を適用してニトロセルロースフィ
ルター（Hybond-N, Amersham Corp., Arlington Height
s,イリノイ州）に移行せしめた。ＵＶに４分間暴露する
ことによりＤＮＡをフィルター上に固定した。次いでフ
ィルターを６×SSPE，５×デンハーツ溶液（１×デンハ
ーツ溶液は、0.02% ポリビニルピロリドン、0.02% BSA
および0.02% フィコール400 である）、0.5% SDSおよび
100 μg/mlの熱不活性化サケ精子ＤＮＡ中で45℃にて６
時間予備ハイブリダイズせしめた。放射能標識プローブ
を添加し、45℃で16時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ブロットを室温で２×SSPE，0.1% SDS中で20分間２
回そして45℃にて20分間２回簡単に洗浄した。0.5 ×SS
PE，0.1% SDS中で20分間の緊縮洗浄を行った。映像強化
膜を用いて−70℃にてFuji RX フィルム（富士フィル
ム）を使ってブロットのオートラジオグラフィーを行っ
た。
【００５０】サザンブロット分析用のＤＮＡプローブ
は、シリカゲルクロマトグラフィー（Gene Clean, Bio1
01, La Jolla, カリフォルニア州）により精製した。ラ
ンダムプライム標識キット（Boehringer Mannheim, FR
G）を使ってα32P-ATP (Amersham)での標識を行った。
は、シリカゲルクロマトグラフィー（Gene Clean, Bio1
01, La Jolla, カリフォルニア州）により精製した。ラ
ンダムプライム標識キット（Boehringer Mannheim, FR
G）を使ってα32P-ATP (Amersham)での標識を行った。
【００５１】2.1.11. ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ配列分析は、Pharmacia (Uppsala, スウェーデ
ン) からのT7配列決定用キットを使って、二本鎖鋳型を
配列決定するためのプロトコルを利用して行った。配列
分析しようとするＤＮＡは、 pBluescript II KS+ 中に
サブクローニングしそしてCsCl密度勾配遠心により精製
した制限断片であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応に
よってＤＮＡ増幅させそしてシリカゲルクロマトグラフ
ィー（GeneClean, Bio101）により精製した制限断片で
ある。標準的M13 プライマーに加えて、Gene Assembler
Plus (Pharmacia, Uppsala,スウェーデン) 上で合成さ
れた合成オリゴヌクレオチドをＤＮＡ配列分析に使っ
た。配列分析する生成物は、変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（4.5 ％ポリアクリルアミド）により分離
し、そしてオートラジオグラフィーによって検出した。
ン) からのT7配列決定用キットを使って、二本鎖鋳型を
配列決定するためのプロトコルを利用して行った。配列
分析しようとするＤＮＡは、 pBluescript II KS+ 中に
サブクローニングしそしてCsCl密度勾配遠心により精製
した制限断片であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応に
よってＤＮＡ増幅させそしてシリカゲルクロマトグラフ
ィー（GeneClean, Bio101）により精製した制限断片で
ある。標準的M13 プライマーに加えて、Gene Assembler
Plus (Pharmacia, Uppsala,スウェーデン) 上で合成さ
れた合成オリゴヌクレオチドをＤＮＡ配列分析に使っ
た。配列分析する生成物は、変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（4.5 ％ポリアクリルアミド）により分離
し、そしてオートラジオグラフィーによって検出した。
【００５２】2.1.12. ＰＣＲ ＤＮＡ増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＤＮＡ増幅は、2.5 U
のTaq ポリメラーゼ(Promega) を使って熱循環器(Bioex
cellence, Wessex, Andover Hampshire,イギリス) を使
って35サイクル行った。このＰＣＲは、50mM KCl, 10mM
Tris-HCl, pH9.6, 1.5mM MgCl2, 0.001%ゼラチン, 0.0
1% Triton X-100および200 μM の各dNTPの存在下で100
μl の容量中で行った。完全な鞘フラジェリン遺伝子
とその調節配列を含むＤＮＡ断片を増幅するために、λ
ZAP 上のT7プライマー(5′AATACGACTCACTATAG 3 ′)
を、フラジェリン遺伝子の上流のＤＮＡから得られた部
分配列データから誘導したオリゴヌクレオチド 5′CCGC
TTCCTCCTGAGC 3′（プライマー２）と組み合わせて使っ
た。各ＰＣＲサイクルは、95℃で１分、48℃で１分およ
び72℃で２分から成った。
のTaq ポリメラーゼ(Promega) を使って熱循環器(Bioex
cellence, Wessex, Andover Hampshire,イギリス) を使
って35サイクル行った。このＰＣＲは、50mM KCl, 10mM
Tris-HCl, pH9.6, 1.5mM MgCl2, 0.001%ゼラチン, 0.0
1% Triton X-100および200 μM の各dNTPの存在下で100
μl の容量中で行った。完全な鞘フラジェリン遺伝子
とその調節配列を含むＤＮＡ断片を増幅するために、λ
ZAP 上のT7プライマー(5′AATACGACTCACTATAG 3 ′)
を、フラジェリン遺伝子の上流のＤＮＡから得られた部
分配列データから誘導したオリゴヌクレオチド 5′CCGC
TTCCTCCTGAGC 3′（プライマー２）と組み合わせて使っ
た。各ＰＣＲサイクルは、95℃で１分、48℃で１分およ
び72℃で２分から成った。
【００５３】2.1.13. 配列分析 PC/Gene （リリース6.50 ; Genofit S.A., Geneva,スイ
ス）コンピュータープログラムを使ってヌクレオチド配
列を分析した。FASTA プログラム（リリース1.3 ; W.R.
RearsonおよびD.J. Lipman, 1988,"Improved tools fo
r biological sequence comparison", Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85:2444-2448）およびFASTP プログラム
（リリース ; D.J. LipmanおよびW.R. Pearson, 1985,
"Rapid and sensitive protein similarity searches",
Science 227:1435-1441）を使って、次のデータベース
とヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を比較した：EM
BL（リリース27.0）、GenBank （リリース67.0）、NBRF
/PIR（リリース28.0）、Swiss-Prot（リリース18.0）お
よびBrookhaven（リリース4.0 ）。Clustal コンピュー
タープログラム(D.G. Higgins およびP.M. Sharp, 198
8, "CLUSTAL : a package for performing multiple al
ignment on amicrocomputer", Gene 73:237-244 ; D.
G. Higgins およびP.M. Sharp, 1989,"Fast and sensit
ive multiple sequence alignments on a microcompute
r", CABIOS Commun. 5151-153)を使って類似配列を整列
せしめた。
ス）コンピュータープログラムを使ってヌクレオチド配
列を分析した。FASTA プログラム（リリース1.3 ; W.R.
RearsonおよびD.J. Lipman, 1988,"Improved tools fo
r biological sequence comparison", Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85:2444-2448）およびFASTP プログラム
（リリース ; D.J. LipmanおよびW.R. Pearson, 1985,
"Rapid and sensitive protein similarity searches",
Science 227:1435-1441）を使って、次のデータベース
とヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を比較した：EM
BL（リリース27.0）、GenBank （リリース67.0）、NBRF
/PIR（リリース28.0）、Swiss-Prot（リリース18.0）お
よびBrookhaven（リリース4.0 ）。Clustal コンピュー
タープログラム(D.G. Higgins およびP.M. Sharp, 198
8, "CLUSTAL : a package for performing multiple al
ignment on amicrocomputer", Gene 73:237-244 ; D.
G. Higgins およびP.M. Sharp, 1989,"Fast and sensit
ive multiple sequence alignments on a microcompute
r", CABIOS Commun. 5151-153)を使って類似配列を整列
せしめた。
【００５４】2.1.14. 電子顕微鏡検査 鞭毛調製物の試料を、ピオロホルムコーティングした銅
網(200メッシュ, Biorad) に10分間適用し、次いで蒸留
水の水滴で簡単に３回洗浄し、そしてホスホタングステ
ン酸(PTA) によりネガティブ染色した。60 kV および30
μm の対物レンズ口径でPhilips 201 電子顕微鏡を使っ
て検査を行った。
網(200メッシュ, Biorad) に10分間適用し、次いで蒸留
水の水滴で簡単に３回洗浄し、そしてホスホタングステ
ン酸(PTA) によりネガティブ染色した。60 kV および30
μm の対物レンズ口径でPhilips 201 電子顕微鏡を使っ
て検査を行った。
【００５５】2.2. 結果 2.2.1. ペリプラズム鞭毛鞘タンパク質遺伝子のクロー
ニング トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）C5からペリプラズム鞭毛を単離した。電子顕微
鏡検査を使って調製物が鞭毛のみを含むことを確かめた
（結果は示してない）。この単離した鞭毛に対してウサ
ギ血清を惹起せしめ、Ｔ．ヒオジセンテリエ細胞溶解物
および精製した鞭毛の両方の電気泳動により分離したタ
ンパク質に対する反応性をイムノブロット上で試験し
た。鞭毛タンパク質と特異的に反応した血清を使って、
ファージλZAP 中に作製したＴ．ヒオジセンテリエライ
ブラリーを鞭毛タンパク質の発現についてスクリーニン
グした。
ニング トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysen
teriae）C5からペリプラズム鞭毛を単離した。電子顕微
鏡検査を使って調製物が鞭毛のみを含むことを確かめた
（結果は示してない）。この単離した鞭毛に対してウサ
ギ血清を惹起せしめ、Ｔ．ヒオジセンテリエ細胞溶解物
および精製した鞭毛の両方の電気泳動により分離したタ
ンパク質に対する反応性をイムノブロット上で試験し
た。鞭毛タンパク質と特異的に反応した血清を使って、
ファージλZAP 中に作製したＴ．ヒオジセンテリエライ
ブラリーを鞭毛タンパク質の発現についてスクリーニン
グした。
【００５６】そのようなスクリーニングによって、６つ
の免疫反応性プラークの同定が可能になった。１つのク
ローンからのλZAPII/fla6と命名した組換えλZAP ファ
ージを、オランダのバーンにあるCentraalbureau voor
SchimmelculturesにCBS 513.91のもとに寄託した。ウエ
スタンブロット分析は、λZAPII/fla6がポリクローナル
ウサギ抗鞭毛血清と強力に反応する41 kDaポリペプチド
の合成を指令することを証明した（図５）。免疫反応性
タンパク質の合成は、イソプロピル−β−チオガラクト
ピラノシドによって誘導されなかった（図５、レーンＡ
およびＢ）。このことは、Ｔ．ヒオジセンテリエ発現シ
グナルがλZAPII/fla6上に存在し、Ｅ．コリ中で機能し
ていることを示唆する。λZAPII/fla6により発現された
タンパク質に結合する抗体をウサギ免疫血清からアフィ
ニティー精製し、この抗体を使って、精製Ｔ．ヒオジセ
ンテリエ鞭毛を有するウエスタンブロットを探査した
（図５、レーンＣ）。アフィニティー精製抗体は44 kDa
タンパク質に強力に結合し、そしてＴ．ヒオジセンテリ
エ鞭毛鞘タンパク質として同定された35 kDaタンパク質
には弱く結合した。ファージクローンλZAPII/fla6から
ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼ EcoRIで消化
した。アガロースゲル電気泳動は、それぞれ1500 bp と
1750 bp の２つのＴ．ヒオジセンテリエ特異的 EcoRI断
片の存在を明らかにした。両断片を別々に試験管内転写
／翻訳系において試験し、それらがタンパク質の構成を
指令するかどうかを調べた。1750 bp 断片の転写のみが
標識バンド、中でも約44 kDaの優勢バンドの合成を引き
起こした（図６）。この分子量はＴ．ヒオジセンテリエ
の鞘フラジェリンの分子量に相当する。それらの結果
は、1750 bp 断片が完全な鞘フラジェリン遺伝子とその
プロモーターを含むことを指摘する。
の免疫反応性プラークの同定が可能になった。１つのク
ローンからのλZAPII/fla6と命名した組換えλZAP ファ
ージを、オランダのバーンにあるCentraalbureau voor
SchimmelculturesにCBS 513.91のもとに寄託した。ウエ
スタンブロット分析は、λZAPII/fla6がポリクローナル
ウサギ抗鞭毛血清と強力に反応する41 kDaポリペプチド
の合成を指令することを証明した（図５）。免疫反応性
タンパク質の合成は、イソプロピル−β−チオガラクト
ピラノシドによって誘導されなかった（図５、レーンＡ
およびＢ）。このことは、Ｔ．ヒオジセンテリエ発現シ
グナルがλZAPII/fla6上に存在し、Ｅ．コリ中で機能し
ていることを示唆する。λZAPII/fla6により発現された
タンパク質に結合する抗体をウサギ免疫血清からアフィ
ニティー精製し、この抗体を使って、精製Ｔ．ヒオジセ
ンテリエ鞭毛を有するウエスタンブロットを探査した
（図５、レーンＣ）。アフィニティー精製抗体は44 kDa
タンパク質に強力に結合し、そしてＴ．ヒオジセンテリ
エ鞭毛鞘タンパク質として同定された35 kDaタンパク質
には弱く結合した。ファージクローンλZAPII/fla6から
ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼ EcoRIで消化
した。アガロースゲル電気泳動は、それぞれ1500 bp と
1750 bp の２つのＴ．ヒオジセンテリエ特異的 EcoRI断
片の存在を明らかにした。両断片を別々に試験管内転写
／翻訳系において試験し、それらがタンパク質の構成を
指令するかどうかを調べた。1750 bp 断片の転写のみが
標識バンド、中でも約44 kDaの優勢バンドの合成を引き
起こした（図６）。この分子量はＴ．ヒオジセンテリエ
の鞘フラジェリンの分子量に相当する。それらの結果
は、1750 bp 断片が完全な鞘フラジェリン遺伝子とその
プロモーターを含むことを指摘する。
【００５７】pBluescript II KS + 中で1750 bp 断片を
サブクローニングする試みは繰り返し陰性であった。こ
れは、それが含有する遺伝子の発現がＥ．コリ中で毒性
であることを示唆する。従って、該断片をポリメラーゼ
連鎖反応により増幅せしめ、図７に概略されるようにそ
のヌクレオチド配列を決定した。増幅されたＤＮＡのヌ
クレオチド配列分析は、１つの単一転写解読枠の存在を
明らかにした。この転写解読枠を包含するヌクレオチド
配列およびそれから誘導されるアミノ酸配列を配列表の
配列番号１のもとに示す。コードされるタンパク質は、
36.0 kDaの計算分子量を有する320 アミノ酸残基から成
る。アミノ酸残基20〜38は精製された44kDaのＴ．ヒオ
ジセンテリエ鞘フラジェリンのＮ末端配列と一致する。
よって、この転写解読枠は19アミノ酸のシグナルペプチ
ドと共にこのＴ．ヒオジセンテリエ鞘フラジェリンをコ
ードする。シグナルペプチドが無ければ、該タンパク質
は33.8 kDaの計算分子量を有し、SDS-PAGEにより決定づ
けられた生来のタンパク質の44 kDaの評価値よりも小さ
い。このことは、鞘フラジェリンが翻訳後修飾を受ける
ことを示唆する。KyteおよびDoolitteの演算法による親
水性分析（図２）は、膜に広がる領域であるらしい１つ
の優勢な疎水性領域を証明する。この領域はシグナルペ
プチドと一致する。コード領域の上流に、推定上のＥ．
コリ−35および−10配列並びにリボソーム結合部位が同
定される。終結コドンの下流には、転写ターミネーター
として働くかもしれない２つの逆方向反復配列が存在す
る。
サブクローニングする試みは繰り返し陰性であった。こ
れは、それが含有する遺伝子の発現がＥ．コリ中で毒性
であることを示唆する。従って、該断片をポリメラーゼ
連鎖反応により増幅せしめ、図７に概略されるようにそ
のヌクレオチド配列を決定した。増幅されたＤＮＡのヌ
クレオチド配列分析は、１つの単一転写解読枠の存在を
明らかにした。この転写解読枠を包含するヌクレオチド
配列およびそれから誘導されるアミノ酸配列を配列表の
配列番号１のもとに示す。コードされるタンパク質は、
36.0 kDaの計算分子量を有する320 アミノ酸残基から成
る。アミノ酸残基20〜38は精製された44kDaのＴ．ヒオ
ジセンテリエ鞘フラジェリンのＮ末端配列と一致する。
よって、この転写解読枠は19アミノ酸のシグナルペプチ
ドと共にこのＴ．ヒオジセンテリエ鞘フラジェリンをコ
ードする。シグナルペプチドが無ければ、該タンパク質
は33.8 kDaの計算分子量を有し、SDS-PAGEにより決定づ
けられた生来のタンパク質の44 kDaの評価値よりも小さ
い。このことは、鞘フラジェリンが翻訳後修飾を受ける
ことを示唆する。KyteおよびDoolitteの演算法による親
水性分析（図２）は、膜に広がる領域であるらしい１つ
の優勢な疎水性領域を証明する。この領域はシグナルペ
プチドと一致する。コード領域の上流に、推定上のＥ．
コリ−35および−10配列並びにリボソーム結合部位が同
定される。終結コドンの下流には、転写ターミネーター
として働くかもしれない２つの逆方向反復配列が存在す
る。
【００５８】2.2.2. Ｔ．ヒオジセンテリエ鞘フラジェ
リンの相同性分析 鞘タンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列と
データーベース中に存在する配列との比較は、Ｔ．パリ
ダム〔R.D. Isaacs, J.H. Hanke, L.M. Guzman-Verduzc
o, G. Newport, N. Agabian, M.V. Norgard, S.A. Luke
hartおよびJ.D.Radolf (1989) Infect. Immun. 57:3403
-3411並びにR.D. Isaacs およびJ.D. Radolf (1990) In
fect. Immun. 58:2025-2034〕およびＳ．アウランチア
〔B. BrahamshaおよびE.P. Greenberg (1989) J. Bacte
riol. 171:1692-1697 〕の鞘フラジェリンとの相同性を
明らかにした。同一アミノ酸および保存アミノ酸置換の
両方を包含すると、Ｔ．ヒオジセンテリエ鞘フラジェリ
ンの全体配列相同性はＴ．パリダムに対して30.5％であ
り、そしてＳ．アウランチアに対して32.1％である。
リンの相同性分析 鞘タンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列と
データーベース中に存在する配列との比較は、Ｔ．パリ
ダム〔R.D. Isaacs, J.H. Hanke, L.M. Guzman-Verduzc
o, G. Newport, N. Agabian, M.V. Norgard, S.A. Luke
hartおよびJ.D.Radolf (1989) Infect. Immun. 57:3403
-3411並びにR.D. Isaacs およびJ.D. Radolf (1990) In
fect. Immun. 58:2025-2034〕およびＳ．アウランチア
〔B. BrahamshaおよびE.P. Greenberg (1989) J. Bacte
riol. 171:1692-1697 〕の鞘フラジェリンとの相同性を
明らかにした。同一アミノ酸および保存アミノ酸置換の
両方を包含すると、Ｔ．ヒオジセンテリエ鞘フラジェリ
ンの全体配列相同性はＴ．パリダムに対して30.5％であ
り、そしてＳ．アウランチアに対して32.1％である。
【００５９】実施例３：Ｔ．ヒオジセンテリエのクロー
ン化鞭毛鞘タンパク質はマウスの実験的病気に対する部
分的保護を提供する 3.1. 材料および方法 3.1.1. 菌株および増殖条件 OF-1マウスに対して病原性であるオランダの野外単離物
のＴ．ヒオジセンテリエ（T. hyodysenteriae） C5 を
実施例１に記載の通りに増殖させた。細菌濃度は暗視野
顕微鏡下で血球計数器を使って測定した。エシェリキア
・コリ（Escherichia coli） DH5αF ′（Bethesda Res
earch Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithe
rsburg, メリーランド州）をプラスミド形質転換のため
の受容体として使い、LB培地中またはLB寒天プレート上
で増殖させた（Maniatisら、1982）。
ン化鞭毛鞘タンパク質はマウスの実験的病気に対する部
分的保護を提供する 3.1. 材料および方法 3.1.1. 菌株および増殖条件 OF-1マウスに対して病原性であるオランダの野外単離物
のＴ．ヒオジセンテリエ（T. hyodysenteriae） C5 を
実施例１に記載の通りに増殖させた。細菌濃度は暗視野
顕微鏡下で血球計数器を使って測定した。エシェリキア
・コリ（Escherichia coli） DH5αF ′（Bethesda Res
earch Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithe
rsburg, メリーランド州）をプラスミド形質転換のため
の受容体として使い、LB培地中またはLB寒天プレート上
で増殖させた（Maniatisら、1982）。
【００６０】3.1.2. マウス メスのIco:OF1 (OF-1)マウスをIffa Credo（フランス）
から入手し、標準的実験用食物および飲料水を自由に取
ることができる隔離カゴ中に収容した。
から入手し、標準的実験用食物および飲料水を自由に取
ることができる隔離カゴ中に収容した。
【００６１】3.1.3. クローニングおよび発現 Ｔ．ヒオジセンテリエ（T. hyodysenteriae）の鞘フラ
ジェリン(flaA)遺伝子のクローニングおよび発現は上の
実施例において記載されている。flaA遺伝子を含むファ
ージλfla6をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) に使って、隣
接の非コード配列を持たない着目の遺伝子の全解読枠を
含むＤＮＡ断片を得た。鞭毛鞘遺伝子を増幅するのにオ
リゴデオキシヌクレオチド（Pharmacia, Woerden, オラ
ンダ） 5′gggatccccTTAACAAACTCAACTTTG 3′および
5′gggaattcTTATTGAGCTTGTTCTT 3′（それぞれ配列番
号１中のヌクレオチド160 〜177 およびヌクレオチド10
65〜1049）を使った。BamHI またはEcoRI 制限酵素消化
部位を含むリンカー配列（上記オリゴデオキシヌクレオ
チド中に大文字で表示した部分）を添加し、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ(Gst) 遺伝子を有する読み
枠内でプラスミドpGEX-3X (Pharmacia) 中への前記増幅
遺伝子のクローニングおよび発現を促進した。10ナノグ
ラムの鋳型ＤＮＡを、次のサイクルパラメーターでＰＣ
Ｒ（35サイクル）に使った：95℃で１分、48℃で１分、
72℃で２分。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動により単離し、GeneClean (Bio101, La Jolla,
カリフォルニア）により精製し、EcoRI とBamHI で消化
し、そしてpGEX-3X 中に連結せしめた。組換えプラスミ
ドpGEX-flaA を用いてＥ．コリ DH5αを形質転換せしめ
た。こうして融合タンパク質の発現は、イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）により誘導可
能であるtac プロモーターの支配下にあるだろう。
ジェリン(flaA)遺伝子のクローニングおよび発現は上の
実施例において記載されている。flaA遺伝子を含むファ
ージλfla6をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) に使って、隣
接の非コード配列を持たない着目の遺伝子の全解読枠を
含むＤＮＡ断片を得た。鞭毛鞘遺伝子を増幅するのにオ
リゴデオキシヌクレオチド（Pharmacia, Woerden, オラ
ンダ） 5′gggatccccTTAACAAACTCAACTTTG 3′および
5′gggaattcTTATTGAGCTTGTTCTT 3′（それぞれ配列番
号１中のヌクレオチド160 〜177 およびヌクレオチド10
65〜1049）を使った。BamHI またはEcoRI 制限酵素消化
部位を含むリンカー配列（上記オリゴデオキシヌクレオ
チド中に大文字で表示した部分）を添加し、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ(Gst) 遺伝子を有する読み
枠内でプラスミドpGEX-3X (Pharmacia) 中への前記増幅
遺伝子のクローニングおよび発現を促進した。10ナノグ
ラムの鋳型ＤＮＡを、次のサイクルパラメーターでＰＣ
Ｒ（35サイクル）に使った：95℃で１分、48℃で１分、
72℃で２分。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動により単離し、GeneClean (Bio101, La Jolla,
カリフォルニア）により精製し、EcoRI とBamHI で消化
し、そしてpGEX-3X 中に連結せしめた。組換えプラスミ
ドpGEX-flaA を用いてＥ．コリ DH5αを形質転換せしめ
た。こうして融合タンパク質の発現は、イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）により誘導可
能であるtac プロモーターの支配下にあるだろう。
【００６２】FlaA 融合タンパク質は次のようにして単
離した：Ｅ．コリ(pGEX/flaA) の誘導培養物250 mlを遠
心し（6,000 ×g 、10分、４℃）、細菌ペレットを5 ml
のリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS, pH 7.2) ／1% Triton 中
に再懸濁し、超音波処理し、そして遠心した（10,000×
g 、20分、４℃）。ペレットをPBS/Triton中に再懸濁
し、超音波処理し、再遠心した。この操作を４回繰り返
した。こうして、SDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(SDS-PAGE)およびイムノブロッティングにより観察す
ると、総タンパク質含量の90％以上がGst-FlaAから成る
不溶性ペレットが得られた。この材料を免疫処置に使っ
た。Biotrap (Schleicher and Schuell, Dassel,ドイ
ツ) 中でSDS −ポリアクリルアミドゲルから電気溶出さ
せたGst-FlaAは可溶性であり、これをELISA （下記参
照）に使った。タンパク質濃度はタンパク質アッセイ試
薬（Pierce, Rockford, イリノイ州）を使って決定する
か、またはSDS-PAGEを使った標準量の低分子量マーカー
(Pharmacia)との比較により評価した。
離した：Ｅ．コリ(pGEX/flaA) の誘導培養物250 mlを遠
心し（6,000 ×g 、10分、４℃）、細菌ペレットを5 ml
のリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS, pH 7.2) ／1% Triton 中
に再懸濁し、超音波処理し、そして遠心した（10,000×
g 、20分、４℃）。ペレットをPBS/Triton中に再懸濁
し、超音波処理し、再遠心した。この操作を４回繰り返
した。こうして、SDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(SDS-PAGE)およびイムノブロッティングにより観察す
ると、総タンパク質含量の90％以上がGst-FlaAから成る
不溶性ペレットが得られた。この材料を免疫処置に使っ
た。Biotrap (Schleicher and Schuell, Dassel,ドイ
ツ) 中でSDS −ポリアクリルアミドゲルから電気溶出さ
せたGst-FlaAは可溶性であり、これをELISA （下記参
照）に使った。タンパク質濃度はタンパク質アッセイ試
薬（Pierce, Rockford, イリノイ州）を使って決定する
か、またはSDS-PAGEを使った標準量の低分子量マーカー
(Pharmacia)との比較により評価した。
【００６３】3.1.4. OF-1マウスの予防接種およびチャ
レンジ 表４に概略されるスケジュールによりマウスを免疫処置
およびチャレンジした。ここでＮはグループあたりのマ
ウスの数であり；ipはフロイント不完全アジュバントを
用いた腹腔内予防接種を意味し；o+は10μg のコレラ毒
素の存在下での経口予防接種を意味し；o-はコレラ毒素
を使わない経口予防接種を意味する。チャレンジ実験に
ついては、用量は胃内投与され、108 個の対数期Ｔ．ヒ
オジセンテリエ C5 株 (T.hyo)または培地(TSB) を含ん
だ。
レンジ 表４に概略されるスケジュールによりマウスを免疫処置
およびチャレンジした。ここでＮはグループあたりのマ
ウスの数であり；ipはフロイント不完全アジュバントを
用いた腹腔内予防接種を意味し；o+は10μg のコレラ毒
素の存在下での経口予防接種を意味し；o-はコレラ毒素
を使わない経口予防接種を意味する。チャレンジ実験に
ついては、用量は胃内投与され、108 個の対数期Ｔ．ヒ
オジセンテリエ C5 株 (T.hyo)または培地(TSB) を含ん
だ。
【００６４】
【表４】
【００６５】腹腔内(i.p.)免疫処置は、第５週齢におい
て0.3 mlのフロイント不完全アジュバント中の15μg の
Gst またはGst-FlaAを使って行った。３週間後、マウス
にフロイント不完全アジュバント中の同量のタンパク質
をi.p.追加免疫し、あるいは100 μg のGst もしくは1
mgのGst-FlaAを含み10μg のコレラ毒素(CT ; C-3012,
Sigma, St Louis, Mo.) を含むかまたは含まない0.2M N
a2HCO3 1.0mlを胃内投与した。７日後、マウスに108 個
のＴ．ヒオジセンテリエを胃内投与することによりチャ
レンジした。12日後、頸部脱臼によりマウスを犠牲にし
て盲腸におけるＴ．ヒオジセンテリエ感染の徴候、即ち
カタル性炎症、過剰の管内粘液、水腫、充血および萎
縮、を評価した。盲腸の病変に０〜３の等級を付けた：
て0.3 mlのフロイント不完全アジュバント中の15μg の
Gst またはGst-FlaAを使って行った。３週間後、マウス
にフロイント不完全アジュバント中の同量のタンパク質
をi.p.追加免疫し、あるいは100 μg のGst もしくは1
mgのGst-FlaAを含み10μg のコレラ毒素(CT ; C-3012,
Sigma, St Louis, Mo.) を含むかまたは含まない0.2M N
a2HCO3 1.0mlを胃内投与した。７日後、マウスに108 個
のＴ．ヒオジセンテリエを胃内投与することによりチャ
レンジした。12日後、頸部脱臼によりマウスを犠牲にし
て盲腸におけるＴ．ヒオジセンテリエ感染の徴候、即ち
カタル性炎症、過剰の管内粘液、水腫、充血および萎
縮、を評価した。盲腸の病変に０〜３の等級を付けた：
【００６６】等級０は病変が無いことを表し；等級１は
弱い病変を示し；等級２は中程度の病変を示し；そして
等級３は重度の病変を示す。盲腸の内容物の連続希釈液
を培養し、盲腸材料１グラムあたりのＴ．ヒオジセンテ
リエのコロニー形成単位(cfu) を測定した。
弱い病変を示し；等級２は中程度の病変を示し；そして
等級３は重度の病変を示す。盲腸の内容物の連続希釈液
を培養し、盲腸材料１グラムあたりのＴ．ヒオジセンテ
リエのコロニー形成単位(cfu) を測定した。
【００６７】3.1.5. 血清の収集および腸ホモジネート
の調製 各グループの５匹のマウスから、第０日と第21日におい
て眼窩穿刺により得られた血液から血清を調製した。そ
れらのマウスを第29日に頸部脱臼により犠牲にし、腸ホ
モジネートを調製した。0.1 mg/ml の大豆トリプシンイ
ンヒビター(Sigma) を含む50 mM EDTAの氷冷溶液 5ml中
で腸全体をホモジナイズし、次いで４℃にて6,000 ×g
で10分間遠心した。2 mlの上清を収集し、それに95％エ
タノール中の100mM フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド(PMSF) 20 μl を添加し、そして試料を13,000×g で
30分間遠心した。上清1.5 mlに、15μl の100mM PMSFと
15μl の1 ％アジ化ナトリウム(Sigma) を添加し、この
溶液を室温で10分間置いておいた。次いで100 μl のウ
シ胎児血清を添加し、試料を−20℃で保存した。
の調製 各グループの５匹のマウスから、第０日と第21日におい
て眼窩穿刺により得られた血液から血清を調製した。そ
れらのマウスを第29日に頸部脱臼により犠牲にし、腸ホ
モジネートを調製した。0.1 mg/ml の大豆トリプシンイ
ンヒビター(Sigma) を含む50 mM EDTAの氷冷溶液 5ml中
で腸全体をホモジナイズし、次いで４℃にて6,000 ×g
で10分間遠心した。2 mlの上清を収集し、それに95％エ
タノール中の100mM フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド(PMSF) 20 μl を添加し、そして試料を13,000×g で
30分間遠心した。上清1.5 mlに、15μl の100mM PMSFと
15μl の1 ％アジ化ナトリウム(Sigma) を添加し、この
溶液を室温で10分間置いておいた。次いで100 μl のウ
シ胎児血清を添加し、試料を−20℃で保存した。
【００６８】3.1.6. 電気泳動、ウエスタンブロッティ
ングおよびELISA 実施例１に記載した通りに、12.5% SDS-PAGE上でタンパ
ク質を分離し、ニトロセルロース紙に移行せしめ、特異
抗体を使って検出した。Gst またはGst-FlaAに対する抗
体をELISA により決定した。96ウエルのポリスチレン製
ミクロタイタープレート（Greiner, Alphen a/d Rijn,
オランダ）を、予め決定された最適量の、上記のように
得られた可溶性Gst またはGst-FlaAを炭酸緩衝液 pH 9.
6 中に含有する溶液0.1 mlで一晩コーティングした。PB
S/0.1% Tween 20 (PBST)で２回ウエルを洗浄した。1:20
希釈血清試料または未希釈の腸洗浄液の４倍希釈液をPB
ST中で作り、コーティングしたウエル中で37℃にて１時
間インキュベートした。該ウエルを水道水／0.01% Twee
n 20で３回洗浄し、そして1:1000希釈されたペルオキシ
ダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG またはペルオキシダーゼ接
合ヤギ抗マウスIgAを添加した。プレートを更に37℃で
１時間インキュベートした。水道水／0.01%Tween 20で
３回ウエルを洗浄した。50 mg の２，２′−アジノ−ビ
ス（３′−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸
を含む調製したばかりの溶液100 μlと0.1M Na2HPO4-0.
05Mクエン酸 100ml中の30% H2O2 25 μl とを添加する
ことにより基質反応を行った。室温で30分間インキュベ
ーション後、405 nmでの光学濃度を測定した。非免疫処
置マウスのOD405 の２倍を与える最大血清希釈度として
力価を定義した。
ングおよびELISA 実施例１に記載した通りに、12.5% SDS-PAGE上でタンパ
ク質を分離し、ニトロセルロース紙に移行せしめ、特異
抗体を使って検出した。Gst またはGst-FlaAに対する抗
体をELISA により決定した。96ウエルのポリスチレン製
ミクロタイタープレート（Greiner, Alphen a/d Rijn,
オランダ）を、予め決定された最適量の、上記のように
得られた可溶性Gst またはGst-FlaAを炭酸緩衝液 pH 9.
6 中に含有する溶液0.1 mlで一晩コーティングした。PB
S/0.1% Tween 20 (PBST)で２回ウエルを洗浄した。1:20
希釈血清試料または未希釈の腸洗浄液の４倍希釈液をPB
ST中で作り、コーティングしたウエル中で37℃にて１時
間インキュベートした。該ウエルを水道水／0.01% Twee
n 20で３回洗浄し、そして1:1000希釈されたペルオキシ
ダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG またはペルオキシダーゼ接
合ヤギ抗マウスIgAを添加した。プレートを更に37℃で
１時間インキュベートした。水道水／0.01%Tween 20で
３回ウエルを洗浄した。50 mg の２，２′−アジノ−ビ
ス（３′−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸
を含む調製したばかりの溶液100 μlと0.1M Na2HPO4-0.
05Mクエン酸 100ml中の30% H2O2 25 μl とを添加する
ことにより基質反応を行った。室温で30分間インキュベ
ーション後、405 nmでの光学濃度を測定した。非免疫処
置マウスのOD405 の２倍を与える最大血清希釈度として
力価を定義した。
【００６９】3.2. 結果 3.2.1. 組換えタンパク質の生産および精製 組換えGst およびGst-FlaAをＥ．コリから精製し、SDS-
PAGEとイムノブロッティング（それぞれ図８のパネルＡ
とＢ）により分析して該調製物の純度を決定した。Gst
の調製物中には全く汚染タンパク質が検出されなかっ
た。イムノブロットにおいて、それらの調製物中の全て
のタンパク質バンドがGst に対する特異的抗血清と反応
した（パネルＢ、レーン１）。Gst-FlaAの調製物は、ク
ーマシーブリリアントブルー染色したSDS −ポリアクリ
ルアミドゲル上に主要な68 kDaバンドと低分子量のかす
かなバンドを含んだ。その小さいタンパク質の大部分
は、Gst に対する抗血清と反応するので（パネルＢ、レ
ーン２）、Gst-FlaA融合生成物の分解産物である。
PAGEとイムノブロッティング（それぞれ図８のパネルＡ
とＢ）により分析して該調製物の純度を決定した。Gst
の調製物中には全く汚染タンパク質が検出されなかっ
た。イムノブロットにおいて、それらの調製物中の全て
のタンパク質バンドがGst に対する特異的抗血清と反応
した（パネルＢ、レーン１）。Gst-FlaAの調製物は、ク
ーマシーブリリアントブルー染色したSDS −ポリアクリ
ルアミドゲル上に主要な68 kDaバンドと低分子量のかす
かなバンドを含んだ。その小さいタンパク質の大部分
は、Gst に対する抗血清と反応するので（パネルＢ、レ
ーン２）、Gst-FlaA融合生成物の分解産物である。
【００７０】3.2.2. Ｔ．ヒオジセンテリエ組換えタン
パク質に対する抗体応答 フロイント不完全アジュバント中でのGst またはGst-Fl
aAのi.p.投与に次いでフロイント不完全アジュバント中
の抗原のi.p.追加免疫またはコレラ毒素の存在下での経
口追加免疫に対するマウスの免疫応答を調べた。表５に
おいて、グループは表４中に定義されたものと同じであ
り、結果は５匹のマウスのグループあたりの平均抗体価
として表される。
パク質に対する抗体応答 フロイント不完全アジュバント中でのGst またはGst-Fl
aAのi.p.投与に次いでフロイント不完全アジュバント中
の抗原のi.p.追加免疫またはコレラ毒素の存在下での経
口追加免疫に対するマウスの免疫応答を調べた。表５に
おいて、グループは表４中に定義されたものと同じであ
り、結果は５匹のマウスのグループあたりの平均抗体価
として表される。
【００７１】
【表５】
【００７２】表５から、Gst-FlaAでのi.p.免疫処置に次
ぐi.p.追加免疫が、Gst-FlaAに特異的な血清IgG 抗体と
腸IgA 抗体の両方を検出可能なレベルで誘導したと結論
づけることができる。i.p.感作後にコレラ毒素の存在下
で経口追加免疫すると、血清IgG 抗体応答は有意に低
く、特異的IgA は検出できなかった。CTの非存在下での
Gst-FlaAの経口追加免疫は、IgA およびIgG 力価に対し
て同様な効果を有した。非免疫処置マウスでは、血清中
にも腸内にも特異抗体は全く検出されなかった。
ぐi.p.追加免疫が、Gst-FlaAに特異的な血清IgG 抗体と
腸IgA 抗体の両方を検出可能なレベルで誘導したと結論
づけることができる。i.p.感作後にコレラ毒素の存在下
で経口追加免疫すると、血清IgG 抗体応答は有意に低
く、特異的IgA は検出できなかった。CTの非存在下での
Gst-FlaAの経口追加免疫は、IgA およびIgG 力価に対し
て同様な効果を有した。非免疫処置マウスでは、血清中
にも腸内にも特異抗体は全く検出されなかった。
【００７３】3.2.3. Ｔ．ヒオジセンテリエによるチャ
レンジ 保護におけるフラジェリンの役割を決定づけるために、
免疫処置マウスおよび対照マウスをＴ．ヒオジセンテリ
エにより経口的にチャレンジし、盲腸における病変の存
在を評価した（表６）。表６のグループ番号は表４のも
のと一致する。各グループは７匹のマウスから成った。
結果はグループ平均盲腸得点±標準偏差として表され
る。
レンジ 保護におけるフラジェリンの役割を決定づけるために、
免疫処置マウスおよび対照マウスをＴ．ヒオジセンテリ
エにより経口的にチャレンジし、盲腸における病変の存
在を評価した（表６）。表６のグループ番号は表４のも
のと一致する。各グループは７匹のマウスから成った。
結果はグループ平均盲腸得点±標準偏差として表され
る。
【００７４】
【表６】
【００７５】非免疫処置マウス（グループ１）または G
st（グループ３と４）もしくは水（グループ７）で免疫
処置されたマウスは、中程度から重度の盲腸病変を有し
た。Gst-FlaAで２回i.p.免疫処置したマウス（グループ
５）では盲腸はあまり冒されなかった。Gst-FlaAでi.p.
免疫処置しそしてコレラ毒素の存在下で抗原により経口
追加免疫したマウスは、対照グループにおいて観察され
たものと同等の盲腸病変を有した（グループ６）。Gst-
FlaAでi.p.感作しそしてコレラ毒素の非存在下でGst-Fl
aAにより経口追加免疫したマウスは、Ｔ．ヒオジセンテ
リエによるその後のチャレンジに対して全く保護されな
かった（グループ８）。培地を接種した非免疫処置マウ
スは盲腸病変を持たなかった（グループ２）。
st（グループ３と４）もしくは水（グループ７）で免疫
処置されたマウスは、中程度から重度の盲腸病変を有し
た。Gst-FlaAで２回i.p.免疫処置したマウス（グループ
５）では盲腸はあまり冒されなかった。Gst-FlaAでi.p.
免疫処置しそしてコレラ毒素の存在下で抗原により経口
追加免疫したマウスは、対照グループにおいて観察され
たものと同等の盲腸病変を有した（グループ６）。Gst-
FlaAでi.p.感作しそしてコレラ毒素の非存在下でGst-Fl
aAにより経口追加免疫したマウスは、Ｔ．ヒオジセンテ
リエによるその後のチャレンジに対して全く保護されな
かった（グループ８）。培地を接種した非免疫処置マウ
スは盲腸病変を持たなかった（グループ２）。
【００７６】実施例４：Ｔ．ヒオジセンテリエ抗原を発
現する弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムによる
マウスの免疫処置 4.1. 材料および方法 4.1.1. 菌株 マウスにＴ．ヒオジセンテリエ抗原を運ぶのに使ったビ
ヒクルは、B.A.D. Stockerにより提供されたaroA変異体
であるサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhi
murium）SL3261、およびΔcya Δcrp Δasd 変異体であ
るＳ．チフィムリウムX3897 であった。X3987 はβ−ア
スパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの染色体
遺伝子の欠失（Δasd ）を有し、そのため細胞壁の必須
構成成分であるジアミノピメリン酸(DAP) の不在下で増
殖することができない。Ｅ．コリDH5αF ′(Bethesda R
esearch Laboratories Life Technologies, Inc., Gait
hersburg,メリーランド州) をプラスミドＤＮＡの形質
転換受容体として使った。Ｅ．コリΔasd X6097 をプラ
スミドpYA292およびその誘導体の中間受容体として使っ
た。
現する弱毒化されたサルモネラ・チフィムリウムによる
マウスの免疫処置 4.1. 材料および方法 4.1.1. 菌株 マウスにＴ．ヒオジセンテリエ抗原を運ぶのに使ったビ
ヒクルは、B.A.D. Stockerにより提供されたaroA変異体
であるサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhi
murium）SL3261、およびΔcya Δcrp Δasd 変異体であ
るＳ．チフィムリウムX3897 であった。X3987 はβ−ア
スパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの染色体
遺伝子の欠失（Δasd ）を有し、そのため細胞壁の必須
構成成分であるジアミノピメリン酸(DAP) の不在下で増
殖することができない。Ｅ．コリDH5αF ′(Bethesda R
esearch Laboratories Life Technologies, Inc., Gait
hersburg,メリーランド州) をプラスミドＤＮＡの形質
転換受容体として使った。Ｅ．コリΔasd X6097 をプラ
スミドpYA292およびその誘導体の中間受容体として使っ
た。
【００７７】4.1.2. 培養条件 Ｓ．チフィムリウムおよびＥ．コリを、適宜50μg/mlの
カナマイシンまたは100 μg/mlのアンピシリンを含むLB
ブロス中またはLBプレート上で増殖させた〔J.Sambroo
k, E.F. Fritsch およびT. Maniatis, 1989, Molecular
Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 〕。Ｓ．チフ
ィムリウムによる経口免疫処置のための接種材料は、50
0 mlのLB（適当な抗生物質を含む）中で37℃にて一晩菌
株を振盪(200 rpm) 培養することにより調製した。細胞
を遠心（10,000×g, 10 分, 4 ℃）により収得し、1 ml
あたり約1010コロニー形成単位(cfu) の濃度を与えるよ
うに2 mlのPBS, pH 7.2 中に再懸濁した。
カナマイシンまたは100 μg/mlのアンピシリンを含むLB
ブロス中またはLBプレート上で増殖させた〔J.Sambroo
k, E.F. Fritsch およびT. Maniatis, 1989, Molecular
Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 〕。Ｓ．チフ
ィムリウムによる経口免疫処置のための接種材料は、50
0 mlのLB（適当な抗生物質を含む）中で37℃にて一晩菌
株を振盪(200 rpm) 培養することにより調製した。細胞
を遠心（10,000×g, 10 分, 4 ℃）により収得し、1 ml
あたり約1010コロニー形成単位(cfu) の濃度を与えるよ
うに2 mlのPBS, pH 7.2 中に再懸濁した。
【００７８】4.1.3. プラスミド プラスミドpGEX-3X (Pharmacia) は、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性 tacプロモ
ーターの支配下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ(Gst) 遺伝子を担持している。プラスミドpUX2（Amer
sham, Buckinghamshire,イギリス）は、β−ガラクトシ
ダーゼをコードしそしてcro-c1857 遺伝子により温度調
節される。プラスミドpYA292は、クローニングされる抗
原がPtrcプロモーターの支配下に置かれるasd + クロー
ニングベクターである〔Nakayama, K., S.M. Kellyおよ
びR. Curtiss, III. 1988, "Construction of an Asd+
expression-cloning vector: stable maintenance and
high level expression ofcloned genes in a Salmone
lla vaccine strain", Bio/Tech., 6:693-697〕。該ベ
クターはX3987 の染色体Δasd 欠失を補完し、よってDA
P の非存在下で、例えばDAP が存在しない哺乳動物中で
増殖させるとX3987 中に安定に維持される。プラスミド
pUC108.2は、プラスミドpSC105〔N.G. Stoker, N.F. Fa
irweather およびB.G. Spratt, 1982, "Versatile low-
copy-number plasmid vectors for cloning in Escher
ichia coli", Gene 18:335-341〕の誘導体であるプラス
ミドpLG338中にクローニングされたpUC8.2〔Z. Hanna,
C. Fregau, G. Prefontaine およびR. Brousseau, 198
4, "Construction of a family of universal expressi
on plasmid vectors", Gene30:247-250〕からのLacZα
遺伝子の第一塩基および多重クローニング部位を含む。
このプラスミドは細胞あたり６〜８コピーにおいて存在
する。発現はlac プロモーターからである。
−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性 tacプロモ
ーターの支配下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ(Gst) 遺伝子を担持している。プラスミドpUX2（Amer
sham, Buckinghamshire,イギリス）は、β−ガラクトシ
ダーゼをコードしそしてcro-c1857 遺伝子により温度調
節される。プラスミドpYA292は、クローニングされる抗
原がPtrcプロモーターの支配下に置かれるasd + クロー
ニングベクターである〔Nakayama, K., S.M. Kellyおよ
びR. Curtiss, III. 1988, "Construction of an Asd+
expression-cloning vector: stable maintenance and
high level expression ofcloned genes in a Salmone
lla vaccine strain", Bio/Tech., 6:693-697〕。該ベ
クターはX3987 の染色体Δasd 欠失を補完し、よってDA
P の非存在下で、例えばDAP が存在しない哺乳動物中で
増殖させるとX3987 中に安定に維持される。プラスミド
pUC108.2は、プラスミドpSC105〔N.G. Stoker, N.F. Fa
irweather およびB.G. Spratt, 1982, "Versatile low-
copy-number plasmid vectors for cloning in Escher
ichia coli", Gene 18:335-341〕の誘導体であるプラス
ミドpLG338中にクローニングされたpUC8.2〔Z. Hanna,
C. Fregau, G. Prefontaine およびR. Brousseau, 198
4, "Construction of a family of universal expressi
on plasmid vectors", Gene30:247-250〕からのLacZα
遺伝子の第一塩基および多重クローニング部位を含む。
このプラスミドは細胞あたり６〜８コピーにおいて存在
する。発現はlac プロモーターからである。
【００７９】4.1.4. Ｔ．ヒオジセンテリエ鞭毛鞘遺伝
子を含むベクターの作製 上述したようにＴ．ヒオジセンテリエの鞭毛鞘タンパク
質遺伝子flaAをクローニングし、そしてそれらのヌクレ
オチド配列を決定した。実施例１および２に記載の通り
に染色体ＤＮＡを単離した。flaA遺伝子を含むファージ
λfla6 10ナノグラムをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) に
使って着目の遺伝子の全解読枠を含むＤＮＡ断片を得
た。増幅に使ったオリゴヌクレオチド（Pharmacia, Woe
rden, オランダ）は、flaAの既知ヌクレオチド配列に基
づいており、クローニングと発現を容易にするためにBa
mHI またはEcoRI 制限酵素消化部位を含むリンカー配列
により隣接させた。プライマー 5′TTAACAAACTCAACTTTG
3′（配列番号１のヌクレオチド160-177 ）および 5′
TTATTGAGCTTGTTCTT 3′（配列番号１のヌクレオチド10
49-1065 ）を使って、flaA遺伝子断片を含む配列を増幅
せしめた。サイクルパラメーターは次のようであった：
95℃で１分、35℃で１分および72℃で２分。PCR 増幅さ
れたＤＮＡ断片をGeneClean により精製し、EcoRI とBa
mHI で消化し、そしてプラスミドpYA292, pLUC108.2, p
GEX-3XおよびpUEX2 中に連結せしめた。pYA292中では未
融合タンパク質がコードされる。pLUC108.2 ではlacZα
ペプチドとの融合体(1.2 kD)が作られ、一方pGEX-3X で
はGst との融合体(27.5 kD) が作られ、そしてpUEX2 で
はβ−ガラクトシダーゼとの融合体(116 kD)が作られ
る。
子を含むベクターの作製 上述したようにＴ．ヒオジセンテリエの鞭毛鞘タンパク
質遺伝子flaAをクローニングし、そしてそれらのヌクレ
オチド配列を決定した。実施例１および２に記載の通り
に染色体ＤＮＡを単離した。flaA遺伝子を含むファージ
λfla6 10ナノグラムをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) に
使って着目の遺伝子の全解読枠を含むＤＮＡ断片を得
た。増幅に使ったオリゴヌクレオチド（Pharmacia, Woe
rden, オランダ）は、flaAの既知ヌクレオチド配列に基
づいており、クローニングと発現を容易にするためにBa
mHI またはEcoRI 制限酵素消化部位を含むリンカー配列
により隣接させた。プライマー 5′TTAACAAACTCAACTTTG
3′（配列番号１のヌクレオチド160-177 ）および 5′
TTATTGAGCTTGTTCTT 3′（配列番号１のヌクレオチド10
49-1065 ）を使って、flaA遺伝子断片を含む配列を増幅
せしめた。サイクルパラメーターは次のようであった：
95℃で１分、35℃で１分および72℃で２分。PCR 増幅さ
れたＤＮＡ断片をGeneClean により精製し、EcoRI とBa
mHI で消化し、そしてプラスミドpYA292, pLUC108.2, p
GEX-3XおよびpUEX2 中に連結せしめた。pYA292中では未
融合タンパク質がコードされる。pLUC108.2 ではlacZα
ペプチドとの融合体(1.2 kD)が作られ、一方pGEX-3X で
はGst との融合体(27.5 kD) が作られ、そしてpUEX2 で
はβ−ガラクトシダーゼとの融合体(116 kD)が作られ
る。
【００８０】4.1.5. Ｅ．コリおよびＳ．チフィムリウ
ムの遺伝子操作 flaAを含む組換えプラスミドを用いてエレクトロポレー
ション（W.J. Dower,J.F. Miller およびW. Ragsdale,
1988, "High efficiency transformation ofE. coli by
high voltage electroporation" Nucleic Acids Res.
13:6127-6144）によりＥ．コリを形質せしめた。組換え
鞘フラジェリン(FlaA)のプラスミド生産物を塩化セシウ
ム密度勾配遠心によりＥ．コリから精製し、そしてエレ
クトロポレーションによるＳ．チフィムリウムの形質転
換に使った。形質転換体を抗生物質耐性（pLUC108.2, p
GEX-3X, pUEX2 ）またはDAP の非存在下での増殖（pYA2
92）についてスクリーニングした。リン酸塩緩衝化塩溶
液, pH 7.0 (PBS)中で１回洗浄した40 ml の一晩培養物
からの50μl のイムノブロット分析によって組換えFlaA
生産について形質転換体を試験した。Ｓ．チフィムリウ
ムのエレクトロポレーションがラフ変異体について選択
されなかったことを確かめるために、SDS-PAGEと銀染色
により形質転換体のLPS プロフィールを調べた（P.J. H
itchcockおよびT.M. Brown, 1983, Morphological hete
rogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chem
otypes in silver-stained polyacrylamide gels", J.
Bacteriol.154:269-277 ）。
ムの遺伝子操作 flaAを含む組換えプラスミドを用いてエレクトロポレー
ション（W.J. Dower,J.F. Miller およびW. Ragsdale,
1988, "High efficiency transformation ofE. coli by
high voltage electroporation" Nucleic Acids Res.
13:6127-6144）によりＥ．コリを形質せしめた。組換え
鞘フラジェリン(FlaA)のプラスミド生産物を塩化セシウ
ム密度勾配遠心によりＥ．コリから精製し、そしてエレ
クトロポレーションによるＳ．チフィムリウムの形質転
換に使った。形質転換体を抗生物質耐性（pLUC108.2, p
GEX-3X, pUEX2 ）またはDAP の非存在下での増殖（pYA2
92）についてスクリーニングした。リン酸塩緩衝化塩溶
液, pH 7.0 (PBS)中で１回洗浄した40 ml の一晩培養物
からの50μl のイムノブロット分析によって組換えFlaA
生産について形質転換体を試験した。Ｓ．チフィムリウ
ムのエレクトロポレーションがラフ変異体について選択
されなかったことを確かめるために、SDS-PAGEと銀染色
により形質転換体のLPS プロフィールを調べた（P.J. H
itchcockおよびT.M. Brown, 1983, Morphological hete
rogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chem
otypes in silver-stained polyacrylamide gels", J.
Bacteriol.154:269-277 ）。
【００８１】4.1.6. プラスミドの試験管内安定性 LBブロス中でのＳ．チフィムリウム形質転換体の一晩培
養物を新鮮培地で100倍希釈し、そして更に８時間イン
キュベートした。次いで、それらの培養物を再び新鮮培
地中で100 倍希釈し、一晩インキュベートした。各継代
培養物の連続希釈液を、適当な抗生物質を含有するかま
たは不含有であるLBプレート上に塗布した。
養物を新鮮培地で100倍希釈し、そして更に８時間イン
キュベートした。次いで、それらの培養物を再び新鮮培
地中で100 倍希釈し、一晩インキュベートした。各継代
培養物の連続希釈液を、適当な抗生物質を含有するかま
たは不含有であるLBプレート上に塗布した。
【００８２】4.1.7. マウスの免疫処置、マウス器官に
おける細菌の計数、血清および腸洗浄液の収集 10週齢の雌のBALB/cマウスに、注射針を使って第０日と
第21日に1010 cfuのＳ．チフィムリウムワクチン株を経
口投与した。最初の投与の７，14および21日後に３匹の
動物のグループを犠牲にし、肝臓および脾臓中に存在す
るサルモネラ菌の数を測定した。肝臓および脾臓を滅菌
蒸留水中でストマッカーを使ってホモジナイズした。そ
れらのホモジネートにおいて抗生物質が補足されたまた
は抗生物質を含まないLBプレート上で二重反復試験にお
いて生存数をカウントし、pLUC108.2, pGEX-3XまたはpU
EX2 プラスミドを含む菌株により免疫処置されたマウス
から回収したコロニーにおける組換えプラスミドの保有
を決定した。それらの組換えＳ．チフィムリウム中での
FlaAの発現を調べた。ニトロセルロースフィルター（Hy
bond C, Amersham）をLBプレート上に載せ、回収した細
胞をニトロセルロース上に画線培養した。37℃で一晩イ
ンキュベートした後、フィルターを取り上げ、クロロホ
ルム蒸気に１時間暴露し、そして0.05% Tween を含むPB
S 中で４回洗浄した。該フィルターの免疫スクリーニン
グは、イムノブロットを使った場合と同様にFlaAに対す
る特異的抗血清を使って行った（下記参照）。第42日に
犠牲にしたマウスにおいて、Ｓ．チフィムリウムおよび
Ｔ．ヒオジセンテリエ抗原に対する血清および腸抗体応
答をELISA により測定した。尾の出血によりまたはハロ
タンで麻酔したマウスからの心臓穿刺により、第一およ
び第二の経口投与の３週間後に血液試料を収集した。血
液を同容量の85mMクエン酸三ナトリウム−65mMクエン酸
の溶液と混合し、6,000 ×g で遠心し、そして上清を−
20℃で保存した。腸試料は、実施例３に記載されたよう
にして細かく切り刻んだ小腸から調製した。
おける細菌の計数、血清および腸洗浄液の収集 10週齢の雌のBALB/cマウスに、注射針を使って第０日と
第21日に1010 cfuのＳ．チフィムリウムワクチン株を経
口投与した。最初の投与の７，14および21日後に３匹の
動物のグループを犠牲にし、肝臓および脾臓中に存在す
るサルモネラ菌の数を測定した。肝臓および脾臓を滅菌
蒸留水中でストマッカーを使ってホモジナイズした。そ
れらのホモジネートにおいて抗生物質が補足されたまた
は抗生物質を含まないLBプレート上で二重反復試験にお
いて生存数をカウントし、pLUC108.2, pGEX-3XまたはpU
EX2 プラスミドを含む菌株により免疫処置されたマウス
から回収したコロニーにおける組換えプラスミドの保有
を決定した。それらの組換えＳ．チフィムリウム中での
FlaAの発現を調べた。ニトロセルロースフィルター（Hy
bond C, Amersham）をLBプレート上に載せ、回収した細
胞をニトロセルロース上に画線培養した。37℃で一晩イ
ンキュベートした後、フィルターを取り上げ、クロロホ
ルム蒸気に１時間暴露し、そして0.05% Tween を含むPB
S 中で４回洗浄した。該フィルターの免疫スクリーニン
グは、イムノブロットを使った場合と同様にFlaAに対す
る特異的抗血清を使って行った（下記参照）。第42日に
犠牲にしたマウスにおいて、Ｓ．チフィムリウムおよび
Ｔ．ヒオジセンテリエ抗原に対する血清および腸抗体応
答をELISA により測定した。尾の出血によりまたはハロ
タンで麻酔したマウスからの心臓穿刺により、第一およ
び第二の経口投与の３週間後に血液試料を収集した。血
液を同容量の85mMクエン酸三ナトリウム−65mMクエン酸
の溶液と混合し、6,000 ×g で遠心し、そして上清を−
20℃で保存した。腸試料は、実施例３に記載されたよう
にして細かく切り刻んだ小腸から調製した。
【００８３】4.1.8. SDS-PAGE、イムノブロッティング
（ウエスタンブロッティング）およびELISA タンパク質を12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分
離し(SDS-PAGE)そしてクーマシーブリリアントブルーR2
50染色により可視化した。ニトロセルロースフィルター
への電気泳動的移行後、タンパク質を上述の通り特異的
抗血清と反応させ、そして結合した抗体をアルカリホス
ファターゼ接合抗体により可視化した。組換えFlaAに特
異的な抗体は実施例３に記載のELISA によって検出し
た。力価は血清の1/750 希釈液または腸ホモジネートの
1/16希釈液のOD405 から、４匹の非免疫処置マウスを使
って得られた平均値を差し引いた値として測定した。
（ウエスタンブロッティング）およびELISA タンパク質を12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分
離し(SDS-PAGE)そしてクーマシーブリリアントブルーR2
50染色により可視化した。ニトロセルロースフィルター
への電気泳動的移行後、タンパク質を上述の通り特異的
抗血清と反応させ、そして結合した抗体をアルカリホス
ファターゼ接合抗体により可視化した。組換えFlaAに特
異的な抗体は実施例３に記載のELISA によって検出し
た。力価は血清の1/750 希釈液または腸ホモジネートの
1/16希釈液のOD405 から、４匹の非免疫処置マウスを使
って得られた平均値を差し引いた値として測定した。
【００８４】4.1.9. 免疫学的試薬 FlaAに対するポリクローナル抗血清は、ウエスタンブロ
ットから単離した変性FlaAでウサギを免疫処置すること
によって調製した。Gst は、実施例３に従って、それら
の抗原を発現しているＥ．コリからのアフィニティーク
ロマトグラフィーによって得られた。100 μg のGst を
フロイント完全アジュバント中に3 mlの最終容量に乳化
し、第０日と第21日にニュージーランド白ウサギに皮下
および筋肉内注射した。第34日に血清を収集し、これを
イムノブロット実験とELISA において使った。
ットから単離した変性FlaAでウサギを免疫処置すること
によって調製した。Gst は、実施例３に従って、それら
の抗原を発現しているＥ．コリからのアフィニティーク
ロマトグラフィーによって得られた。100 μg のGst を
フロイント完全アジュバント中に3 mlの最終容量に乳化
し、第０日と第21日にニュージーランド白ウサギに皮下
および筋肉内注射した。第34日に血清を収集し、これを
イムノブロット実験とELISA において使った。
【００８５】4.2. 結果 4.2.1. 弱毒化されたＳ．チフィムリウムによる組換え
Ｔ．ヒオジセンテリエタンパク質の試験管内発現 Ｔ．ヒオジセンテリエFlaAの合成を指令するプラスミド
を用いてエレクトロポレーションによりＳ．チフィムリ
ウムSL3261（プラスミドpLUC108.2, pGEX-3X,pUEX2 ）
またはＳ．チフィムリウム X3987（プラスミドpYA292）
を形質転換せしめた。試験した全ての形質転換体は、プ
ロテイナーゼＫ処理された全細胞溶解物のLPS 特異的染
色により評価すると平滑であり（結果は示してない）、
イムノブロッティング（図９）により示されるように組
換えFlaAを発現した。SL3261とX3987 は染色体上にlacI
遺伝子を担持していないので、pGEX-3X, pLUC108.2およ
びpYA292プラスミドでのタンパク質発現は構成的であ
る。pUEX2 プラスミドを含む細菌による異種抗原の発現
も同様に、それらの細菌が許容温度で増殖しなかったた
め、構成的であった。pLUC108.2, pYA292, pGEX-3Xおよ
びpUEX2 によりコードされる組換えFlaA（融合）タンパ
ク質の分子量は、それぞれ40, 39, 66および156 kDa で
ある（図９）。発現レベルの重大な相違が観察された。
pGEX-3X ではFlaA合成はイムノブロット上にかろうじて
検出することができた。注目すべきなのは、それらの
Ｓ．チフィムリウムが他のサルモネラ菌よりもゆっくり
増殖したことである。明らかにFlaAの発現は宿主に有毒
である。どのワクチン株も持たない場合、クーマシーブ
リリアントブルー染色ゲル上に組換えタンパク質の発現
は検出されなかった。
Ｔ．ヒオジセンテリエタンパク質の試験管内発現 Ｔ．ヒオジセンテリエFlaAの合成を指令するプラスミド
を用いてエレクトロポレーションによりＳ．チフィムリ
ウムSL3261（プラスミドpLUC108.2, pGEX-3X,pUEX2 ）
またはＳ．チフィムリウム X3987（プラスミドpYA292）
を形質転換せしめた。試験した全ての形質転換体は、プ
ロテイナーゼＫ処理された全細胞溶解物のLPS 特異的染
色により評価すると平滑であり（結果は示してない）、
イムノブロッティング（図９）により示されるように組
換えFlaAを発現した。SL3261とX3987 は染色体上にlacI
遺伝子を担持していないので、pGEX-3X, pLUC108.2およ
びpYA292プラスミドでのタンパク質発現は構成的であ
る。pUEX2 プラスミドを含む細菌による異種抗原の発現
も同様に、それらの細菌が許容温度で増殖しなかったた
め、構成的であった。pLUC108.2, pYA292, pGEX-3Xおよ
びpUEX2 によりコードされる組換えFlaA（融合）タンパ
ク質の分子量は、それぞれ40, 39, 66および156 kDa で
ある（図９）。発現レベルの重大な相違が観察された。
pGEX-3X ではFlaA合成はイムノブロット上にかろうじて
検出することができた。注目すべきなのは、それらの
Ｓ．チフィムリウムが他のサルモネラ菌よりもゆっくり
増殖したことである。明らかにFlaAの発現は宿主に有毒
である。どのワクチン株も持たない場合、クーマシーブ
リリアントブルー染色ゲル上に組換えタンパク質の発現
は検出されなかった。
【００８６】プラスミドpYA292はＴ．ヒオジセンテリエ
X3987中で安定に維持される。他のプラスミドの試験管
内安定性を調べるために、抗生物質を含まない培地中で
ワクチン株を繰り返し継代培養した。その継代培養物の
連続希釈液を適当な抗生物質含有または不含有のLBプレ
ート上に塗布すると、抗生物質の存在は、pGEX-3X, pLU
C108.2または誘導体を含有するＴ．ヒオジセンテリエ S
L3261 を使って得られるcfu の数に対して全く有意な影
響を与えなかった。このことは、それらの条件下での宿
主細菌中のそれらのプラスミドの穏当な安定性を証明す
る。
X3987中で安定に維持される。他のプラスミドの試験管
内安定性を調べるために、抗生物質を含まない培地中で
ワクチン株を繰り返し継代培養した。その継代培養物の
連続希釈液を適当な抗生物質含有または不含有のLBプレ
ート上に塗布すると、抗生物質の存在は、pGEX-3X, pLU
C108.2または誘導体を含有するＴ．ヒオジセンテリエ S
L3261 を使って得られるcfu の数に対して全く有意な影
響を与えなかった。このことは、それらの条件下での宿
主細菌中のそれらのプラスミドの穏当な安定性を証明す
る。
【００８７】4.2.2. サルモネラワクチン株により経口
感染されたマウスの肝臓および脾臓のコロニー形成 BALB/cマウスに、組換えFlaAタンパク質を生産するＳ．
チフィムリウム（S. typhimurium）ワクチン株1010 cfu
を経口投与した。感染の７，14および21日後に肝臓およ
び脾臓をワクチン株の存在について調べた（表７）。
感染されたマウスの肝臓および脾臓のコロニー形成 BALB/cマウスに、組換えFlaAタンパク質を生産するＳ．
チフィムリウム（S. typhimurium）ワクチン株1010 cfu
を経口投与した。感染の７，14および21日後に肝臓およ
び脾臓をワクチン株の存在について調べた（表７）。
【００８８】
【表７】
【００８９】表７の結果は、器官あたりのコロニー形成
単位(cfu) として表され、これは適当な抗生物質の存在
下または非存在下で測定した。NDは測定せずを意味す
る。挿入断片を持たないpGEX, pYA292またはpLUCを含む
ワクチン株は、第７日においてのみ観察した。肝臓にお
いて得られた結果が表７に示され、脾臓において得られ
た結果もそれと同様である。第７日にはX3987(pYA292)
が肝臓中に多数認められた（器官あたりそれぞれ3.7 ×
103 以上、および4.5 ×103 以上の細菌）。２匹のマウ
スの肝臓において同様な数のpLUC含有SL3261が検出され
た。第三のマウスでは全くサルモネラが検出されなかっ
た。pGEXを含むＳ．チフィムリウムでは、肝臓あたり10
〜600 の細菌が単離された。pLUC/flaA またはpGEX/fla
A を担持しているサルモネラは肝臓からも脾臓からも再
単離されなかった。SL3261(pGEX/flaA) で免疫処置され
たマウスから単離されたサルモネラ菌を除いて、肝臓お
よび脾臓から単離された全てのサルモネラ菌がクローン
化抗原を発現した。この動物から第７日に単離された全
サルモネラ菌はプラスミドを失っており、一方第14日に
回収されたサルモネラ菌のほぼ半分がプラスミドを含ん
でいなかった。
単位(cfu) として表され、これは適当な抗生物質の存在
下または非存在下で測定した。NDは測定せずを意味す
る。挿入断片を持たないpGEX, pYA292またはpLUCを含む
ワクチン株は、第７日においてのみ観察した。肝臓にお
いて得られた結果が表７に示され、脾臓において得られ
た結果もそれと同様である。第７日にはX3987(pYA292)
が肝臓中に多数認められた（器官あたりそれぞれ3.7 ×
103 以上、および4.5 ×103 以上の細菌）。２匹のマウ
スの肝臓において同様な数のpLUC含有SL3261が検出され
た。第三のマウスでは全くサルモネラが検出されなかっ
た。pGEXを含むＳ．チフィムリウムでは、肝臓あたり10
〜600 の細菌が単離された。pLUC/flaA またはpGEX/fla
A を担持しているサルモネラは肝臓からも脾臓からも再
単離されなかった。SL3261(pGEX/flaA) で免疫処置され
たマウスから単離されたサルモネラ菌を除いて、肝臓お
よび脾臓から単離された全てのサルモネラ菌がクローン
化抗原を発現した。この動物から第７日に単離された全
サルモネラ菌はプラスミドを失っており、一方第14日に
回収されたサルモネラ菌のほぼ半分がプラスミドを含ん
でいなかった。
【００９０】4.2.3. Ｓ．チフィムリウムおよびＴ．ヒ
オジセンテリエ抗原に対するマウス抗体応答 1010個のサルモネラワクチン株の経口追加免疫を受けた
３週間後に殺したマウスからの血清および腸ホモジネー
トを、全サルモネラ超音波処理物に対する抗体、即ち組
換えFlaAについてELISA により分析した。応答の程度は
ワクチン構成物によって変化したけれども、全てのマウ
スが腸ホモジネートにおいて免疫グロブリン抗サルモネ
ラ力価を発揮した（表８）。
オジセンテリエ抗原に対するマウス抗体応答 1010個のサルモネラワクチン株の経口追加免疫を受けた
３週間後に殺したマウスからの血清および腸ホモジネー
トを、全サルモネラ超音波処理物に対する抗体、即ち組
換えFlaAについてELISA により分析した。応答の程度は
ワクチン構成物によって変化したけれども、全てのマウ
スが腸ホモジネートにおいて免疫グロブリン抗サルモネ
ラ力価を発揮した（表８）。
【００９１】
【表８】
【００９２】表８の結果は、各動物グループの４匹のマ
ウスの各々についての1:16希釈腸洗浄液または1:750 希
釈血清試料のOD405 から、４匹の非免疫処置動物で得ら
れた平均値（それぞれ0.207 および0.284 ）を差し引い
たものとして与えられる。３つのpLUC構成物の全てが、
サルモネラ超音波処理物に対する有力な腸抗体応答を誘
導し、一方X3987(pYA292/flaA)により誘導された応答は
X3987(pYA292) と比較すると著しく減少した。pGEXワク
チンに対する応答も同じく異なり、４匹のマウスのうち
の３匹がSL3261(pGEX)およびSL3261(pGEX/flaA) ワクチ
ンに対して貧弱に応答した。
ウスの各々についての1:16希釈腸洗浄液または1:750 希
釈血清試料のOD405 から、４匹の非免疫処置動物で得ら
れた平均値（それぞれ0.207 および0.284 ）を差し引い
たものとして与えられる。３つのpLUC構成物の全てが、
サルモネラ超音波処理物に対する有力な腸抗体応答を誘
導し、一方X3987(pYA292/flaA)により誘導された応答は
X3987(pYA292) と比較すると著しく減少した。pGEXワク
チンに対する応答も同じく異なり、４匹のマウスのうち
の３匹がSL3261(pGEX)およびSL3261(pGEX/flaA) ワクチ
ンに対して貧弱に応答した。
【００９３】腸において認められたのと同様に、サルモ
ネラ超音波処理物に対する血清抗体応答はワクチン構成
物間で異なったが、腸において認められる応答（表８）
の相対的大きさとは直接関連がなかった。最高の血清応
答はX3987(pYA292) またはSL3261(pLUC)により免疫処置
されたマウスにおいて認められ、一方でpGEX誘導体また
はpLUC/flaA を含むSL3261は、非免疫処置動物において
測定された応答よりほんの少し上の血清抗サルモネラ応
答を引き起こした。
ネラ超音波処理物に対する血清抗体応答はワクチン構成
物間で異なったが、腸において認められる応答（表８）
の相対的大きさとは直接関連がなかった。最高の血清応
答はX3987(pYA292) またはSL3261(pLUC)により免疫処置
されたマウスにおいて認められ、一方でpGEX誘導体また
はpLUC/flaA を含むSL3261は、非免疫処置動物において
測定された応答よりほんの少し上の血清抗サルモネラ応
答を引き起こした。
【００９４】
配列番号：１ 配列の長さ：1140 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ 起源 生物名：トレポネーマ・ヒオジセンテリエ(Treponema h
yodysenteriae) 株名：Ｃ５ 直接の起源 細胞系名：CBS 513.91 配列の特徴 特徴：非コード領域 存在位置：１〜102 塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：内鞭毛鞘タンパク質 存在位置： 103〜1062塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：シグナルペプチド 存在位置： 103〜159 塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：成熟内鞭毛鞘タンパク質 存在位置： 159〜1062塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：推定上の−35領域 存在位置：27〜32 特徴：推定上の−10領域 存在位置：50〜55 特徴：推定上のリボソーム結合部位 存在位置：86〜91 配列： TGATTTATTT TTTTGATTAA ATTTGCTTGA CAAATTAAGA AATTTAGTGT 50 ATAAAAGTTG TATTATTATG CTTATTAATT AGTACAAGGA GTGCAATAAA 100 TT ATG AAA AAG TTA TTC GTA GTA TTA ACT TCC ATT TTT ATC GCT 144 Met Lys Lys Leu Phe Val Val Leu Thr Ser Ile Phe Ile Ala 1 5 10 GCA TCT GCT TAC GGT TTA ACA AAC TCA ACT TTG ATT GAT TTT GCT 189 Ala Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Thr Leu Ile Asp Phe Ala 15 20 25 TTA ACA GGT AAT GCT GAT AAC TTA CAA GCT GGA GAA GGT GAT ACA 234 Leu Thr Gly Asn Ala Asp Asn Leu Gln Ala Gly Glu Gly Asp Thr 30 35 40 AAT GAA GTA GTT CCA GTT GCA GAA AAT CTT TAT AAT GAT AAC TGG 279 Asn Glu Val Val Pro Val Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Asp Asn Trp 45 50 55 GTA GTA TGG TTG AAT GAA TCT GCT AGA TTA ACA GAG AAT CGC AGA 324 Val Val Trp Leu Asn Glu Ser Ala Arg Leu Thr Glu Asn Arg Arg 60 65 70 AAT TCT TAT GTT ACT AAC GTA GAC AGT AAA GGT AAC AAC GGT GCT 369 Asn Ser Tyr Val Thr Asn Val Asp Ser Lys Gly Asn Asn Gly Ala 75 80 85 TGG GAA GCA GGT AAA GTT CTT GGT GTA AGA GTA CAT TTC CCA TTA 414 Trp Glu Ala Gly Lys Val Leu Gly Val Arg Val His Phe Pro Leu 90 95 100 GCA GCT TGG AAC AGT TAT GCT TTA GTA AAA CCA GTA TAT GAA CTT 459 Ala Ala Trp Asn Ser Tyr Ala Leu Val Lys Pro Val Tyr Glu Leu 105 110 115 GAA ATG TAT GGC GGT GCT GAT GGT ACT AAA TAT ACA GAA GGT AAA 504 Glu Met Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Thr Lys Tyr Thr Glu Gly Lys 120 125 130 GGT GTT ATA CAT AAC GTT GGC GAA ATC AAA TCT ATT AGT TCT TGG 549 Gly Val Ile His Asn Val Gly Glu Ile Lys Ser Ile Ser Ser Trp 135 140 145 GTT TAT GGA CGT AAC TAT TTA ATT AGT TAT TTC GTA AAC TTA CAA 594 Val Tyr Gly Arg Asn Tyr Leu Ile Ser Tyr Phe Val Asn Leu Gln 150 155 160 AAT GAA TTT GGT GAA TTA AAA TCT TAT CCA ATG GGT ACT GTT TAC 639 Asn Glu Phe Gly Glu Leu Lys Ser Tyr Pro Met Gly Thr Val Tyr 165 170 175 TTC AAC GGT TGG AGA CAA GTA AGA TGG GAA AAC AGA GAA TAC TTA 684 Phe Asn Gly Trp Arg Gln Val Arg Trp Glu Asn Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 CCT AAT GTT CGC GAC AGA GTA TTA GTA AGA GAA CCT CTT TAT CCT 729 Pro Asn Val Arg Asp Arg Val Leu Val Arg Glu Pro Leu Tyr Pro 195 200 205 AGA ATG ATC CCT TCT GTT AAA TTA GAT TCT TTA GGT TTC TAT AGA 774 Arg Met Ile Pro Ser Val Lys Leu Asp Ser Leu Gly Phe Tyr Arg 210 215 220 ACT AAA GAT ACT AAA GGC GGA GAT TTC ATC ACT TAC GTT AAA GAT 819 Thr Lys Asp Thr Lys Gly Gly Asp Phe Ile Thr Tyr Val Lys Asp 225 230 235 GTA ACA CTT GAG TAT GAC GTA GTA GTT GTT GAT TTT GAA GAA GAT 864 Val Thr Leu Glu Tyr Asp Val Val Val Val Asp Phe Glu Glu Asp 240 245 250 ATC GAC GAT GAA GCT ACT TGG CAG TTA TTA AAA ACA GAA AAC GAT 909 Ile Asp Asp Glu Ala Thr Trp Gln Leu Leu Lys Thr Glu Asn Asp 255 260 265 AGA AAA CAA GCT ATC GAA TCT GCT AGA ATA CGT GAA CAA GCT GAG 954 Arg Lys Gln Ala Ile Glu Ser Ala Arg Ile Arg Glu Gln Ala Glu 270 275 280 TTA AGA GAT CTT GAA CAA AGA CGT ATA GGC GAC GGT ACT GCT GCT 999 Leu Arg Asp Leu Glu Gln Arg Arg Ile Gly Asp Gly Thr Ala Ala 285 290 295 GAT CAA GGT GCT GCT GCT AAT ACA GGT GCT GCT GAC ACA GGC GCT 1044 Asp Gln Gly Ala Ala Ala Asn Thr Gly Ala Ala Asp Thr Gly Ala 300 305 310 GCT CAA GAA CAA GCT CAA TAATTAAATT AGTTTGGAAA TAAAAGGCTA 1092 Ala Gln Glu Gln Ala Gln - 315 320 ATTAATAGAT TAAGGGGAAA CTTTAATAGT TTCCCCTTTT TTTATTGT 1140
yodysenteriae) 株名：Ｃ５ 直接の起源 細胞系名：CBS 513.91 配列の特徴 特徴：非コード領域 存在位置：１〜102 塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：内鞭毛鞘タンパク質 存在位置： 103〜1062塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：シグナルペプチド 存在位置： 103〜159 塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：成熟内鞭毛鞘タンパク質 存在位置： 159〜1062塩基対 他の情報：転写解読枠 特徴：推定上の−35領域 存在位置：27〜32 特徴：推定上の−10領域 存在位置：50〜55 特徴：推定上のリボソーム結合部位 存在位置：86〜91 配列： TGATTTATTT TTTTGATTAA ATTTGCTTGA CAAATTAAGA AATTTAGTGT 50 ATAAAAGTTG TATTATTATG CTTATTAATT AGTACAAGGA GTGCAATAAA 100 TT ATG AAA AAG TTA TTC GTA GTA TTA ACT TCC ATT TTT ATC GCT 144 Met Lys Lys Leu Phe Val Val Leu Thr Ser Ile Phe Ile Ala 1 5 10 GCA TCT GCT TAC GGT TTA ACA AAC TCA ACT TTG ATT GAT TTT GCT 189 Ala Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Thr Leu Ile Asp Phe Ala 15 20 25 TTA ACA GGT AAT GCT GAT AAC TTA CAA GCT GGA GAA GGT GAT ACA 234 Leu Thr Gly Asn Ala Asp Asn Leu Gln Ala Gly Glu Gly Asp Thr 30 35 40 AAT GAA GTA GTT CCA GTT GCA GAA AAT CTT TAT AAT GAT AAC TGG 279 Asn Glu Val Val Pro Val Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Asp Asn Trp 45 50 55 GTA GTA TGG TTG AAT GAA TCT GCT AGA TTA ACA GAG AAT CGC AGA 324 Val Val Trp Leu Asn Glu Ser Ala Arg Leu Thr Glu Asn Arg Arg 60 65 70 AAT TCT TAT GTT ACT AAC GTA GAC AGT AAA GGT AAC AAC GGT GCT 369 Asn Ser Tyr Val Thr Asn Val Asp Ser Lys Gly Asn Asn Gly Ala 75 80 85 TGG GAA GCA GGT AAA GTT CTT GGT GTA AGA GTA CAT TTC CCA TTA 414 Trp Glu Ala Gly Lys Val Leu Gly Val Arg Val His Phe Pro Leu 90 95 100 GCA GCT TGG AAC AGT TAT GCT TTA GTA AAA CCA GTA TAT GAA CTT 459 Ala Ala Trp Asn Ser Tyr Ala Leu Val Lys Pro Val Tyr Glu Leu 105 110 115 GAA ATG TAT GGC GGT GCT GAT GGT ACT AAA TAT ACA GAA GGT AAA 504 Glu Met Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Thr Lys Tyr Thr Glu Gly Lys 120 125 130 GGT GTT ATA CAT AAC GTT GGC GAA ATC AAA TCT ATT AGT TCT TGG 549 Gly Val Ile His Asn Val Gly Glu Ile Lys Ser Ile Ser Ser Trp 135 140 145 GTT TAT GGA CGT AAC TAT TTA ATT AGT TAT TTC GTA AAC TTA CAA 594 Val Tyr Gly Arg Asn Tyr Leu Ile Ser Tyr Phe Val Asn Leu Gln 150 155 160 AAT GAA TTT GGT GAA TTA AAA TCT TAT CCA ATG GGT ACT GTT TAC 639 Asn Glu Phe Gly Glu Leu Lys Ser Tyr Pro Met Gly Thr Val Tyr 165 170 175 TTC AAC GGT TGG AGA CAA GTA AGA TGG GAA AAC AGA GAA TAC TTA 684 Phe Asn Gly Trp Arg Gln Val Arg Trp Glu Asn Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 CCT AAT GTT CGC GAC AGA GTA TTA GTA AGA GAA CCT CTT TAT CCT 729 Pro Asn Val Arg Asp Arg Val Leu Val Arg Glu Pro Leu Tyr Pro 195 200 205 AGA ATG ATC CCT TCT GTT AAA TTA GAT TCT TTA GGT TTC TAT AGA 774 Arg Met Ile Pro Ser Val Lys Leu Asp Ser Leu Gly Phe Tyr Arg 210 215 220 ACT AAA GAT ACT AAA GGC GGA GAT TTC ATC ACT TAC GTT AAA GAT 819 Thr Lys Asp Thr Lys Gly Gly Asp Phe Ile Thr Tyr Val Lys Asp 225 230 235 GTA ACA CTT GAG TAT GAC GTA GTA GTT GTT GAT TTT GAA GAA GAT 864 Val Thr Leu Glu Tyr Asp Val Val Val Val Asp Phe Glu Glu Asp 240 245 250 ATC GAC GAT GAA GCT ACT TGG CAG TTA TTA AAA ACA GAA AAC GAT 909 Ile Asp Asp Glu Ala Thr Trp Gln Leu Leu Lys Thr Glu Asn Asp 255 260 265 AGA AAA CAA GCT ATC GAA TCT GCT AGA ATA CGT GAA CAA GCT GAG 954 Arg Lys Gln Ala Ile Glu Ser Ala Arg Ile Arg Glu Gln Ala Glu 270 275 280 TTA AGA GAT CTT GAA CAA AGA CGT ATA GGC GAC GGT ACT GCT GCT 999 Leu Arg Asp Leu Glu Gln Arg Arg Ile Gly Asp Gly Thr Ala Ala 285 290 295 GAT CAA GGT GCT GCT GCT AAT ACA GGT GCT GCT GAC ACA GGC GCT 1044 Asp Gln Gly Ala Ala Ala Asn Thr Gly Ala Ala Asp Thr Gly Ala 300 305 310 GCT CAA GAA CAA GCT CAA TAATTAAATT AGTTTGGAAA TAAAAGGCTA 1092 Ala Gln Glu Gln Ala Gln - 315 320 ATTAATAGAT TAAGGGGAAA CTTTAATAGT TTCCCCTTTT TTTATTGT 1140
【図１】図１は、９アミノ酸間隔を使ってコンピュータ
ー計算したアミノ酸１〜アミノ酸320 のトレポネーマ・
ヒオジセンテリエ鞘タンパク質のタンパク質配列のヒド
ロパシー指数を表す。
ー計算したアミノ酸１〜アミノ酸320 のトレポネーマ・
ヒオジセンテリエ鞘タンパク質のタンパク質配列のヒド
ロパシー指数を表す。
【図２】図２は、６アミノ酸の平均グループ長さを使っ
てコンピューター計算したトレポネーマ・ヒオジセンテ
リエ鞘タンパク質のタンパク質配列のヒドロパシー指数
を表す。これはHoppおよびWoods, 1981 に従った抗原決
定基の予想を与える。
てコンピューター計算したトレポネーマ・ヒオジセンテ
リエ鞘タンパク質のタンパク質配列のヒドロパシー指数
を表す。これはHoppおよびWoods, 1981 に従った抗原決
定基の予想を与える。
【図３】図３は、O. GascuelおよびJ.L. Golmard, 1988
(CABIOS 4, 357-365)に従った、トレポネーマ・ヒオジ
センテリエ鞘タンパク質の配列についての３種のコンホ
メーションの確率プロフィールのプロットを表す。各コ
ンホメーションに予想される領域の範囲をグラフの上に
示す。
(CABIOS 4, 357-365)に従った、トレポネーマ・ヒオジ
センテリエ鞘タンパク質の配列についての３種のコンホ
メーションの確率プロフィールのプロットを表す。各コ
ンホメーションに予想される領域の範囲をグラフの上に
示す。
【図４】図４は、J. NovotnyおよびC. Auffray, 1984
(Nucleic Acids Research 12, 243-255) に従ったトレ
ポネーマ・ヒオジセンテリエ鞘タンパク質の配列の二次
構造の予想を表す。
(Nucleic Acids Research 12, 243-255) に従ったトレ
ポネーマ・ヒオジセンテリエ鞘タンパク質の配列の二次
構造の予想を表す。
【図５】図５は、Ｅ．コリ中でλZAPII/fla6ファージが
ポリクローナルウサギ抗血清と反応する41 kDaのポリヌ
クレオチドの合成を指令することを示すウエスタンブロ
ット結果である。
ポリクローナルウサギ抗血清と反応する41 kDaのポリヌ
クレオチドの合成を指令することを示すウエスタンブロ
ット結果である。
【図６】図６は、λZAPII/fla6ファージのEcoRI 消化後
に得られた1500 bp および1750bp 断片が試験管内転写
／翻訳系において44 kDaタンパク質の合成を指令するか
どうかを調べた結果を表す。
に得られた1500 bp および1750bp 断片が試験管内転写
／翻訳系において44 kDaタンパク質の合成を指令するか
どうかを調べた結果を表す。
【図７】図７は、λZAPII/fla6ファージのからの1750 b
p 断片をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、ヌクレ
オチド配列決定する手順を示す。
p 断片をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、ヌクレ
オチド配列決定する手順を示す。
【図８】図８は、Ｅ．コリからの組換えGst およびGst-
FlaA調製物のSDS-PAGE（Ａ）およびイムノブロット
（Ｂ）による純度分析の結果を表す。レーン１は組換え
Gst調製物でありそしてレーン２はGst-FlaA調製物であ
る。
FlaA調製物のSDS-PAGE（Ａ）およびイムノブロット
（Ｂ）による純度分析の結果を表す。レーン１は組換え
Gst調製物でありそしてレーン２はGst-FlaA調製物であ
る。
【図９】図９は、形質転換体Ｓ．チフィムリウム33261
(pLUC180.2, pGEX-3XおよびpUEX2) またはX3987(pYA29
2) によりコードされる組換えFlaA（融合）タンパク質
のイムノブロットを表す。
(pLUC180.2, pGEX-3XおよびpUEX2) またはX3987(pYA29
2) によりコードされる組換えFlaA（融合）タンパク質
のイムノブロットを表す。
Claims (7)
- 【請求項１】 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Trep
onema hyodysenteriae）の内鞭毛鞘タンパク質の少なく
とも一部分をコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 次の群： (a) 配列表の配列番号１に表されるヌクレオチド配列の
少なくとも一部分を有するＤＮＡ； (b) いずれかの外来ＤＮＡとハイブリダイズし且つトレ
ポネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteri
ae）の内鞭毛鞘タンパク質の免疫原性を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド；または (c) (a) で定義したＤＮＡまたは(b) で定義したポリヌ
クレオチドに遺伝暗号の結果として縮重し、且つトレポ
ネーマ・ヒオジセンテリエ（Treponema hyodysenteria
e）の内鞭毛鞘タンパク質の免疫原性を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド； から選択されるポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Trep
onema hyodysenteriae）の内鞭毛鞘タンパク質の少なく
とも一部分の発現をコードする組換えポリヌクレオチド
であって、適当なベクターおよび該ベクター中に挿入さ
れた請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む
ことを特徴とする組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Trep
onema hyodysenteriae）の内鞭毛鞘タンパク質のアミノ
酸配列の少なくとも一部分を有するポリペプチド。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１に表されるアミノ酸
配列の少なくとも一部分を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 請求項３に記載の組換えポリヌクレオチ
ドまたは請求項４もしくは５に記載のポリペプチドの有
効量を含有する、トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Tr
eponema hyodysenteriae）感染を防止するためのワクチ
ン。 - 【請求項７】 トレポネーマ・ヒオジセンテリエ（Trep
onema hyodysenteriae）感染を防止するために使われる
請求項４または５に記載のポリペプチド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91202478 | 1991-09-25 | ||
| NL91202478:3 | 1992-07-24 | ||
| NL92202273:6 | 1992-07-24 | ||
| EP92202273 | 1992-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189773A true JPH06189773A (ja) | 1994-07-12 |
Family
ID=26129402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4276829A Pending JPH06189773A (ja) | 1991-09-25 | 1992-09-22 | トレポネーマ・ヒオジセンテリエ ワクチン |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0534526A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06189773A (ja) |
| AU (1) | AU2524492A (ja) |
| CA (1) | CA2078851A1 (ja) |
| IL (1) | IL103237A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518563A (ja) * | 2010-01-28 | 2013-05-23 | アンナ・ロサンデル | ワクチンにおいて使用するための組換えタンパク質、前記タンパク質に対する抗体、ならびに該タンパク質を含む診断法および療法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979501B (zh) * | 2010-09-17 | 2012-05-23 | 华中农业大学 | 表达猪链球菌2型表面抗原基因sao的重组猪霍乱沙门氏菌及疫苗与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015132A2 (en) * | 1989-05-24 | 1990-12-13 | Syntro Corporation | Cloned treponema hyodysenteriae endoflagellar antigen |
-
1992
- 1992-09-14 EP EP92202796A patent/EP0534526A1/en not_active Withdrawn
- 1992-09-22 CA CA002078851A patent/CA2078851A1/en not_active Abandoned
- 1992-09-22 JP JP4276829A patent/JPH06189773A/ja active Pending
- 1992-09-22 AU AU25244/92A patent/AU2524492A/en not_active Abandoned
- 1992-09-22 IL IL103237A patent/IL103237A0/xx unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518563A (ja) * | 2010-01-28 | 2013-05-23 | アンナ・ロサンデル | ワクチンにおいて使用するための組換えタンパク質、前記タンパク質に対する抗体、ならびに該タンパク質を含む診断法および療法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL103237A0 (en) | 1993-02-21 |
| CA2078851A1 (en) | 1993-03-26 |
| AU2524492A (en) | 1993-04-01 |
| EP0534526A1 (en) | 1993-03-31 |
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