JPH06189785A - 抗ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
抗ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法Info
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- JPH06189785A JPH06189785A JP4296464A JP29646492A JPH06189785A JP H06189785 A JPH06189785 A JP H06189785A JP 4296464 A JP4296464 A JP 4296464A JP 29646492 A JP29646492 A JP 29646492A JP H06189785 A JPH06189785 A JP H06189785A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 煩雑な化学合成によるＤ（＋）−６−エリス
ロ−ネオプテリン誘導体を経ずに、しかも容易な手法で
抗体の吸収操作の不要なＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンのモノクローナル抗体を製造する方法を提供す
ること。 【構成】 Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを免
疫賦活タンパク質又は含硫タンパク質と架橋したものを
免疫原として動物を免疫し、該動物から抗Ｄ（＋）−６
−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体を誘導す
ることから成る、抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテ
リンモノクローナル抗体の製造方法を提供した。
ロ−ネオプテリン誘導体を経ずに、しかも容易な手法で
抗体の吸収操作の不要なＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンのモノクローナル抗体を製造する方法を提供す
ること。 【構成】 Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを免
疫賦活タンパク質又は含硫タンパク質と架橋したものを
免疫原として動物を免疫し、該動物から抗Ｄ（＋）−６
−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体を誘導す
ることから成る、抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテ
リンモノクローナル抗体の製造方法を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗Ｄ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法及び
該モノクローナル抗体を用いる免疫測定方法に関する。
スロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法及び
該モノクローナル抗体を用いる免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンは活性
化マクロファージから放出され, 細胞性免疫亢進の指標
として臨床的にも, ウイルスや細菌による感染症, 癌及
び臓器移植の診断及び臨床的指標として注目されてい
る。
化マクロファージから放出され, 細胞性免疫亢進の指標
として臨床的にも, ウイルスや細菌による感染症, 癌及
び臓器移植の診断及び臨床的指標として注目されてい
る。
【０００３】Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに
対する抗体を得る目的で、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネ
オプテリンをそのまま免疫しても、Ｄ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンの分子量が小さいために抗体を得る
ことができないことは公知である。このため、Ｄ（＋）
−６−エリスロ−ネオプテリンにスペーサーを結合して
成る誘導体を化学合成して、グルタルアルデヒド等でウ
シ血清アルブミン等に結合したものを抗原としてウサギ
等に免疫して抗血清を得る方法が開発された（特公平２
−５５４３４号）。
対する抗体を得る目的で、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネ
オプテリンをそのまま免疫しても、Ｄ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンの分子量が小さいために抗体を得る
ことができないことは公知である。このため、Ｄ（＋）
−６−エリスロ−ネオプテリンにスペーサーを結合して
成る誘導体を化学合成して、グルタルアルデヒド等でウ
シ血清アルブミン等に結合したものを抗原としてウサギ
等に免疫して抗血清を得る方法が開発された（特公平２
−５５４３４号）。
【０００４】しかし、この方法で化学合成した免疫原を
得るには煩雑な操作と熟練が必要で、一般的に利用する
ことは困難であるばかりでなく、得られた抗血清からＤ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに対する抗体を得
るには、非特異成分を煩雑な吸収操作で除く必要があ
る。
得るには煩雑な操作と熟練が必要で、一般的に利用する
ことは困難であるばかりでなく、得られた抗血清からＤ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに対する抗体を得
るには、非特異成分を煩雑な吸収操作で除く必要があ
る。
【０００５】さらに、Ｗｅｙｒｅｒらはこの方法で化学
合成した抗原を用いてモノクローナル抗体の作出を試み
たが、実用に供し得るモノクローナル抗体は得られなか
った（HYBRIDOMA,9,71,1990)。
合成した抗原を用いてモノクローナル抗体の作出を試み
たが、実用に供し得るモノクローナル抗体は得られなか
った（HYBRIDOMA,9,71,1990)。
【０００６】また従来、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンの検出には、上記のごとく熟練を要する化学合
成による免疫原を用い、煩雑な吸収操作でウサギ等の抗
血清から精製した抗体を用いており、いまだ実用可能な
モノクローナル抗体の製造方法とその利用方法は得られ
ていない。
プテリンの検出には、上記のごとく熟練を要する化学合
成による免疫原を用い、煩雑な吸収操作でウサギ等の抗
血清から精製した抗体を用いており、いまだ実用可能な
モノクローナル抗体の製造方法とその利用方法は得られ
ていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、従来、
Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに対する抗体を
得るには特公平２−５５４３４号に開示されているよう
に、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの誘導体の
化学合成から始め、しかる後、ウシ血清アルブミンに結
合したものを用いなければならなかった。しかしその方
法は煩雑な手順を要するとともに、その免疫原からいま
だ実用に供するモノクローナル抗体を得ることはできな
かった。さらにウサギ等から得られた抗血清からＤ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに特異的な抗体を
得るには、煩雑な吸収操作を必要とする。
Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに対する抗体を
得るには特公平２−５５４３４号に開示されているよう
に、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの誘導体の
化学合成から始め、しかる後、ウシ血清アルブミンに結
合したものを用いなければならなかった。しかしその方
法は煩雑な手順を要するとともに、その免疫原からいま
だ実用に供するモノクローナル抗体を得ることはできな
かった。さらにウサギ等から得られた抗血清からＤ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンに特異的な抗体を
得るには、煩雑な吸収操作を必要とする。
【０００８】従って、本発明の目的は、これら煩雑な化
学合成によるＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリン誘
導体を経ずに、しかも容易な手法で抗体の吸収操作の不
要なＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンのモノクロ
ーナル抗体を製造する方法を提供することである。ま
た、本発明の目的は、この方法により製造されたモノク
ローナル抗体を用いた免疫測定方法を提供することであ
る。
学合成によるＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリン誘
導体を経ずに、しかも容易な手法で抗体の吸収操作の不
要なＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンのモノクロ
ーナル抗体を製造する方法を提供することである。ま
た、本発明の目的は、この方法により製造されたモノク
ローナル抗体を用いた免疫測定方法を提供することであ
る。
【０００９】本願発明者らは、鋭意研究の結果、Ｄ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンをそのまま免疫賦
活タンパク質又は含硫タンパク質に結合したものを免疫
原として用いることにより、簡単な操作で高い親和性を
有する抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノク
ローナル抗体を得ることができることを見出し本発明を
完成した。
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンをそのまま免疫賦
活タンパク質又は含硫タンパク質に結合したものを免疫
原として用いることにより、簡単な操作で高い親和性を
有する抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノク
ローナル抗体を得ることができることを見出し本発明を
完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、Ｄ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンを免疫賦活タンパク質又は含硫タン
パク質と架橋したものを免疫原として動物を免疫し、該
動物から抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノ
クローナル抗体を誘導することから成る、抗Ｄ（＋）−
６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造
方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に
より製造された抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリ
ンモノクローナル抗体とＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンとの特異的反応性を利用してＤ（＋）−６−エ
リスロ−ネオプテリンを検出又は測定することから成る
免疫測定方法を提供する。
スロ−ネオプテリンを免疫賦活タンパク質又は含硫タン
パク質と架橋したものを免疫原として動物を免疫し、該
動物から抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノ
クローナル抗体を誘導することから成る、抗Ｄ（＋）−
６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造
方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に
より製造された抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリ
ンモノクローナル抗体とＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンとの特異的反応性を利用してＤ（＋）−６−エ
リスロ−ネオプテリンを検出又は測定することから成る
免疫測定方法を提供する。
【００１１】以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】本発明において、「免疫賦活タンパク質」
とは抗体産生を増進させるタンパク質であり、その例と
してムラミルジペプタイド、結核菌、百日咳菌等を挙げ
ることができる。また、含硫タンパク質とは、イオウを
含むタンパク質であり、その好ましい例として、γ- グ
ロブリン、マクログロブリン、チログロブリン、メルカ
プトアルブミン、アルブミン、フィブリノーゲン等を挙
げることができる。
とは抗体産生を増進させるタンパク質であり、その例と
してムラミルジペプタイド、結核菌、百日咳菌等を挙げ
ることができる。また、含硫タンパク質とは、イオウを
含むタンパク質であり、その好ましい例として、γ- グ
ロブリン、マクログロブリン、チログロブリン、メルカ
プトアルブミン、アルブミン、フィブリノーゲン等を挙
げることができる。
【００１３】免疫賦活タンパク質又は含硫タンパク質と
Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンとの架橋は、こ
れらを架橋剤と反応させることにより行うことができ
る。免疫賦活タンパク質を用いる場合には、架橋剤とし
てはグルタルアルデヒドやカルボジイミド等を用いるこ
とができる。この場合、免疫賦活タンパク質、Ｄ（＋）
−６−エリスロ−ネオプテリン及び架橋剤の混合比率
は、特に限定されないが、１：１０：１０ないし１：１
０2 ：１０3 程度が好ましく、反応は好ましくは１２℃
〜３７℃で１〜２０時間程度行われる。また、含硫タン
パク質を用いる場合には、架橋剤としてはサクシンイミ
ドやマレイミド等を用いることができる。この場合、免
疫賦活タンパク質、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテ
リン及び架橋剤の混合比率は、特に限定されないが、
１：１０2 ：１０2 ないし１：１０3 ：１０3 程度が好
ましく、反応は好ましくは１２℃〜３７℃で１〜２０時
間程度行われる。
Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンとの架橋は、こ
れらを架橋剤と反応させることにより行うことができ
る。免疫賦活タンパク質を用いる場合には、架橋剤とし
てはグルタルアルデヒドやカルボジイミド等を用いるこ
とができる。この場合、免疫賦活タンパク質、Ｄ（＋）
−６−エリスロ−ネオプテリン及び架橋剤の混合比率
は、特に限定されないが、１：１０：１０ないし１：１
０2 ：１０3 程度が好ましく、反応は好ましくは１２℃
〜３７℃で１〜２０時間程度行われる。また、含硫タン
パク質を用いる場合には、架橋剤としてはサクシンイミ
ドやマレイミド等を用いることができる。この場合、免
疫賦活タンパク質、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテ
リン及び架橋剤の混合比率は、特に限定されないが、
１：１０2 ：１０2 ないし１：１０3 ：１０3 程度が好
ましく、反応は好ましくは１２℃〜３７℃で１〜２０時
間程度行われる。
【００１４】次に、上記のようにしてタンパク質と架橋
されたＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを免疫原
として用い、動物を免疫する。免疫の方法は常法により
行うことができる。例えば、アジュバントとともに、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヤギ等の動物に２〜３週間毎に
数回繰り返して接種することにより免疫することができ
る。
されたＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを免疫原
として用い、動物を免疫する。免疫の方法は常法により
行うことができる。例えば、アジュバントとともに、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヤギ等の動物に２〜３週間毎に
数回繰り返して接種することにより免疫することができ
る。
【００１５】次いで、免疫した動物からモノクローナル
抗体を誘導する。これは、この分野において周知の常法
により行うことができる。すなわち、免疫した動物から
脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これ
と腫瘍細胞株と融合させる。腫瘍細胞株としては、ヒポ
キサンチン- グアニン- ホスホリポジルトランスフェラ
ーゼ欠損あるいはチミジンキナーゼ欠損等の適切な選択
マーカーを持ったミエローマ細胞等を用いることができ
る。細胞融合は, 例えばKohler,G. and Milstein,C.
（Nature 256,495,1975 ）の方法またはこれに準ずる方
法によって行われる。細胞融合によって得られた細胞は
その培養上清中の抗体価を, 例えば酵素免疫測定法等に
よって測定し, 抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリ
ン抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択され
たハイブリドーマはさらに例えば限界希釈法によってク
ローニングを行ってクローンを得る。このクローンは,
例えばあらかじめプリスタンを投与したBALB/cマウス腹
腔へ移植し, ７〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度
に含む腹水を採取することができる。
抗体を誘導する。これは、この分野において周知の常法
により行うことができる。すなわち、免疫した動物から
脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これ
と腫瘍細胞株と融合させる。腫瘍細胞株としては、ヒポ
キサンチン- グアニン- ホスホリポジルトランスフェラ
ーゼ欠損あるいはチミジンキナーゼ欠損等の適切な選択
マーカーを持ったミエローマ細胞等を用いることができ
る。細胞融合は, 例えばKohler,G. and Milstein,C.
（Nature 256,495,1975 ）の方法またはこれに準ずる方
法によって行われる。細胞融合によって得られた細胞は
その培養上清中の抗体価を, 例えば酵素免疫測定法等に
よって測定し, 抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリ
ン抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択され
たハイブリドーマはさらに例えば限界希釈法によってク
ローニングを行ってクローンを得る。このクローンは,
例えばあらかじめプリスタンを投与したBALB/cマウス腹
腔へ移植し, ７〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度
に含む腹水を採取することができる。
【００１６】なお, 抗体価を測定するための酵素免疫測
定法は, 例えば次のようにして実施することができる。
すなわち, 前記のネオプテリン架橋物をコートしたマイ
クロプレートに検体を加え, 一定時間反応の後洗浄後,
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを加え,
さらに一定時間反応させる。未反応の標識抗体を洗浄
後, 過酸化水素を含むO-フェニレンジアミン液を加え一
定時間反応させた後, 硫酸を加えて反応を止め, 490nm
の吸光度を測定する。
定法は, 例えば次のようにして実施することができる。
すなわち, 前記のネオプテリン架橋物をコートしたマイ
クロプレートに検体を加え, 一定時間反応の後洗浄後,
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを加え,
さらに一定時間反応させる。未反応の標識抗体を洗浄
後, 過酸化水素を含むO-フェニレンジアミン液を加え一
定時間反応させた後, 硫酸を加えて反応を止め, 490nm
の吸光度を測定する。
【００１７】本発明の方法により、Ｄ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンに対して高い特異性を有するモノク
ローナル抗体を得ることができる。このモノクローナル
抗体は、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの検出
のための免疫測定方法に利用することができる。免疫測
定方法自体はこの分野において周知であり、いかなる免
疫測定方法にも上記モノクローナル抗体を適用すること
ができる。すなわち、標識剤に基づいて分類すれば、酵
素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ビオ
チンを用いる免疫測定法等に適用することが可能である
し、測定様式に基づいて分類すれば、サンドイッチ法、
凝集法、競合法等に適用することが可能である。本発明
の免疫測定方法によれば、抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−
ネオプテリンモノクローナル抗体のＤ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンに対する特異性及び親和性が高いの
で、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを高感度に
検出又は測定することができる。
スロ−ネオプテリンに対して高い特異性を有するモノク
ローナル抗体を得ることができる。このモノクローナル
抗体は、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの検出
のための免疫測定方法に利用することができる。免疫測
定方法自体はこの分野において周知であり、いかなる免
疫測定方法にも上記モノクローナル抗体を適用すること
ができる。すなわち、標識剤に基づいて分類すれば、酵
素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ビオ
チンを用いる免疫測定法等に適用することが可能である
し、測定様式に基づいて分類すれば、サンドイッチ法、
凝集法、競合法等に適用することが可能である。本発明
の免疫測定方法によれば、抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−
ネオプテリンモノクローナル抗体のＤ（＋）−６−エリ
スロ−ネオプテリンに対する特異性及び親和性が高いの
で、Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンを高感度に
検出又は測定することができる。
【００１８】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体
的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定
されるものではない。
的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定
されるものではない。
【００１９】
【実施例】実施例１ 結核菌を５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに浮遊し, さ
らに１０8 個の百日咳菌を懸濁した後, ２×１０-2Ｍの
Ｄ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μｌ加えた。そ
こへ25％グルタルアルデヒドを150 μｌ加え, 37℃にて
３時間反応させた。その反応液をＰＢＳにて透析した。
らに１０8 個の百日咳菌を懸濁した後, ２×１０-2Ｍの
Ｄ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μｌ加えた。そ
こへ25％グルタルアルデヒドを150 μｌ加え, 37℃にて
３時間反応させた。その反応液をＰＢＳにて透析した。
【００２０】その１容量と完全アジュバント１容量とを
混和して, BALB/cマウスへ２週間間隔で100 μｌづつ４
回免疫した。最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し,その脾細胞とマウスミエローマP3X63.Ag8.653 と1
0：1 の割合で混合し, Kohlerらの方法（Nature 256,49
5,1975 ）に準じて細胞融合並びにＨＡＴ選択を実施し
た。
混和して, BALB/cマウスへ２週間間隔で100 μｌづつ４
回免疫した。最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し,その脾細胞とマウスミエローマP3X63.Ag8.653 と1
0：1 の割合で混合し, Kohlerらの方法（Nature 256,49
5,1975 ）に準じて細胞融合並びにＨＡＴ選択を実施し
た。
【００２１】増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体
価は酵素免疫測定法により測定し,さらに限界希釈法に
よりクローニングを行った。酵素免疫測定法はγ- グロ
ブリンを５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶かし, 2-
メルカプトエタノール５μｌを加え, ２×１０-2ＭのＤ
(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μｌ加え, さらに
２×１０-2Ｍのm-マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを200 μｌ加えて37℃にて３
時間反応させたものをＰＢＳにて透析し, それをネオプ
テリン架橋物としてマイクロプレートに吸着させた。ウ
エルの培養上清を加え, 37℃で１時間反応の後洗浄し,
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを加え,
さらに37℃で１時間反応させた。未反応の標識抗体を洗
浄後, 0.002 ％過酸化水素を含む３ｍｇ／ｍｌのO-フェ
ニレンジアミン液を加え室温で30分間反応させた後, 1N
硫酸を加えて反応を止め, 490nm の吸光度を測定した。
価は酵素免疫測定法により測定し,さらに限界希釈法に
よりクローニングを行った。酵素免疫測定法はγ- グロ
ブリンを５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶かし, 2-
メルカプトエタノール５μｌを加え, ２×１０-2ＭのＤ
(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μｌ加え, さらに
２×１０-2Ｍのm-マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを200 μｌ加えて37℃にて３
時間反応させたものをＰＢＳにて透析し, それをネオプ
テリン架橋物としてマイクロプレートに吸着させた。ウ
エルの培養上清を加え, 37℃で１時間反応の後洗浄し,
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを加え,
さらに37℃で１時間反応させた。未反応の標識抗体を洗
浄後, 0.002 ％過酸化水素を含む３ｍｇ／ｍｌのO-フェ
ニレンジアミン液を加え室温で30分間反応させた後, 1N
硫酸を加えて反応を止め, 490nm の吸光度を測定した。
【００２２】得られたクローン（１０Ｅ- ４- ５と名付
ける）はあらかじめ0.5 ｍｌのプリスタンを投与したBA
LB/cマウス腹腔へ移植し, ７〜14日後にモノクローナル
抗体を高濃度に含む腹水を採取した。これらの腹水は硫
安分画法（45％飽和）の後,イオン交換クロマトグラフ
ィーにてIgG に精製した。
ける）はあらかじめ0.5 ｍｌのプリスタンを投与したBA
LB/cマウス腹腔へ移植し, ７〜14日後にモノクローナル
抗体を高濃度に含む腹水を採取した。これらの腹水は硫
安分画法（45％飽和）の後,イオン交換クロマトグラフ
ィーにてIgG に精製した。
【００２３】実施例２ チログロブリンを５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶
かし, 2-メルカプトエタノール５μｌを加え, さらに２
×１０-2ＭのＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μ
ｌ加えた。そこへ２×１０-2Ｍのスクシンイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレートを200 μｌ加え, 37℃にて３時間反応させ
た。その反応液をＰＢＳにて透析した。
かし, 2-メルカプトエタノール５μｌを加え, さらに２
×１０-2ＭのＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを200 μ
ｌ加えた。そこへ２×１０-2Ｍのスクシンイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレートを200 μｌ加え, 37℃にて３時間反応させ
た。その反応液をＰＢＳにて透析した。
【００２４】その１容量と完全アジュバント１容量とを
混和して, 以下実施例１と同様な方法にて細胞融合を行
い, クローン（１２Ａ- ３- ４と名付ける）を得た。得
られたクローンは実施例１と同様な方法で腹水を採取の
後, IgG に精製した。
混和して, 以下実施例１と同様な方法にて細胞融合を行
い, クローン（１２Ａ- ３- ４と名付ける）を得た。得
られたクローンは実施例１と同様な方法で腹水を採取の
後, IgG に精製した。
【００２５】実施例３ 得られた２種類のモノクローナル抗体をＰＢＳにて希釈
し, ネオプテリンを測定する既存の外国製ＲＩＡ試薬
（IMMUtest Neopterin；HENNING BERLIN GMBH ）を使用
して抗体の力価を比較した結果を図１に示した。得られ
たモノクローナル抗体は高い力価を示した。
し, ネオプテリンを測定する既存の外国製ＲＩＡ試薬
（IMMUtest Neopterin；HENNING BERLIN GMBH ）を使用
して抗体の力価を比較した結果を図１に示した。得られ
たモノクローナル抗体は高い力価を示した。
【００２６】実施例４ 得られた２種類のモノクローナル抗体につき実施例１の
酵素免疫測定法を実施するとき, 予め２×１０-4ＭのＤ
(+)-6-エリスロ- ネオプテリン, ２×１０-4ＭのＤ(+)-
6-エリスロ- ビオプテリンあるいは２×１０-4Ｍのキサ
ントプテリンと37℃で１時間反応させてから実施させ
て, モノクローナル抗体の特異性を検討した結果を表１
に示した。得られたモノクローナル抗体はＤ(+)-6-エリ
スロ- ネオプテリンに高い特異性を示した。
酵素免疫測定法を実施するとき, 予め２×１０-4ＭのＤ
(+)-6-エリスロ- ネオプテリン, ２×１０-4ＭのＤ(+)-
6-エリスロ- ビオプテリンあるいは２×１０-4Ｍのキサ
ントプテリンと37℃で１時間反応させてから実施させ
て, モノクローナル抗体の特異性を検討した結果を表１
に示した。得られたモノクローナル抗体はＤ(+)-6-エリ
スロ- ネオプテリンに高い特異性を示した。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例５ Ｄ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを検出する目的で, 得
られた２種類のモノクローナル抗体につき実施例１の酵
素免疫測定法を実施するとき, 予め種々の濃度に希釈さ
れたＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンと37℃で１時間反
応させてから実施させ, 検出可能なネオプテリン濃度を
検討した結果を図２に示した。なお、図２中、Ｂ／Ｂ0
は反応を指数で表したものであり、Ｂ0 とは１００％反
応が起こった状態、Ｂとはネオプテリンが作用し反応に
変化が起こった状態を示す。得られたモノクローナル抗
体はＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを１６nmol/Lまで
高感度に測定できた。
られた２種類のモノクローナル抗体につき実施例１の酵
素免疫測定法を実施するとき, 予め種々の濃度に希釈さ
れたＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンと37℃で１時間反
応させてから実施させ, 検出可能なネオプテリン濃度を
検討した結果を図２に示した。なお、図２中、Ｂ／Ｂ0
は反応を指数で表したものであり、Ｂ0 とは１００％反
応が起こった状態、Ｂとはネオプテリンが作用し反応に
変化が起こった状態を示す。得られたモノクローナル抗
体はＤ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを１６nmol/Lまで
高感度に測定できた。
【００２９】実施例６ Ｄ(+)-6-エリスロ- ネオプテリンを検出する目的で, 得
られた２種類のモノクローナル抗体をヒト組織切片と37
℃で１時間反応させた後, 洗浄し, ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリンを加え, さらに37℃で１時間
反応させた。未反応の標識抗体を洗浄後, 0.002 ％過酸
化水素を含む0.5 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンチジン液を
加え室温で５分間反応させた後, 精製水で洗浄して反応
を止め,顕微鏡下で茶褐色の染色を観察した．得られた
モノクローナル抗体は特有な染色像を示した。
られた２種類のモノクローナル抗体をヒト組織切片と37
℃で１時間反応させた後, 洗浄し, ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリンを加え, さらに37℃で１時間
反応させた。未反応の標識抗体を洗浄後, 0.002 ％過酸
化水素を含む0.5 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンチジン液を
加え室温で５分間反応させた後, 精製水で洗浄して反応
を止め,顕微鏡下で茶褐色の染色を観察した．得られた
モノクローナル抗体は特有な染色像を示した。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、煩雑な化学合成によるＤ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリン誘導体を経ずに、
しかも容易な手法で抗体の吸収操作の不要なＤ（＋）−
６−エリスロ−ネオプテリンのモノクローナル抗体を製
造する方法が提供された。本発明の方法により製造され
るモノクローナル抗体はＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンに対する特異性及び親和性が高いので、これを
用いる免疫測定方法により、Ｄ（＋）−６−エリスロ−
ネオプテリンを高感度に検出又は測定することが可能に
なった。
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリン誘導体を経ずに、
しかも容易な手法で抗体の吸収操作の不要なＤ（＋）−
６−エリスロ−ネオプテリンのモノクローナル抗体を製
造する方法が提供された。本発明の方法により製造され
るモノクローナル抗体はＤ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンに対する特異性及び親和性が高いので、これを
用いる免疫測定方法により、Ｄ（＋）−６−エリスロ−
ネオプテリンを高感度に検出又は測定することが可能に
なった。
【図１】本発明の方法により製造されたモノクローナル
抗体及び比較のため、市販のＲＩＡ測定キット中の抗体
の力価を比較した図である。
抗体及び比較のため、市販のＲＩＡ測定キット中の抗体
の力価を比較した図である。
【図２】本発明の方法により製造されたモノクローナル
抗体によるＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの検
出可能なネオプテリン濃度を検討した結果を示す図であ
る。
抗体によるＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンの検
出可能なネオプテリン濃度を検討した結果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 津末 玄夫 東京都世田谷区松原２番地23−２
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリン
を免疫賦活タンパク質又は含硫タンパク質と架橋したも
のを免疫原として動物を免疫し、該動物から抗Ｄ（＋）
−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体を誘
導することから成る、抗Ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオ
プテリンモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法により製造された抗Ｄ
（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗
体とＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンとの特異的
反応性を利用してＤ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリ
ンを検出又は測定することから成る免疫測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4296464A JPH06189785A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 抗ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4296464A JPH06189785A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 抗ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189785A true JPH06189785A (ja) | 1994-07-12 |
Family
ID=17833897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4296464A Pending JPH06189785A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | 抗ｄ（＋）−６−エリスロ−ネオプテリンモノクローナル抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06189785A (ja) |
-
1992
- 1992-10-08 JP JP4296464A patent/JPH06189785A/ja active Pending
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