JPH06189793A - 有毒成分について混合物を検査するための分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 有毒成分について混合物を検査するための分
析方法 【構成】 有毒成分について検査しようとする混合物を
まずクロマトグラフィーによって分別部分に分離する。
ついでこの分離された分別部分をクロマトグラフィー系
自体において発光微生物と接触させ、そして生物発光を
測定することによって分別部分の毒性を測定する。クロ
マトグラフィーを用いる分離は薄層クロマトグラフィー
またはカラム液体クロマトグラフィーのいずれかによっ
て遂行できる。 【効果】 混合物中に含まれる個々の成分の毒性を選択
的に検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は有毒成分について混合物
を検査するための分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】長年の間、化合物の毒性試験において発
光細菌が用いられてきた（例えば、エイ・エイ・ブリッ
ヒ（Ａ．Ａ．Ｂｕｌｉｃｈ）；ジー・ビトン（Ｇ．Ｂｉ
ｔｔｏｎ）；ビー・ジェイ・ダトケイ（Ｂ．Ｊ．Ｄｕｔ
ｋａｙ），“微生物を用いる毒性試験（Ｔｏｘｉｃｉｔ
ｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ）”，シーアールシー・プレス（ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ），ボカ−レートン（Ｂｏｃａ−Ｒａｔｏ
ｎ），フロリダ，ＵＳＡ，第５７頁ないし第７４頁参
照）。発光細菌検査の原理は、発光細菌によって生ずる
生物発光の減少を導く、この細菌に対する物質の毒性を
基にしている。この減少量は測定方法によって評価され
る。種々の化合物の混合物の場合、従来は混合物（全
体）の毒性を全体として評価できるに過ぎなかった。含
まれている個々の成分の毒性については何も情報を得る
ことができなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところで、本発明によ
って指定された課題は、測定された毒性を混合物の個々
の成分に割り当てることを可能にする発光細菌検査に基
づく、有毒成分について混合物を検査するための方法を
提供することであった。それと同時に、分析方法自体が
発光細菌に対して有毒な作用を及ぼさないという重要な
境界条件も満足されるであろう。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によると、この課
題の解決手段は、検査しようとする混合物をまずクロマ
トグラフィーによって分別部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に
分離し、この分離された分別部分をクロマトグラフィー
系自体において発光微生物と接触させ、そして生物発光
を測定することによってこの分別部分の毒性を測定する
ことを特徴としている。分別部分は有利には薄層クロマ
トグラフィーまたはカラム液体クロマトグラフィーによ
って分離される。薄層クロマトグラフィーの場合、ＴＬ
Ｃプレートを発光微生物の懸濁液で濡らして、個々の分
別部分に割り当てられた局部的な生物発光を測定する。
このためには、ＴＬＣプレートを写真フィルムと接触さ
せ、そして個々の分別部分に割り当てられた生物発光を
視覚またはデンシトメトリーのいずれかにより、露光さ
れたフィルム上で評価するのが好都合である。

【０００５】カラム液体クロマトグラフィーによって分
離を遂行する場合には、発光微生物の懸濁液をクロマト
グラフィーカラムから出た溶出液と連続的に混合し、そ
してその混合物の生物発光を通気光度系（ｔｈｒｏｕｇ
ｈｆｌｏｗ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）によって測定す
る。本発明は次の利点を与える。

【０００６】１．クロマトグラフィーを基にした従来の
検出方法が混合物成分の同一性、量および／または化学
構造に関する情報を提供するのに対し、本発明方法は混
合物のうちの或成分の生物的作用に関する直接の情報を
提供し、すなわち混合物の毒性はその混合物の個々別々
の成分に直接割り当てることができる。このようにして
クロマトグラフィー分離により得られる情報の質が改善
される。

【０００７】２．混合物中の未知の有毒化合物の構造上
の解明に伴う苦労および費用が毒性の選択的な検出によ
ってかなり低減させることができる。なぜならば、（例
えば単離およびそれに続く分光学的検査による）構造上
の解明に関する作業を、毒性の検出結果に基づいて毒性
作用を割り当てることができる混合物のそれらの成分に
集中できるからである。この分析方法の利用可能な応用
には、廃水中の未知の有毒成分の構造上の解明および様
々な製品中の殺生物剤の検出が含まれる。本発明は添付
図面と共に下記の実施例によって説明される。

【０００８】

【実施例】

１．薄層クロマトグラフィーによる毒性の検出 発光微生物を用いる薄層クロマトグラフィーによって毒
性は次のように検出される。標準的な実験室的方法を用
いる薄層クロマトグラフィーによって試料、例えば殺生
物剤について試験しようとする製品の抽出物を分離させ
る。この後には蛍光吸光度による慣用の検出法を続けて
もよい。溶離液を完全に蒸発させた後、ＴＬＣプレート
上に薄膜が残るように噴霧または浸漬することによっ
て、（３％の塩化ナトリウムを含む水中に懸濁した）発
光微生物の懸濁液をＴＬＣプレートに塗布する。ついで
このプレートを透明なフィルムまたはガラス板で被う。
次に暗室内でこのガラス板上に写真フィルムを置いて
０．５ないし１５分間放置する。ついで通例の実験室的
方法によってこのフィルムを現象し、そして固定する。
その後フィルムの露光されなかった部分または露光部分
にＴＬＣプレート上の有毒分別部分を割り当てることが
できる。

【０００９】実施例 試料：殺生物剤について検査しようとする製品の抽出物 溶剤：メタノール／イソプロパノール／水（１／１／１
容量部） ＴＬＣプレート：ダルムシュタット，メルクの製品，品
番５７１５，蛍光指示薬Ｆ₂₅₂ を有するシリカゲル６
０。分離に先立ってプレートをメタノールで２回洗浄し
てから乾燥する。 溶離液：ｎ−ヘプタン／ジクロルメタン／メタノール
（１５／４／１容量部）。 展開は単一のＴＬＣ室内で垂直方向に遂行する。 発光微生物：フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ） フィルム：アグファ スコピックス ビデオ（Ａｇｆａ
Ｓｃｏｐｉｘ Ｖｉｄｅｏ）５Ｂ 露光時間：１４分間

【００１０】 ２．高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） 毒性検出用のＨＰＬＣ装置を図１に図解して示す。溶離
液をＨＰＬＣポンプ２により貯蔵容器１から試料入口バ
ルブ３を経てクロマトグラフィーカラム４に導入する。
カラム４から連続的に流出する分別部分（溶出液）を、
隣接する評価装置６の中の検出器で常法により評価す
る。紫外線検出器５における測定セルとして通気セル
（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）を使用する。つ
いで発光微生物の懸濁液を計量型ポンプ８により貯蔵容
器９からティー（ｔｅｅ）７を経て、通気セルから流出
する溶出液の流れの中に連続的に導入する。混合区画室
１０の中で溶出液と発光細菌懸濁物とを徹底的に混合す
る。ついでその混合物を通気光度計１１に排出させて、
そこで個々の分別部分の生物発光を測定して評価する
（評価装置１２）。

【００１１】実施例 試料：有毒成分について検査しようとする水性試料 高圧液体クロマトグラフ：オートサンプラーおよびＭＷ
Ｄ検出器を有するヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰ １０５０ 細菌懸濁物 排出用ポンプ：バイオトロニク（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ）
ＢＴ ８１００ データ評価：ＧＩＮＡソフトウエア（Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ）（ラヴテスト（Ｒａｖｔｅｓｔ）） ＨＰＬＣカラム：シャンドン ハイパーシル（Ｓｈａｎ
ｄｏｎ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＯＤＳ，５μｍ；１０ｃｍ
×０．４ｃｍ直径 混合用コイル：バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）生物適合
性アフター−カラム誘導系（ａｆｔｅｒ−ｃｏｌｕｍｎ
ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ） 通気光度計：ラヴテスト ラモナ（Ｒａｖｔｅｓｔ Ｒ
ａｍｏｎａ）９０ 試料容量：２０μｌ（試料ループ） 溶離液：３％のＮａＣｌを含む水；１．５ｍｌ／ｍｉ
ｎ． 発光細菌の流量：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出波長：（ＵＶ検出）：２２０ｎｍ 細菌：０℃に冷やされている、３％のＮａＣｌを含む水
の中に懸濁されているフォトバクテリウム・ホスホレウ
ム

【００１２】記録された結果は図２（ａ）および図２
（ｂ）に示される。上方の曲線は有毒成分について検査
しようとする試料の、紫外線検出器５および評価装置６
で測定された従来のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。下
方の曲線は通気光度計１１および評価装置１２で測定さ
れた同じ溶出液の生物発光を示している。紫外線活性の
主要成分が約２０分間の保持時間で認められるととも
に、第二の成分が約１５分間の保持時間において認めら
れる。

【００１３】毒性の検出においては３つの信号群、すな
わち約１０分間における小さな信号、約１４分間におけ
る二重信号および約２０分間における主要成分に属する
信号が存在する。面白いことには、最初の２つの信号群
は通気光度計の検出と一致していない。これらの信号を
生ずる試験混合物の成分は明らかに２５４ｎｍにおいて
紫外線検出器で検出できず、かつ／またはこのために十
分な濃度で存在しない。しかしながら、約１０分間およ
び約１４分間における発光の減衰は有毒成分がこれらの
保持時間で溶出されたことを示している。

【００１４】毒性の高さを示すためには、同一の細菌懸
濁物を用いる同一条件下で既知の毒性を有する物質の定
義された量をクロマトグラフィーによって分析すること
ができ、そして試料およびこのようにして生じた発光の
減衰の測定に関する極く僅かな時間差で上記の量を測定
することができる。ついでこの既知の物質によって生じ
た毒性信号は未知の物質によって生じた信号のための対
照信号として役立つことができ、そして未知の物質によ
って生ずる信号の大きさと比較化合物の既知の量によっ
て生ずる信号の大きさ（これらの大きさはピーク高さま
たはピーク面積として表される）を互いに異ならせるフ
ァクターについて的確に述べることができる。

【００１５】ビブリオ・ハーヴェイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈ
ａｒｖｅｙｉ）ＡＴＣＣ １４１２６およびゼノラブダ
ス・ルミネッセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２９９９９はＨＰＬＣの
適用に対して特に適した細菌株であることがわかった。
驚ろくべきことには、溶離液が水中に２５％という高い
メタノール濃度の組成を持つときでさえ、これらの菌株
のいずれも発光の減少を実質的に示さない。細菌にとっ
て有毒である物質はそれでもなおそれらの発光の減少に
よって検出される。したがって毒性の検出のためにＨＰ
ＬＣを用いる応用範囲は溶離剤として水のみを用いる場
合と比べて広範囲に広げることができる。以上、発明の
詳細な説明において詳しく説明した本発明を具体的に要
約すれば次の通りである。

【００１６】（１）有毒成分について混合物を検査する
ための分析方法において、混合物をまずクロマトグラフ
ィーによって分別部分に分離し、分離された分別部分を
クロマトグラフィー系自体において発光微生物と接触さ
せ、そして生物発光の減少量によって分別部分の毒性を
測定することを特徴とする前記方法。

【００１７】（２）薄層クロマトグラフィーによって分
別部分を分離することを特徴とする前記第１項の方法。 （３）カラム液体クロマトグラフィーによって分別部分
を分離することを特徴とする前記第１項の方法。

【００１８】（４）発光微生物の懸濁液で薄層クロマト
グラフィーのプレートを濡らし、そして個々の分別部分
に割り当てられた局部的な生物発光を測定することを特
徴とする前記第１項の方法。 （５）薄層クロマトグラフィーのプレートを写真フィル
ムと接触させ、そして個々の分別部分に割り当てられた
生物発光を視覚またはデンシトメトリーのいずれかによ
って、露光フィルム上で評価することを特徴とする前記
第４項の方法。 （６）発光微生物として好ましくはビブリオ・ハーベイ
ＡＴＣＣ １４１２６またはゼノラブダス・ルミネッセ
ンスＡＴＣＣ ２９９９９細菌株を用いることを特徴と
する前記第３項の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】毒性検出用ＨＰＬＣ装置の説明図である。

【図２】（ａ）紫外線検出器５および評価装置６で測定
されたＨＰＬＣクロマトグラム図である。 （ｂ）通気光度計１１および評価装置１２で測定された
ＨＰＬＣクロマトグラム図である。

【符号の説明】

１，９ 貯蔵容器 ２ ＨＰＬＣポンプ ３ 試料入口バルブ ４ クロマトグラフィーカラム ５ 紫外線検出器 ６，１２ 評価装置 ７ ティー ８ 計量型ポンプ １０ 混合区画室 １１ 通気光度計

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴオルフガング・クライス ドイツ連邦共和国デイー51467 ベルギツ シユ・グラツドバツハ、ローツイングシユ トラーセ 18 (72)発明者 ハンス−ゲオルク・ラスト ドイツ連邦共和国デイー51465 ベルギツ シユ・グラツドバツハ、ロマーシヤイダ ー・ホーヘ 10 (72)発明者 ギユンター・エベルツ ドイツ連邦共和国デイー51375 レーフエ ルクーゼン、ホルンダーヴエク 12

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有毒成分について混合物を検査するための
   分析方法において、混合物をまずクロマトグラフィーに
   よって分別部分に分離し、分離された分別部分をクロマ
   トグラフィー系自体において発光微生物と接触させ、そ
   して生物発光の減少量によって分別部分の毒性を測定す
   ることを特徴とする前記方法。